JP7008406B2 - ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択するための発現構築物および方法 - Google Patents
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Description
プロモーターと、
目的のポリペプチドをコードする第1のエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第1の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
修飾免疫グロブリン膜貫通領域または非免疫グロブリン膜貫通領域である膜貫通領域をコードする第2のエクソンと、
第2の停止コドンと
ポリアデニル化部位と
を含む発現構築物であって、宿主細胞に侵入すると、第1および第2のエクソンが転写されることにより、目的のポリペプチドが発現され、所定割合の目的のポリペプチドが宿主細胞の外膜上に表示される、発現構築物を提供する。
(i)
(a)5’から3’方向に、
プロモーターと、
抗体重鎖をコードするエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第1の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
改変免疫グロブリン膜貫通領域または改変もしくは非改変非免疫グロブリン膜貫通領域から選択される膜貫通領域をコードする第2のエクソンと、
第2の停止コドンと、
ポリ(A)部位と
を含む発現構築物と、
(b)抗体軽鎖をコードする発現構築物と
を宿主細胞に共トランスフェクトすること、
(ii)トランスフェクト宿主細胞を抗体の発現に適する条件下で培養することと、
(iii)抗体の細胞膜発現を検出すること、ならびに
(iv)細胞膜の表面上に抗体を表示する宿主細胞を選択すること
を含む。
実施例
導入
調製した選択的スプライシング構築物は、ヒトighg1遺伝子のスプライスドナー配列を含んでいた。イントロン(スプライスアクセプター部位を含む)は、ニワトリcTNTイントロン4に由来していたが、エクソンは、ighg1遺伝子の膜貫通領域(以下ではM1M2と呼ぶ)、T細胞受容体アルファ(PTCRA)の膜貫通領域、またはマウスB7-1遺伝子に由来していた。いくつかの構築物において、マウスB7-1膜貫通ドメインは、天然に存在する膜貫通ドメインおよびこれらの改変を含む、他の膜貫通ドメインにより置換した。さらに、B7-1膜貫通領域におけるB7-1細胞質ゾル側末端は、ER輸出シグナルを含むまたは含まないいくつかの他の細胞質ゾル側末端により置換した。
LB培養プレート
500mlの水を16gのLB寒天(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)(1リットルのLBは10gのトリプトン、5gの酵母エキスおよび10gのNaClを含む)と混合し、沸騰させた。冷却後、それぞれの抗生物質を溶液に加え、これを平板化した(アンピシリンプレートは100g/mlおよびカナマイシンプレートは50g/ml)。
すべてのPCRは、50lの最終容積中1lのdNTP(各dNTPについて10mM;Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)、2単位のPhusion(登録商標)DNAポリメラーゼ(Finnzymes Oy、Espoo、Finland)、25nmolのプライマーA(Microsynth、Balgach、SwitzerlandまたはOperon、Ebersberg、Germany)、25nmolのプライマーB(Microsynth、Balgach、SwitzerlandまたはOperon、Ebersberg、Germany)、10lの5×HF緩衝液(7.5mM MgCl2、Finnzymes、Espoo、Finland)、1.5lのジメチルスルホキシド(DMSO、Finnzymes、Espoo、Finland)および1~3lの鋳型(10~20ng)を用いて実施した。用いたすべてのプライマーを表2に示す。
すべての制限消化のために、約1gのプラスミドDNA(NanoDrop、ND-1000分光光度計(Thermo Scientific、Wilmington、DE、USA)により定量した)を10~20単位の各酵素、4lの対応する10× NEBuffer(NEB、Ipswich、MA、USA)と混合し、容積を滅菌H2Oで40lとした。反応物を酵素に必要な温度で1時間インキュベートした。
消化を可能にするために、Macherey Nagel Extract IIキット(Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)またはGel and PCR clean-upキット(同じキットの新たな商標名)を用いて40μlの溶出緩衝液を用いて製造業者の取扱説明書に従って制限消化の前にすべてのPCR断片を精製した。このプロトコールは、DNA試料の緩衝液を交換するためにも用いた。
ゲル電気泳動は、1~2%アガロースゲルを用いて実施した。これらは、必要量のUltraPure(商標)アガロース(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)および1×トリス酢酸EDTA緩衝液(TAE、pH8.3;Bio RAD、Munich、Germany)を用いて調製した。DNAの染色のために1lのGel Red Dye(Biotum、Hayward、CA、USA)を100mlのアガロースゲルに加えた。サイズマーカーとして、2lの1kb DNAラダー(NEB、Ipswich、MA、USA)を用いた。電気泳動は、125ボルトで約1時間行った。
各ライゲーションのために、4lのインサートを1lのベクター、400単位のリガーゼ(T4 DNAリガーゼ、NEB、Ipswich、MA、USA)および1lの10×リガーゼ緩衝液(T4 DNAリガーゼ緩衝液;NEB、Ipswich、MA、USA)と混合し、UHP水を用いて10l最終容積まで満たした。混合物を室温で1~2時間インキュベートした。
ライゲーション産物の形質転換のために、コンピテント細菌「TOP10」(One Shot(登録商標)TOP10コンピテント大腸菌;Life Technologies、Carlsbad、CA、USA)を用いた。25~50lの細菌を氷上で5分間解凍した。次いで、3~5lのライゲーション産物をコンピテント細菌に加え、42℃で1分間の短時間熱ショックの前に氷上で20~30分間インキュベートした。次いで、500lのS.O.C培地(Invitogen、Carlsbad、CA、USA)を各チューブごとに加え、撹拌しながら37℃で1時間インキュベートした。最後に、細菌をアンピシリンまたはカナマイシンを含むLBプレート(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA)上にのせ、37℃で終夜インキュベートした。
小規模調製のために、形質転換した細菌のコロニーを2.5mlのLBおよびアンピシリンまたはカナマイシン中で37℃、200rpmで6~16時間増殖させた。DNAは、大腸菌用プラスミド精製キット(NucleoSpin QuickPureもしくはNucleoSpin Plasmid(Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)またはQiagen QuickLyse Miniprep(Qiagen))を用いて製造業者の取扱説明書に従って抽出した。
中規模調製のために、形質転換した細菌を200mlのLBおよびアンピシリン(またはカナマイシン)中で37℃で終夜増殖させた。次いで、培養物を725gで20分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット(NucleoBond Xtra Midi;Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
大規模調製のために、形質転換した細菌を500mlのLBおよびアンピシリン(またはカナマイシン)中で37℃で終夜増殖させた。培養物を725gで20分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット(NucleoBond PC500またはNucleoBond Xtra Maxi;Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
ギガレベルの調製のために、形質転換した細菌を1500mlのLBおよびアンピシリン(またはカナマイシン)中で37℃で終夜増殖させた。培養物を725gで20分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット(NucleoBond PC10000;Macherey Nagel、Oensingen、Switzerland)を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
IgG1抗体の重鎖のクローニング
本特許に用いたIgG1重鎖をコードする遺伝子は、GeneArt(Regensburg)によりチャイニーズハムスター細胞における発現のために最適化された。重鎖の可変部および定常部は、GeneArtにより2つの異なるプラスミドで提供された。受領後、GeneArt構築物を水に可溶化し、重鎖定常領域および重鎖可変領域をKpnIおよびApaI酵素を用いて一緒にクローニングした。この作業は、外部CROにより実施され、融合産物がGlenmarkに引き渡された。この融合構築物の配列決定の後、理論配列と比較した重鎖定常領域の配列の変化がFc領域のCH2ドメインに特定された(EEMTKとDELTK)。メガプライマーPCRによりこの領域を変更するようにプライマーを設計し、オープンリーディングフレームの5’および3’側の好都合な制限部位を同時に導入した。
IgG1フォーマット抗体の重鎖のコード領域を、プライマーGlnPr1518(配列番号11)、GlnPr1519(配列番号12)およびGlnPr1520(配列番号13)ならびに鋳型としてのプラスミドpGLEX41_HC(GSC314、配列番号48)を用いたPCRにより増幅した。得られたPCR産物は、アンプリコンの5’末端および3’末端におけるNheI制限部位を含んでおり、ighg1遺伝子(配列番号65)のNCBIデータベース入力の最後の40bpsならびにHindIII制限部位を正確に含めるために改変した。3’末端の改変は、IgG1重鎖の定常部のC末端領域における天然スプライスドナー部位を再構成するために行った。PCR産物は、制限酵素NheIおよびHindIIIを用いて切断し、同じ酵素およびCIPedを用いて切断したpGLEX41(GSC281、配列番号304)にクローニングした。得られたベクターは、pGLEX41_HC-AS(プラスミドバッチ番号GSC3836、配列番号287)と呼び、制限消化および配列解析により確認した。
選択的スプライシング構築物におけるM1M2膜貫通領域をヒトT細胞受容体アルファ(PTCRA)遺伝子の膜貫通ドメインに置き換えるために、相補的プライマーGlnPr1799(配列番号28)およびGlnPr1735(配列番号26)をインサート断片の作製に用いた。これらのプライマーは、部分的に重複しており、PCRを用いて二本鎖DNAに完成させた。インサート断片をAgeIおよびBstBIを用いて切断し、同じ酵素で消化し、CIPで処理したpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)の主鎖にクローニングした。インサートの一部が、得られた小規模調製物から欠落していたので、この小規模調製物についてプライマーGlnPr1799(配列番号28)およびGlnPr269(配列番号1)を用いて新たな増幅を実施した。増幅されたインサート断片をAgeIおよびBstBIで消化し、同じ酵素で消化し、CIPで処理したpGLEX41_HC-I4(0Y)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4398、配列番号37)の主鎖にクローニングした。1つの小規模調製物を配列決定により確認し、プライマーGlnPr1840(配列番号31)およびGlnPr269(配列番号1)を用いた別のPCRに用いた。アンプリコンをAgeIおよびBstBIで消化し、同じ酵素で消化し、CIPで処理したpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)、pGLEX41_HC-I4(0Y)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4398、配列番号37)、pGLEX41_HC-I4(ポリA)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4401、配列番号38)およびpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2-SV40ter(GSC4402、配列番号39)の主鎖にクローニングした。ライゲーションにより、それぞれ中規模調製物pGLEX41_HC-I4-PTCRA(GSC5854、配列番号40)、pGLEX41_HC-I4(0Y)-PTCRA(GSC5855、配列番号41)、pGLEX41_HC-I4(ポリA)-PTCRA(GSC5857、配列番号42)およびpGLEX41_HC-I4-PTCRA-SV40ter(GSC5856、配列番号43)がそれぞれ得られた。すべての中規模調製物を配列決定により検証した。
M1M2-PTCRA融合構築物をコードするインサートは、GeneArt_Seq32(配列番号64)という名称でGeneArtに発注した。この断片は、T細胞受容体アルファサブユニット(PTCRA)の膜貫通ドメインにより置換された膜貫通ドメインを除いて、IgG1重鎖の正規のM1M2膜貫通領域を含む。GeneArtにより提供されたプラスミドを制限酵素AgeIおよびBstBIを用いて切断し、精製したインサートは、同じ酵素で消化し、CIPで処理した、pGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)、pGLEX41_HC-I4(0Y)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4398、配列番号37)、pGLEX41_HC-I4(ポリA)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4401、配列番号38)およびpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2-SV40ter(GSC4402、配列番号39)の主鎖にそれぞれライゲートした。ライゲーションにより、中規模調製物pGLEX41_HC-I4-M1M2-PTCRA-M1M2(GSC6030、配列番号44)、pGLEX41_HC-I4(0Y)-M1M2-PTCRA-M1M2(GSC6048、配列番号45)、pGLEX41_HC-I4(ポリA)-M1M2-PTCRA-M1M2(GSC6047、配列番号46)およびpGLEX41_HC-I4-M1M2-PTCRA-M1M2-SV40ter(GSC6046、配列番号47)が得られた。すべての中規模調製物を配列決定により確認した。
膜貫通領域をマウスB7-1遺伝子の膜貫通領域に変えるために、融合PCRを実施した。最初に、マウスB7-1膜貫通領域をコードする配列を社内構築物(GeneArt_Seq43としてGeneArtに発注した、配列番号66)からプライマーGlnPr2100(配列番号33)およびGlnPr2101(配列番号34)を用いてPCRにより増幅した。ベクターpGLEX41_HC-I4(0Y)-B7-B7-B7のクローニングのために、cTNT-I4(0Y)をコードする断片を鋳型pGLEX41_HC-I4(0Y)-M1M2-M1M2-M1M2(GSC4398、配列番号37)からプライマーGlnPr1516(配列番号9)およびGlnPr2102(配列番号35)を用いてPCRにより増幅した。マウスB7-1膜貫通領域をコードする配列を社内構築物(GeneArt_Seq43としてGeneArtに発注した、配列番号66)からプライマーGlnPr2100(配列番号33)およびGlnPr2101(配列番号34)を用いてPCRにより増幅した。両PCR産物をプライマーGlnPr1516(配列番号9)およびGlnPr2100(配列番号33)を用いて融合させた。得られたPCR産物をBstBIおよびHindIIIで消化し、同じ酵素で消化し、CIPで処理したpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、pGLEX41_HC-I4(0Y)-B7-B7-B7の中規模調製物を生成させ、バッチ番号GSC7057を付与し、制限消化および配列決定により確認した(配列番号53)。
マウスB7-1膜貫通領域を用いたキメラタンパク質の膜表示が高度に効率的であることが示された(Chou W-Cら、(1999) Biotechnol Bioeng、65巻、160~9頁;Liao K-Wら、(2001) Biotechnol Bioeng、73巻、313~23頁)。スプライスアクセプターのポリ(Y)トラクトにおけるYsの量を0に減少させることにより、細胞膜上の表示抗体の量が著しく低下したことも本明細書で示された(実施例3における図6F参照)。
膜表示に対する膜貫通ドメインの影響を評価するために、いくつかの構築物を設計した。主として疎水性残基を含む膜貫通らせんは、表面表示の安定化のために有利であると考えられ、したがって、第1のアプローチとして、B7-1膜貫通領域のB7-1膜貫通ドメインを疎水性残基のみを含む他のタンパク質の膜貫通ドメインにより置換した。さらに、膜貫通らせんの長さが表面表示に対して影響を与えうるので、これらの第1の構築物は、B7-1膜貫通ドメインと同様の長さを有する膜貫通ドメインのみから構成されていた。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表4に要約する。
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-ACVL1-B7 GSC11213(配列番号81)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-ANTR2-B7 GSC11214(配列番号82)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-CD4-B7 GSC11210(配列番号83)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-PTPRM-B7 GSC11205(配列番号84)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-TNR5-B7 GSC11217(配列番号85)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-ITB1-B7 GSC11756(配列番号86)
疎水性残基のみを含む膜貫通ドメインが表面表示に対する影響を有さない(実施例4における図10参照)ので、B7-1膜貫通ドメインと同様の長さを有するが、1つまたは複数の荷電および/または極性残基を含む他の膜貫通ドメインを選択した。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表6に要約する。
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-1B07-B7 GSC11296(配列番号87)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-IGF1R-B7 GSC11295(配列番号88)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-TRBM-B7 GSC11390(配列番号89)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-IL4RA-B7 GSC11391(配列番号90)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-LRP6-B7 GSC11392(配列番号91)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-GpA-B7 GSC11397(配列番号92)
PTCRA膜貫通ドメインは、21アミノ酸長であり、そのうちの3アミノ酸は、荷電残基である。これらの荷電残基の存在は、表面表示システムにおけるこの特定の膜貫通ドメインの相対的な不良な性能の説明となりうる(実施例4における図11参照)。したがって、これらの残基の疎水性アミノ酸バリンへの突然変異は、表面表示に関して有益でありうる。
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_R8V-B7 GSC11216(配列番号94)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_K13V-B7 GSC11203(配列番号95)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_D18V-B7 GSC11211(配列番号96)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_R8V_K13V-B7 GSC11212(配列番号97)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_R8V_D18V-B7 GSC11398(配列番号98)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_K13V_D18V-B7 GSC11208(配列番号99)
pGLEX41_HC-I4-B7-PTCRA_R8V_K13V_D18V-B7 GSC11291(配列番号100)
膜貫通ドメインにおける荷電および残基の存在が表面表示を消失させない(実施例4における図12参照)ことから、B7-1膜貫通ドメインより短くもしくは長く、今回は1つもしくは複数の荷電および/または極性残基を含む膜貫通ドメインを用いて膜貫通ドメインの長さを評価した。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表9に要約する。
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-FCERA-B7 GSC11297(配列番号101)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-KI2L2-B7 GSC11298(配列番号102)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-IL3RB-B7 GSC11393(配列番号103)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-CD3E-B7 GSC11394(配列番号104)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-ITA2B-B7 GSC11395(配列番号105)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-CD28-B7 GSC11396(配列番号106)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-M1M2-B7 GSC11389(配列番号107)
表面表示に対する膜貫通長の影響を評価するために、B7-1膜貫通ドメイン配列の中央部における疎水性残基を除去または追加することにより、B7-1膜貫通ドメインの種々の変異体を作製した。
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7(18)-B7 GSC11677(配列番号108)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7(20)-B7 GSC11679(配列番号109)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7(24)-B7 GSC11484(配列番号110)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7(26)-B7 GSC11292(配列番号111)
細胞質ゾル側末端(ER輸出シグナルを含むまたは含まない)は、表面表示に対する影響を有しうるので、改変細胞質ゾル側末端を有するいくつかの構築物を設計した。これらの細胞質ゾル側末端の配列および特性を表12に要約する。
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7-6His GSC11207(配列番号112)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7-KCFCK GSC11209(配列番号113)
pGLEX41_GBR200HC-I4-B7-B7-GATlnoER GSC11483(配列番号118)
軽鎖インサート(0704970pGA4)を有するGeneArtから提供されたクローニングベクターを、プライマーGlnPr501(配列番号4)およびGlnPr502(配列番号5)を用いたPCRの鋳型として用いた。これらのプライマーは、軽鎖のオープンリーディングフレームを増幅し、オープンリーディングフレームにHindIII制限部位5’およびXbaI制限部位3’を付加する。アンプリコンをXbaIおよびHindIIIで消化し、XbaIおよびHindIIIを用いて切断したシャトルベクターにライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、ギガレベルの調製物を生成させ、これを配列決定および消化により確認した。IgG1フォーマットの抗体の軽鎖のコード領域をこのギガレベルの調製物からXbaIおよびHindIIIで切断し、同じ酵素で開き、CIPで処理したプラスミドpGLEX41(GSC281、配列番号304)の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、pGLEX41_LCの大規模調製物を生成させ、バッチ番号GSC315(配列番号294)を付与し、配列決定により確認した。その後、同じDNAのいくつかのバッチを中規模調製物またはギガレベルの調製物レベルで生成させ、バッチ番号GSC315a、GSC315b、GSC315c、GSC315dおよびCGC315eを付与した(すべてのこれらの調製物が配列決定により確認されたので、それらを以下でGSC315プラスミドと呼ぶものとする(配列番号294))。
IgG4重鎖をコードする配列をGlenmarkにおいて作製し、シャトルベクターで受け取った。IgG4重鎖コード配列をプライマーGlnPr1488(配列番号328)およびGlnPr1452(配列番号327)を用いたPCRにより増幅した。精製後、得られたPCR産物をプライマーGlnPr1494(配列番号260)およびGlnPr1452(配列番号327)を用いて再増幅した。これらの2ラウンドのPCRにより、リーダーペプチドが改変され、コード配列の両末端に制限部位が付加される。得られたPCR産物を精製し、シャトルベクターpCR-blunt(Zero Blunt(登録商標)PCR Cloningキット、Invitrogen、LifeTechnology)にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、陽性クローンをSpeIおよびClaIで消化して、IgG4重鎖コード配列を抽出した。得られたインサートをNheIおよびBstBIで消化し、CIPで処理したpGLEX41(GSC281、配列番号304)にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、ギガレベルの調製物pGLEX41_IgG4-HCを生成させ、プラスミドバッチ番号GSB59を付与し、配列決定により確認した(配列番号79)。
膜結合IgG4の発現のための選択的スプライシングカセットの付加のために、IgG4重鎖のコード配列をプライマーGlnPr1494(配列番号260)およびGlnPr2294(配列番号261)を用いたPCRによりpGLEX41_IgG4-HC(GSB59、配列番号79)を鋳型として用いて増幅した。得られたPCR産物をクリーンアップし、SpeIおよびHindIIIで消化し、NheIおよびHindIIIで消化し、CIPで処理したpGLEX41_HC-I4-B7-B7-B7(GSC7056、配列番号55)主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物pGLEX41_IgG4-HC-B7-B7-B7を調製し、これにプラスミドバッチ番号GSC11218を付与し、配列決定により確認した(配列番号80)。
IgG4軽鎖をコードする配列をGlenmarkにおいて作製し、シャトルベクターで受け取った。3種のプライマーGlnPr1487(配列番号325)、GlnPr1491(配列番号326)およびGlnPr1494(配列番号260)を用いた単一ラウンドのPCRを用いて、リーダーペプチドを交換し、制限部位をコード配列の両末端に付加した。PCR産物をSpeIおよびClaIで消化し、NheIおよびBstBIで開き、CIPで処理したpGLEX41(GSC281、配列番号304)主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物pGLEX41_IgG4-LCを生成させ、プラスミドバッチ番号GSC3704を付与し、配列決定により確認した(配列番号319)。
二重特異性抗体の重鎖を二重特異性BEAT(登録商標)フォーマットの一部としてGlenmarkにおいて作製した。2ラウンドのPCRを用いて、コザック配列、シグナルペプチドおよびフランキング制限部位を付加した。第1ラウンドにおいて、プライマーGlnPr1726(配列番号24)およびGlnPr1500(配列番号7)を用いて鋳型を増幅した。PCR産物を精製し、プライマーGlnPr1500(配列番号7)およびGlnPr1725(配列番号23)を用いた第2ラウンドのPCRの鋳型として用いた。得られたアンプリコンを精製し、制限酵素SpeIおよびClaIを用いて切断した。このインサートを、NheIおよびBstBIを用いて開き、CIPで処理した主鎖pGLEX41(GSC281、配列番号304)にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、pGLEX41_BEAT-HC-Hisを中規模調製物規模で生成させ、バッチ番号GSC5607(配列番号296)を付与した。配列決定管理および制限消化により、プラスミドを確認した。このプラスミドは、鋳型配列からのHisタグの除去のためのプライマーGlnPr1725(配列番号23)およびGlnPr1760(配列番号27)を用いた改変PCRの鋳型として用いた。アンプリコンをSpeIおよびClaIで消化し、制限酵素NheIおよびBstBIを用いて開き、CIPで処理した、ベクターpGLEX41(GSC281、配列番号304)の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物pGLEX41_BEAT-HCにプラスミドバッチ番号GSC5644を付与し、配列決定により確認した(配列番号49)。
BEAT重鎖をコードする鋳型ベクター(GSC5644、配列番号49)をプライマーGlnPr1800(配列番号29)およびGlnPr1725(配列番号23)を用いて増幅した。精製産物を制限酵素SpeIおよびHindIIIを用いて消化し、酵素NheIおよびHindIIIを用いて開き、CIPで処理したベクターpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物pGLEX41_BEAT-HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2にプラスミドバッチ番号GSC5537(配列番号50)を付与し、制限消化および配列決定により確認した。
scFv-Fc配列を二重特異性BEAT(登録商標)フォーマットの一部として社内で開発した。増幅は、プライマーGlnPr1690(配列番号22)、GlnPr1689(配列番号21)およびGlnPr1502(配列番号8)を用いて実施した。これらのプライマーは、コザック配列、シグナルペプチドおよび制限部位をアンプリコンに付加する。PCR産物をプライマーGlnPr1689(配列番号21)およびGlnPr1502(配列番号8)を用いて再増幅し、得られたアンプリコンをNheIおよびClaIを用いて消化した。このインサート断片を、NhelおよびBstBIを用いて切断し、CIPで処理した主鎖pGLEX41(GSC281、配列番号304)とライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、バッチ番号GSC5608(配列番号51)を有する中規模調製物pGLEX41_scFv-Fcを生成させ、制限消化および配列決定により確認した。
scFvをコードする鋳型ベクター(GSC5608、配列番号51)をプライマーGlnPr1801(配列番号30)およびGlnPr1689(配列番号21)を用いて増幅した。精製産物をNheIおよびHindIIIで消化し、同じ酵素を用いて開き、CIPで処理したベクターpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(GSC3899、配列番号36)にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、プラスミドバッチ番号GSC5538(配列番号52)を有する中規模調製物pGLEX41_scFv-Fc-I4-M1M2-M1M2-M1M2を生成させ、制限消化および配列決定により確認した。
軽鎖配列を二重特異性BEAT(登録商標)フォーマットの一部として社内で構築した。増幅は、プライマーGlnPr1689(配列番号21)、GlnPr1727(配列番号25)およびGlnPr1437(配列番号6)を用いて実施した。これらのプライマーは、シグナルペプチド、コザック配列およびフランキング制限部位をアンプリコンに付加する。アンプリコンを精製し、制限酵素ClaIおよびNheIを用いて消化し、NheIおよびClaIで開き、CIPで処理したシャトルベクターの主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物を調製し、配列決定により検証した。二重特異性構築物の軽鎖をコードするこのシャトルベクターを制限酵素NheIおよびClaIを用いて消化し、NheIおよびBstBIで開き、CIPしたベクターpGLEX41(GSC281、配列番号304)にインサートをクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、pGLEX41_BEAT-LCの中規模調製物を調製し(プラスミドバッチ番号GSC5540、配列番号302)、プラスミドを制限消化および配列決定により確認した。
導入
実施例1では、分泌タンパク質またはC末端膜貫通領域(TM)を有する同じタンパク質をコードする、同じDNA鋳型からの2つの異なるmRNAの発現をもたらす選択的スプライシング構築物のクローニングを述べた。定義の項で詳述したように、膜貫通領域は、任意選択のリンカー、膜貫通ドメインおよび任意選択の細胞質ゾル側末端を含む。これらの構築物は、標的タンパク質の効率的な分泌を維持しながら、この技術を細胞膜上にタンパク質の一部を表示するために用いることができるかどうかを判定するためにCHO-S細胞にトランスフェクトした。IgG1サブクラスの抗体、IgG4サブクラスの抗体およびBEAT(登録商標)フォーマットの二重特異性抗体の3種のタンパク質をこの実験に用いた。
トランスフェクション
懸濁CHO-S細胞に、50mlバイオリアクターチューブ(Tubespins、TPP)方式でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection、Illkirch、France)を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を5mLのOptiMEM培地(#31985-047、Invitrogen)またはCD-CHO培地(#10743-011、Life Technologies)中に2 E6個細胞/mLの密度で播種した。JetPEI(登録商標):DNA複合体を細胞に3(μg/μg)の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終DNA濃度は、2.5μg/mLであった。振盪しながら(200rpm)37℃で5時間インキュベートした後、5mLの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で37℃、5%CO2および80%湿度でインキュベートした。
細胞の表面染色をトランスフェクション後1日目に実施した。合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(PBS中2%FBS)で2回洗浄し、次いで、検出抗体を含む100μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。カッパ軽鎖の特異的検出は、マウス抗ヒトカッパ軽鎖APC標識抗体(#561323、BD Pharmingen)を用いて実施し、赤色レーザー(640nm)により励起し、スペクトル範囲661/19nmで検出した。重鎖およびscFv-Fcの両方は、PEコンジュゲートヤギ抗ヒトFcガンマ特異抗体(#12-4998-82、eBioscience)を用いて、青色レーザー(488nm)により励起し、スペクトル範囲583/26nmで検出した。scFv-Fcは、FITC標識プロテインA(#P5145、Sigma)を用いて、青色レーザーにより488nmで励起し、スペクトル範囲525/30で特異的に検出した。暗所で室温で20分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために200μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をGuavaフローサイトメーター(Merck Millipore)またはFACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Octet QK機器(Fortebio、Menlo Park、CA)およびプロテインAバイオセンサーを用いてトランスフェクション後4~6日目に測定した。
IgG1抗体発現のために、軽鎖を発現する発現ベクターpGLEX41_LC(配列番号294)およびそれぞれpGLEX41_HC-I4-B7-B7-B7(配列番号55)、pGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(配列番号36)、pGLEX41_HC-I4-PTCRA(配列番号40)またはpGLEX41_HC-I4-M1M2-PTCRA-M1M2_corrected(配列番号284)という名称の第2のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにCHO-S細胞をトランスフェクトした。対照として、分泌重鎖をコードする非スプライシング構築物を用いた(配列番号48)。
これらの結果に基づいて、選択的スプライシング構築物が産生された抗体の一部を選択的スプライシングにより細胞膜に成功裏に偏向させたと結論することができる。表面染色は、PTCRA膜貫通ドメインを含む構築物で低かったが、染色は、M1M2膜貫通領域を含む構築物をトランスフェクトした細胞で高く、B7-1膜貫通領域を含む構築物でさらにより高かった。シグナル強度に加えて、M1M2膜貫通領域がB細胞の進化中の抗体の効率的な膜表示のために選択され、したがって、免疫グロブリンの膜表示のための最も効率的な構築物であることを考慮すると、染色されうる細胞集団の百分率は、B7-1構築物によるトランスフェクションで驚くべきほど高かった。
導入
実施例2で実証されたように、膜貫通領域の選択的スプライシングにより、さもなければ正常に分泌される抗体の一部が細胞表面に転送される。それにもかかわらず、分泌過程のこの改変は、抗体の分泌レベルに対する負の影響を有しうる。分泌抗体と膜表示抗体との間のスプライシング比を微調整することは、非スプライス抗体構築物(選択的スプライシング膜貫通領域を含まない)で認められる発現レベルに回復する助けとなりうる。これは、以下の実施例で実証される。
トランスフェクション
懸濁CHO-S細胞に、50mlバイオリアクターチューブ(Tubespins、TPP)方式でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection、Illkirch、France)を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を5mLのOptiMEM培地(#31985-047、Invitrogen)中に2 E6個細胞/mLの密度で播種した。JetPEI(登録商標):DNA複合体を細胞に3(μg/μg)の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終DNA濃度は、2.5μg/mLであった。振盪しながら(200rpm)37℃で5時間インキュベートした後、5mLの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で37℃、5%CO2および80%湿度でインキュベートした。
細胞の表面染色をトランスフェクション後1日目に実施した。合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(PBS中2%FBS)で2回洗浄し、次いで、検出抗体を含む100μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。重鎖の特異的検出は、PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体(#512-4998-82、eBioscience)を用いて、青色レーザー(488nm)により励起し、スペクトル範囲583/26nmで実施した。暗所で室温で20分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために200μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をGuavaフローサイトメーター(Merck Millipore)またはFACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Octet QK機器(Fortebio、Menlo Park、CA)およびプロテインAバイオセンサーを用いてトランスフェクション後4~6日目に測定した。
軽鎖を発現する発現ベクターpGLEX41_LC(配列番号294)およびM1M2膜貫通ドメイン(配列番号36~39)、PTCRA膜貫通ドメイン(配列番号40~43)、M1M2-PTCRA融合膜貫通ドメイン(配列番号44~47)またはB7-1膜貫通ドメイン(配列番号53~56)を含む、重鎖をコードし、改変型のイントロンを含む第2のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにCHO-S細胞をトランスフェクトした。対照として、選択的スプライシングを用いない分泌重鎖を用いた(配列番号48)。
ガストリンターミネーターは、とりわけM1M2構築物について細胞膜上のIgGに陽性に染色された細胞の割合を増加させたが、標準構築物と比較して分泌IgGのより高い発現をもたらさなかった。イントロンにおける付加的なポリ(A)の挿入は、構築物M1M2における膜表示抗体の割合を増加させた(B7-1については結論を引き出すことができなかった)。付加的なポリ(A)を含むM1M2構築物は、高いレベルの分泌IgGも示した(非スプライス対照構築物の発現の最大80%)。
Galli GI、Guise J、Tucker PW、Nevins JR (1988)、Poly(A) site choice rather than splice site choice governs the regulated production of IgM heavy-chain RNAs、Proc Natl Acad Sci USA、4月、85巻(8号)、2439~43頁
導入
細胞により産生される抗体の一部の膜表示のための選択的スプライシングシステムは、膜貫通領域の特性によって改変される可能性がある。例えば、膜貫通ドメインの長さおよび構造が膜表示の有効性に影響を及ぼしうることを推測することができよう。さらに、膜貫通領域の細胞質ゾル側末端は、ER輸出シグナルの存在または非存在によって細胞表面表示に影響を及ぼしうる。以下の実施例では、我々は、膜貫通ドメインのアミノ酸組成も、その長さも、膜貫通領域の細胞質ゾル側末端も、表面表示および分泌に対する重大な影響を有しないことを示す。
トランスフェクション
懸濁CHO-S細胞に、50mlバイオリアクターチューブ(Tubespins、TPP)方式でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection、Illkirch、France)を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を5mLのOptiMEM培地(#31985-047、Invitrogen)中に2 E6個細胞/mLの密度で播種した。JetPEI(登録商標):DNA複合体を細胞に3(μg/μg)の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終DNA濃度は、2.5μg/mLであった。振盪しながら(200rpm)37℃で5時間インキュベートした後、5mLの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で37℃、5%CO2および80%湿度でインキュベートした。
細胞の表面染色をトランスフェクション後1日目に実施した。合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(PBS中2%FBS)で2回洗浄し、次いで、検出抗体を含む100μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。重鎖の特異的検出は、PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体(#512-4998-82、eBioscience)を用いて、青色レーザー(488nm)により励起し、スペクトル範囲583/26nmで検出した。暗所で室温で20分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために200μLの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をGuavaフローサイトメーター(Merck Millipore)またはFACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Octet QK機器(Fortebio、Menlo Park、CA)およびプロテインAバイオセンサーを用いてトランスフェクション後4~6日目に測定した。
軽鎖を発現する発現ベクターpGLEX41_LC(配列番号294)および異なる膜貫通領域を含む重鎖をコードする第2のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにCHO-S細胞をトランスフェクトした。対照として、選択的スプライシングを用いない分泌重鎖を用い(配列番号48)、B7-1膜貫通領域を含む構築物(配列番号55)を陽性対照として用いた。
細胞表面表示および抗体分泌レベルに対する膜貫通ドメインの影響を解析するために、B7-1膜貫通ドメインを疎水性残基のみを含む同様の長さ(22~23アミノ酸)の膜貫通ドメイン(配列番号81~86参照)により置き換えた。膜貫通ドメインの交換は、抗体の細胞表面表示または分泌に対する影響を有さなかった(図10参照)。
文献で、B7-1細胞質ゾル側末端における構造的非線状ER輸出シグナルの存在が示唆されている(Linら、2013)。著者らは、細胞表面に向けての膜貫通タンパク質の細胞質ゾルドメインにおけるER輸送シグナルの存在は、細胞表面上のタンパク質の量に対する正の影響を有しうることを見いだした。高い代謝回転を有するタンパク質の場合、ERから膜への加速輸出が原形質膜からのタンパク質分解性切断を補いうる。
総合すると、データから、我々の選択的スプライシングシステムにおける膜貫通ドメインの長さまたはアミノ酸組成は、抗体の分泌レベルおよび細胞膜上の産物表示に対して軽微な影響を与えたにすぎなかったことが示唆される。選択的スプライシングシステムの微調整に用いられる可能性がある、分泌産物と膜表示産物との比のわずかな変化が認められた。構築物のすべてが、抗体の有意な表面表示を、および適切な分泌レベルシフトも、もたらした。興味深いことに、細胞表面表示の蛍光レベルに対する膜貫通ドメインの大きな影響が認められた。疎水性アミノ酸の存在または非存在は、平均蛍光の制御を可能にするものであったが、分泌レベルまたは細胞表面表示を示す細胞の百分率に影響を及ぼさなかった。
Lin Y.、Chen B.、Wei-Cheng Lu W. Chien-I Su C.、Prijovich Z.、Chung W.、Wu P.、Chen K.、Lee, I.、Juan T.およびRoffler, S. (2013). The B7-1 Cytoplasmic Tail Enhaces Intracellular Transport and Mammalian Cell Surface Display of Chimeric Proteins in the Absence of a Linear ER Export Motif PLoS One. 9月20日、8巻(9号)
Baeza-Delgado, C1、Marti-Renom, MA、Mingarro, I. (2012). Structure-based statistical analysis of transmembrane helices. Eur Biophys J. 2013年3月、42巻(2~3号)、199~207頁
White, SHおよびWimley、 WC (1999). Membrane protein folding and stability: physical principles. Annu Rev Biophys Biomol Struct.、28巻、319~65頁。
導入
細胞のトランスフェクションは、組換えタンパク質発現のための安定細胞株の樹立のための最初のステップである。多くの理由(不均質な初期細胞集団、ゲノムにおけるプラスミドが組み込まれる遺伝子座が異なること、翻訳後機構が異なることおよび発現のえぴジェネティックな調節)のために、このステップは、一般的に、発現および分泌レベルに関してだけでなく、タンパク質フォールディング、グリコシル化および他の翻訳後修飾のような産物の質の特性に関しても不均質な細胞集団を生じさせる。二重特異性抗体は、すべての可能な組合せでアセンブルしうる最大4つの異なるサブユニット(2つの重鎖および2つの軽鎖)により構成されている。プラスミド組込み、転写および翻訳の調節ならびにERにおけるフォールディングの有効性次第で、特定のクローンは、不要の副産物の代わりに正しくアセンブルされた産物を好ましくは分泌しうる。この所望の分泌パターンを有するクローンの選択は、分泌タンパク質の広範なスクリーニングおよび特性評価を必要とする。目的の産物および最小限の副産物を産生する細胞株を得るために必要なスクリーニングの量を低減することは、大きな進歩であろう。
安定プールの確立
安定トランスフェクトCHO細胞は、二重特異性ヘテロ二量体BEATの発現のための前述のベクターpGLEX41_BEAT-HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(「pHC-M1M2」と略記;配列番号50)、pGLEX41_scFv-Fc-I4-M1M2-M1M2-M1M2(「pscFv-Fc-M1M1」と略記;配列番号52)およびpGLEX41_BEAT-LC(「pLC」と略記;配列番号302)ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための2つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。懸濁CHO-S細胞に、50mlバイオリアクター方式でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、Polyplus-transfection、Illkirch、France)を用いて線状化ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を5mLのOptiMEM培地(#31985-047、Invitrogen)中に2 E6個細胞/mLの密度で播種した。JetPEI(登録商標):DNA複合体を細胞に3(μg/μg)の重量比で加えた。2.5μg/mLの最終DNA濃度を細胞に加えた。振盪しながら(200rpm)37℃で細胞をJetPEI(登録商標):DNA複合体とともに5時間インキュベートした後、5mLの培養培地PowerCHO2(#BE12-771Q、Lonza)を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で37℃、5%CO2および80%湿度でインキュベートした。トランスフェクションの1日後に細胞を、安定なプールの増殖を可能にする濃度のピューロマイシン(#P8833-25mg、Sigma)およびジェネティシン(#11811-098、Gibco)を含む選択培地中に各種濃度(0.7、0.5および0.4 E5個細胞/mL)で96ウエルプレートに播種した。静的条件下での14日間の選択の後に15の生産性安定プールをウエルから採取し、TubeSpinバイオリアクター中に拡大した。
クローンは、二重特異性ヘテロ二量体BEATの発現のための前述のベクターpGLEX41_BEAT-HC-I4-B7-B7-B7(「pHC-B7」と略記、配列番号321)、pGLEX41_scFv-Fc-I4-B7-B7-B7(「pscFv-Fc-B7」と略記、配列番号323)およびpGLEX41_BEAT-LC(「pLC」と略記、配列番号302)ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための2つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。トランスフェクションおよび安定な形質転換体の選択は、前述のように実施した。静的条件下での14日間の選択の後にすべての安定な形質転換体を収集し、プールし、動的条件(オービタル振盪)下で1週間にわたり継代した。単一細胞選別は、パルスプロセシングにより細胞ダブレットを除外した生存細胞においてゲーティングすることによりFACSAriaIIを用いて実施した。
安定細胞上の軽鎖(LC)およびFc断片の二重表面染色は、実施例2で詳細に述べたように回分播種後2日目に実施した。手短かに述べると、合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(2%FBSを含むPBS)で2回洗浄し、次いで100μLの検出抗体中に再懸濁した。カッパ軽鎖の特異的検出は、マウス抗ヒトカッパLC APC標識抗体(#561323、BD Pharmingen)を用いて実施し、Fc断片は、PEコンジュゲートヤギ抗ヒトFcガンマ特異抗体(#12-4998-82、eBioscience)を用いて検出した。暗所で室温で20分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために200μLに再懸濁した。細胞は、Guavaフローサイトメーター(Merck Millipore)を用いて解析した。
この染色のために、細胞表面上に表示された分子の結合アームの検出のための可溶性標的を用いた。手短かに述べると、合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(2%FBSを含むPBS)で2回洗浄し、次いで100μLのビオチニル化標的1およびHisタグ付き標的2の混合物に再懸濁した。暗所で室温で20分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄し、APCとコンジュゲートしたストレプトアビジン(#554067、BD Pharmingen)およびPEで標識した抗Hisタグ抗体(#IC050、RD Systems)を含む100μLの混合物に再懸濁した。暗所で室温で20分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、Guavaフローサイトメーター(Merck Millipore)を用いたフローサイトメトリー解析のために200μLに再懸濁した。
組換えプールは、補足増殖培地(PowerCHO2、2mM L-グルタミン、8mM Glutamax(Life Technologies、Carlsbad、CA)、15%Efficient Feed A(Life Technologies)、15%Efficient Feed B(Life Technologies))中0.5 E6個細胞/mLの細胞密度でTubeSpinsに播種した。クローンは、増殖培地(PowerCHO2、2mM L-グルタミン)中0.5 E6個細胞/mLの細胞密度でTubeSpinsに播種し、ActiCHO Feed A&Bフィード、(#U050-078、PAA Laboratories GmbH)の供給を毎日実施した。回分または流加培養の14日目に上清を遠心分離により収集し、0.2μmシリンジフィルター(#99722、TPP)を用いてろ過した。粗上清を直接分析するか、またはStreamline Protein Aビーズ(#17-1281-02、GE)を用いて精製した。タンパク質をCaliper LabChip GXIIタンパク質アッセイを用いて解析した。異なる種をそれらの分子量により同定し、各産物の割合を決定する。
pHC-M1M2、pScFv-Fc-M1M2およびpLC構築物を用いたトランスフェクションの後に合計15の安定プールが得られた。これらのプールの分泌プロファイルを測定するために補足バッチを開始した。プールにおける軽鎖およびFc断片(scFv-Fcおよび重鎖)の二重表面染色をバッチ播種後2日目に実施した。図19に補足バッチの2日目に二重染色により測定したプールの1つの表面プロファイルの例を示す。ドットプロットは、カッパLC染色の強度(y軸)対ヒトFc染色の強度(x軸)を示す。象限は、陰性染色細胞と陽性染色細胞との間の限界を任意に確定するものである。象限Q8は、細胞膜上にタンパク質を発現しない細胞、例えば、非産生細胞の亜集団の割合を示す。Q7は、Fc断片について陽性であるが、カッパLCについて陰性であり、したがって、細胞膜上にscFv-Fc-DIMを示す細胞に対応する細胞の割合である。Q6における二重陽性細胞は、細胞膜上にLcおよびFc断片の両方、例えば、BEATまたはFab-DIM分子を表示する細胞である。
Q6*=Q6/(Q6+Q7)=23.9%およびQ7*=Q7/(Q6+Q7)=76.1%。
この解析を15のすべての生産性安定プールについて実施し、図20に示す相関に用いた。
この実施例では、細胞膜表示と組み合わせた選択的スプライシング技術は、単一細胞の分泌プロファイルの定性的予測のための有効なリポーターシステムであることが実証された。LCおよびFc表面検出に基づく一般的検出方法または分子の可溶性標的を含む産物特異染色法を用いてトランスフェクト細胞の細胞膜表示パターンと実際の分泌プロファイルとの間の明らかな相関が見いだされた。該アプローチは、回分または流加培養中の細胞の能力の時間のかかるスクリーニングも、分泌産物の収集、精製および広範な特性評価も必要としない。
導入
細胞株の開発プロセスの主要な課題は、例えば、良質の組換えタンパク質の高分泌速度を得るための、高能力クローンの時間効果的な選択である。選択的スプライシングによる発現タンパク質の一部の細胞膜表示がクローンの実際の定性的分泌プロファイルを示すことが上で実証された。この実施例では、細胞膜表示のレベルがクローンの分泌レベルと定量的に相関すること、および表面表示の強度に基づいて高生産性細胞を選択することができることを実証すこととする。
安定細胞株の開発
安定トランスフェクトCHO細胞は、ヒト化IgG1抗体の発現のためのベクターpGLEX41_HC-I4-M1M2-M1M2-M1M2(配列番号36)およびpGLEX41_LC(配列番号294)ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための2つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。
補足バッチを2mM L-グルタミン、8mM Glutamax、15%Efficient Feed A(#A1023401、Invitrogen)および15%Efficient FeedB(#A1024001、Invitrogen)を添加したPowerCHO2(#BE12-771Q、Lonza)中に0.5E6個細胞/mLの細胞密度で播種した。生存細胞数(VCC)および生存能をGuavaフローサイトメーターのViaCountアッセイを用いて1、3および7日目にモニターした。IgG力価をOctet QK機器を用いて1、3および7日目に測定した。安定プールの比生産性qPを1日目から3日目の間に以下の式により計算した。
qP=比分泌速度または生産性[pg/細胞/日]
IgG=3日目および1日目のIgG力価「pg/mL」
t=培養時間[日]
VCCmeand1-d3=1日目から3日目までの平均生存細胞数[細胞/mL]。
安定プール上のFc断片の染色は、バッチ播種後1日目に実施した。手短かに述べると、合計1 E5個の細胞を収集し、96ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液(PBS中2%FBS)で2回洗浄し、次いで、100μLの検出抗体に再懸濁した。Fc断片の特異的検出は、PEコンジュゲートヤギ抗ヒトFcガンマ特異抗体(#12-4998-82、eBioscience)を用いて実施した。暗所で室温で20分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために200μLに再懸濁した。細胞をGuavaフローサイトメーターを用いて解析した。
クローンは、前述のように確立した安定形質転換体の不均質なプール(「安定細胞株の開発」の項参照)からフローサイトメトリー細胞選別により得た。この目的のために、Fc断片の表面染色を前述のプロトコールに従って実施した。選別は、パルスプロセシングにより細胞ダブレットを除外した生存細胞においてゲーティングすることによりFACSAria IIを用いて実施した。3つのゲートを表面蛍光強度(「低」、「中」および「高」)に従って定義し、単一細胞を200μLのクローニング培地を含む96ウエルプレートに分配した。静的条件下での2週間の増殖の後、細胞を動的条件下で拡大し、選択されたクローンの能力を前述のように評価した。
安定プールの表面染色プロファイルの解析を図23に示す。領域g1(図23、プロファイルA)におけるゲーティングされた生存細胞の表面蛍光をヒストグラム(図23、プロットB)として表示し、分布の平均蛍光(平均[RFU])を計算した。平均蛍光は、細胞膜上に発現したIgGレベルの尺度として用いた。この解析は、すべての得られた安定プールについて実施し、表面IgGのレベルを上清において測定した分泌IgGの実際のレベルと比較した。
この実施例では、細胞膜上に選択的スプライシングにより発現するIgGのレベルが組換え細胞の実際の分泌レベルをレポートするものであることが実証された。産物の特異的に検出後の細胞膜蛍光は、上清中の蓄積IgG濃度およびトランスフェクト安定細胞のqPと相関する。また該相関は、回分生産工程の段階にかかわりなく、有効であったことが実証された。総合すると、これらのデータにより、組換え細胞の定量的分泌レベルは、本明細書で述べた選択的スプライシング表面表示リポーターシステムにより予測することができることが示された。これは、フローサイトメトリー細胞選別を用いて細胞表面上に表示されたIgGの密度に従ってクローンを選択することによって確認された。実際、高産生細胞をこのアプローチを用いて選択することができ、産業上適切な比生産性を示すクローンを時間効率的に得ることができた。
Claims (15)
- 5’から3’方向に、
プロモーターと、
目的のポリペプチドをコードする第1のエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第1の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
改変もしくは非改変非免疫グロブリン膜貫通領域から選択される膜貫通領域をコードする第2のエクソンと、
第2の停止コドンと、
ポリ(A)部位と
を含む発現構築物であって、
前記非免疫グロブリン膜貫通領域は、配列番号173のマウスB7-1膜貫通領域であり、
宿主細胞に侵入すると、前記第1および第2のエクソンが転写されることにより、目的のポリペプチドが発現され、所定割合の目的のポリペプチドが宿主細胞膜上に表面表示される、発現構築物。 - 前記イントロンがポリ(A)部位を含む、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記イントロンのスプライスアクセプター部位がポリ(Y)トラクトを含み、ポリ(Y)トラクトのY含量が、それにおけるピリミジン塩基の数を変更することにより改変される、請求項1または2に記載の発現構築物。
- 少なくとも1つの分岐点領域を含み、前記少なくとも1つの分岐点領域の配列が、分岐点領域の共通配列CTRAYY(配列番号347)に関して改変されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の発現構築物。
- イントロンのスプライスドナー部位の共通配列が改変されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 目的のポリペプチドが抗体重鎖またはその断片を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の発現構築物。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むクローニングまたは発現ベクター。
- 請求項8に記載の1つまたは複数のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
- 抗体重鎖の発現のための請求項6に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および抗体軽鎖の発現のための発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項9に記載の宿主細胞。
- 抗体重鎖の発現のための請求項6に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、scFV-Fcの発現のための請求項5に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および抗体軽鎖の発現のための発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項9に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを産生する方法であって、培養物中で請求項9から11のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から発現したポリペプチドを単離することとを含む、方法。
- 目的のポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する方法であって、
(i)請求項1に記載の発現構築物を宿主細胞にトランスフェクトすることと、
(ii)目的のポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
(iii)目的のポリペプチドの細胞膜発現を検出することと、
(iv)所望の発現レベルで細胞膜の表面上に目的のポリペプチドを表示する宿主細胞を選択することと
を含む、方法。 - 目的のヘテロ多量体ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する方法であって、
(i)目的の第1のポリペプチドをコードする少なくとも1つの請求項1に記載の発現構築物および目的の第2のポリペプチドをコードする請求項1に記載の発現構築物を宿主細胞にコトランスフェクトすることと、
(ii)目的のヘテロ多量体ポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
(iii)目的のヘテロ多量体ポリペプチドの細胞膜発現を検出することと、
(iv)所望の発現レベルで細胞膜の表面上に所望の目的のヘテロ多量体ポリペプチドを表示する宿主細胞を選択することと
を含む、方法。 - 二重特異性抗体を発現する宿主細胞を選択する方法であって、
(i)抗体重鎖をコードする請求項1に記載の発現構築物、scFV-Fcをコードする請求項1に記載の発現構築物および抗体軽鎖をコードする発現構築物を宿主細胞にコトランスフェクトすることと、
(ii)二重特異性抗体を発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
(iii)二重特異性抗体の細胞膜発現を検出することと、
(iv)所望の発現レベルで細胞膜の表面上に所望の二重特異性抗体を表示する宿主細胞を選択することと
を含む、方法。
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