CN116323954A - 表达免疫调节融合蛋白的溶瘤病毒 - Google Patents

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Abstract

描述了产生和分泌新型免疫调节融合蛋白的重组溶瘤病毒。所述融合蛋白编码与PD‑1或PD‑L1特异性结合的单链可变片段抗体(ScFv)，所述ScFv通过抗体Fc区与TGFβ受体II的胞外结构域(TGFβRIIecto)融合。所述免疫调节融合蛋白具有双重功能：阻断由PD‑1/PD‑L1介导的抑制通路和阻断TGFβ的免疫抑制活性。另外，提供了双基因溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，除了编码ScFv‑Fc‑TGFβRIIecto融合蛋白的基因之外，所述双基因溶瘤HSV还包括编码IL12，一种T细胞刺激因子的基因。

Description

表达免疫调节融合蛋白的溶瘤病毒
本专利申请要求于2020年6月26日提交的美国临时申请63/044,818的优先权，所述美国临时申请的内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2021年6月23日的所述ASCII副本命名为087735_0140_SL.txt并且大小为126,354字节。
技术领域
本发明涉及被工程化以表达调节免疫应答的蛋白质的溶瘤病毒以及所述溶瘤病毒在治疗癌症中的用途。更具体地，本公开提供了重组溶瘤单纯疱疹病毒，所述重组溶瘤单纯疱疹病毒包括编码抑制免疫系统调节因子的蛋白质的基因构建体。
背景技术
溶瘤病毒是选择性感染和裂解癌细胞的病毒。溶瘤病毒已经成为用于治疗各种癌症的临床试验的对象，所述癌症包括黑色素瘤、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌(Aghi和Martuza(2005)《癌基因(Oncogene)》24:7802-7816)。多个临床试验已经证明了通过缺失至少一个拷贝的编码ICP34.5的基因而在正常细胞中复制的能力弱化的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)的安全性(Rampling等人(2000)《基因疗法(GeneTherapy)》7:859-866；Papanastassiou等人(2002)《基因疗法》9:398-406；Makie等人(2001)《柳叶刀(Lancet)》357:525-526；Markert等人(2000)《基因疗法》7:867-874；Markert等人(2009)《分子疗法(Molecular Therapy)》17:199-207；Senzer等人(2009)《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》27:5763-5771)。
除了通过裂解癌细胞直接攻击肿瘤之外，溶瘤HSV可以在患者体内诱导抗肿瘤免疫应答(Papanastassiou等人(2002)；Markert等人(2009)；Senzer等人(2009))，因为病毒抗原在受感染癌细胞上表达，并且当癌细胞被裂解时释放肿瘤抗原。病毒还参与先天免疫应答的介体，作为病毒感染的宿主识别的一部分，产生炎性应答(Hu等人(2006)《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》12:6737-6747)。对溶瘤病毒治疗的这些免疫应答可以为癌症患者提供全身性益处，从而抑制未被病毒感染的肿瘤，包括转移性肿瘤，并且可以预防疾病复发。
然而，肿瘤细胞可以通过参与抑制性免疫检查点通路来逃避免疫系统的破坏(Pardoll(2012)《癌症自然评论(Nature Reviews Cancer)》第12卷:252-264；Darvin等人(2018)《实验与分子医学(Exp Mol Med)》50:1-11)。抑制性免疫检查点通路，如由免疫检查点蛋白PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM3和TIGIT的相互作用介导的抑制性免疫检查点通路，抵消免疫系统激活，以防止自身免疫应答。肿瘤细胞可以通过表达免疫检查点蛋白来利用这些抑制通路，所述免疫检查点蛋白与T细胞上的其对应物相互作用，从而导致T细胞失活和抗肿瘤免疫应答停止。免疫检查点蛋白抑制T细胞的激活或功能，以调节免疫应答的强度和持续时间并且维持自身耐受性。许多免疫检查点蛋白都是已知的，如PD-1(程序性死亡1)及其配体PD-L1和PD-L2；CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)及其配体CD80和CD86；TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)；LAG-3(淋巴细胞激活基因-3)；TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)；BTLA(CD272或B和T淋巴细胞弱化子)和VISTA(T细胞激活的V结构域免疫球蛋白抑制因子)(Pardoll(2012)《癌症自然评论》12:252-264；Borcherding等人(2018)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》430:2014-2029)。
在2015年，Talimogene laherparepvec(“TVec”)，一种通过功能性缺失两个基因(编码ICP34.5和ICP47)和插入编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因而衍生自临床HSV病毒株的HSV，成为当批准用于治疗黑色素瘤时被批准在美国使用的第一个溶瘤免疫疗法。在III期研究中，患有IIIB期至IV期黑色素瘤的患者的总应答率为26％(Andtbacka等人(2015)《临床肿瘤学杂志》33:2780-2788)。增加溶瘤病毒疗法的有效性并且将其用途扩展到其它类型的癌症有很大的需求。
发明内容
本文公开了重组溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其被设计成产生和分泌呈ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白形式的新型免疫调节蛋白，所述融合蛋白包括与免疫检查点分子(如PD-1或PD-L1)特异性结合的单链可变片段抗体(ScFv)，所述ScFv通过抗体Fc区与TGFβ受体II的胞外结构域融合。免疫调节融合蛋白是双功能的，其阻断由免疫检查点分子介导的抑制通路并且阻止TGFβ与其受体接合。进一步提供了包括双基因构建体的重组HSV，除了编码双功能ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的基因之外，所述双基因构建体还包括编码白介素12(IL12)，一种免疫刺激性细胞因子的基因。经工程化的溶瘤HSV选择性感染肿瘤细胞并且在肿瘤细胞中复制，从而允许在肿瘤位点处产生和分泌免疫调节分子。本文还提供了抗PD-1或抗PD-L1ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白和包含此类蛋白的组合物，包括包含ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的无病毒条件培养基。除了ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白之外，如本文提供的蛋白质组合物可以任选地包括免疫激活因子，如IL12。重组溶瘤HSV和/或包含由感染重组溶瘤HSV的细胞产生和分泌的蛋白质的组合物可以递送至受试者用于治疗癌症。受试者可以是人癌症患者或可以是非人动物，例如狗、猫或马。
在第一方面，本文提供了经工程化的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，所述HSV包括核酸构建体，所述核酸构建体包括编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白包括与免疫检查点蛋白结合的ScFv，其中所述ScFv通过Fc抗体区与TGFβ受体II(TGFβRIIecto)的胞外结构域融合。此类融合蛋白在本文中被称为ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白或简称为ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白，并且还可以被称为ScFv-Fc-TGFβRIIecto[融合]蛋白。
ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的ScFv与如PD-1或PD-L1等免疫检查点蛋白特异性结合，以防止免疫检查点蛋白与其受体或配体接合。在一些实施例中，融合蛋白的ScFv部分衍生自与PD-1特异性结合的单克隆抗体，例如，BB9抗PD-1抗体、RG1H10抗PD-1抗体或派姆单抗(pembrolizumab)。例如，ScFv可以衍生自BB9抗体并且包括重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列具有重链CDR(HC-CDR)，所述HC-CDR具有SEQ ID NO:63(HC-CDR1)、SEQ ID NO:64(HC-CDR2)和SEQ ID NO:65(HC-CDR3)的氨基酸序列，所述轻链可变区序列具有轻链CDR(LC-CDR)，所述LC-CDR具有SEQ ID NO:66(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67(LC-CDR2)和SEQ ID NO:68(LC-CDR3)的氨基酸序列。BB9衍生的抗PD-1scFv可以包括与SEQ IDNO:8具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在某些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的序列。在另外的实施例中，ScFv可以衍生自RG1H10抗体，并且包括与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:13具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在一些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少95％同一性的序列。在另外的实施例中，ScFv可以衍生自派姆单抗，并且包括与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在一些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的序列。
在一些实施例中，ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的ScFv部分衍生自与PD-L1特异性结合的单克隆抗体，如Combi5抗PD-L1抗体、H6B1LEM抗PD-L1抗体或阿维鲁单抗(avelumab)。例如，ScFv可以衍生自Combi5抗体，并且包括与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在某些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的序列。在另外的实施例中，ScFv可以衍生自H6B1LEM抗体，并且包括与SEQ ID NO:24具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在一些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性的序列。在另外的实施例中，ScFv可以衍生自阿维鲁单抗，并且包括与SEQ ID NO:28具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在一些实施例中，融合蛋白的ScFv部分可以包括SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的序列。
ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的TGFβtrap部分包括TGFβ受体II(TGFβRII)的胞外结构域。TGFβ胞外结构域可以是人TGFβRII(SEQ ID NO:7)的胞外结构域，或者可以是与SEQID NO:7具有至少95％同一性的多肽序列。融合蛋白的ScFv部分通过Fc抗体区与TGFβRII胞外结构域连接。Fc区可以是IgG1或IgG4抗体的Fc区，并且可以是人IgG1或IgG4 Fc区或其变体，例如，可以是包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列的Fc区，或者可以是包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列的Fc区。肽接头可以任选地将Fc区与TGFβRII胞外结构域连接，例如柔性肽接头，如(GGGGS)n(SEQ ID NO:61)，例如，SEQ ID NO:56。
在各个实施例中，由溶瘤病毒的核酸构建体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以包括用于从细胞分泌融合蛋白的信号肽。信号肽可以是指导分泌的任何信号肽，并且可以优选地位于融合蛋白的ScFv的N端。可以在ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的N端使用的信号肽的一个实例是SEQ ID NO:34。
包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的序列的核酸构建体可以进一步包括启动子。启动子与ScFv-Fc-TGFβtrap编码序列可操作地连接，并且可以是在如人类细胞等哺乳动物细胞中具有功能的启动子。可以与ScFv-Fc-TGFβtrap基因可操作地连接的哺乳动物启动子的实例包括但不限于CMV启动子、EF1α启动子、HTLV启动子、EF1α/HTLV杂合启动子或JeT启动子。
如本文所提供的编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的溶瘤病毒可以进一步包括一种或多种另外的转基因。在各个实施例中，至少一种另外的转基因可以是免疫激活细胞因子，例如，GM-CSF、IL2、IL12、IL15、IL18、IL21、IL24、I型干扰素、III型干扰素、干扰素γ或TNFα。在一些实施例中，如本文所提供的编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的溶瘤病毒可以进一步包括编码IL12的转基因。
本文所提供的第二方面是经工程化的HSV，所述经工程化的HSV包括两种转基因：第一基因和第二基因，所述第一基因编码如上文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中所述融合蛋白的ScFv与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合，所述第二基因编码IL12。IL12基因可以编码哺乳动物IL12，例如，鼠类IL12或人IL12。在其成熟的功能形式中，IL12是两个多肽，p40和p35亚基的异二聚体。如本文所提供的包括用于表达IL12的基因的重组HSV可以包括编码p40多肽链的序列和编码p35多肽链的序列，其中每个序列独立地与单独的启动子可操作地连接，或者可替代地，两个IL12亚基可以与同一启动子可操作地连接并且通过用于产生两个多肽链的自切割2A序列或IRES分离。在另外的实施例中，p40亚基编码序列可以通过编码肽接头的序列与p35编码序列连接，所述肽接头允许产生编码两种亚基的单一多肽。例如，IL12基因可以编码单一多肽(例如，SEQ ID NO:52)，所述单一多肽包括通过2x弹性蛋白接头(SEQ ID NO:55)与人IL12 p35亚基连接的人IL12 p40亚基。
本文所提供的重组溶瘤HSV的两种转基因(即，ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12基因)可以在单个构建体(即，双基因构建体)中提供，并且ScFv-Fc-TGFβtrap基因和IL12可以与单个启动子可操作地连接，或者每个基因可以与单独的启动子可操作地连接。当使用单个启动子时，每个基因的编码区可以例如通过IRES或2A“自切割肽”序列连接。
如本文所提供的由溶瘤HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的一些实施例是其中ScFv与PD-1特异性结合并且衍生自单克隆抗体BB9、单克隆抗体RG1H10或派姆单抗，并且Fc区是IgG1 Fc或IgG4 Fc的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白。例如，抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以具有SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的序列，或者可以具有与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44中的任一个具有至少95％同一性的序列。ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的其它实例是其中ScFv与PD-L1特异性结合并且衍生自单克隆抗体Combi5、单克隆抗体H6B1LEM或阿维鲁单抗，并且Fc区是IgG1 Fc或IgG4 Fc的ScFv-Fc-TGFβtrap。例如，抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50的序列，或者可以具有与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50中的任一个具有至少95％同一性的序列。本公开具体但不排他地提供了编码任何例示的ScFv-Fc-TGFβtrap的重组HSV，包括编码任何例示的ScFv-Fc-TGFβtrap并且还编码IL12的双基因重组HSV。
根据本文所提供的实施例中的任何实施例的重组HSV可以是HSV-1病毒株或HSV-2病毒株，并且在一些优选实施例中，所述重组HSV衍生自HSV-1病毒株F、HSV-1病毒株KOS、HSV-1病毒株JS1或HSV-1病毒株17。在各个实施例中，HSV-1病毒株不包括功能性ICP34.5编码基因。例如，被插入ScFv-Fc-TGFβtrap基因和任选地IL12基因的HSV可以是
Figure BDA0004090762590000061
一种缺乏功能性ICP34.5编码基因(RL1基因)的HSV-1病毒株17衍生的HSV，其中ICP34.5编码基因的两个拷贝都具有695bp缺失。ICP34.5编码基因中的缺失位点也是本文所提供的构建体的插入位点。因此，在各个示例性实施例中，本文所提供的重组HSV是Seprehvec病毒，其包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap的转基因以及任选地在每个ICP34.5基因座处插入的编码IL12的转基因，其中Seprehvec HSV的两个ICP34.5编码基因例如通过从ICP34.5编码序列的上游延伸到编码区中的695bp缺失，使得RL-1基因的主要部分缺失而失活。
本公开的另外的方面是药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体或溶液中的本文所提供的任何重组溶瘤HSV。药物病毒制剂可以包括滴度为约106pfu/ml或更高，例如，滴度为约107pfu/ml或滴度为108pfu/ml或更高的重组HSV。可以将药物重组HSV组合物包装以供注射或输注，例如在小瓶中。病毒可以在缓冲液中提供，所述缓冲液可以任选地包括冷冻保护剂，例如甘油。药物组合物可以以冷冻组合物的形式提供。
本公开的另一方面是一种使用编码ScFv-Fc-TGFβtrap的重组HSV治疗癌症的方法。所述方法可以包括向患有癌症的受试者施用重组HSV，所述重组HSV包括编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap的核酸构建体。在一些实施例中，所述癌症可以是实体瘤。所述重组HSV可以是本文所公开的任何重组HSV，例如，编码能够与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合的ScFv-Fc-TGFβtrap的任何重组HSV。所述受试者可以是人或可以是非人动物，例如，狗、猫、牛、公牛或马。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实例，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用(例如，胸膜内施用、腹膜内施用)、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注或其它递送方式进行。注射可以是例如，肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。治疗方案可以包括多于一次施用所述病毒，并且可以包括在数天、数周或数月的时间段内多次给药。在一些实施例中，由所述方法中所使用的HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap是抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap，例如，具有包括抗体BB9的重链CDR和轻链CDR的scFv的抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap，即具有SEQ ID NO:63(HC-CDR1)、SEQ ID NO:64(HC-CDR2)和SEQ ID NO:65(HC-CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(HC-CDR)的重链可变区序列和具有SEQ ID NO:66(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67(LC-CDR2)和SEQ ID NO:68(LC-CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR(LC-CDR)的轻链可变区序列，并且在一些实施例中，抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的scFv包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在另外的实例中，由所述方法中所使用的HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap是抗PD-L1ScFv-Fc-TGFβtrap，并且在一些实施例中，具有与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
治疗癌症可以使用编码如本文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap并且进一步编码IL12的重组HSV。所述方法可以包括向患有癌症的受试者施用重组HSV，所述重组HSV包括编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap的核酸构建体并且还编码IL12。在一些实施例中，所述癌症可以是实体瘤。所述重组HSV可以是本文所公开的任何重组HSV，例如，编码能够与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合的ScFv-Fc-TGFβtrap的任何重组HSV。所述受试者可以是人或可以是非人动物，例如，狗、猫、牛、公牛或马。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实例，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用(例如，胸膜内施用、腹膜内施用)、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注或其它递送方式进行。注射可以是例如，肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。治疗方案可以包括多于一次施用所述病毒，并且可以包括在数天、数周或数月的时间段内多次给药。在一些实施例中，由所述方法中所使用的HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap是抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap，例如，具有包括抗体BB9的重链CDR和轻链CDR的scFv的抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap，即具有SEQ ID NO:63(HC-CDR1)、SEQ ID NO:64(HC-CDR2)和SEQ IDNO:65(HC-CDR3)的氨基酸序列的重链CDR(HC-CDR)的重链可变区序列和具有SEQ ID NO:66(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67(LC-CDR2)和SEQ ID NO:68(LC-CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR(LC-CDR)的轻链可变区序列，并且在一些实施例中，抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的scFv包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变区序列。在另外的实例中，由所述方法中所使用的HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap是抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap，并且在一些实施例中，具有与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的轻链可变区序列。本文进一步提供了一种在治疗癌症的方法中使用的重组HSV，其中所述方法包括向患有癌症的受试者施用包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的核酸构建体的重组HSV。在一些实施例中，所述癌症可以是实体瘤。所述重组HSV可以是本文所公开的任何重组HSV，例如，编码能够与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合的ScFv-Fc-TGFβtrap的任何重组HSV。在一些实施例中，所述重组HSV可以进一步包括至少一种另外的转基因，并且可以包括编码免疫激活细胞因子，例如IL12的另外的转基因。所述受试者可以是人或可以是非人动物，例如，狗、猫、牛、公牛或马。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实例，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用(例如，胸膜内施用、腹膜内施用)、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注或其它递送方式进行。注射可以是例如，肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。治疗方案可以包括多于一次施用所述病毒，并且可以包括在数天、数周或数月的时间段内多次给药。
在另外的方面，本文提供了一种ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白，其包括与免疫检查点抑制剂结合的抗体的单链可变片段(ScFv)、TGFβRII胞外结构域(TGFβRIIecto)和将ScFv与TGFβRIIecto连接的Fc抗体区。融合蛋白可以是分离的、部分纯化的或基本上纯化的蛋白质。融合蛋白的ScFv可以与如PD-1或PD-L1等免疫检查点分子特异性结合。在一些实施例中，ScFv可以衍生自与PD-1结合的单克隆抗体，如BB9单克隆抗体、RG1H10单克隆抗体或派姆单抗。例如，融合蛋白的ScFv部分可以包括与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:19具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白包括衍生自BB9 PD-1抗体的scFv，并且在一些实施例中，所述scFv包括具有序列SEQ ID NO:63(HC-CDR1)、SEQ ID NO:64(HC-CDR2)和SEQ ID NO:65(HC-CDR3)的CDR的重链可变区和具有序列SEQ ID NO:66(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67(LC-CDR2)和SEQ ID NO:68(LC-CDR3)的CDR的轻链可变区。ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白可以包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变区。在其它实施例中，ScFv可以衍生自与PD-L1结合的单克隆抗体，如Combi5单克隆抗体、H6B1LEM单克隆抗体或阿维鲁单抗。例如，融合蛋白的ScFv部分可以包括与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的氨基酸序列。在各个实施例中，ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白的TGFβRIIecto部分可以衍生自人TGFβ受体II，并且可以与SEQ IDNO:7具有至少95％氨基酸同一性。在一些实施例中，TGFβRIIecto包括SEQ ID NO:7。将ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白的ScFv部分与TGFβRIIecto连接的Fc区可以是IgG1的Fc区或可以是IgG4 Fc区。在示例性实施例中，Fc区是人IgG1 Fc区或其变体(例如，SEQ ID NO:5)或可以是IgG4 Fc区(SEQ ID NO:3)或与其具有至少95％氨基酸同一性的序列(例如，SEQ ID NO:2)。融合蛋白可以任选地包括位于Fc与TGFβRIIecto之间的肽接头。
如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白的各个实施例包括其中ScFv与PD-1特异性结合并且衍生自单克隆抗体BB9、单克隆抗体RG1H10或派姆单抗，并且Fc区是IgG4Fc区的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白。例如，抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以具有SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的序列，或者可以具有与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44中的任一个具有至少95％同一性的序列。ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的其它实例是其中ScFv与PD-L1特异性结合并且衍生自单克隆抗体Combi5、单克隆抗体H6B1LEM或阿维鲁单抗，并且Fc区是IgG4 Fc区的ScFv-Fc-TGFβtrap。例如，抗PD-L1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50的序列，或者可以具有与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50中的任一个具有至少95％同一性的序列。在一些实施例中，ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白在无病毒条件培养基中提供，并且在一些实施例中，ScFv-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白可以从无病毒条件培养基中部分或基本上纯化。
本文中还提供了条件培养基组合物，如无病毒条件培养基(VFCM)组合物，所述条件培养基组合物包含ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，如本文公开的任何融合蛋白。可以将VFCM组合物浓缩并且调配成用作药物组合物。进一步提供了包含如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的药物组合物。在各个实施例中，除了ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白之外，VFCM组合物还包含免疫激活细胞因子，例如，IL12。
在另一方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用包含ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白(如本文所公开的任何ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白)的药物组合物。所述方法可以包括向患有癌症的受试者施用重组HSV，所述重组HSV包括编码能够与免疫检查点抑制剂结合的ScFv-Fc-TGFβtrap的核酸构建体。所述受试者可以是人或可以是非人动物，如狗、猫或马。在一些实施例中，所述癌症可以是实体瘤。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实例，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用(例如，胸膜内施用、肺内施用、腹膜内施用)、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注或其它递送方式进行。注射可以是例如，肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。治疗方案可以包括多于一次施用蛋白质或蛋白质组合物，并且可以包括在数天、数周或数月的时间段内多次给药。
本公开的又另一方面是一种核酸构建体，所述核酸构建体包括编码本文所公开的任何ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的序列。编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的核酸序列可以与启动子，如真核启动子，如在哺乳动物细胞中可操作的真核启动子可操作地连接。合适的启动子的非限制性实例包括EF1α启动子、HTLV启动子、EF1α/HTLV融合启动子、CMV启动子、JeT启动子和其功能性衍生物。
附图说明
图1A和1B提供了包括经工程化的“ScFv-Fc-TGFβtrap”基因的核酸构建体的示意图：图1A)与EF1α/HTLV杂合启动子(白色箭头)可操作地连接的ScFv-Fc-TGFβtrap基因构建体；实心黑色条形：信号肽；左斜条纹条：识别PD-1、PD-L1或CTLA-4中任一种的抗体的ScFv；白色条形：IgG1或IgG4的人Fc区；右斜条纹条：TGFβRII的胞外结构域。图1B)包括ScFv-Fc-TGFβtrap编码基因和IL12编码的基因两者的双基因构建体。ScFv-Fc-TGFβtrap构建体与图1A中提供的构建体相同。IL12构建体包括与单个开放阅读框可操作地连接的CMV启动子，所述单个开放阅读框包括编码IL12的p40亚基的序列，随后是编码2x弹性蛋白接头的序列，随后是编码IL12的p35亚基的序列。图未按比例绘制。
图2A提供了示出了从用ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepGI-097、三个单独的SepGI-137分离株和三个单独的SepGI-138分离株感染的A431细胞培养物中收获的VFCM的TGFβRII含量的MSD测定结果的条形图，并且图2B)提供了示出了从用ScFv-Fc-TGFβtrap HSVSepGI-097、三个SepGI-137分离株和三个SepGI-138分离株感染的HepG2细胞培养物中收获的VFCM的TGFβRII含量的MSD测定结果的条形图。两个图的阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用不表达任何外源转基因的HSV(SepGI-Null)感染的细胞培养物的VFCM。n.d.，未检测到。
图3A提供了响应于仅TGFβ1(实心正方形)、无TGFβ1(实心三角形)或TGFβ1加上重组人TGFβRII的滴定(实心圆)的表达CD103的人CD8+T细胞的百分比；图3B提供了示出了在存在TGFβ1和来自感染的A431细胞培养物的各种VFCM的情况下表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的条形图。缺乏ScFv-Fc-TGFβtrap(黑色条形)的VFCM包括来自未感染培养物和SepGI-Null感染培养物的VFCM。包含ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括SepGI-097-感染培养物、SepGI-137-感染培养物和SepGI-138-感染培养物；并且图3C)提供了示出了在存在TGFβ1和来自感染的HepG2细胞培养物的各种VFCM的情况下表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的条形图。缺乏ScFv-Fc-TGFβtrap(黑色条形)的VFCM包括未感染培养物和SepGI-Null-感染培养物的VFCM。包含ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括SepGI-097-感染培养物、SepGI-137-感染培养物和SepGI-138-感染培养物的VFCM。
图4A提供了在响应于阻断PD-1/PD-L1相互作用的荧光素酶测定中抗PD-1IgG抗体BB9的标准曲线滴定；图4B)提供了在用ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepGI-097、SepGI-137(三个分离株)和SepGI-138(两个分离株)感染的A431细胞培养物的VFCM中PD-1阻断活性的定量的条形图。阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用SepGI-Null，一种不表达任何外源转基因的HSV感染的细胞培养物的VFCM。n.d.，未检测到。
图5A提供了示出了从未感染的A431细胞培养物以及用不包括ScFv-Fc-TGFβtrap转基因的SepGI-Null和SepGI-123以及各自包括ScFv-Fc-TGFβtrap转基因的HSV Sep GI-143、SepGI-144和SepGI-145感染的A431培养物中收获的VFCM的TGFβRII含量的MSD测定结果的条形图；并且图5B)提供了示出了从未感染的HepG2细胞培养物以及用不包括ScFv-Fc-TGFβtrap转基因的SepGI-Null和SepGI-123以及各自包括ScFv-Fc-TGFβtrap转基因的HSVSep GI-143、SepGI-144和SepGI-145感染的HepG2细胞培养物中收获的VFCM的TGFβRII含量的MSD测定结果的条形图。n.d.，未检测到。
图6A提供了响应于仅TGFβ1(实心正方形)、无TGFβ1(实心三角形)或TGFβ1加上重组人TGFβRII的滴定(实心圆)的表达CD103的人CD8+T细胞的百分比；图6B提供了示出了在存在TGFβ1和来自感染的A431细胞培养物的各种VFCM的情况下表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的条形图。缺乏ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括来自未感染培养物、SepGI-Null-感染培养物和SepGI-123-感染培养物的VFCM。包含ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括来自SepG1-143-感染培养物、SepG1-144-感染培养物和SepGI-145-感染培养物的VFCM；图6C)提供了示出了在存在TGFβ1和来自感染的HepG2细胞培养物的各种VFCM的情况下表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的条形图。缺乏ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括来自未感染培养物、SepGI-Null-感染培养物和SepGI-123-感染培养物的VFCM。包含ScFv-Fc-TGFβtrap的VFCM包括来自SepG1-143-感染培养物、SepG1-144-感染培养物和SepGI-145-感染培养物的VFCM。
图7A提供了在响应于阻断PD-1/PD-L1相互作用的荧光素酶测定中抗PD-1克隆BB9IgG的标准曲线滴定；图7B)提供了在用ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepG1-143、SepGI-144和SepGI-145感染的A431细胞培养物的VFCM中PD-1阻断活性的定量的条形图。阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用不表达ScFv-Fc-TGFβtrap的HSV，SepGI-Null和SepGI-123感染的细胞培养物的VFCM。n.d.，未检测到。
图8A提供了在响应于IL-12受体结合和信号传导的基于报告基因细胞的荧光素酶测定中重组人IL-12的标准曲线滴定；图8B提供了示出了与用IL12 HSV SepGI-123或ScFv-Fc-TGFβtrap+IL12 HSV SepG1-143、SepGI-144和SepGI-145感染的A431细胞的VFCM一起温育的报告基因细胞的IL12响应性发光的条形图；图8C提供了示出了与用IL12 HSV SepGI-123或ScFv-Fc-TGFβtrap+IL12 HSV SepG1-143、SepGI-144和SepGI-145感染的HepG2细胞的VFCM一起温育的报告基因细胞的IL12反应性发光的条形图。两个图的阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用不表达任何外源转基因的HSV(SepGI-Null)感染的细胞培养物的VFCM。
图9提供了示出了从用ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepGI-143、SepGI-144和SepGI-158的四个单独的分离株感染的A431细胞培养物中收获的VFCM的TGFβRII含量的MSD测定结果的条形图。阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用不表达任何外源转基因的HSV(SepGI-Null)感染的细胞培养物的VFCM。n.d.，未检测到。
图10A提供了在响应于阻断PD-1/PD-L1相互作用的荧光素酶测定中抗PD-1克隆BB9IgG的标准曲线滴定，并且图10B提供了在用ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepG1-143、SepGI-145和SepGI-158的四个分离株感染的A431细胞培养物的VFCM中PD-1阻断活性的定量的条形图。阴性对照包括来自未感染细胞培养物的VFCM和来自用不表达任何外源转基因的HSV(SepGI-Null)感染的细胞培养物的VFCM。n.d.，未检测到。
图11A提供了在响应于IL-12受体结合和信号传导的基于报告基因细胞的荧光素酶测定中重组鼠类IL-12的标准曲线滴定，并且图11B是示出了用表达RG1H10抗PD-1cFv-Fc-TGFβtrap基因和鼠类IL12基因的SepGI-162HSV的四种不同的分离株感染的A431细胞的VFCM中IL12(标准化为重组鼠类IL12)的浓度的条形图。阴性对照包括来自未感染的A431细胞培养物的VFCM和来自用不表达任何外源转基因的HSV(SepGI-Null)感染的A431细胞培养物的VFCM。
图12A)是提供了用于感染3T6细胞的各种病毒的总产量(pfu)的图，基于从用HSV病毒株17+(“Virttu 17+”)、HSV1716
Figure BDA0004090762590000131
SepGI-Null和SepGI-145感染的3T6细胞获得的、在感染病毒后一小时或感染后72小时收集的上清液的滴度，，模拟感染的上清液也作为对照被滴定；图12B)提供了用HSV病毒株HSV病毒株17+(“Virttu 17+”)、HSV1716
Figure BDA0004090762590000132
SepGI-Null和SepGI-145感染Vero细胞的相同数据。图12C)示出了以输出/输入病毒pfu的形式表示的A)的数据的条形图，并且图12D)示出了以输出/输入病毒pfu的形式表示的B)的数据的条形图。
图13A)是提供了用于感染cKPF细胞的各种病毒的总产量(pfu)的图，基于从用HSV病毒株17+(“Virttu 17+”)、HSV1716
Figure BDA0004090762590000133
SepGI-Null和SepGI-145感染的cKPF细胞获得的、在感染病毒后一小时或感染后72小时收集的上清液的滴度，，模拟感染的上清液也作为对照被滴定；图13B)提供了用HSV病毒株HSV病毒株17+(“Virttu 17+”)、HSV1716
Figure BDA0004090762590000134
SepGI-Null和SepGI-145感染Vero细胞的相同数据。图13C)示出了以输出/输入病毒pfu的形式表示的A)的数据的条形图，并且图13D)是示出以输出/输入病毒pfu的形式表示的B)的数据的条形图。
图14A-14C提供了在第0天接种MB49膀胱癌细胞并且在第8天和此后每隔一个工作日通过瘤周注射调配物缓冲液、SepGI-Null HSV或SepGI-162进行处理(总共进行九次处理)的小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。图14A)是通过注射调配物缓冲液处理的小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图；图14B)是通过注射SepGI-Null HSV(缺乏外源转基因)处理的小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图；并且图14C)是通过注射包括BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap和鼠类IL12基因的SepGI-162HSV处理的小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。
图15A-15C提供了图14A-14C中表示的小鼠相对于第0天的体重变化百分比的图。图15A)示出了通过注射调配物缓冲液处理的小鼠的体重百分比随着时间推移的变化；图15B)示出了通过注射SepGI-Null HSV(缺乏外源转基因)处理的小鼠的体重百分比随着时间推移的变化；并且图15C)示出了通过注射包括BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap和鼠类IL12基因的SepGI-162HSV处理的小鼠的体重百分比随着时间推移的变化。
图16提供了用调配物缓冲液(实线)、缺乏转基因的SepGI-Null HSV(虚线)和包括BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap和鼠类IL12基因的SepGI-162(点线)处理的图14和15的肿瘤植入小鼠的存活率百分比随着时间推移的卡普兰-迈耶图(Kaplan Meier plot)。当肿瘤体积达到2000mm3时，对小鼠实施安乐死。
图17A-17C提供了在接种原发性肿瘤并且用SepGI-162处理之后，在对侧腹上用第二次接种MB49膀胱癌细胞再激发以形成继发性肿瘤的小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的曲线。将如在图14C中所示的在第-40天(图14C中的第0天)接种MB49肿瘤细胞并且显示出最小肿瘤进展(一只小鼠)或肿瘤消除(三只小鼠，表示为单线)的小鼠在第0天再接种在对侧腹中注射的肿瘤细胞，并且监测在原始位点处的原发性肿瘤生长和在对侧腹位点处的继发性肿瘤生长两者，持续另外3周。图17A)是示出了在第0天接种肿瘤细胞的对照小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。对照小鼠尚未接受先前的肿瘤接种或处理。图17B)提供了在第0天继发性肿瘤接种之后三周内再激发的小鼠的原始(原发性)肿瘤的生长的图。图17C)提供了再激发的小鼠的继发性肿瘤的生长的图。
图18A和18B提供了图17的对照和继发性位点肿瘤细胞接种的小鼠的再激发相对于第0天的体重变化百分比的图。图18A)在第0天接种肿瘤的对照小鼠的体重的变化百分比；图18B)在第0天接种继发性肿瘤后，接受SepGI-162作为原发性肿瘤处理的小鼠的体重的变化百分比。
图19提供了在已经用SepGI-162处理原发性肿瘤之后，在第0天接种继发性肿瘤(图17B)的图17和18中所示的小鼠的相对肿瘤重量的图。对照小鼠在第0天接种肿瘤细胞，但是未接种原发性肿瘤并且未用SepGI-162治疗(图17A)。通过解剖安乐死小鼠的肿瘤获得肿瘤重量；将肿瘤重量除以肿瘤生长的天数以得到相对肿瘤重量。
图20A-20C提供了HSV感染的细胞的增殖曲线，其显示了在R1基因中缺失的HSV对犬骨肉瘤OSCA-40细胞的细胞毒性。将OSCA-40细胞接种在96孔E-板(
Figure BDA0004090762590000151
罗氏公司(Roche))中并且在用图20A)SepGI-Null、图20B)SepGI-145和图20C)SepGI-dsred所指示的MOI下感染。使用/>
Figure BDA0004090762590000152
实时细胞分析系统实时监测病毒感染的细胞和对照未感染的细胞的增殖曲线。最上面的曲线表示未感染的细胞；按照下降顺序，剩余曲线表示在MOI 0.1、MOI 1和MOI 10下感染的细胞。竖直线指示感染时间。细胞指数值(y轴)与细胞数量成比例。
图21提供了条形图，该条形图提供了450nm处的吸光度作为夹心ELISA的结果，以测试TGFβRIIecto融合蛋白的产生和与由SepGI-145-感染的OSCA-40细胞产生的犬TGFβR1的结合。未处理的OSCA-40细胞、SepGI-Null感染的OSCA-40细胞和SepGI-145-感染的OSCA-40细胞(稀释1:4)的VFCM的结果显示，SepGI-145-感染的OSCA-40细胞产生与犬TGFβ结合的功能性抗PD-L1-Fc-TGFβRIIecto融合蛋白。
图22提供了使用来自用Combi5 IgG等效物中的SepGI-Null和SepGI-145感染的OSCA-40细胞的浓缩VFCM的PD-1/PD-L1阻断测定的结果。
图23A)提供了重组IL12以发光单位表示的标准曲线。图23B)提供了示出了使用来自用SepGI-Null和SepGI-145感染的OSCA-40细胞的VFCM的IL12测定的结果的图。
图24是提供了从用SepGI-Null HSV和ScFv-Fc-TGFβtrap HSV SepGI-097、SepGI-138、SepGI-162和SepGI-167感染的BHK细胞的培养物中分离的浓无病毒条件培养基中TGFβRII的浓度的条形图。
图25A)是示出了响应于仅TGFβ1(实心正方形)、无TGFβ1(实心三角形)或TGFβ1加上重组人TGFβRII的滴定(实心圆)的表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的图，并且图25B)提供了示出了在存在TGFβ1和来自感染的BHK细胞培养物的各种浓缩VFCM的情况下表达CD103的人CD8+T细胞的百分比的条形图。缺乏ScFv-Fc-TGFβtrap的浓缩VFCM是SepGI-Null。包含ScFv-Fc-TGFβtrap的浓缩VFCM包括SepG1-097、SepGI-138、SepGI162和SepGI-167。在1:200、1:400、1:800和1:1600稀释度下测试每种浓缩VFCM。
图26提供了接种MB49肿瘤细胞并且用重组HSV SepGI-162处理的小鼠的肿瘤体积随着时间推移的变化。A)是7只接种肿瘤细胞并且用调配物缓冲液每周处理3次持续3周的组1小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。B)是7只接种肿瘤细胞并且在8天后开始用SepGI-Null对照HSV每周处理3次持续3周后的组2小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。C)是8只接种肿瘤细胞并且在8天后开始用编码抗PD-1scFv-Fc-TGFβTrap和IL12的SepGI-162重组HSV每周处理3次持续3周后的组3小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。D)是8只接种肿瘤细胞并且在两周内用编码抗PD-1scFv-Fc-TGFβTrap和IL12的SepGI-162重组HSV处理3次的组4小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。E)是8只接种肿瘤细胞并且在一周内用编码抗PD-1scFv-Fc-TGFβTrap和IL12的SepGI-162重组HSV处理3次的组4小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。F)是8只接种肿瘤细胞并且用编码抗PD-1scFv-Fc-TGFβTrap和IL12的SepGI-162重组HSV每周处理一次持续一周的组4小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。
图27提供了接种MB49肿瘤细胞并且用重组HSV SepGI-167处理的小鼠的肿瘤体积随着时间推移的变化。A)是6只接种肿瘤细胞并且用调配物缓冲液每周处理3次持续2周的组1小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。B)是6只接种肿瘤细胞并且用1x107pfu的编码抗PD-L1 scFv-Fc-TGFβTrap和IL12的重组HSV SepGI-167每周处理3次持续2周的组2小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。C)是6只接种肿瘤细胞并且用1x106pfu SepGI-167每周处理3次持续2周的组3小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。D)是6只接种肿瘤细胞并且用1x105pfu SepGI-167每周处理3次持续2周的组4小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。E)是6只接种肿瘤细胞并且在1周的过程内用1x107pfu重组HSV SepGI-167处理3次的组5小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。F)是6只接种肿瘤细胞并且在1周的过程内用1x106pfu重组HSV SepGI-167处理3次的组6小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。G)是6只接种肿瘤细胞并且在1周的过程内用1x105pfu重组HSV SepGI-167处理3次的组7小鼠的肿瘤体积随着时间推移而变化的图。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文所描述的病毒学、细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、转基因细胞产生、蛋白质化学和核酸化学以及杂交技术有关的术语是本领域熟知且常用的。除非另外说明，否则通常根据本领域熟知的常规程序以及如本文中引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的执行本文所提供的方法和技术。参见例如，Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)(1989)以及Ausubel等人,《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Publishing Associates)(1992)。许多基础文本都描述了标准抗体产生过程，包括Borrebaeck(编辑)《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第2版纽约弗里曼公司(Freeman and Company,NY),1995；McCafferty等人《抗体工程化实用方法(Antibody Engineering,A Practical Approach)》英国牛津的牛津出版社(Oxford Press,Oxford,England)IRL,1996；以及Paul(1995)《抗体工程化方案(Antibody Engineering Protocols)》新泽西州托托瓦的哈门那出版社(Humana Press,Towata,N.J.),1995；Paul(编辑),《基础免疫学(FundamentalImmunology)》,纽约瑞文出版社(Raven Press,N.Y),1993；Coligan(1991)《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》纽约威利/格林(Wiley/Greene,NY)；Harlow和Lane(1989)《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,纽约冷泉港实验室出版社；Stites等人(编辑)《基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》(第4版)加利福尼亚州洛思阿图斯的朗格医学出版物(Lange Medical Publications,LosAltos,Calif.)以及其中引用的参考文献；《编码单克隆抗体：原理与实践(CodingMonoclonal Antibodies:Principles and Practice)》(第2版)纽约州纽约市的学术出版社(Academic Press,New York,N.Y.),1986，以及Kohler和Milstein《自然(Nature)》256:495-497,1975。酶促反应和丰富/纯化技术也是熟知的并且如本领域通常实现的或如本文所描述的根据制造商的说明书执行。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合使用的术语以及实验室程序和技术也是本领域熟知且常用的。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制剂、调配和递送以及患者治疗。
本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。
本文提供的标题仅仅是为了方便读者并且并不限制本公开的各个方面，所述方面可以通过整体参考本说明书来理解。
除非本文中上下文另外要求，否则单数术语应包括复数含义，并且复数术语应包括单数含义。除非明确地并且肯定地限于单个实体，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及任何词的单数用途包括多个指示物。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一者或两者或其任何组合，并且术语“和/或”意指具有或不具有另一个的特定特征或组分中的每个特征或组分的具体公开内容。例如，本文中在如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，在如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”和“含有(containing)”以及其语法变体旨在是非限制性的，使得所提及的项或所列出的多个项不排除可以添加到所列出的项中的其它项。
术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”意指组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分，所述另外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。
如本文所使用的，术语“约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于所述值或组成是如何测量或确定，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约(about)”或“大约(approximately)”可以意指在一个或大于一个标准偏差内。可替代地，取决于测量系统的限制，“约”或“大约”可以意指至多10％(即，±10％)或更多的范围。例如，约5mg可以包括介于4.5mg与5.5mg之间的任何数值。当在本公开中提供具体值或组成时，除非另外陈述，否则“约”或“大约”的含义应被假定在所述具体值或组成的可接受误差范围内。当提供值的范围时，意在值包括范围的边界。
术语“肽”、“多肽”、“多肽链”和“蛋白质”以及本文中使用的其它相关术语可互换使用并且指代氨基酸的聚合物，并且不限于任何特定长度。多肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。多肽包括重组形式或化学合成形式。多肽包括前体分子和成熟分子。
本文所使用的术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸(或DNA或RNA)片段”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及其它相关术语可互换使用，并且指代核苷酸的聚合物并且不限于任何特定长度。核酸包括重组形式和化学合成形式。核酸包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸、锁核酸和具有一种或多种非天然存在的核苷酸类似物的核酸或核酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物以及其混合物。核酸分子可以是单链或双链的。尽管“碱基对”或“bp”通常用于指双链核酸分子的长度，但是在一些情况下其可以与核苷酸(nt)可互换地使用，其中任一者可以用于指代单链或双链核酸分子的长度。
术语“基因”广泛地用于指编码多肽或表达的RNA的核酸分子(通常为DNA，但任选地为RNA)的任何区段。因此，基因包括编码表达的RNA的序列(其可以包括多肽编码序列或例如功能性RNA，如核糖体RNA、tRNA、反义RNA、微小RNA、短发夹RNA、核酶等)。基因可以任选地进一步包括与调节序列连接的序列的表达所需要的或影响这些序列的表达的调节序列。基因还可以涵盖与蛋白质或处于其天然状态的RNA编码序列相关的序列，例如，内含子序列、5'或3'非翻译序列等。在一些实例中，基因可以仅指DNA或RNA分子的蛋白质编码部分，其可以包括或可以不包括内含子。基因的长度通常大于50个核苷酸，如长度大于100个核苷酸，并且长度可以例如介于50个核苷酸与500,000个核苷酸之间，如长度介于100个核苷酸与100,000个核苷酸之间或长度介于约200个核苷酸与约50,000个核苷酸之间或长度介于约200个核苷酸与约20,000个核苷酸之间。基因可以从多种来源获得，包括但不限于从所关注的一个或多个来源克隆或从已知或预测的序列信息合成。
核酸序列、核酸分子或基因可以“衍生自”指定来源，其可以包括从指定来源分离(全部或部分)核酸区段。核酸分子还可以通过例如直接克隆、PCR扩增或来自指定多核苷酸来源的DNA合成或基于与指定多核苷酸来源相关的序列(例如，数据库中的序列、公开的序列、通过DNA测序确定的序列)而衍生自指定来源。衍生自特定来源或物种的基因或核酸分子还包括相对于来源核酸分子具有序列修饰的基因或核酸分子。例如，衍生自来源的基因或核酸分子(例如，特定参考基因)可以包括相对于来源基因或核酸分子的一个或多个突变，所述一个或多个突变是非预期的或有意引入的，并且如果有意引入一个或多个突变(包括取代、缺失或插入)，则可以通过任何方式来引入序列改变，所述方式包括细胞或核酸的随机或靶向突变、扩增或其它分子生物学合成技术或通过化学合成或其任何组合。衍生自编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可以编码功能性RNA或多肽，所述功能性RNA或多肽与参考或来源功能性RNA或多肽或与其功能性片段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。例如，衍生自编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可以编码具有至少85％、至少90％的功能性RNA或多肽，并且可以与参考或来源功能性RNA或多肽或与其功能性片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
术语“衍生物”在本文中用于指通过改变核苷酸或氨基酸序列而产生的核酸分子(或衍生自参考核酸分子的多肽)、病毒基因组、病毒、病毒基因组、病毒或多肽。例如，具有例如至少85％、至少90％或至少95％核苷酸或氨基酸序列的序列变体可以被称为衍生自参考核酸分子或多肽。密码子优化的核酸序列也“衍生自”用于设计它们的非密码子优化的序列。包括氨基酸序列插入的多肽(包括功能性结构域，如但不限于用于鉴定或纯化的蛋白质标签、信号、前导序列、转运肽或核定位序列、SUMO序列等)被认为“衍生自”不包括插入的原始多肽。相似地，具有缺失序列(包括缺失功能性结构域)的蛋白质可以被称为“衍生自”包括结构域的原始蛋白质。
如本文所使用的，关于多肽的术语“衍生物”还可以指已经例如通过与如聚乙二醇、白蛋白(例如，人类血清白蛋白)等另一个化学部分缀合而化学修饰或如通过磷酸化或糖基化而翻译后修饰的多肽。
如本文所使用的，术语“变体”多肽和多肽的“变体”是指包括相对于参考多肽序列具有一个或多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中、从氨基酸序列中缺失和/或取代到氨基酸序列中的氨基酸序列的多肽。例如，多肽序列变体可以与参考核酸分子或多肽具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列同一性。类似地，变体多核苷酸包括相对于另一多核苷酸序列具有一个或多个核苷酸插入到核苷酸序列中、从核苷酸序列中缺失和/或取代到核苷酸序列中的核苷酸序列。优选地，蛋白质变体具有与其所衍生的蛋白质基本上相同的活性或功能。例如，如本文所提供的与所公开的ScFv具有至少95％氨基酸同一性的变体ScFv可以具有与参考ScFv基本上相同的抗原结合特异性和结合亲和力。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用实施合适的算法的可公开获得的计算机软件，如Smith和Waterman的局部同源性算法(《高等应用数学(Add.APL.Math.)》2:482,1981)，通过Needleman和Wunsch的全局同源比对算法(《分子生物学杂志》48:443,1970)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。如本文所使用的，“序列同一性的百分比”或“百分比(％)[序列]同一性”是通过在由两个序列之间的局部比对长度限定的比较窗口上比较两个最佳局部比对的序列来确定的(这也可以被认为是“同源性的百分比”或“百分比(％)同源性”)。与参考序列相比，比较窗口中的氨基酸序列可以包括添加或缺失(例如，空位或突出端)以用于两个序列的最佳比对。两个序列之间的局部比对仅包括根据取决于用于进行比对的算法的标准而被认为足够相似的每个序列的区段。百分比同一性通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数、将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数并且将结果乘以100。例如，GAP和BESTFIT可以用于确定已经被鉴定用于比较的两个序列的最佳比对。通常，使用空位权重的默认值5.00和空位权重长度的默认值0.30。
具有相同或相似功能的多肽之间的相似性可以是至少95％、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同、或至少99％相同。在一些实例中，氨基酸取代可以包括一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，由于其取代的保守性质，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以纠正。用于作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如，Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，所述文献通过引用整体并入本文。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的实例包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在确定多肽与另一多肽序列的同一性百分比时，不考虑将相对较短的氨基酸序列(例如，60个氨基酸或更少，优选地40个氨基酸或更少、或24个氨基酸或更少)包括在多肽中，所述氨基酸序列编码用于定位、检测、纯化多肽或将多肽与其它部分(如肽接头、氨基酸标签、信号肽、核定位序列等)连接的功能性结构域，所述部分基本上不影响多肽的基本功能或活性。
“内源”核酸分子、基因或蛋白质是如其存在于宿主中或由宿主天然产生的天然核酸分子、基因或蛋白质。
“外源核酸分子”或“外源基因”(在本文中也称为“转基因”)是指已经引入(“转化”)细胞中或引入如病毒基因组等基因组中的核酸分子或基因。经转化的细胞可以被称为重组细胞，可以向其中引入另外的外源基因。如果用核酸分子转化的细胞的后代已经遗传外源核酸分子，则其也称为“经转化的”。相似地，重组或工程化病毒是已经引入外源核酸分子的病毒。引入病毒中的外源核酸分子或构建体或基因通常是通过将外源核酸分子、构建体或基因插入病毒基因组中来实现的。
术语“基因工程化”、“工程化”和“重组”可互换地用于指已经使用分子克隆技术通过人为干预制备的生物体、病毒、载体和构建体，所述分子克隆技术可以包括但不限于核酸分子的化学合成、通过分离的聚合酶或逆转录酶的核酸分子合成、DNA的限制、DNA的连接、聚合酶链式反应(PCR)、使用CRISPR系统和/或cas酶的体外或体内DNA编辑(限制、定点突变和/或基因插入)、或体外或体内位点特异性重组。
如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指通过基因工程(例如对病毒或细胞进行基因工程，以包括编码蛋白质的基因或核酸构建体)产生的蛋白质。
当应用于生物体或病毒时，术语重组、工程化或基因工程化是指已经通过将异源或外源重组核酸序列引入生物体或病毒或其基因组中而操纵的生物体或病毒，并且包括基因敲除、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失或插入，以及将转基因或合成基因引入生物体或病毒或其基因组中。重组或基因工程化生物体或病毒还可以是已经引入用于基因“敲低”的构建体的生物体。此类构建体包括但不限于RNAi、微小RNA、shRNA、siRNA、反义和核酶构建体。还包括其基因组已经被大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR系统的cas酶的活性改变的生物体或病毒。外源或重组核酸分子可以整合到重组体/基因工程化生物体或病毒的基因组中，或者在其它实例中，不整合到重组体/基因工程化生物体的基因组中。如本文所使用的，“重组(微)生物体”或“重组宿主细胞”或“重组病毒”包括重组生物体、细胞或病毒的后代或衍生物。因为由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，所以这种后代或衍生物可能实际上与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所使用的术语的范围内。
术语“启动子”是指能够与细胞中的RNA聚合酶结合并启动下游(3'方向)编码序列的转录的核酸序列。启动子包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。启动子可以包括转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子通常但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子可以包含-10和-35原核启动子共有序列。来自各种不同来源的大量启动子(包括组成型、诱导型和阻遏型启动子)是本领域熟知的。代表性来源包括例如藻类、病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且来自这些来源的合适的启动子是容易获得的，或可以基于在线可公开获得或例如来自如ATCC等保藏机构以及其它商业或个人来源的序列以合成方式制备。启动子可以是单向的(启动一个方向上的转录)或双向的(启动任一方向上的转录)。启动子可以是组成型启动子、阻遏型启动子或诱导型启动子。
当调节序列影响基因的表达(例如，表达的水平、定时和/或位置)时，基因与调节序列(如启动子)“可操作地连接”。
如本文所使用的，“弱化”意指量、程度、强度(intensity)或强度(strength)降低。弱化的基因表达可以指所讨论的基因的转录或经编码的蛋白质的翻译、折叠或组装的显著减少的量和/或速率。作为非限制性实例，弱化基因可以是突变或破坏的基因(例如，通过部分或全部缺失、截短、移码或插入突变而破坏的基因)，或者由于基因调节序列的改变而具有降低的表达。
术语宿主细胞在本文中可以用于指感染如溶瘤病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)等病毒的细胞。在许多情况下，如本文所公开的宿主细胞感染重组HSV。用于病毒繁殖或病毒编码的重组蛋白的产生的宿主细胞的非限制性实例包括但不限于Vero细胞、BHK细胞、A431细胞、MB49细胞和HepG2细胞。优选地，宿主细胞有效感染如HSV等病毒，即宿主细胞繁殖病毒，即，当感染时可能产生感染性病毒。如本文所公开的宿主细胞将是真核细胞，例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、犬细胞、马细胞、小鼠细胞)。值得注意的是，本文公开了被重组病毒感染的各种宿主细胞，其中当在适当条件下培养或递送到受试者体内时，所述宿主细胞产生由工程化到重组病毒中的基因编码的蛋白质。此类病毒编码的重组蛋白可以由宿主细胞分泌到培养基(用于经培养的宿主细胞)或胞外环境(用于受试者施用的宿主细胞)中。在一个实例中，通过重组核酸方法通过将编码多肽的核酸序列(例如，DNA)插入病毒基因组中来产生多肽。病毒用于感染宿主细胞，并且外源核酸序列由宿主细胞在促进表达的条件下表达，所述条件可以是体内条件。
用于重组核酸操纵的一般技术描述于例如Sambrook等人,《分子克隆：实验手册》,第1-3卷,冷泉港实验室出版社,第2版,1989，或者F.Ausubel等人,《分子生物学实验指南》(纽约格林出版社和威利国际科学出版社(Green Publishing and Wiley-Interscience),1987)中并且定期更新，所述文献通过引用整体并入本文。
如本文所使用的，“分离的”核酸或蛋白质是从其天然环境或核酸或蛋白质在自然界中存在的环境中去除的。例如，将分离的蛋白质或核酸分子从在其天然或自然环境中与其相关的细胞或生物体中去除。在一些实例中，分离的核酸或蛋白质可以部分地或基本上纯化，但是对于分离而言纯化的特定水平不做要求。因此，例如，分离的核酸分子可以是已经从其在自然界中被整合到的染色体、基因组或附加体切离的核酸序列。
“纯化的”核酸分子或核苷酸序列或蛋白质或多肽序列基本上不含细胞材料和细胞组分。例如，纯化的核酸分子或蛋白质可以不含除缓冲液或溶剂之外的化学物质。“基本上不含”不旨在意指除新核酸分子之外的其它组分是不可检测的。
术语“天然存在的”和“野生型”是指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型核酸分子、核苷酸序列或蛋白质可以存在于天然来源中并且从天然来源分离，并且不是通过人为操纵有意修饰的。
在某些实施例中，本文所描述的抗体和融合蛋白(例如，ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白)可以进一步包括翻译后修饰。示例性翻译后蛋白修饰包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、无岩藻糖基化、羰基化、SUMO化、生物素化或添加多肽侧链或疏水性基团。因此，经修饰的多肽可以包含非氨基酸要素，如脂质、多糖或单糖以及磷酸盐。在一个实施例中，糖基化可以是将一个或多个唾液酸部分缀合到多肽的唾液酸化。唾液酸部分改善溶解度和血清半衰期，同时还减低蛋白质的可能免疫原性。参见Raju等人(2001)《生物化学(Biochemistry)》40:8868-76。
本文中使用的“抗原结合蛋白”以及相关术语是指包括与抗原结合的部分的蛋白质以及任选地使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包括例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代性蛋白质支架或人工支架。此类支架包括但不限于包括例如引入突变以稳定抗原结合蛋白的三维结构的抗体源性支架以及包括例如生物相容性聚合物的完全合成支架。参见例如，Korndorfer等人,2003,《蛋白质：结构、功能和生物信息学(Proteins:Structure,Function,andBioinformatics)》,第53卷,第1:121-129期；Roque等人,2004,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于利用纤维蛋白连接素组分作为支架的抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可以具有例如免疫球蛋白的结构。在一个实施例中，“免疫球蛋白”是指由两对相同的多肽链构成的四聚体分子，每对具有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”(约50-70kDa)链。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“D”区。通常参见，《基础免疫学》，第7章(Paul，W.编辑，第2版，纽约瑞文出版社(1989)，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。重链和/或轻链可以包括或可以不包括用于分泌的前导序列。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个抗原结合位点。在一个实施例中，抗原结合蛋白可以是具有不同于四聚体免疫球蛋白分子但仍与靶抗原结合或与两个或更多个靶抗原结合的结构的合成分子。例如，合成抗原结合蛋白可以包括抗体片段、1-6个或更多个多肽链、多肽的非对称组合件或其它合成分子。
免疫球蛋白链的可变区表现出由三个高变区(也称为互补性决定区或CDR)接合的相对保守的构架区(FR)的相同一般结构。从N端到C端，轻链和重链两者都包括区段FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
一个或多个CDR可以共价或非共价地并入分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入CDR作为更大多肽链的部分，可以将CDR与另一多肽链共价地连接或者可以非共价地并入CDR。CDR允许抗原结合蛋白与所关注的特定抗原特异性结合。
将氨基酸分配给每个结构域将根据以下定义进行：Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美国卫生和人类服务部(US Dept.of Health and Human Services),公共卫生署(PHS),美国国立卫生研究院(NIH),NIH公开第91-3242号,1991(“Kabat编号”)。免疫球蛋白链中氨基酸的其它编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(international ImMunoGeneTicsinformation system)；Lefranc等人,《发展竞争免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》29:185-203；2005)；AHo(Honegger和Pluckthun,《分子生物学杂志》309(3):657-670；2001；Chothia(Al-Lazikani等人,1997《分子生物学杂志》273:927-948；以及Contact(Maccallum等人,1996《分子生物学杂志》262:732-745)。
本文中使用的“抗体(antibody/antibodies)”以及相关术语是指与抗原特异性结合的完整免疫球蛋白或其抗原结合部分。除非另有指示，否则术语“抗体”包括除了包括全长重链和全长轻链的抗体之外的其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实例公开于下文中。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双功能抗体、纳米抗体、三功能抗体、四功能抗体以及包含足以赋予与多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。
抗体包括重组产生的抗体和抗原结合部分。抗体包括非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。抗体包括单特异性、多特异性(例如，双特异性、三特异性和高阶特异性)。抗体包括四聚体抗体、轻链单体、重链单体、轻链二聚体、重链二聚体。抗体包括F(ab')2片段、Fab'片段和Fab片段。抗体包括单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)抗体、驼峰化(camelized)抗体、亲和体、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型抗体(抗Id)、微型抗体和纳米抗体。抗体包括单克隆群体和多克隆群体。
本文中使用的“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”以及其它相关术语是指包含与抗原相互作用并且有利于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于与其抗原特异性结合的抗体，所述术语将包括其CDR结构域中的至少一个结构域的至少部分。
如本文中在抗体或抗原结合蛋白或抗体片段的上下文中使用的术语“特异性结合(specific binding/specifically binds/specifically binding)”以及其它相关术语是指相对于其它分子或部分与抗原非共价或共价优选地结合(例如，抗体相对于其它可用抗原与具体抗原特异性结合)。通过其抗原名称(例如，“PD-1的抗体”、“抗PD-1抗体”或“PD-1抗体”)提及的本文所描述的抗体是与参考抗原特异性结合的抗体。在各个实施例中，如果抗体以10-5M或更少、或10-6M或更少、或10-7M或更少、或10-8M或更少、或10-9M或更少、或10- 10M或更少、或10-11M或更少的解离常数KD与抗原结合，则所述抗体与靶抗原特异性结合。本文所描述的融合蛋白包括与免疫检查点分子连同其它蛋白结构域特异性结合的ScFv。抗体或抗原结合蛋白或抗体片段的结合特异性可以例如通过ELISA、放射免疫测定(RIA)、MSD测定、免疫放射测定(IRMA)、电化学发光测定(ECL)或酶免疫测定(EIA)来测量。解离常数(KD)可以使用BIACORE表面等离子体共振(SPR)测定来测量。表面等离子体共振是指允许通过例如使用BIACORE系统(新泽西州皮斯卡塔韦通用医疗集团Biacore生命科学事业部(BiacoreLife Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。
如本文所使用的“表位”以及相关术语是指由抗原结合蛋白(例如，由抗体或其抗原结合部分)结合的抗原的一部分。表位可以包括通过抗原结合蛋白结合的两个或更多个抗原的一部分。表位可以包括一个抗原或两个或更多个抗原的非连续部分(例如，在抗原的初级序列中不连续但在抗原的三级和四级结构的上下文中彼此足够接近以通过抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。通常，抗体的可变区，具体地是CDR与表位相互作用。
本文中使用的“抗体片段”、“抗体部分”、“抗体的抗原结合片段”或“抗体的抗原结合部分”以及其它相关术语是指除了完整抗体之外包括结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；和Fd片段，以及dAb；双功能抗体；线性抗体；和包含足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少一部分的多肽。抗体的抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及包含足以赋予抗体片段抗原结合性质的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。
术语“Fab”、“Fab片段”以及其它相关术语是指包括可变轻链区(VL)、恒定轻链区(CL)、可变重链区(VH)和第一恒定区(CH1)的单价片段。Fab能够与抗原结合。F(ab')2片段是包括在铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。F(Ab')2具有抗原结合能力。Fd片段包括VH和CH1区。Fv片段包括VL和VH区。Fv可以与抗原结合。dAb片段具有VH结构域、VL结构域或VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634和6,696,245；以及Ward等人，《自然》341:544-546,1989)。
“单链可变片段”或“ScFv”是免疫球蛋白的重(VH)链和轻(VL)链的可变区的融合蛋白，其与大约十个至25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以提供灵活性，并且包括一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基以提供溶解度，并且可以将VH的N端与VL的C端连接，反之亦然。scFv缺乏其所衍生的抗体的恒定区，并且包括连接重链和轻链可变区的接头，使得抗体仅是单链，但被设计为保留原始免疫球蛋白的特异性。
术语“人抗体”是指具有衍生自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施例中，所有可变结构域和恒定结构域都衍生自人免疫球蛋白序列(例如，全人抗体)。这些抗体可以通过各种方式制备，所述方式的实例如下描述，包括通过重组方法或通过用小鼠的感兴趣的抗原进行免疫，所述小鼠被基因修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体。
“人源化”抗体是指具有通过一种或多种氨基酸取代、缺失和/或添加而与衍生自非人物种的抗体的序列不同的序列的抗体，使得与非人物种抗体相比，在将人源化抗体施用于人类受试者时，所述人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。在一个实施例中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸发生突变以产生人源化抗体。在另一个实施例中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。在另一个实施例中，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基被改成降低在将非人抗体施用于人类受试者时所述非人抗体的可能的免疫原性，其中经过改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或者对氨基酸序列作出的改变是保守性改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中找到。
本文中使用的术语“嵌合抗体”以及相关术语是指包含来自第一抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施例中，一个或多个CDR衍生自人抗体。在另一个实施例中，所有CDR衍生自人抗体。在另一个实施例中，来自多于一个人抗体的CDR在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包括来自第一人抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗体的轻链的CDR2和CDR3以及来自第三抗体的重链的CDR。在另一个实例中，CDR来源于如人和小鼠、或人和兔、或人和山羊等不同物种。本领域技术人员应理解，其它组合是可能的。
另外，框架区可以衍生自相同抗体之一，衍生自如人抗体等一种或多种不同抗体或衍生自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体相同、同源或衍生自所述抗体，而所述链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体相同、同源或衍生自所述抗体。还包括表现出期望的生物活性(即，与靶抗原特异性结合的能力)的此类抗体的片段。
术语“铰链”是指通常在蛋白质的两个结构域之间发现并且可以允许整体构建的灵活性和一个或两个结构域相对于彼此移动的氨基酸区段。在结构上，铰链区包括约10个至约100个氨基酸，例如，约15个至约75个氨基酸、约20个至约50个氨基酸或约30个至约60个氨基酸。
如本文所使用的，术语“Fc”或“Fc区”是指在铰链区中开始或在铰链区之后开始并且在重链的C端结束的抗体重链恒定区的部分。Fc区包括CH2和CH3区的至少一部分，并且可以包括或可以不包括铰链区的一部分。Fc区可以与Fc细胞表面受体以及免疫补体系统的一些蛋白质结合。Fc区表现出效应子功能，所述效应子功能包括包含补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用(ADP)、调理作用和/或细胞结合中的任何一种活性或两种或更多种活性的任何组合。在一个实施例中，Fc区可以包括增加或减少这些功能中的任何一种或任何组合的突变。在一个实施例中，Fc结构域包括减少效应子功能的LALA-PG突变(L234A、L235A、P329G)。在一个实施例中，Fc结构域介导蛋白质复合物的血清半衰期，并且Fc结构域中的突变可以增加或减少蛋白质复合物的血清半衰期。在一个实施例中，Fc结构域影响蛋白质复合物的热稳定性，并且Fc结构域中的突变可以增加或减少蛋白质复合物的热稳定性。Fc区也可以通过肽间二硫键二聚化。因此，包括IgG1或IgG4 Fc的融合蛋白可以形成同源二聚体。在IgG4 Fc结构域的一些实施例中，形成同源二聚体的肽间二硫键可能优于不通过铰链区中的S228P突变二聚化的肽内二硫键。
本公开提供了治疗组合物，所述治疗组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂混合的本文所描述的任何重组HSV或本文所描述的重组蛋白组合物。赋形剂涵盖例如载体、稳定剂、稀释剂或填料(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。另外的实例包括缓冲剂、稳定剂、防腐剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和等渗剂。当治疗组合物包含细胞时，药学上可接受的赋形剂将被选择以便不干涉细胞的活力或活性。
治疗组合物和用于制备治疗组合物的方法是本领域熟知的并且例如在“《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》”(第20版,A.R.Gennaro A R.编辑,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.))中找到。治疗组合物可以被调配用于肠胃外施用，可能并且可以例如包含赋形剂、无菌水、生理盐水、如聚乙二醇等聚亚烷基二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制本文所描述的抗体(或其抗原结合蛋白)的释放。纳米微粒调配物(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可以用于控制抗体(或其抗原结合蛋白)的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。调配物中抗体(或其抗原结合蛋白)的浓度取决于多种因素，包括要施用的药物剂量和施用途径而变化。
如本文所使用的术语“受试者”是指包括脊椎动物、哺乳动物和非哺乳动物的人和非人动物。在一个实施例中，受试者可以是人、非人灵长类动物、猿猴、猿、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫科动物、山羊、狼、蛙科动物或鱼。
术语“施用(administering/administered)”以及语法变体是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入受试者体内。本文所公开的调配物的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的，短语“肠胃外施用”意指除了肠内施用和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。
术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”或相关术语可以互换使用并且是指如本文所描述的病毒或多肽在施用于受试者时足以影响相关的疾病或病症的可测量的改善或预防的量。治疗有效量将取决于病毒或多肽的相对活性(例如，抑制肿瘤生长)、受试者的体重和年龄以及性别、受试者的疾病病状的严重程度、施用方式等而变化，这些可以由本领域普通技术人员确定。
重组溶瘤病毒
溶瘤病毒提供了癌症疗法的靶向方法，因为所述溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞。各种类型的溶瘤病毒是本领域已知的，包括包括细小病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、塞内加谷病毒(SVV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、麻疹病毒(MV)、痘苗病毒(VACV)、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV)。这些病毒在肿瘤细胞中复制并且引起细胞裂解和/或诱导对所述病毒感染的肿瘤细胞的免疫应答。本公开提供了重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包括编码如本文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的异源基因构建体。构建体可以包括在哺乳动物细胞中有活性的启动子，所述启动子与ScFv-Fc-TGFβtrap-编码序列可操作地连接，并且构建体可以插入到溶瘤病毒的基因组中。
在各个实施例中，针对ScFv-Fc-TGFβtrap的表达修饰的溶瘤病毒可以是单纯疱疹病毒(人α疱疹病毒；HSV)，如HSV-1、HSV-2或具有HSV-1或HSV-2两者的序列的重组HSV。例如，可以使用HSV-1或HSV-2病毒株的实验室病毒株或临床分离株。HSV-1和HSV-2的多种经分离的和经修饰的病毒株是本领域已知的，并且可以考虑用于本文所公开的组合物和方法中，作为非限制性实例，包括HSV-1病毒株A44、HSV-1病毒株Angelotti、HSV-1病毒株CL101、HSV-1病毒株CVG-2、HSV-1病毒株H129、HSV-1病毒株HFEM、HSV-1病毒株HZT、HSV-1病毒株JS1、HSV-1病毒株MGH10、HSV-1病毒株MP、HSV-1病毒株Patton、HSV-1病毒株R15、HSV-1病毒株R19、HSV-1病毒株RH2、HSV-1病毒株SC16、HSV-1病毒株KOS、HSV-1病毒株F和HSV-1病毒株17、HSV-2病毒株186、HSV-2病毒株333、HSV-2病毒株B4327UR、HSV-2病毒株G、HSV-2病毒株G、HSV-2病毒株HG52、HSV-2病毒株SA8、HSV-2病毒株SD90、HSV-2病毒株SN03、HSV-2病毒株SS01和HSV-2病毒株ST04。还考虑用于本文所提供的组合物和方法的是这些病毒株或本领域已知的或分离的其它病毒株的衍生物或突变体。
病毒株的衍生物包括但不限于可以具有一个或多个被突变的内源基因(包括一个或多个部分或完全缺失的内源基因)、可以具有插入到病毒基因组中的转基因(异源基因)(包括但不限于一种或多种可选择标志物、阴性可选择标志物(“自杀基因”)和/或可检测标志物(例如，编码荧光蛋白的基因或编码产生可检测产物的酶的基因))和/或可以具有一个或多个修饰，如但不限于限制性位点、重组位点或“着陆垫(landing pad)”、外源启动子等的病毒。衍生物可以具有其它修饰，如但不限于非基因序列的缺失或突变，例如，基因调节区(如启动子)或非编码序列(如但不限于正向或反向重复序列)。作为非限制性实例，病毒株的衍生物可以是可替代地或除了其它修饰之外还包括支持或调节病毒生长或活力的一种或多种转基因、影响宿主细胞功能的一个或多个基因或编码治疗蛋白的一种或多种转基因的病毒。
在一些非限制性实施例中，HSV是HSV-1，如HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株F、或者HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株F中的任何一种的衍生物。例如，用于引入ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的病毒株可以是HSV-1病毒株17突变体1716、HSV-1病毒株F突变体R3616(Chou和Roizman(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》89:3266-3270)、HSV-1病毒株F突变体G207(Toda等人(1995)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》9:2177-2185)、HSV-1病毒株F突变体G47Δ(Toda等人(2001)《美国国家科学院院刊》98:6396-6401)、HSV-1突变体NV1020(Geevarghese等人(2010)《人类基因疗法》21:1119-28)、RE6(Thompson等人(1983)《病毒学(Virology)》131:171-179)、KeM34.5(Manservigi等人(2010)《开放病毒学杂志(The Open VirologyJournal)》4:123-156)、M032(Campadelli-Fiume等人(2011)《医学病毒学综述(RevMed.Virol)》21:213-226)、Baco(Fu等人(2011)《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》129:1503-10)、M032或C134(Cassady等人(2010)《开放病毒学杂志》4:103-108)或Talimogenelaherparepvec(“TVec”，先前为
Figure BDA0004090762590000321
Liu等人(2003)《基因疗法》10:292-303)或这些病毒株中的任何病毒株的另外的衍生物或突变体。
内源病毒基因的突变可以包括影响病毒在非癌细胞中复制或繁殖的基因的突变或缺失，或病毒避免宿主防御的能力。例如，可以在包括ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的HSV中缺失ICP34.5编码基因、ICP6编码基因、ICP0编码基因、vhs编码基因或ICP27编码基因中的任何之一。不产生由一个或多个基因(其中基因是多拷贝的)编码的功能性蛋白的突变体在本文中被称为具有功能性缺失的基因。ICP34.5编码基因、ICP6编码基因、ICP0编码基因和vhs编码基因中的一者或多者的功能性缺失可能导致HSV在非癌细胞中复制受损。
ICP34.5编码基因RL1位于HSV-1基因组的长重复序列(RL)中，并且以两个拷贝存在。在一些实施例中，ICP34.5编码基因的一个或两个拷贝突变或部分或完全缺失，使得不产生功能蛋白。在优选的实施例中，包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的转基因和任选地IL12基因的溶瘤HSV功能性缺失负责神经毒性的ICP34.5编码基因(Chou等人(1990)《科学(Science)250:1262-1266)，例如，HSV病毒基因组的ICP34.5编码基因的两个拷贝都是失活的。例如，用于引入ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的溶瘤HSV可以是HSV-1病毒株17的突变体，并且可以是HSV1716(Brown等人(1994)《普通病毒学杂志(Journal of General Virology)》75:2367-2377；MacLean等人(1991)《普通病毒学杂志》72:631-639)或其突变体或衍生物，或可以是SeprehvecTM或其衍生物或突变体。HSV1716和SeprehvecTM两者在RL1基因的两个拷贝中都具有缺失，因此它们不产生功能性基因产物，但在其它方面各自具有与HSV病毒株17基本上相似的基因组，所述HSV病毒株17已经被完全测序(Pfaff等人(2016)《普通病毒学杂志》97:2732-2741；ncbi.nlm.nih.gov/genome，登录号：JN555585)。HSV1716在RL1基因座上缺失755bp，而Seprehvec RL1缺失是695bp，从基因编码区的上游开始并延伸通过大部分编码区。这些缺失区域可以用作用于插入本文所描述的转基因的位点。
如本文所提供的重组HSV可以具有插入到ICP34.5基因座、ICP6基因座、ICP0基因座或vhs基因座中的一个或多个转基因。在一些优选的实施例中，如本文所提供的重组溶瘤HSV可以具有插入到缺失的ICP34.5编码基因座中的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白基因和IL12基因中的一者或两者。在一些优选的实施例中，如本文所提供的重组溶瘤HSV针对ICP34.5是功能性缺失的(即，是ICP34.5无效的)，并且具有插入到ICP34.5编码基因座的两个拷贝中的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白基因和IL12基因。
本文所提供的重组溶瘤病毒包括编码新型融合蛋白的表达构建体，所述融合蛋白同时破坏免疫检查点蛋白和TGFβ(ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白构建体)的相互作用，所述融合蛋白包括可以由被编码所述融合蛋白的重组病毒感染的细胞表达和分泌的单一多肽链。ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的ScFv部分与免疫检查点蛋白特异性结合，并且TGFβtrap部分与TGFβ结合并螯合。融合蛋白的ScFv部分通过抗体Fc区，例如，IgG1 Fc区(例如，SEQ ID NO:5或与其具有至少95％同一性的变体)或IgG4 Fc区(例如，SEQ ID NO:3或与其具有至少95％同一性的变体，如SEQ ID NO:2)与TGFβ受体II的胞外结构域(TGFβRIIecto)连接。
由如本文所提供的重组HSV的表达构建体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白可以包括与程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)结合的ScFv抗体。PD-1是I型膜蛋白，其是在活化的巨噬细胞和T细胞上表达的T细胞调节因子的延伸的CD28/CTLA-4家族的成员。PD-L1(PD-1的配体)是在如活化的单核细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞以及在许多肿瘤细胞上表达的40kDa 1型跨膜蛋白。在活化的T细胞(包括肿瘤浸润性T细胞)上表达的PD-1与在许多肿瘤上上调的PD-L1结合可以抑制表达PD-1的T淋巴细胞的激活(增殖和细胞因子产生)(Topalian等人(2012)《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)》24:207-212)。
如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的ScFv可以衍生自与PD-1或PD-L1特异性结合的单克隆抗体，即，可以具有与PD-1或PD-L1特异性结合的单克隆抗体的重链可变序列和轻链可变序列。重链可变抗体区和轻链可变抗体区通过肽接头连接。例如，连接重链可变区和轻链可变区的肽接头的长度可以为八至三十个氨基酸，如长度为约十至约二十五个氨基酸，其中接头优选地包括多个甘氨酸残基以提供柔性，并且包括一个或多个羟基化氨基酸(例如，丝氨酸或苏氨酸)以提供溶解度。合适的接头的一个实例是(GGGGS)n接头(SEQ IDNO:61)，其中n可以例如介于1与30之间、介于1与24之间、介于1与12之间或介于1与6之间，例如，SEQ ID NO:56的接头(GGGGS)3。
ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的ScFv部分可以包括通过肽接头与PD-1的抗体的轻链的可变区连接的PD-1的抗体的重链的可变区，或者可以包括通过肽接头与PD-L1的抗体的轻链的可变区连接的PD-L1的抗体的重链的可变区。如本文所证明的，用编码抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白或抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的重组病毒感染的细胞产生并分泌能够破坏PD-1/PD-L1信号传导通路和TGFβ信号传导通路两者的功能性抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白或抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白。在一些实施例中，由重组HSV的表达构建体编码的融合蛋白的ScFv部分可以衍生自与PD-1特异性结合的单克隆抗体，如BB9抗PD-1抗体、RG1H10抗PD-1抗体或派姆单抗。在其它实施例中，由重组HSV的表达构建体编码的融合蛋白的ScFv部分可以衍生自与PD-L1特异性结合的单克隆抗体，如Combi5抗PD-L1抗体、H6B1LEM抗PD-L1抗体或阿维鲁单抗。
例如，在一些实施例中，由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap的抗PD-1ScFv可以包括具有SEQ ID NO:63(HC-CDR1)、SEQ ID NO:64(HC-CDR2)和SEQ ID NO:65(HC-CDR3)的氨基酸序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:66(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67(LC-CDR2)和SEQ IDNO:68(LC-CDR3)的氨基酸序列的轻链CDR(LC-CDR)，并且可以具有与SEQ ID NO:8具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:9具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变结构域。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括BB9抗体(SEQ ID NO:8)的重链可变结构域和BB9抗体(SEQ ID NO:9)的轻链可变结构域区。ScFv的接头可以将轻链的N端与重链的C端连接，或者可替代地可以将重链的N端与轻链的C端连接。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括与SEQ ID NO:11具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以是或包括SEQ ID NO:11。
在另外的实施例中，由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap的抗PD-1ScFv可以具有与SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH区和与SEQ ID NO:13具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL区。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括RG1H10抗体(SEQ ID NO:12)的VH区和RG1H10抗体(SEQ ID NO:13)的VL区。ScFv的接头可以将轻链的N端与重链的C端连接，或者可替代地可以将重链的N端与轻链的C端连接。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括与SEQ ID NO:15具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以是或包括SEQ ID NO:15。
在一些另外的实施例中，由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap的抗PD-1ScFv可以具有与SEQ ID NO:16具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH区和与SEQ ID NO:17具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL区。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括派姆单抗(SEQ ID NO:16)的VH区和派姆单抗(SEQ ID NO:17)的VL区。ScFv的接头可以将轻链的N端与重链的C端连接，或者可替代地可以将重链的N端与轻链的C端连接。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以包括与SEQ ID NO:19具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以是或包括SEQ ID NO:19。
在一些实施例中，由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap的抗PD-L1 ScFv可以具有与SEQ ID NO:20具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH区和与SEQ ID NO:21具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL区。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括Combi5抗体(SEQ ID NO:20)的VH区和Combi5抗体(SEQ ID NO:21)的VL区。ScFv的接头可以将轻链的N端与重链的C端连接，或者可替代地可以将重链的N端与轻链的C端连接。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括与SEQ ID NO:23具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以是或包括SEQ ID NO:23。
在另外的实施例中，抗PD-L1 ScFv可以具有与SEQ ID NO:24具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH区和与SEQ ID NO:25具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL区。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括H6B1LEM抗体(SEQ ID NO:24)的VH区和H6B1LEM抗体(SEQ ID NO:25)的VL区。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括与SEQID NO:27具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以是或包括SEQ ID NO:27。
在一些实施例中，由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap的抗PD-L1 ScFv可以具有与SEQ ID NO:28具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH区和与SEQ ID NO:29具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL区。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括阿维鲁单抗(SEQ ID NO:28)的VH区和阿维鲁单抗(SEQ ID NO:29)的VL区。在一些实施例中，抗PD-L1 ScFv可以包括与SEQ ID NO:31具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-1ScFv可以是或包括SEQ ID NO:31。
表1：与免疫检查点蛋白PD-1和PD-L1结合的单克隆抗体
Figure BDA0004090762590000351
Figure BDA0004090762590000361
由如本文所提供的重组溶瘤HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的TGFβtrap部分包括转化生长因子β受体II(TGFβRII)的胞外“胞外结构域”(Lin等人(1995)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》270:2747-2754)，其在本文中可以被称为TGFβtrap或TGFβRIIecto。由如本文所公开的构建体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的TGFβRIIecto优选地是人TGFβRII(SEQ ID NO:7)的胞外结构域，并且可以是人TGFβRII胞外结构域的变体，例如，可以具有与SEQ ID NO:7具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的保留SEQ ID NO:7的TGFβRIIecto的TGFβ结合活性的氨基酸序列。
TGFβRII胞外结构域通过Fc抗体区与ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的抗PD-1或抗PD-L1 ScFv连接。在一些实施例中，Fc区可以是IgG1或IgG4抗体的Fc区(例如，Genbank登录号：6IFJ_A或Genbank登录号：CAA04843.1)，并且可以是人IgG1或IgG4 Fc区或其变体，例如，可以是包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列(例如，SEQ IDNO:3)的Fc区，或者可以是包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的序列的Fc区。Fc区还可以是非人物种的IgG的Fc区或其变体。例如，用于将TGFβRII胞外结构域与scFv连接的Fc区可以来自犬、马或猫科动物物种。在各个实施例中，TGFβRII胞外结构域与抗体Fc区直接连接，而没有中间肽接头。在其它实施例中，TGFβRII胞外结构域通过介于约四与约三十二个氨基酸之间，例如，介于约四与约二十四个氨基酸之间或介于约四与约十六个氨基酸之间的序列与抗体Fc区连接。例如，(GGGGS)n(G4S)接头(SEQ ID NO:62)可以用于ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的TGFβRII胞外结构域与Fc区之间，其中n可以介于1与30之间、介于1与24之间、介于1与12之间、介于1与8之间、介于1与6之间或介于1与4之间，例如，SEQ ID NO:56的接头(GGGGS)3。
本文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白由单个开放阅读框编码并且被设计成由重组溶瘤HSV感染的细胞产生和分泌，所述细胞可以是培养物中的细胞或用包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的核酸构建体的重组HSV处理的受试者的细胞。在不将本文所提供的组合物和方法限制于任何特定机制的情况下，认为如本文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白可以由感染细胞产生和分泌，并且可以通过每个多肽的Fc区二聚化以形成具有与PD1或PD-L1结合的两个相同的ScFv和与TGFβ结合的两个TGFβRII胞外结构域的双多肽分子。
在各个实施例中，由核酸构建体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白将包括用于从细胞分泌融合蛋白的信号肽。信号肽可以是指导从真核细胞(如人类细胞)分泌的任何信号肽，并且可以优选地位于融合蛋白的ScFv的N端。可以在ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的N端使用的信号肽的一个实例是SEQ ID NO:34。可以位于由重组HSV编码的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的N端处的信号肽的另外的非限制性实例包括SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
在各个实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自抗PD-1抗体BB9，并且可以包括SEQ IDNO:40的氨基酸序列或可以是SEQ ID NO:40的变体，如与SEQ ID NO:40具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。在另外的实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自抗PD-1抗体RG1H10，并且可以包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列或可以是具有SEQ ID NO:42的序列的融合蛋白的变体，如与SEQ ID NO:42具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。在另外的实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自派姆单抗，并且可以包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列或可以是SEQ ID NO:44的蛋白质的变体，如与SEQ ID NO:44具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的变体包括具有替代性的信号肽、Fc区、VH/VL的取向以及连接VH和VL区或连接TGFβRIIecto和Fc区的接头的变体。
在又另外的实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自抗PD-L1抗体Combi5，并且可以包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列或可以是SEQ ID NO:46的多肽的变体，如与SEQ ID NO:46具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。在其它实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自抗PD-1抗体H6B1LEM，并且可以包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列或可以是SEQ ID NO:48的多肽的变体，如与SEQ ID NO:48具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。在另外的实施例中，编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中ScFv衍生自阿维鲁单抗，并且可以包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列或可以具有SEQ ID NO:50的序列或可以是SEQ ID NO:50的多肽的变体，如与SEQ ID NO:50具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的变体包括具有替代性的信号肽、Fc区、VH/VL取向以及连接VH和VL区或连接TGFβRIIecto和Fc区的接头的变体。
编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的构建体可以与用于在真核细胞中表达的启动子可操作地连接。可以在重组病毒中用于表达ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，SEQ ID NO:33)、杂合CMV启动子(例如，U.S9,777,290)、HTLV启动子、EF1α启动子、杂合EF1α/HTLV启动子(例如，SEQ ID NO:32)、JeT启动子(美国专利第6,555,674号)、SPARC启动子(例如，US 8,436,160)、RSV启动子、SV40启动子或逆转录病毒LTR启动子如MMLV启动子或衍生自任何这些启动子的启动子。构建体还可以包括聚腺苷酸化序列，例如，BGH、SV40、HGH或RBG聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列具有SEQ ID NO:38的序列。
如本文所提供的重组溶瘤病毒可以进一步包括编码白介素-12(IL12)的基因。因此，本文提供了经工程化的溶瘤病毒，所述经工程化的溶瘤病毒具有第一基因和至少第二基因，所述第一基因编码如上文所公开的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白，其中融合蛋白的ScFv与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合，所述至少第二基因编码IL12。IL12基因可以是人IL12或可以是另一哺乳动物物种的IL12。在其成熟的功能形式中，IL12是包括p40亚基和p35亚基的异二聚体。如本文所提供的包括用于表达IL12的基因的重组HSV可以包括编码p40多肽链的序列和编码p35多肽链的序列，其中每个序列独立地与单独的启动子可操作地连接。可替代地，编码p40亚基的序列可以通过2A“自切割”序列或内部核糖体进入位点(IRES)与编码p35亚基的序列连接，以便从同一转录单元产生两条多肽链。2A序列的非限制性实例包括P2A、E2A、F2A和T2A(参见例如，Liu等人(2017)《自然科学报告(Nature SciRep)》7:2193)。IRES的非限制性实例包括MMLV、RSV、FGF 1和2基因以及PDGF和VEGF基因的IRES(参见例如，Renaud-Gabardos等人(2015)《世界实验医学杂志(World J Exp Med)》5:11-20；Mokrejs等人(2006)《核酸研究(Nuc Acids Res)》D125-D130)。在另外的实施例中，p40亚基编码序列可以通过编码肽接头的序列与p35编码序列连接，所述肽接头允许产生编码两种亚基的单一多肽。例如，IL12基因可以编码单一多肽(例如，SEQ ID NO:54或与其具有至少95％同一性的多肽)，所述单一多肽包括通过2x弹性蛋白接头与鼠类IL12 p35亚基连接的鼠类IL12 p40亚基。
由如本文所提供的IL12基因编码的p40 IL12亚基可以包括人p40 IL12亚基，即，可以包括SEQ ID NO:57或可以包括与SEQ ID NO:57具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。由如本文所提供的IL12基因编码的p35 IL12亚基可以包括人p35IL12亚基，即，可以包括SEQ ID NO:58或可以包括与SEQ ID NO:58具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，如本文所提供的重组HSV的IL12基因包括p40 IL12编码序列，随后是肽接头，随后是p35编码序列，其中IL12基因编码SEQID NO:52的多肽或与SEQ ID NO:52具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
如本文所提供的重组HSV的IL12基因或IL12亚基基因可以与真核启动子可操作地连接，所述真核启动子包括但不限于本文所公开的任何真核启动子，例如，CMV启动子(例如，SEQ ID NO:33)、杂合CMV启动子(例如，U.S 9,777,290)、HTLV启动子、EF1α启动子、杂合EF1α/HTLV启动子(例如，SEQ ID NO:32)、JeT启动子(美国专利第6,555,674号)、SPARC启动子(例如，US 8,436,160)、RSV启动子、SV40启动子或逆转录病毒LTR启动子或衍生自这些启动子中的任何启动子的启动子。与IL12基因可操作地连接的启动子可以与和编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因可操作地连接的启动子相同或不同。编码IL12的构建体还可以包括聚腺苷酸化序列，例如，BGH、SV40、HGH或RBG聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列具有SEQ ID NO:38的序列。
包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因和编码IL12的基因的双基因重组HSV可以包括编码本文所公开的任何ScFv-Fc-TGFβtrap的基因。例如，双基因重组HSV可以包括IL12基因和编码其中ScFv与PD-1特异性结合的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的基因。在各个实施例中，双基因载体的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的ScFv可以衍生自例如BB9抗体、RG1H10抗体或派姆单抗。在一些实施例中，由双基因载体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白包括SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44，或包括与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其它实施例中，双基因重组HSV可以包括IL12基因和编码其中ScFv与PD-L1特异性结合的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的基因。例如，双基因载体的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的ScFv可以衍生自Combi抗体、H6B1LEM抗体或阿维鲁单抗。在一些实施例中，由双基因载体编码的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白包括SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50，或包括与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ IDNO:50具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文考虑的实施例中的任何实施例中，ScFv-Fc-TGFβtrap编码基因和IL12编码基因可以被定向为以相同方向转录并可以从病毒基因组的同一条链转录而来，或者两个基因可以被定向为以相反方向转录，使得基因被病毒基因组的相反的链转录。在本文考虑的实施例中的任何实施例中，ScFv-Fc-TGFβtrap编码基因和IL12编码基因可以插入在HSV基因组的相同基因座处，例如，可以在基因组中彼此相邻，或者可以将两个转基因插入在不同的基因组基因座处。在一些实例中，ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12基因中的一者或两者被插入到基因座中，其中该基因功能性缺失。例如，ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12基因中的一者或两者可以插入到编码ICP6的基因、编码ICP0的基因、编码vhs的基因、编码ICP27的基因或编码ICP34.5的RL1基因中。在一些实施例中，ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12基因中的两者都被插入到RL1基因的两个拷贝中。
在各个实施例中，包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因和编码IL12的基因的双基因重组HSV可以包括编码与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少95％同一性的ScFv-Fc-TGFβtrap的基因和编码与SEQ ID NO:54具有至少95％同一性的IL12的基因，其中ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白破坏PD1/PD-L1信号传导并与TGFβ结合。例如，如本文所提供的重组HSV可以包括编码SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的ScFv-Fc-TGFβtrap的基因，并且可以编码SEQ ID NO:54的IL12。在另外的实施例中，包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因和编码IL12的基因的双基因重组HSV可以包括编码与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50具有至少95％同一性的ScFv-Fc-TGFβtrap的基因和编码与SEQ ID NO:54具有至少95％同一性的IL12的基因，其中ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白破坏PD1/PD-L1信号传导并与TGFβ结合。例如，如本文所提供的重组HSV可以包括编码SEQID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50的ScFv-Fc-TGFβtrap的基因，并且可以编码SEQID NO:54的IL12。
根据本文所提供的实施例中的任何实施例的双基因重组HSV可以是HSV-1病毒株或HSV-2病毒株，并且在一些优选实施例中，所述双基因重组HSV衍生自HSV-1病毒株F、HSV-1病毒株KOS、HSV-1病毒株JS1或HSV-1病毒株17。在各个实施例中，HSV-1病毒株不包括功能性ICP34.5编码基因。在一些实施例中，重组HSV是HSV1716
Figure BDA0004090762590000401
的衍生物(WO 92/13943；MacClean等人(1991)《通用病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》72:631-639；Brown等人(1992)《通用病毒学杂志》75:2367-2377)。
在另外的实例中，ScFv-Fc-TGFβtrap基因和IL12基因引入其中的HSV可以是
Figure BDA0004090762590000411
一种缺乏功能性ICP34.5编码基因的HSV-1 17病毒株衍生的HSV载体，其中ICP34.5编码基因具有695bp缺失。包括第一RL1基因(核苷酸位置513-1259)的HSV基因组的TRL区包括从位置382至1076的缺失，并且包括第二RL1基因(核苷酸位置125858-12112)的HSV基因组的IRL区包括从位置125992至125298的缺失。编码ICP34.5的RL1基因中的缺失位点也是本文所提供的构建体的插入位点。因此，在各个示例性实施例中，本文所提供的重组HSV包括插入在ICP34.5编码基因座处的编码ScFv-Fc-TGFβtrap的转基因和编码IL12的转基因，其中HSV的两个ICP34.5编码基因都是失活的，并且两个ICP34.5编码基因都具有ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12编码转基因的插入。重组HSV可以具有病毒基因组的另外的改变，例如，可以具有一个或多个被突变的另外的内源病毒基因，包括功能性缺失。ScFv-Fc-TGFβtrap基因和IL12基因可以由单独的启动子调节。基因可以以相同或相反方向定向，例如，在一些实施例中，基因从病毒基因组的相反链转录。在一些实施例中，重组HSV是在ICP34.5编码基因的两个拷贝中具有695bp内部缺失的/>
Figure BDA0004090762590000412
HSV-1衍生物，并且将ScFv-Fc-TGFβtrap和IL12编码转基因各自插入到被定向用于以相反方向转录的两个非功能性ICP34.5编码基因座中。
本文所提供的重组HSV可以使用本领域已知的分子克隆技术来制备，包括限制性内切核酸酶消化、连接、聚合酶链式反应(PCR)和/或基因合成(例如，使用商业服务，如DNA2.0、Blue Heron、Genewiz、GeneScript、泓迅生物科技公司(Synbio Technologies)、GeneArt等)。将核酸构建体插入到HSV基因组(其大小可以为例如约135kb至约150kb)中可以利用同源重组，包括使用位点特异性重组酶(参见例如，US 9,085,777，所述文献通过引用并入本文)和/或可以使用cas/CRISPR方法。多种HSV病毒株的基因组序列是可公开获得的，包括HSV-1病毒株17的序列(人α疱疹病毒1病毒株17；GenBank：LT576870.1)。
为了生产病毒，可以将病毒基因组(例如，已经进行一个或多个修饰(插入、缺失或序列改变)到其中的重组病毒基因组)，例如其中已经插入一个或多个核酸构建体的重组病毒基因组，转染到能够产生病毒的细胞，例如，Vero细胞、BHK细胞、A431细胞或HepG2细胞中。可以从接种的感染细胞的噬斑中分离重组病毒。
如本文所提供的重组病毒可以用于治疗癌症。病毒可以被调配为药物组合物，其中病毒可以与药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂组合。载体可以包括醇(如乙醇)、糖或糖醇(例如，肌醇、山梨糖醇、甘露醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇)、或其合适的混合物、蛋白质或肽(血清白蛋白、明胶等)和/或脂质或表面活性剂。例如用于肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、瘤内、瘤周和腹膜内施用或用于导管递送的水溶液可以包括缓冲剂并且可以包括盐和/或糖，使得组合物是等渗的。药学上可接受的盐包括无机酸，例如，盐酸或磷酸，或有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。盐包括例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物或氯化物，以及如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱的盐。用于施用于人类受试者的药物调配物将是无菌的，并且可以任选地包括防腐剂、抗菌剂和/或抗真菌剂。
药物病毒制剂可以包括例如滴度为约106pfu/ml、大于106pfu/ml、107pfu/ml、大于107pfu/ml、108pfu/ml或大于108pfu/ml的重组HSV。药物调配物可以在小瓶中提供，并且可以以冷冻形式提供，并且可以任选地包括冷冻保护剂，例如，甘油或明胶。
治疗癌症的方法
还提供了使用如本文所提供的重组HSV治疗癌症的方法。所述方法可以包括向患有癌症的受试者施用有效量的重组HSV。重组HSV可以作为如本文所提供的药物组合物施用。例如，药物组合物可以是在一些实施例中注射到肿瘤中或肿瘤附近的可注射溶液。可替代地或另外，重组HSV可以静脉内或动脉内施用(参见例如，US 2020/0078426，所述文献通过引用并入本文)。
在一些实施例中，本文提供了使用编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的重组HSV治疗受试者的癌症的方法，其中相对于接受不编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的对照病毒的受试者，接受编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的重组HSV的受试者的肿瘤的进展得到减缓。用重组HSV治疗可能导致肿瘤生长或扩散降低、或肿瘤生长或扩散的速率降低。在一些实施例中，相对于用不编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的对照病毒治疗，使用编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的重组HSV治疗受试者的癌症可以增加存活率。在一些实施例中，相对于用不编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的对照病毒治疗，使用编码如本文所提供的ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的重组HSV治疗受试者的癌症可以减少肿瘤复发。
可以通过多种途径中的任何途径施用根据本发明各方面的病毒，所述途径包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、瘤内、瘤周和口服。在一些实施例中，HSV可以被调配成液体组合物，以便通过注射到受试者身体的选定区域来施用。例如，HSV可以施用于体腔(腔内施用，例如，胸膜内、肺内或腹膜内)，其可以任选地使用插入到患者体内的引流管或导管。施用也可以通过瘤内或瘤周递送，其可以通过注射进行。溶瘤单纯疱疹病毒的施用可以是局部施用，例如，施用于其中存在肿瘤的身体的局部区域。
可替代地，溶瘤单纯疱疹病毒的施用可以通过输注到血液中来进行，例如，静脉内或动脉内输注，并且病毒可以被调配成用于此类施用。将所调配的病毒组合物输注到血液中可能需要约30分钟至约3小时，例如，约1小时、约2小时或约3小时。静脉内施用可以包括在紧邻癌症(例如，头颈癌)的一个或多个位置处输注到静脉系统中。
优选地在外周部位处输注到血液，例如，输注到皮肤表面附近的静脉或动脉，而不是在深层组织内。合适的外周位置的实例是臂或腿中的静脉。在一些相关实施例中，施用可以通过中心静脉管线进行。施用优选地是非侵入性的，例如，不需要外科手术、侵入性或介入性放射程序以便在深层组织内或内脏器官的近端定位特定静脉或动脉。在一些实施例中，受试者可以具有所装配的外周静脉装置、导管或套管，以便于施用。优选地，施用可以在门诊环境中进行。
所施用的HSV可以是本文所公开的任何重组HSV，例如，包括编码能够与如PD-1或PD-L1等免疫检查点抑制剂结合并且能够与TGFβ结合的ScFv-Fc-TGFβtrap的核酸构建体的任何重组HSV。除了与PD-1或PD-L1特异性结合的ScFv-Fc-TGFβtrap之外，用于治疗癌症的重组HSV还可以包括IL12基因。
待治疗的受试者可以是任何动物或人。在各个实施例中，受试者是人，并且可以是儿童。受试者可能已经被诊断患有癌症或疑似患有癌症。受试者先前可能接受过针对癌症的治疗。在另外的实施例中，受试者可以是非人动物，如但不限于狗、猫或马。
癌症可以是赘生物或肿瘤。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是良性的或恶性的并且可以是原发性的或继发性的(转移性的)。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。待治疗的癌症可以包括非CNS实体瘤、肉瘤、脊索瘤、斜坡脊索瘤、外周神经鞘瘤、恶性外周神经鞘瘤或肾细胞癌。在一些实施例中，所述癌症可以是实体瘤。实体瘤可以例如位于膀胱、骨骼、乳房、眼睛、胃、头颈部、生殖细胞、肾脏、肝脏、肺、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、软组织、肾上腺、鼻咽、甲状腺、视网膜和子宫中。实体瘤可以包括黑色素瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤和神经母细胞瘤。癌症可以是小儿实体瘤，即，儿童的实体瘤，例如，骨肉瘤、软骨母细胞瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、恶性生殖细胞瘤、威尔姆氏瘤(Wilms tumor)、恶性横纹肌样肿瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、肾上腺皮质癌、鼻咽癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、横纹肌肉瘤、硬纤维瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤或神经纤维肉瘤。
所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实例，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用、肺内施用、腹膜内施用、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注、导管或其它递送方式进行。注射可以是例如，肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。在一些实施例中，用重组HSV治疗可以通过将病毒施用于体腔(腔内施用，例如，肺内或腹膜内)来进行，并且可以涉及通过插入患者体内的导管或引流管进行的施用。病毒的施用可以在渗出液从体腔完全或部分排出后进行。病毒可以作为液体调配物施用。治疗方案可以包括多于一次施用病毒，并且可以包括在数小时、数天、数周或数月的时间段内多次给药。治疗方案可以在任何其它癌症治疗之前或之后。
重组融合蛋白组合物
本发明的另外的方面是包含ScFv-Fc-TGFβtrap多肽的组合物。所述组合物可以是例如由用如本文所提供的包括用于在宿主细胞中表达ScFv-Fc-TGFβtrap的核酸构建体的重组HSV感染的细胞培养物制备的无病毒条件培养基(VFCM)。作为非限制性实例，组合物可以包含ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白，其包括SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50或与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50具有至少95％同一性的任何这些ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的变体，其中ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白破坏PD1/PD-L1信号传导并与TGFβ结合。在一些实施例中，组合物可以包含具有基于BB9 PD-1抗体的scFv的ScFv-Fc-TGFβtrap，例如，包括SEQ ID NO:40或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物可以包含具有基于Combi5 PD-L1抗体的scFv的ScFv-Fc-TGFβtrap，例如，包括SEQ ID NO:46或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。例如，VFCM可以由HSV(如本文所公开的SepGI-097或SepG1-138)或与其基本上相似的HSV产生。无病毒条件培养基可以任选地进一步包括IL12。例如，VFCM可以由HSV(如本文所公开的SepGI-143或SepG1-162)或与其基本上相似的HSV产生，或可以由HSV(如本文所公开的SepGI-145或SepG1-167)或与其基本上相似的HSV产生。如本文所提供的VFCM组合物可以通过实例中公开的方法来制备，通过从感染培养物中收获培养基，离心以去除细胞和细胞碎片，并且过滤以去除病毒。
在一些实施例中，VFCM可以用于癌症治疗方法中。例如，在一些实施例中，VFCM可以用于兽医应用，其中向患有癌症的非人动物(如但不限于狗、马、牛、公牛、猴、猿或猫科动物)施用VFCM组合物。
癌症可以是任何类型的癌症，如但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤或肾癌。在各个实施例中，提供了用于通过施用如本文所提供的VFCM来减缓或停止癌症进展、减小肿瘤大小、预防癌症复发或延长如非人类受试者等受试者的存活的方法。
用于施用于受试者的VFCM组合物可以是浓缩的、透析的或稀释的VFCM。VFCM的一种或多种组分可以例如通过捕获或色谱法从VFCM中去除，并且一种或多种化合物可以添加到VFCM中，包括但不限于一种或多种药物赋形剂(如但不限于盐、缓冲剂、稳定剂)或一种或多种治疗化合物。在一些实施例中，VFCM组合物可以用于制备分离的、部分纯化的或基本上纯化的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白。部分或基本纯化可以通过蛋白质化学领域公知的蛋白质的分离/纯化方法进行。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分配或这些的任何组合。例如，可以对条件培养基进行色谱法和/或透析。在一个实施例中，色谱法包括任何一个程序或两个或更多个程序的任何组合，包括亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和/或二氧化硅色谱法。在一些实施例中，亲和色谱法包括蛋白A或G(来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁组分)。
纯化后，多肽可以交换到不同缓冲液中和/或通过本领域已知的各种方法中的任何方法浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。
包含ScFv-Fc-TGFβtrap和任选地IL12的经纯化的蛋白质组合物(包含基本上纯化的蛋白质组合物)可以被调配成用于药物用途，并且可以用于治疗癌症。如上文针对病毒调配物所公开的，施用可以是局部的，或者可以是全身性的，并且优选地以治疗有效量进行。所施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方例如关于剂量的决定等在全科医生和其它医师的责任之内，并且通常要考虑待治疗的病症、个体患者的病状、递送部位、施用方法以及执业医生已知的其它因素。上文提及的技术和方案的实例可以在《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第20版,2000,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司出版中找到。
实例
实例1：ScFv-Fc-TGFβtrap构建体。
ScFv-Fc-TGFβtrap构建体被设计成用于表达融合蛋白，所述融合蛋白从融合蛋白的N端到C端依次包括：信号肽(SEQ ID NO:34)、与PD-L1或PD-1特异性结合的ScFv抗体、人IgG4 Fc区(Fc4，SEQ ID NO:2)和人TGFβ受体II的胞外结构域(TGFβRII胞外结构域或TGFβRIIecto，SEQ ID NO:7)。图1A提供了包括与编码融合蛋白的序列可操作地连接的EF1α/HTLV杂合启动子(SEQ ID NO:32)的构建体的一般图。组装了三个ScFv-Fc-TGFβtrap构建体，其包括编码ScFv抗PD-1抗体的序列：包括编码抗PD-1抗体BB9的ScFv的序列(SEQ ID NO:39)的构建体、包括编码抗PD-1抗体RG1H10的ScFv的序列(SEQ ID NO:41)的构建体和包括编码具有衍生自抗PD-1抗体派姆单抗的氨基酸序列的ScFv的序列(SEQ ID NO:43)的构建体。抗PD-1单克隆抗体BB9和RG1H10对小鼠以及人PD-1具有反应性(表1)。另外，构建了三个构建体，其包括针对抗PD-L1的ScFv抗体：包括编码抗PD-L1抗体H6B1LEM的ScFv的序列(SEQ IDNO:45)的构建体、包括编码抗PD-L1抗体Combi5的ScFv的序列(SEQ ID NO:47)的构建体和包括编码具有衍生自阿维鲁单抗的氨基酸序列的ScFv的序列(SEQ ID NO:49)的构建体。抗PD-L1单克隆抗体H6B1LEM、抗PD-L1单克隆抗体Combi5和抗PD-L1单克隆抗体阿维鲁单抗对小鼠和人PD-L1具有反应性(表1)。
表2：抗体-Fc-TGFβRII融合蛋白的ScFv组分
Figure BDA0004090762590000461
通过PCR克隆产生侧接attL位点的构建体，并且将其插入到HSV-1
Figure BDA0004090762590000462
基因组的内部缺失的RL1基因座中。/>
Figure BDA0004090762590000463
是衍生自HSV病毒株17的HSV-1载体，其中编码负责神经毒性的γ34.5kd(ICP34.5)多肽的RL1基因的两个拷贝被使RL1基因失活的695bp缺失(RL1序列内的核苷酸125975至125221)破坏。RL1缺失位点包括用于插入侧接attL序列的任何所关注基因或构建体的attR重组位点。基本上根据制造商的说明书，使用体外重组克隆，将侧接attL序列的ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体在缺失位点处插入到两个RL1基因座中，所述重组克隆使用LR ClonaseTM加上整合酶和整合宿主因子的酶混合物(加利福尼亚州卡尔巴斯德的赛默飞世尔公司(ThermoFisher,Carlsbad,CA))。
重组反应后，将病毒基因组DNA转染到BHK(幼仓鼠肾成纤维细胞)细胞中用于产生重组病毒。从经转染的BHK细胞收获病毒，然后用于感染Vero(非洲绿猴(绿猴属(Chlorocebus sp.))肾上皮)细胞。收集来自受感染的Vero细胞的单个噬斑并且传代到新的Vero细胞。重复此过程，总共四轮噬斑分离。然后通过用约3.2x105个噬斑形成单位(PFU)的病毒感染约3.2x107个BHK细胞并且培养三天来产生病毒储备液。三天后，将上清液以2100 x g旋转两次，以沉淀细胞和碎片。在细胞沉淀之后，将包含病毒的上清液以17200 xg旋转以沉淀病毒。将病毒重悬、过滤，并且在Vero细胞上滴定。由经纯化的ScFv-Fc-TGFβtrap病毒SepGI-097(抗PD-1-Fc4-TGFβtrap)、SepGI-137(抗PD-L1-Fc4-TGFβtrap)、SepGI-138(抗PD-L1-Fc4-TGFβtrap)和SepGI-152(抗PD-1-Fc4-TGFβtrap)产生病毒种子储备液和研究储备液。
实例2：由重组ScFv-Fc-TGFβtrap病毒产生的TGFβRIIecto的定量
使用SepGI-097(抗PD-1-Fc4-TGFβtrap)、SepGI-137(抗PD-L1-Fc4-TGFβtrap)和SepGI-138(抗PD-L1-Fc4-TGFβtrap)病毒来感染A431人表皮样癌细胞和HepG2人肝癌细胞，以验证由病毒感染的细胞引起的ScFv-Fc-TGFβtrap的产生。
实例1中描述的经工程化的ScFv-Fc-TGFβtrap构建体包括N端信号肽(SEQ ID NO:34)，以指导融合蛋白从感染宿主细胞分泌(图1A)。为了确定由转基因病毒产生的TGFβRII胞外结构域(TGFβRIIecto)的量，分析了用经工程化的病毒株感染的宿主细胞的条件培养基。Meso Scale Discovery(MSD)夹心测定(马里兰州罗克维尔的Meso Scale Discovery公司(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)；Dabitao等人(2011)《免疫学方法杂志(JImmunol Methods)》372:71-77)是使用识别TGFβRII的捕获和检测抗体进行的(人TGFβ-RII Duo Set ELISA试剂盒，明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))。使用山羊抗人TGFβRII捕获抗体(R&D系统公司部件#842376)来包被96孔板的孔，并且将生物素化山羊抗人TGFβRII抗体(R&D系统公司部件#842377)与MSD磺基标签标记的链霉亲和素(马里兰州罗克维尔的中尺度诊断公司(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)组合使用以供检测。
为了从ScFv-Fc-TGFβtrap HSV病毒株产生无病毒条件培养基(VFCM)，在37℃、5％CO2下，用3x105个A431细胞接种于12孔板(或HepG2细胞，接种在单独的板中)，1mL培养基中。第二天，用重组HSV以MOI＝0.5感染A431细胞和HepG2细胞，并且在1.25mL培养基中温育3天。3天后，去除细胞上清液，并且通过0.1μm膜(颇尔Acrodisc注射器过滤器(PallAcrodisc Syringe filter)部件#4611)过滤以去除病毒。然后将病毒后培养上清液(VFCM)等分并且储存在-80℃下。还制备了不包括外源转基因的SepGI-Null、
Figure BDA0004090762590000481
HSV载体的VFCM作为对照。
通过在杜尔贝科氏PBS(DPBS)中稀释捕获抗体以制备4μg/mL储备溶液并且将30μl储备溶液添加到96孔板的每个孔的底角来进行用于定量TGFβRII胞外结构域的测定。轻轻拍打板以确保抗体溶液均匀地覆盖每个孔的底部，并且然后将板在跷跷板式振荡器上温育5-10分钟，之后将板密封并且在不振荡的情况下在4℃下温育过夜。然后将孔用含150μl5％ MSD阻断剂A(马里兰州罗克维尔的Meso Scale Discovery公司)的0.05％ Tween20、1xDPBS中在室温下封闭1.5小时，或在4℃下在定轨振荡器上过夜。然后将板用1xDPBS、0.05％Tween20洗涤三次，之后将VFCM样品的稀释液(例如，1:10、1:50、1:250稀释液)以50μl体积添加到孔中。除了SepGI-Null(缺乏转基因)的VFCM之外，将来自未感染细胞的条件培养基用作另外的对照。将80ng/ml TGFβRII标准品的连续稀释液(提供于R&D ELISA试剂盒中)添加到单独的孔中。将板密封并且在室温下在定轨振荡器上温育2小时。在此温育后，将板用PBS/0.05％ Tween20(PBS-T)洗涤三次，之后添加25μl检测溶液(1μg/ml生物素化TGFβRII检测抗体、1μg/ml磺基标签标记的链霉亲和素试剂和1％阻断剂的A的PBS-T溶液)。将板密封，用箔覆盖，并且在定轨振荡器上在室温下温育1小时。然后将板用PBS-T洗涤三次，将150μl的读取缓冲液添加到每个孔中，并且根据制造商的说明书(Meso Scale Discovery公司)在MSD成像仪上读取板。
图2A和2B提供了基于来自重组人TGFβRII的连续稀释液的标准曲线的插值，以每个样品两个孔的平均值(以ng/mL为单位)的形式提供了分析结果。图2A示出了从感染的A431细胞的VFCM的MSD测定中确定的TGFβRII抗体结合分子的量，并且图2B提供了从感染的HepG2细胞的VFCM的MSD测定中确定的TGFβRII抗体结合分子的量。来自测定来自两种细胞类型的VFCM的结果是显著一致的，这表明用包括ScFv-Fc-TGFβtrap(SepGI-097、SepGI-137和SepGI-138)的病毒感染的所有细胞样品都产生与TGFβRII抗体反应的分子(即，产生ScFv-Fc-TGFβtrap分子)，其中SepGI-138感染导致产生最大量的含TGFβRII的分子。
实例3：基于CD103细胞的TGFβRIItrap功能测定。
TGFβ1通过细胞毒性T细胞诱导CD103(αE整合蛋白)表达(Wang等人(2004)《免疫学杂志(J Immunol)》172:214-221；El-Asady等人(2005)《实验医学杂志(J Exp Med)》201:1647-1657)。为了确定ScFv-FcTGFβtrap构建体的表达阻断TGFβ信号传导的程度，开发了一种用来评估ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白通过测量从CD8+T细胞表面缺乏CD103的表达来耗尽TGFβ的细胞培养基的能力的测定方法。
使用来自干细胞技术公司(STEMCELL Technologies)(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华(Vancouver,BC,Canada)；目录号17951)的EasySepTM人T细胞分离试剂盒来从PBMC中分离T细胞。简而言之，将经解冻的PBMC(大约5x107个细胞)添加到9mL预温热的培养基中并且以1,400rpm沉淀5分钟，并且然后重悬于1ml Robosep缓冲液(干细胞技术公司，目录号20104)中并且转移到5ml聚苯乙烯管中。然后将来自EasySepTM人T细胞分离试剂盒的50μl抗体混合物添加到细胞中，并且通过移液将细胞加上抗体混合物混合并在室温下温育10分钟。将提供有EasySepTM试剂盒的珠粒涡旋，并且将40μl珠粒悬浮液添加到细胞-抗体混合物中。2-3分钟后，将EasySepTM缓冲液添加到管中，以达到总体积2.5ml。将包括细胞、抗体和珠粒的整个2.5ml添加到Robosep磁体中并且静置3分钟，之后用2ml血清移液管去除缓冲液和未结合的细胞并且添加到15ml锥形管中。添加完全培养基以使体积达到10ml，并且将管以1,400rpm离心4分钟。去除上清液后，将细胞沉淀物重悬于4ml AIM-V培养基(赛默飞世尔公司，目录号12055091)中，并且对细胞进行计数。将细胞冷冻以供将来使用，或者在如下所述的CD3/CD28选择后直接使用。
在基于细胞的CD103表达测定中，对用ScFv-Fc4-TGFβtrap病毒SepGI-097、SepGI-137和SepGI-138感染的A431细胞和HepG2细胞的VFCM的TGFβtrap功能进行测试。将SepGI-Null的VFCM、不具有任何外源转基因的
Figure BDA0004090762590000491
载体和来自未感染细胞的条件培养基用作对照。
将50μl的4ng/mL重组人TGFβ1的溶液(rhTGFβ；宾夕法尼亚州韦恩市的义翘神州科技有限公司(Sino Biological,Wayne,PA)添加到每个孔中，随后添加100μl未稀释的或在含有1％ FBS的RPMI培养基中以1:5稀释的VFCM。一式两份地进行每个测定。对照孔接受100μl AIM-V培养基，所述培养基包括从6000ng/mL滴定至8ng/mL的重组人TGFβRII(义翘神州科技有限公司，目录#103358-H03H)加上2.5μg/mL的针对PD-1或PD-L1的IgG。
在将rhTGFβ和ScFv-Fc4-TGFβtrap HSV VFCM添加到孔中之后，将板在37℃、5％CO2下预温育，同时进一步制备T细胞。将T细胞旋转沉降并且以1.6x106个细胞/mL的浓度重悬于AIM-V培养基中。通过将珠粒悬浮于1ml AIM-V培养基中并且使用Robosep磁体进行捕获来洗涤足以在测定(每个测定8x104个T细胞)中提供3:1的T细胞与珠粒比率的抗CD3/CD28磁性珠粒(人T细胞激活剂Dynabeads，加利福尼亚州卡尔巴斯德的赛默飞世尔公司)。然后将珠粒悬浮于体积为100-200μl AIM-V培养基中并且转移到重悬的T细胞中。通过倒置将管混合，并且将50μl T细胞加上珠粒添加到包括rhTGFβ和VFCM的96孔测定板的孔中。然后将板在37℃、5％ CO2下温育两天(如果使用新鲜的T细胞的话)或三天(如果使用冷冻的T细胞的话)。
为了染色细胞以便进行流式细胞术分析，将板以1,500rpm离心5分钟，去除上清液，将板短暂涡旋，将80μl染色混合物添加到每个孔中，并且将混合物在孔中上下吸移。染色混合物包括含140μl CD4-PECY7(百进生物公司(BioLegend)#357410，克隆#A161A1)、140μl CD8-AF488(百进生物公司#300916，克隆#HIT8a)和280μl CD103-PE(百进生物公司#350206，克隆#Ber-ACT8)的10.5ml FACS缓冲液(DPBS+2％ FBS，1mM EDTA)。然后将板在冰上或4℃下在黑暗中温育20分钟。温育后，将100μl FACS缓冲液添加到每个孔中，并且将板以1,500rpm离心4分钟。使用200μl FACS缓冲液重复洗涤，并且最后将细胞重悬于180μl中并基本上根据制造商的说明书使用Attune NxT流式细胞仪(赛默飞世尔公司)通过流式细胞仪进行分析。
图3A提供了基于表达测定的滴定曲线，其中增加重组TGFβRII的量能够阻止用TGFβ1刺激的CD8+T细胞上的CD103表达。图3B提供了用TGFβ1和在A431细胞中产生的SepGI-097、SepGI-137和SepGI-138HSV的VFCM处理的CD8+T细胞的FACS分析的结果，并且图3C提供了用TGFβ1和在HepG2细胞中产生的SepGI-097、SepGI-137和SepGI-138HSV的VFCM处理的CD8+T细胞的FACS分析的结果。
结果显示，所有表达ScFv-Fc4-TGFβtrap的病毒都能够阻止CD103在CD8+T细胞表面上的表达。用编码“BB9”抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβtrap融合蛋白的SepGI-097、编码“H6B1LEM”抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβtrap融合蛋白的SepGI-137或编码“Combi5”抗PD-L1ScFv-Fc4-TGFβtrap融合蛋白的SepGI-138感染的宿主细胞全都产生了能够阻断TGFβ信号传导的病毒上清液。
实例4：抗PD-1ScFv和抗PD-L1 ScFv功能的阻断测定。
使用PD-1/PD-L1阻断生物测定(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(PromegaCorp.,Madison,WI))来评估ScFv-Fc-TGFβtrap病毒的抗PD-1或抗PD-L1 ScFv部分的功能。这种基于细胞的测定依赖于PD-1/PD-L1信号传导诱导由NFAT应答元件调节的基因的表达的能力。在测定期间，将已经被工程化以表达由NFAT应答元件调节的荧光素酶基因的Jurkat T细胞和表达人PD-L1的经工程化的效应CHO-K1细胞以及激活T细胞受体的蛋白质一起温育。当CHO-K1细胞通过PD-L1/PD-1相互作用与Jurkat T细胞接合时，不诱导荧光素酶表达；然而，由PD-1/PD-L1拮抗剂的结合引起的的相互作用的破坏解除了抑制，从而产生荧光素酶表达。基本上根据制造商的说明书进行PD-1/PD-L1阻断测定，其中测试样品是来自用经工程化的ScFv-Fc-TGFβtrap HSV感染的A431细胞的VFCM的稀释液。还测定了SepGI-Null的VFCM、缺乏外源转基因的HSV
Figure BDA0004090762590000511
载体和来自未感染细胞的条件培养基作为对照。在96孔板中进行测定，并且用Tecan(瑞士门内多夫(/>
Figure BDA0004090762590000512
Switzerland))Spark酶标仪分析荧光素酶信号。
图4A是使用5μg/ml至0.02μg/ml的与PD-1结合的BB9 IgG的稀释液的PD-1/PD-L1阻断测定的滴定曲线。图4B提供了使用由用SepGI-097、SepGI-137和SepGI-138HSV感染的细胞的培养物制备的VFCM以及SepGI-Null载体作为对照并且来自未感染细胞的条件培养基作为另一对照的PD-1/PD-L1阻断测定的结果的图，其中测定信号已经转化为μg/ml BB9IgG等效物。由用所有三种HSV感染的细胞产生的VFCM能够在一定程度上阻断PD-1/PD-L1相互作用，其中SepGI-138病毒表现出最高程度的PD-1/PD-L1阻断。
实例5：ScFv-Fc-TGFβtrap+IL12构建体。
产生了一系列另外的构建体，其中包括与单独的启动子可操作地连接的编码IL12的基因连同编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因(图1B)。通过在实例1的编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的基因上添加一个表达盒来构建这些双基因构建体，所述编码融合蛋白的基因从融合蛋白的N端到C端依次包括：编码信号肽(SEQ ID NO:34)的序列、编码与PD-1或PD-L1特异性结合的ScFv抗体的序列、编码人IgG4 Fc区的序列(Fc4，SEQ ID NO:2)和编码TGFβ受体II的胞外结构域(TGFβRII胞外结构域或TGFβRIIecto，SEQ ID NO:7)的序列，所述表达盒包括巨细胞病毒(CMV)启动子(SEQ ID NO:33)，其可操作地连接于编码人IL12的p40亚基的序列(SEQ ID NO:57)，随后是编码2x弹性蛋白接头的序列(SEQ ID NO:55)，并且然后是编码人IL12的p35亚基的序列(SEQ ID NO:58)。图1B示意性示出了双向表达构建体，所述双向表达构建体包括与ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白编码基因可操作地连接的EF1α/HTLV杂合启动子(SEQ ID NO:32)以及与编码IL12的基因可操作地连接的CMV启动子。
除了包括人IL12的序列的构建体SepGI-123、SepGI-143、SepGI-158、SepGI-159、SepGI-144和SepGI-160之外，还产生了编码鼠类IL12的SepGI-162和SepGI-167构建体，以允许在小鼠模型中测试经工程化的病毒(表3)。这些构建体中的每个构建体包括鼠类IL12表达盒，所述表达盒包括CMV启动子(SEQ ID NO:33)，其可操作地连接于编码鼠类IL12的p40亚基的序列(SEQ ID NO:59)，随后是编码2x弹性蛋白接头的序列(SEQ ID NO.55)，并且然后是编码鼠类IL12的p35亚基的序列(SEQ ID NO:60)。
SepGI-123以单基因HSV形式制备，其包括与EF1α/HTLV启动子可操作地连接的编码人IL12多肽(SEQ ID NO:51)的基因。
表3：ScFv-Fc-TGFβtrap+IL12构建体。
Figure BDA0004090762590000521
如实例1中所描述的，通过PCR克隆产生侧接attL位点的双基因构建体，并且将其克隆到HSV1
Figure BDA0004090762590000522
基因组中。重组反应后，将重组的病毒基因组DNA转染到BHK(幼仓鼠肾成纤维细胞)细胞中，并且如实例1中所述分离病毒。/>
实例6：由编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白和IL12的重组双基因病毒产生的TGFβRIIecto的定量。
使用HSV病毒株SepGI-143(BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)、SepGI-144(H6B1LEM抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)和SepGI-145(Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)来感染A431细胞和HepG2细胞以用于产生VFCM。SepGI-123(包括编码人IL12的转基因，但不包括用于产生ScFv-Fc4-TGFβtrap融合蛋白的构建体)也用于产生VFCM。测定中还包括用SepGI-Null感染的细胞的VFCM和未感染细胞的条件培养基。
如实例2中所描述的，在MSD测定中对VFCM的所分泌的ScFv-Fc-TGFβtrap的量进行测试。图5A提供了使用分别用SepGI-Null、SepGI-123、SepGI-143、SepGI-144和SepGI-145感染的A431细胞的VFCM的MSD测定的结果，并且5B提供了用SepGI-Null、SepGI-123、SepGI-143、SepGI-144和SepGI-145感染的HepG2细胞的VFCM的MSD测定的结果。双基因HSV中的每个双基因HSV产生可检测的TGFβRIIecto，其中包括Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto(SepGI-145)的HSV比SepGI-143(BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)或SepGI-144(H6B1LEM抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)表达更多的融合蛋白。
实例7：表达ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12的双基因HSV的基于CD103细胞的TGFβtrap功能的测定。
使用实例3中所描述的CD103测定来测定ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白在用双基因HSV SepGI-143(BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)、SepGI-144(H6B1LEM抗PD-L1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)和SepGI-145(Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto)感染的细胞的VFCM中的功能。SepGI-Null(无转基因)和Sep-123(仅IL12基因)VFCM用作对照。图6A提供了基于增加重组TGFβRII的量能够阻止用TGFβ1刺激的CD8+T细胞上的CD103表达的表达测定的滴定曲线。图6B提供了来自A431产生的VFCM的结果，并且图6C提供了来自HepG2产生的VFCM的结果。在此测定中，来自未感染细胞和用SepGI-Null感染的细胞的培养基表明，由TGFβ1刺激的CD8+T细胞的CD103表达为30-35％的基础水平。在此测定中，与未感染细胞相比，来自SepGI-123病毒的条件培养基显示出对TGF介导的信号传导的轻微抑制(大约28％)，而包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap的基因的HSV中的每个HSV相对于未感染细胞或用缺乏转基因的病毒感染的细胞(SepGI-Null)的条件培养基的对照显示出对CD103表达的强烈抑制。包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的转基因的病毒全都产生与对照相比表现出对CD103表达的至少70％抑制的条件培养基，这表明ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白由受感染细胞产生和分泌，并且对TGFβ具有所期望的抑制功能。
实例8：双基因病毒的抗PD-1ScFv和抗PD-L1 ScFv功能的阻断测定。
使用实例4中所述的PD-1/PD-L1阻断生物测定(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)来评估由双基因HSV SepG1-143、SepGI-144和SepGI-145编码的融合蛋白的抗PD-1或抗PD-L1 ScFv部分的功能。基本上根据制造商的说明书进行PD-1/PD-L1阻断测定，其中测试样品是来自用经工程化的ScFv-Fc-TGFβtrap HSV感染的A431细胞的VFCM的稀释液。在96孔板中进行测定，并且用Tecan Spark酶标仪分析荧光素酶信号。
图7A是使用5μg/ml至0.02μg/ml的与PD-1结合的BB9 IgG的稀释液的PD-1/PD-L1阻断测定的PD-1或PD-L1结合活性的标准曲线。图7B提供了使用由用SepGI-123(缺乏编码ScFv-Fc-TGFβtrap的基因)、SepGI-143、SepGI-144和SepGI-145HSV感染的细胞的培养物制备的VFCM的PD-1/PD-L1阻断测定的结果的图，其中测定信号(y轴)已经转化为μg/ml BB9IgG等效物。由所有三种双基因HSV的细胞产生的VFCM能够阻断PD-1/PD-L1相互作用，其中编码Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的SepGI-145病毒表现出最高程度的PD-1/PD-L1阻断。
实例9：用于定量由双基因病毒产生的IL12的功能测定。
为了定量由用HSV SepGI-123、SepGI-143、SepGI-144和SepGI-145感染的细胞产生的IL12的量，使用了基于细胞的测定，其中将具有异二聚体IL12受体并且被工程化成具有在IL12响应性启动子的控制下的荧光素酶基因的细胞(
Figure BDA0004090762590000541
IL-12测定就绪细胞(鹰生物科学公司(Eagle Biosciences)(新罕布什尔州阿姆赫斯特(Amherst,NH))，目录#BM4012))与用重组HSV感染的细胞的裂解物一起温育。使用普洛麦格公司One-Glo荧光素酶系统(目录#E6120)进行检测。
简而言之，通过将来自未感染的A431细胞或HepG2细胞(作为对照)以及来自用各种HSV感染的A431细胞和HepG2细胞的稀释的VFCM添加到96孔板的孔中来进行测定。用于感染A431细胞或HepG2细胞并且在测定中测试的HSV包括SepGI-Null、SepGI-123、SepGI-143、SepGI-144或SepGI-145。如实例2中所描述的，产生感染的细胞培养物(VFCM)的裂解物。将重组IL12(R&D系统公司，目录#219-IL-005)的连续稀释液添加到另外的孔中以生成标准曲线。
基本上根据制造商的说明书，使用IL12报告基因细胞。将细胞解冻、稀释，并且将40μl添加到96孔板的每个孔中。然后将40μl稀释的VFCM添加到测定孔中，将孔中的内容物混合，并且将板在37℃、5％ CO2下温育五小时。然后将One-Glo荧光素酶试剂(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)添加到每个孔(40μL)中，并且在室温下10分钟后，使用TecanSpark酶标仪测量萤火虫荧光素酶发光。图8示出了结果。图8A提供了重组IL-12的以相对发光单位表示的标准曲线。图8B提供了来自使用未感染的A431细胞条件培养基、来自用不包括外源转基因的病毒感染的细胞的条件培养基(SepGI-Null)和来自用含IL12基因的病毒SepGI-123(仅IL12)、SepGI-143(抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)、SepGI-144(抗PD-L1ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)或SepGI-145(抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)感染的细胞的条件培养基的测定的发光。图8C提供了来自使用未感染的HepG2细胞条件培养基、来自用不包括外源转基因的病毒感染的细胞的条件培养基(SepGI-Null)和来自用含IL12基因的病毒SepGI-123(仅IL12)、SepGI-143(抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)、SepGI-144(抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)或SepGI-145(抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)感染的细胞的条件培养基的测定的发光。发光结果显示，由用含IL12基因的病毒感染的细胞产生的所有细胞裂解物产生IL12，而用不包括IL12基因的病毒感染的细胞没有显示出高于未感染的对照细胞的发光的发光，这表明IL12基因由重组IL12病毒SepGI-123、SepGI-143和SepGI-145有效表达和分泌。
实例10：由双基因病毒SepGI-158产生的TGFβtrap的MSD测定。
使用实例2中所描述的MSD测定，测试用四种不同的SepGI-158(一种重组HSV，其包括编码具有衍生自单克隆抗体R1GH10的ScFv和IL12转基因(SEQ ID NO:51)的抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap的构建体)的分离株感染的细胞的TGFβtrap产生。图9示出了用重组HSVSepGI-143(编码BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap)、SepGI-145(编码R1GH10抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap)感染的细胞的条件培养基以及未感染的A431细胞和用SepGI-Null感染的A431细胞的条件培养基中的TGFβtrap的量。所有SepGI-158感染的细胞产生TGFβtrap，其中分离株4产生最高量，这与用单基因病毒SepGI-145感染的细胞产生的量相当。
实例11：双基因病毒SepGI-158的抗PD-1ScFv和抗PD-L1 ScFv功能的阻断测定。
还在实例4中所描述的PD-1/PD-L1阻断测定中对来自SepGI-158分离株1-4的无病毒条件培养基进行测试，以评估由SepGI-158感染的细胞产生的PD-L1结合活性的量。在实例10中对来自相同的四种SepGI-158的分离株的条件培养基的TGFβtrap进行分析的测定还比较了由用重组HSV SepGI-143(编码BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap)、SepGI-145(编码Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap)感染的细胞以及未感染的A431细胞和用SepGI-Null感染的A431细胞的条件培养基产生的TGFβtrap的量。图10示出了用所有SepGI-158病毒分离株感染的细胞产生具有PD-1/PD-L1阻断活性的ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白。与由SepGI-158感染的细胞产生的TGFβtrap的量一致(实例10)，分离株4产生最高量的PD-L1阻断活性，这与由用SepGI-145感染的细胞产生的量相当。
实例12：双基因病毒SepGI-162的IL12测定。
使用用四种单独的SepGI-162的分离株(其包括编码BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap(SEQ ID NO:39)和鼠类IL12基因(SEQ ID NO:53)的构建体)感染的A431细胞来产生VFCM，以使用实例9中所描述的测定测试IL12的产生。鼠类IL12能够与人IL12受体相互作用并且引起信号转导，如测定中所测量的。图11A提供了重组鼠类IL-12(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invivogen,San Diego,CA)，目录#rcyc-mil12)以相对发光单位表示的标准曲线。当基于鼠类IL12的标准曲线重新校准IL12测定时，由SepGI-162产生的鼠类IL12的量为大约1μg/ml(图11B)。
实例13：SepGI-145在鼠类和犬细胞中的复制。
在小鼠胚胎细胞系3T6和从正常比格犬(第1代)的新鲜肾组织分离的犬肾原代成纤维细胞(cKPF)细胞中评估溶瘤HSV SepGI-145(编码Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白加上人IL12)的复制。已知支持非弱化HSV病毒株和功能性缺失RL1基因的HSV病毒株的复制的Vero细胞被用作宿主细胞以进行比较。
在第一个实验中，使用SepGI-145和三种对照HSV来接种3T6细胞和Vero细胞。对照病毒是SepGI-Null，其与SepGI-145(在RL1基因中功能性缺失)具有相同的主链但缺乏转基因和HSV1716(也被称为
Figure BDA0004090762590000561
)，其与/>
Figure BDA0004090762590000562
非常相似但在RL1基因的两个拷贝中具有755bp缺失，而不是695bp缺失。/>
Figure BDA0004090762590000563
已经用于许多试验(例如，Rampling等人(2000)《基因疗法》7:859-66；Harrow等人(2004)《基因疗法》11:1648-1668；Streby等人(2017)《临床癌症研究》23:3566-3574；Streby等人(2019)《分子疗法》27:1930-1938)。“Virttu 17+”是HSV 17+病毒株，其是RL1缺失病毒株/>
Figure BDA0004090762590000564
和/>
Figure BDA0004090762590000565
的祖HSV-1病毒株(MacLean等人(1991)《通用病毒学杂志》72:631-639)，其具有完全功能性RL1基因。
为了测试鼠类3T6细胞上的复制，用2x105个细胞接种6孔板的孔，并且在37℃、5％CO2下温育过夜。第二天，用Virttu 17+、Seprehvir、SepGI-Null或SepGI-145以MOI 0.1感染3T6细胞和Vero细胞。将细胞与病毒一起温育1小时，之后收集孔的上清液(T0上清液)并且冷冻，并且添加新鲜培养基。然后将培养物温育72小时，在温育结束时收集72小时上清液并冷冻。然后使用两个时间点上清液(0小时，或复制前，和72小时，复制后)在Vero细胞上滴定。结果见图12。缺乏功能性RL1基因的重组病毒，即，HSV1716、SepGI-Null和SepGI-145，在3T6细胞中不复制；仅“Virttu 17+”在此胚胎小鼠细胞系中显示复制(图12A和12C)。另一方面，所有病毒，无论所述病毒是否具有功能性RL1基因，都能够在Vero细胞中复制(图12B和12D)。
使用犬原代肾原代成纤维细胞(cKPF)细胞和Vero细胞进行相同的实验，不同之处在于将9x104个细胞接种到6孔板的孔中并且在测定之前在37℃、5％ CO2下温育过夜。在这种情况下，所测试的HSV中没有一个在cKPF细胞中复制(图13A和13C)，而所有的HSV在Vero细胞中复制(图13B和13D)。这些结果显示，尽管如HSV1716
Figure BDA0004090762590000572
SepGI-Null和SepGI-145等RL1阴性突变体能够在Vero细胞上复制至高滴度，但所述突变体不能在小鼠胚胎成纤维细胞(3T6)和原代犬cKPF细胞中复制。
实例14：抗PD-1ScFv-FcTGFβtrap+IL12 HSV SepGI-162在小鼠膀胱癌异种移植模型中的功效。
对植入同系MB49肿瘤的C57BL/6小鼠进行体内研究，以测试双基因HSV的作用，所述双基因HSV包括如先前实例中所描述的BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβtrap基因和鼠类IL12基因(SepGI-162)。MB49细胞是通过在存在7,12-二甲基苯并[a]蒽的情况下培养MB49原发性膀胱细胞而衍生的鼠类尿路上皮癌细胞。BB9抗体与人和小鼠PD-1两者特异性结合，并且成熟的人TGFβ1的氨基酸序列与成熟的小鼠TGFβ1的氨基酸序列99％相同。
在第0天，将MB49细胞(1x105个细胞)皮下植入七周龄雌性小鼠的右侧腹并使其形成肿瘤。每个处理组包括八只小鼠。将SepGI-162处理组用SepGI-162病毒(包括BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap基因(SEQ ID NO:39)加上鼠类IL12基因(SEQ ID NO:53)(表2)的
Figure BDA0004090762590000571
)处理。
用病毒或调配物缓冲液对照进行的治疗在第8天开始，并且每隔一天重复一次，或者如果处理日在周末，则在下一个工作日给予治疗，总共九个剂量。将小鼠每周称重一次，并且用卡尺每周测量两次肿瘤。通过瘤周注射施用含1×107pfu HSV的50μl调配物缓冲液。对体重损失等于第零天体重的15％或其肿瘤大小超过2000mm3的小鼠实施安乐死。
图14A-C提供了调配物缓冲液对照组、SepGI-Null处理组和SepGI-162处理组中的个体小鼠的肿瘤体积，并且图15A-C示出了研究过程中小鼠的体重。对于调配物缓冲液对照组中的所有小鼠(图14A)，肿瘤体积在研究过程中增加，两周之后肿瘤大小的速率增加。经SepGI-Null处理的小鼠中的两只小鼠经历肿瘤体积增加速率的降低(图14B)。在SepGI-162处理组中看到显著结果(图14C)。虽然在调配物缓冲液对照组中除了一个调配物缓冲液对照组之外的所有调配物缓冲液对照组在第30天具有2000mm3的肿瘤，但是经SepGI-162处理的小鼠中仅有两只小鼠在第30天具有所述体积的肿瘤。相对于对照组的小鼠，经SepGI-162处理的小鼠中的三只小鼠的肿瘤被完全治愈，并且另外两只小鼠的肿瘤生长被延迟或抑制。SepGI-162处理的功效在图16的存活率图中得到证明，其中导致安乐死的2000mm3肿瘤大小被记录为死亡。存活率图展示了调配物缓冲液对照组在过去34天没有存活，而在同一时间点，经SepGI-Null处理的组的存活率为55％，并且经SepGI-162处理的组的存活率为90％。另外，在研究结束时(45天)，65％的经SepGI-162处理的组是活的。SepGI-162处理对肿瘤的作用在p<0.005水平下是高度显著的(表4)。
表4：对数秩(Mantel-Cox)检验：存活率曲线比较。
处理对 处理 显著性 P值
调配物缓冲液 SepGI-Null ns 0.0524
调配物缓冲液 SepGI-162 ** 0.0022
实例15：用MB49膀胱癌细胞再激发经SepGI-162处理的小鼠。
用双基因HSV SepGI-162进行的治疗成功地治疗上述实例14中详述的同系小鼠膀胱癌模型允许进行肿瘤再激发实验。向MB49肿瘤治愈的三只小鼠以及在第42天研究结束时没有显示出肿瘤生长的小鼠在与接种原始肿瘤细胞的相对侧上注射MB49肿瘤细胞(1x105个细胞，在100μl体积中)的另外的接种物。没有进行进一步病毒处理，因为该研究的设计目的为观察先前的病毒处理对后来出现的(继发性)肿瘤的进展以及对原始(原发性)肿瘤的有无任何保护作用。基于每三天一次的测量结果评估继发性和原发性接种部位处的肿瘤体积(图17)，并且记录体重(图18)。当在研究完成时对小鼠实施安乐死或当由于其它原因对小鼠实施安乐死时，对肿瘤进行解剖并称重(图19)。
图17A示出了对照，其中向先前未接种肿瘤的六只小鼠注射与再激发小鼠相同数量的细胞。对照小鼠与再激发小鼠年龄是匹配的，其接种了用于接种再激发小鼠的相同细胞但不用任何溶瘤病毒调配物处理。肿瘤在所有对照小鼠中形成。图17B和17C分别示出了再激发小鼠中的原发性和继发性肿瘤的生长。图17B和图17C两者中的较低数据点各自表示没有显示出原发性肿瘤的肿瘤生长(图17B)并且没有显示出从再激发肿瘤细胞形成继发性肿瘤(图17C)的三只个体小鼠。在原始实验中已经延迟肿瘤生长的一只小鼠在再激发后显示出原发性和继发性肿瘤的生长。所有小鼠都没表现出体重减轻(图18A和18B)。肿瘤未能在原发性肿瘤治愈的三只小鼠中形成，这表明用表达抗PD-1ScFc-Fc4-TGFβtrap和鼠类IL12的双基因SepGI-162HSV处理的小鼠具有持久的抗肿瘤免疫应答。图19提供了相对于解剖肿瘤的接种后天数归一化的对照小鼠和先前用SepGI-162处理的小鼠的终点肿瘤大小。该图展示了用SepGI-162病毒处理对原发性和随后的继发性肿瘤生长的抑制作用。
实例16：HSV对犬骨肉瘤细胞系的细胞毒性
用Seprehvec病毒SepGI-145、SepGI-Null和SepGI-dsred(
Figure BDA0004090762590000593
包括与插入到内部缺失的RL1基因座中的CMV启动子可操作地连接的DsRed基因)感染犬骨肉瘤细胞系OSCA-40的细胞，以确定这些HSV对犬肿瘤细胞的细胞毒性作用。
对于这些实验，将OSCA-40细胞以10,000个细胞/孔接种到96孔E板(
Figure BDA0004090762590000591
细胞分析仪，加利福尼亚州圣地亚哥的艾森生物科学公司(AceaBiosciences,San Diego,CA))的孔中，允许在37℃、5％ CO2下沉降过夜，并且然后用SepGI-145、SepGI-Null和SepGI-dsred病毒以MOI 0.1、MOI 1.0和MOI 10.0感染。对于每种MOI，用病毒中的每种病毒进行一式三份测定。
基本上根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0004090762590000592
实时细胞分析仪(艾森生物科学公司)在另外4.5天内实时监测增殖。图20A-C分别提供了用SepGI-Null、SepGI-145和SepGI-dsred感染的OSCA-40细胞的增殖曲线，其中归一化细胞指数(y轴)与孔中的细胞数成比例。图20显示OSCA-40细胞对所有三种HSV都是敏感的，表现出相对于未感染细胞的增殖的剂量依赖性(MOI依赖性)抑制。/>
实例17：SepGI-145感染的OSCA-40犬骨肉瘤细胞中所表达的TGFβRIIecto的功能性。
为了测试SepGI-145感染的细胞是否产生和分泌功能性抗PD-L1-Fc-TGFβRII融合蛋白，在12孔板(1x105个细胞/孔)的孔中以MOI 1.0用SepGI-145或SepGI-Null感染犬骨肉瘤细胞系OSCA-40的细胞。将细胞与HSV病毒株在37℃、5％ CO2下一起温育72小时。然后从孔中去除上清液，并且分别通过0.1μm膜(颇尔Acrodisc注射器过滤器部件#4611)过滤以除去病毒。然后将病毒后培养上清液(VFCM)等分，并且在4℃下储存至多两天或置于-80℃下进行较长时间储存。
对于抗PD-L1-Fc-TGFβRII融合蛋白的分析，使用犬TGFβ1包被的板(20ng/孔)(义翘神州科技有限公司#70087-D08H)进行夹心ELISA测定。将对照孔用20ng人TGFβ1(百进生物公司目录#580702)包被。用犬或人TGFβ1包被板在4℃下过夜，之后将孔用PBS/0.01％Tween20洗涤，然后在室温下用PBS/1％ FBS封闭2小时，并且然后再次洗涤(PBS/0.01％Tween20)。将受感染细胞的上清液添加到经包被的孔中，并且在室温下结合2小时。然后将孔洗涤，并且将重组人PD-L1-Fc(R&D#156-B7)添加到孔(10ng/孔)中，并且允许在室温下结合2小时，之后在添加生物素抗人Ig-Fc(百进生物公司#409307)之前将孔再次洗涤，随后在室温下温育1小时。然后将亲和素-HRP试剂添加到孔中，在室温下温育30分钟，然后将板洗涤三次，并且然后将100μl HRP底物溶液添加到每个孔中，并且将板在室温下在黑暗中温育20分钟。然后添加终止溶液(100μl)，并且在450nm处读取板。图21示出了被设计成通过使用TGFβ捕获和使用PD-L1检测的、用于检测功能性(TGFβ结合)TGFβRIIecto和功能性(PD-L1结合)抗PD-L1抗体的ELISA的结果，所述TGFβRIIecto和抗PD-L1抗体作为SepGI-145抗PD-L1-Fc-TGFβRII融合蛋白的一部分而产生。未处理(未感染)的细胞和用SepGI-Null感染的细胞的上清液显示出很少至没有吸光度，而在1:4稀释度下，SepGI-145感染的细胞的上清液(VFCM)显示出PD-L1-Fc-TGFβRII融合蛋白的产生，这表明融合蛋白与犬TGFβ结合。
实例18：抗PD-L1-Fc-TGFβtrap融合蛋白的抗PD-L1 ScFv功能的阻断测定。
使用实例4中所描述的PD-1/PD-L1阻断生物测定(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)来评估由SepGI-145编码的Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的抗PD-L1ScFv部分的功能。测试样品是来自用SepGI-145或SepGI-Null感染的OSCA-40细胞的浓缩VFCM。在96孔板中进行测定，并且用Tecan(瑞士门内多夫)Spark酶标仪分析荧光素酶信号。
图22提供了使用由用SepGI-Null和SepGI-145感染的细胞的培养物制备的VFCM的PD-1/PD-L1阻断测定的结果的图，其中测定信号已经转化为μg/ml Combi5抗PD-L1 IgG等效物。由用SepGI-145HSV感染的细胞产生的VFCM，而不是用SepGI-Null感染的细胞的VFCM，能够阻断PD-1/PD-L1相互作用。
实例19：SepGI-145感染的细胞的IL12活性的测定。
为了定量由用SepGI-145感染的细胞产生的IL12的量，使用了实例8的基于细胞的测定，其中将具有异二聚体IL12受体并且被工程化成具有在IL12响应性启动子的控制下的荧光素酶基因的细胞(
Figure BDA0004090762590000612
Il-12测定就绪细胞(鹰生物科学公司(新罕布什尔州阿姆赫斯特)，目录#BM4012))与用重组HSV感染的细胞的裂解物一起温育。使用普洛麦格公司One-Glo荧光素酶系统(目录#E6120)进行检测。
通过将来自用SepGI-145或作为对照的缺乏转基因的SepGI-Null感染的OSCA-40细胞的稀释的VFCM添加到96孔板的孔中来进行测定。将重组人IL12(R&D系统公司，目录#219-IL-005)的连续稀释液添加到另外的孔中以生成标准曲线。
基本上根据制造商的说明书，使用IL12报告基因细胞。将细胞解冻、稀释，并且将40μl(5x104个细胞)添加到96孔板的每个孔中。然后将40μl稀释的VFCM添加到测定孔中，将孔中的内容物混合，并且将板在37℃、5％ CO2下温育五小时。然后将One-Glo荧光素酶试剂(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)添加到每个孔(40μL)中，并且在室温下5分钟后，使用Tecan Spark酶标仪测量萤火虫荧光素酶发光。图23示出了结果。图23A提供了重组IL12以相对发光单位表示的标准曲线。图23B提供了使用来自用不包括外源转基因的病毒感染的细胞(SepGI-Null)的VFCM和来自用含IL12基因的病毒SepGI-145(抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap加上IL12)感染的细胞的VCFM的测定的发光。发光结果显示，由用含IL12基因的SepGI-145病毒感染的细胞产生的细胞裂解物包括IL12，而用不包括IL12基因的病毒感染的细胞没有显示出高于未感染的对照细胞的发光的发光，这表明IL12基因由重组IL12病毒SepGI-145有效表达和分泌。
实例20：犬中的
Figure BDA0004090762590000611
(HSV1716)、SepGI-145和SepGI-Null的安全性研究。
对健康的成年比格犬进行三部分研究，以评估衍生自RL1基因功能性缺失的HSV-1病毒株17+的疱疹病毒的安全性。研究使用了四组狗，组1、组2、组3和组C(对照)，所述组中的每个组包括两只公狗和两只母狗。在研究开始之前，发现纳入研究的所有狗对于针对疱疹病毒的抗体测试呈阴性。研究评估了狗对所注射的疱疹病毒的任何副作用、病毒脱落以及狗到狗之间的病毒传播。在研究组1的第I部分中，向狗注射HSV1716，在研究组2的第II部分中，向狗注射SepGI-145，并且在研究组3的第III部分中，向狗注射SepGI-Null。组C(非处理组)的狗在研究的所有三个部分中用作对照，所述三个部分顺序地进行，并且还充当用于检测任何狗到狗病毒转移的哨点。
表5：HSV安全性研究，比格犬。
Figure BDA0004090762590000621
在评估
Figure BDA0004090762590000623
(HSV1716)的安全性的研究的第I部分中，在第I阶段第0天开始研究之前，将组C(对照)狗和组1(HSV1716处理)狗混合七天。在第I部分研究的第0天，组1狗接受注射HSV1716，并且组C(对照)狗接受注射调配物缓冲液(包含10％甘油的哈特曼氏溶液(Hartmann's solution))。将组C和组1狗在处理后再混合21天(直到第I部分第21天)。组1和对照狗在研究开始和结束时(第I部分第0天和第21天)进行体格检查。在第I部分研究期间，每周从组1狗和对照狗采集血液样品，用于评估血液化学和血液学，并且测试针对病毒的抗体(血清学)。另外，在第0天、第3天、第5天、第7天、第9天和第14天从组1和对照狗采集尿液、粪便、唾液和鼻拭子样品，以测试任何病毒脱落(表6)。
表6：三部分安全性研究中的狗的测试样品。
Figure BDA0004090762590000622
在评估SepGI-145的安全性的研究的第II部分中，在开始处理之前(即，研究的第-6天至第0天)，将组2(SepGI-145处理)、组2和对照狗混合一周。组2狗接受两个剂量的病毒，并且对照狗接受两个剂量的调配物缓冲液，第一剂量在第II部分研究的第0天，并且第二剂量在四周后即第28天。因为SepGI-145被工程化成表达融合蛋白，所以设计了两个剂量研究以允许观察对第二剂量的病毒的潜在免疫应答。将对照狗和组2狗继续混合，直到第二次处理后三周。在第II部分研究的过程期间，组2和对照狗在处理日和再三周后(即，在第II部分第0天和第21天，以及在第28天和第49天)接受体格检查。从处理当天开始，每周采集血液样品，以测试血液化学、血液学和病毒抗体。在整个研究过程中，在数天内采集尿液、粪便、唾液和鼻样品，并且测试病毒的存在(表6)。
在研究的第III部分中，在研究的第0天开始用SepGI-Null病毒(组3)或调配物缓冲液(对照组C)处理之前，将组3狗和对照组狗混合一周。处理后，将狗继续混合三周。在第III部分研究期间，每周从组3狗和对照狗采集血液样品，用于评估血液化学和血液学，并且测试针对病毒的抗体(血清学)。另外，在第0天、第3天、第5天、第7天、第9天和第14天从组3和对照狗采集尿液、粪便、唾液和鼻拭子样品，以测试任何病毒脱落(表6)。
根据2017年1月1日实施的动物福利法和动物福利条例中规定的标准和条例对动物进行圈养，并且从适应开始到研究结束，每天两次观察动物的总体健康状况、外观和行为。在研究第0天和第21天(组1和组2)、研究第28天和第49天(组1和组3)以及研究第56天和第77天(组1、组3和组4)进行治疗施用之前，由得到许可的兽医进行定期体格检查。组3中的一只狗在第61天被从研究中移除，并且由于在狗打斗中受伤而对其实施安乐死。
对来自血液样品的血清进行测试以确定针对Seprehvir(HSV1716)的中和抗体。在输注病毒之前，所有狗对HSV1716呈血清阴性，并且在输注病毒后的不同时间点测试的所有狗以及对照组1狗保持血清阴性。根据表6中所示的时间表，在研究期间，收集血液样品进行血液化学、血液学和血清学(抗体)测试，并且收集尿液、粪便、唾液和鼻样品以测试病毒的存在。
在Vero细胞上评估在输注后的不同时间点在研究期间收集的样品的溶瘤疱疹病毒的脱落。尽管当应用于培养物时，少数样品引起Vero细胞的形态学变化，但是在第二次传代中没有样品显示出疱疹病毒特异性细胞致病效应。数据显示，在狗中静脉内输注RL1缺失的溶瘤疱疹病毒不会导致在不同时间点收集的尿液、唾液、鼻拭子和粪便拭子样品中的病毒脱落。
根据设施SOP，在它们的研究阶段的最后一次样品收集之后，对所有动物实施人道安乐死。在研究第21天(组1)和研究第77天(组2、组3和组C)，安乐死后，对组织样品进行解剖并且测试病毒或任何异常的存在。在任何经解剖的组织中没有检测到病毒，并且没有发现可归因于病毒的异常。得出的结论是：HSV1716病毒以及相关病毒SepGI-145和SepGI-Null在正常犬细胞中不复制。
实例21：从HSV SepGI-097、SepGI-138和SepGI-162制备浓缩VFCM。
无病毒条件培养基(VCFM)由表达BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的病毒(SepGI-097)、表达Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白的病毒(SepGI-138)、表达BB9抗PD-1ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白以及鼠类IL12的病毒(SepGI-162)和表达Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白以及鼠类IL12的病毒(SepGI-167)产生。VFCM还由SepGI-Null(缺乏转基因的Seprehvec)制备以用作对照。
通过感染BHK细胞来制备受感染细胞的上清液。通过将在T225烧瓶中生长至100％汇合度的BHK细胞解离并且将细胞重悬至最终体积为12ml培养基(DMEM/F12+10％FBS+5％TPB)来将BHK细胞接种到850cm2滚瓶中。将3ml的细胞悬浮液添加到每个滚瓶中。将经接种的瓶子在37℃下温育大约三天(直到约90％汇合度)，其中每个滚瓶的所估计的细胞数为8x107个细胞。将滚瓶用4x107pfu的SepGI-Null、SepGI-097、SepGI-138、SepGI-162或SepGI-167病毒接种。对于在滚瓶中的感染，将培养基从融合细胞层中去除，并且将包括病毒接种物的25ml新鲜培养基添加到瓶中。然后将瓶子在37℃下温育三天。在感染期结束时，将上清液从瓶子和烧瓶中去除并转移到50ml锥形管中，所述锥形管在2,095rcf下旋转15分钟。将上清液转移到新的50ml锥形管中，并且重复离心。
将最终上清液依次通过0.8微米乙酸纤维素注射器过滤器、0.22微米乙酸纤维素注射器过滤器和acrodisc 0.1微米过滤器过滤以去除病毒。然后将VFCM在4℃下储存过夜。
然后使用两个Amicon Ultra-4浓缩器(30kDa MW截止值，密理博公司(Millipore)#UFC803024)/25ml VFCM来浓缩VFCM，以将体积减少至大约660μl/VFCM。然后将浓缩VFCM充分混合、等分，并且储存在-80℃下。
图24提供了分析SepGI-Null、SepGI-138、SepGI-162和SepGI-167感染细胞的浓缩VFCM的TGFβtrap含量的结果。所有病毒后上清液包含浓度为100-200μg/ml的TGFβtrap。在用SepGI-Null对照病毒感染的细胞的病毒后上清液中没有检测到TGFβtrap。
图25提供了使用如实例3中详述的基于细胞的CD103测定分析SepGI-Null、SepGI-138、SepGI-162和SepGI-167感染细胞的浓缩VFCM的TGFβtrap功能的结果。来自用包括用于表达ScFv-Fc-TGFβtrap融合蛋白(SepGI-097、SepGI-138、SepGI-162和SepGI-167)的基因的病毒感染的细胞的所有浓缩VFCM在此测定中能够以至多1:1600稀释度抑制TGFβ信号传导。
实例22：SepGI-162(抗PD-1ScFv-FcTGFβtrap+IL12)在小鼠的MB49膀胱癌异种移植模型中的剂量研究。
进行体内研究以研究双基因HSV SepGI-162的不同给药方案的效果，所述双基因HSV SepGI-162包括如先前实例中所描述的BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβtrap基因和鼠类IL12基因。向六至七周龄的雌性C57BL/6小鼠的右侧腹皮下植入含1x105个同系MB49肿瘤细胞的100μl DPBS。在肿瘤达到100-150mm3之后，通常在肿瘤接种后7-10天，将小鼠用SepGI-162病毒通过瘤内和瘤周注射含1x107pfu的经纯化的病毒的50μl DPBS进行处理。处理组如下：组1：仅用调配物缓冲液(DPBS)处理，每周3次，持续3周(总共9次处理)；组2：用缺乏转基因的SepGI-Null(对照)HSV处理，每周3次，持续3周(总共9次处理)；组3：用具有抗PD-1/TGFβtrap和IL12转基因的SepGI-162HSV处理，每周3次，持续3周(总共9次处理)；组4：用SepGI-162HSV处理，每周3次，持续2周(总共6次处理)；组5：用SepGI-162HSV处理，每周3次，持续1周(总共3次处理)；组6：用SepGI-162HSV处理，每周一次，持续3周(总共3次处理)；以及组7：用SepGI-162HSV 3处理，每周一次，持续1周(单次处理)。对照组1和2各有七只小鼠；SepGI-162处理组3-7各有八只小鼠。
使用卡尺每周测量两次肿瘤体积，并且每周测量一次体重。对具有大小达到2,000mm3或已经损失至少15％体重的肿瘤的小鼠实施安乐死。没有调配物缓冲液对照小鼠(组1)存活至研究结束，并且仅一只SepGI-Null对照小鼠(组2)存活至研究结束。在SepGI-162给药组中，组3和组5中各仅有一只小鼠必须实施安乐死，并且组4中的所有小鼠都存活至研究结束。这些组接受6个或9个剂量的SepG1-162。在研究结束时，接受3个剂量的SepG1-162的组5和组6分别失去一只小鼠和两只小鼠，并且在研究结束时，仅接受一种病毒剂量的组7减少至单只小鼠。
图26A-G提供了在整个研究过程中，调配物缓冲液对照组、SepGI-Null处理组和SepGI-162处理组中的个体小鼠的肿瘤体积。对于调配物缓冲液对照组中的所有小鼠(图26A)，肿瘤体积在研究过程中增加，在接种后大约三周显著增加。总的来说，SepGI-Null处理组的小鼠经历肿瘤体积增长速率的降低(图26B)，但是在该组的任何小鼠中肿瘤都没有被根除。
小鼠连续3周每周接受3个剂量的组3的8只小鼠中的5只小鼠显示出肿瘤完全消退，并且在处理过程结束时在第6只小鼠(肿瘤测量值仅为15mm3)中显示出接近完全消退(图26C)，这证明了表达抗PD1/TGFβtrap和IL2的SepGI-162病毒的有效性。每周给药三次持续两周而不是三周的组4的非常高比例的小鼠(八只小鼠中的七只小鼠)也表现出了MB49肿瘤的完全根除(图26D)，而第八只小鼠显示出对肿瘤生长的显著抑制。提供较少剂量的给药方案也导致肿瘤消退。例如，在单周内对小鼠进行三次处理导致组5的八只小鼠中的六只小鼠实现肿瘤根除(图26E)。在三周内每周给药一次导致组6的八只小鼠中的四只小鼠实现肿瘤根除(图26F)，而单剂量导致组7的一只小鼠实现完全消退(图26G)。总之，给药研究证明了重组SepGI-162病毒的整体有效性和明确的剂量应答。
实例23：SepGI-167(抗PD-L1 ScFv-FcTGFβtrap+IL12)在小鼠的MB49膀胱癌异种移植模型中的剂量研究。
进行另一项体内研究以研究双基因HSV SepGI-167的不同给药方案的效果，所述双基因HSV SepGI-167包括如先前实例中所描述的Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβtrap基因和鼠类IL12基因。向六至七周龄的雌性C57BL/6小鼠的右侧腹皮下植入含1x105个同系MB49肿瘤细胞的100μl DPBS。在肿瘤达到100-150mm3之后，通常在肿瘤接种后7-10天，将小鼠用SepGI-167病毒通过瘤内和瘤周注射含1x105pfu、1x106pfu或1x107pfu的经纯化的病毒的50μl DPBS进行处理。处理组(6只小鼠/组)如下：组1：仅用调配物缓冲液(DPBS)处理，每周3次，持续2周(总共6次处理)；组2：用1x107pfu的具有抗PD-L1/TGFβtrap和IL12转基因的SepGI-167HSV处理，每周3次，持续2周(总共6次处理)；组3：用1x106pfu的SepGI-167HSV处理，每周3次，持续2周(总共6次处理)；组4：用1x105pfu的SepGI-167HSV处理，每周3次，持续2周(总共6次处理)；组5：1周内用1x107pfu的SepGI-167HSV处理3次(总共3次处理)；组6：在1周内用1x106pfu的SepGI-167HSV处理3次(总共3次处理)；以及组7：在1周内用1x105pfu的SepGI-167HSV处理3次(总共3次处理)。
使用卡尺每周测量两次肿瘤体积，并且每周测量一次体重。对具有大小达到2,000mm3或已经损失至少15％体重的肿瘤的小鼠实施安乐死。没有调配物缓冲液对照小鼠(组1)存活至研究结束。在接受最低剂量的SepGI-167病毒(1x105pfu/剂量)的组中，在研究结束时仅一只(组4)或两只(组7)小鼠存活。组3的所有小鼠(各自接受六个剂量的1x106pfu)存活至研究结束，接受3个剂量的1x107pfu的组5的所有小鼠也是如此，并且组2的仅一只小鼠(接受1x107pfu/剂量，总共6个剂量)必须实施安乐死。在研究期间，接受3个剂量的1x106pfu的SepG1-167的组6的小鼠中的两只小鼠必须实施安乐死。
图27A-G提供了在整个研究过程中调配物缓冲液对照组和SepGI-167处理组中的个体小鼠的肿瘤体积。对于调配物缓冲液对照组中的所有小鼠(图27A)，肿瘤体积在研究过程中增加，在接种后大约三周显著增加。对照组1中没有小鼠存活至研究结束。
小鼠连续3周以1x107pfu/剂量每周接受3个剂量的组2显示出6只小鼠中的5只小鼠在处理过程结束时实现肿瘤完全消退(图26B)，这证明了表达抗PDL1/TGFβtrap和IL2的SepGI-167病毒的有效性。接受较低剂量(1x106pfu)的SepGI-167病毒(还是每周三次，持续两周)的组3的小鼠中的两只小鼠在6只小鼠中的2只小鼠中显示出肿瘤根除(图26C)，而在6次处理的相同给药方案中接受最低病毒剂量(1x105pfu)的组4的小鼠中没有小鼠显示出完全肿瘤消退(图26D)。
接受最高剂量水平(1x107pfu)的三种处理的组5的所有小鼠显示出完全肿瘤消退(图26E)。对于组6(接受较低剂量1x106pfu，总共3次处理)，两只小鼠显示出完全肿瘤消退(图26F)，而1x105pfu/剂量的三次剂量导致组7中仅一只小鼠经历肿瘤的完全消退(图26G)。总之，给药研究证明了重组SepGI-167病毒的整体有效性和明确的剂量应答。
序列
SEQ ID NO:1
DNA
人工
编码IgG4的变体Fc区
Figure BDA0004090762590000671
Figure BDA0004090762590000681
SEQ ID NO:2
蛋白质
人工
IgG4的变体Fc区
Figure BDA0004090762590000682
SEQ ID NO:3
蛋白质
智人(Homo sapiens)
IgG4的Fc区
Figure BDA0004090762590000683
SEQ ID NO:4
DNA
智人
编码IgG1的Fc区
Figure BDA0004090762590000684
SEQ ID NO:5
蛋白质
人工
IgG1的变体Fc区
包括氨基酸5处的C至S突变
Figure BDA0004090762590000685
SEQ ID NO:6
DNA
智人
编码TGFβRII的胞外结构域
Figure BDA0004090762590000691
SEQ ID NO:7
蛋白质
智人
TGFβRII的胞外结构域
Figure BDA0004090762590000692
SEQ ID NO:8
蛋白质
人工
抗PD-1抗体BB9的重链可变区
Figure BDA0004090762590000693
SEQ ID NO:9
蛋白质
人工
抗PD-1抗体BB9的轻链可变区
Figure BDA0004090762590000694
SEQ ID NO:10
DNA
人工
编码BB9抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000695
Figure BDA0004090762590000701
SEQ ID NO:11
蛋白质
智人
BB9抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000702
SEQ ID NO:12
蛋白质
人工
抗PD-1抗体RG1H10的重链可变区
Figure BDA0004090762590000703
SEQ ID NO:13
蛋白质
人工
抗PD-1抗体RG1H10的轻链可变区
Figure BDA0004090762590000704
SEQ ID NO:14
DNA
人工
编码RG1H10抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000705
SEQ ID NO:15
蛋白质
人工
RG1H10抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000706
Figure BDA0004090762590000711
SEQ ID NO:16
蛋白质
人工
抗PD-1抗体派姆单抗的重链可变区
Figure BDA0004090762590000712
SEQ ID NO:17
蛋白质
人工
抗PD-1抗体派姆单抗的轻链可变区
Figure BDA0004090762590000713
SEQ ID NO:18
DNA
人工
编码派姆单抗抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000714
SEQ ID NO:19
蛋白质
人工
派姆单抗抗PD-1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000715
SEQ ID NO:20
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体Combi5的重链可变区
Figure BDA0004090762590000721
SEQ ID NO:21
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体Combi5的轻链可变区
Figure BDA0004090762590000722
SEQ ID NO:22
DNA
人工
编码Combi5抗PD-L1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000723
SEQ ID NO:23
蛋白质
人工
Combi5抗PD-L1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000724
SEQ ID NO:24
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体H6B1LEM的重链可变结构域
Figure BDA0004090762590000725
SEQ ID NO:25
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体H6B1LEM的轻链可变结构域
Figure BDA0004090762590000731
SEQ ID NO:26
DNA
人工
编码H6B1LEM抗PD-L1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000732
SEQ ID NO:27
蛋白质
人工
H6B1LEM抗PD-L1单克隆抗体ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000733
SEQ ID NO:28
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体阿维鲁单抗的重链可变结构域
Figure BDA0004090762590000734
SEQ ID NO:29
蛋白质
人工
抗PD-L1抗体阿维鲁单抗的轻链可变结构域
Figure BDA0004090762590000735
SEQ ID NO:30
DNA
人工
编码阿维鲁单抗抗PD-L1ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000741
SEQ ID NO:31
蛋白质
人工
阿维鲁单抗抗PD-L1ScFv(单链可变区片段)
Figure BDA0004090762590000742
SEQ ID NO:32
DNA
人工
EF1a/HTLV杂合启动子
Figure BDA0004090762590000743
SEQ ID NO:33
DNA
巨细胞病毒
CMV启动子
Figure BDA0004090762590000744
Figure BDA0004090762590000751
SEQ ID NO:34
蛋白质
小家鼠(Mus musculus)
信号肽，IgG重链
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
SEQ ID NO:35
蛋白质
人工
信号肽
MEFGLSWVFLVALFRGVQCD
SEQ ID NO:36
蛋白质
人工
信号肽
METDTLLLWVLLLWVP
SEQ ID NO:37
DNA
家牛(Bos taurus)
BGH Poly A加成序列
Figure BDA0004090762590000752
SEQ ID NO:38
DNA
SV40
SV40 PolyA加成序列
Figure BDA0004090762590000753
SEQ ID NO:39
DNA
人工
BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000754
/>
Figure BDA0004090762590000761
SEQ ID NO:40
蛋白质
人工
BB9抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000762
SEQ ID NO:41
DNA
人工
RG1H10抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000763
/>
Figure BDA0004090762590000771
SEQ ID NO:42
蛋白质
人工
RG1H10抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000772
SEQ ID NO:43
DNA
人工
派姆单抗抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000773
/>
Figure BDA0004090762590000781
SEQ ID NO:44
蛋白质
人工
派姆单抗抗PD-1ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000782
SEQ ID NO:45
DNA
人工
Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000783
/>
Figure BDA0004090762590000791
SEQ ID NO:46
蛋白质
人工
Combi5抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000792
SEQ ID NO:47
DNA
人工
H6B1LEM抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000793
/>
Figure BDA0004090762590000801
SEQ ID NO:48
蛋白质
人工
H6B1LEM抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000802
SEQ ID NO:49
DNA
人工
阿维鲁单抗抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto构建体
Figure BDA0004090762590000803
/>
Figure BDA0004090762590000811
SEQ ID NO:50
蛋白质
人工
阿维鲁单抗抗PD-L1 ScFv-Fc4-TGFβRIIecto融合蛋白
Figure BDA0004090762590000812
SEQ ID NO:51
DNA
人工
编码人IL12(p40-2x弹性蛋白-p35)
Figure BDA0004090762590000813
/>
Figure BDA0004090762590000821
SEQ ID NO:52
蛋白质
人工
人IL12(p40-2x弹性蛋白-p35)
Figure BDA0004090762590000822
SEQ ID NO:53
DNA
人工
编码小鼠IL12(p40-2x弹性蛋白-p35)
Figure BDA0004090762590000823
/>
Figure BDA0004090762590000831
SEQ ID NO:54
蛋白质
人工
小鼠IL12(p40-2x弹性蛋白-p35)
Figure BDA0004090762590000832
SEQ ID NO:55
蛋白质
2x弹性蛋白接头
VPGVGVPGVG
SEQ ID NO:56
蛋白质
(GGGGS)3接头
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:57
蛋白质
智人
IL12的P40亚基
Figure BDA0004090762590000833
/>
Figure BDA0004090762590000841
SEQ ID NO:58
蛋白质
智人
IL12的P35亚基
Figure BDA0004090762590000842
SEQ ID NO:59
蛋白质
小家鼠
IL12的P40亚基
Figure BDA0004090762590000843
SEQ ID NO:60
蛋白质
小家鼠
IL12的P35亚基
Figure BDA0004090762590000844
/>
序列表
<110> 索伦托药业有限公司
<120> 表达免疫调节融合蛋白的溶瘤病毒
<130> 087735.0140
<140>
<141>
<150> 63/044,818
<151> 2020-06-26
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 1
gagagcaagt acggcccccc ctgccccccc tgccccgccc ccgagttcct gggcggcccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gcgaggagca gttcaacagc 240
acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
tacaagtgca aggtgagcaa caagggcctg cccagcagca tcgagaagac catcagcaag 360
gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcca ggaggagatg 420
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cgcctgaccg tggacaagag ccgctggcag 600
gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgagcct gggcaag 687
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 3
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 4
<211> 696
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gaaccaaagt cctctgataa aacacatact tgcccacctt gtcctgcacc agagctgctg 60
ggaggtccaa gcgtgttcct gtttcctccc aagccaaaag atactcttat gattagccga 120
acaccagagg tgacgtgcgt ggtggtcgac gtatcacacg aggaccctga agtgaagttt 180
aattggtacg tagacggggt tgaggtgcat aacgcgaaga ccaaacctag agaggagcag 240
tataattcaa cctaccgggt cgtttctgtc ctcacagtcc tccaccaaga ttggttgaac 300
ggaaaagaat ataagtgtaa agtgtctaac aaggctcttc ccgcgcctat agagaaaacg 360
atcagcaaag cgaaggggca accaagggaa ccgcaagtct acactcttcc accgtcacgg 420
gatgagctga ctaagaatca agtgtcactt acttgccttg taaaaggatt ctacccatca 480
gacatcgcgg tcgagtggga atctaacggt caaccggaga acaattataa aaccactcct 540
cccgttcttg actccgacgg ttcatttttc ctctattcca aactgacggt tgataagtct 600
cgatggcaac aaggcaatgt gtttagttgt tctgtcatgc acgaagcact gcacaaccat 660
tatacacaaa agtcactttc tctcagtccc ggaaag 696
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 408
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
attcctcctc acgtccaaaa gtcagtaaat aatgatatga tagtcactga taataatggt 60
gctgtaaagt tcccacagct ttgcaagttt tgcgatgtca ggttttctac ctgcgataat 120
cagaagagct gcatgagcaa ttgctctatt acatccatct gtgaaaagcc gcaggaggta 180
tgtgtagcag tatggagaaa gaacgatgaa aacattacac tcgaaaccgt ttgccacgac 240
ccaaaacttc catatcacga ttttatactc gaagatgcgg caagtcccaa atgcataatg 300
aaagagaaga aaaaaccagg cgaaacgttt tttatgtgta gttgcagtag cgatgagtgc 360
aacgataata taatcttctc agaagagtat aacacttcta acccagac 408
<210> 7
<211> 136
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Arg Leu Thr Thr Asn
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Gly Gly Gly Pro Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Val Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln His Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Ala Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 10
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggcttccg cctgaccacc aacggcatca gctgggtgcg ccaggccccc 180
ggccagggcc tggagtggat gggctggatc agcgccggcg gcggccccac caactacgcc 240
cagaagctgc agggccgcgt gaccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gagctgcgca gcctgcgcag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccaa gggcctgtac 360
ggcaccaagg acgcctgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgg cggcggcggc 420
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agccagagcg tgctgaccca gccccccagc 480
gtgagcgagg tgcccggcca gcgcgtgacc atcagctgca gcggcggcgg cagcaacatc 540
ggcagcaacg ccgtgaactg gtaccagcac ttccccggca aggcccccaa gctgctgatc 600
tactacaacg acctgctgcc cagcggcgtg agcgaccgct tcagcgccag caagagcggc 660
accagcgcca gcctggccat cagcggcctg cgcagcgagg acgaggccga ctactactgc 720
gccgcctggg acgacaacct gagcgcctac gtgttcgcca ccggcaccaa ggtgaccgtg 780
ctg 783
<210> 11
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Arg Leu
35 40 45
Thr Thr Asn Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Gly Gly Gly Pro Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Asp Ala Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
145 150 155 160
Val Ser Glu Val Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln His Phe Pro
180 185 190
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Leu Pro Ser
195 200 205
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
210 215 220
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Ser Ala Tyr Val Phe Ala Thr Gly Thr
245 250 255
Lys Val Thr Val Leu
260
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Ile Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Ile Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Leu Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Ala Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 14
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 14
atggagtggt cttgggtatt cctctttttt cttagcgtca ccacaggtgt tcactcccaa 60
gttcaacttg tgcaaagcgg ctccgagttg aagaaacctg gggcaagcgt gaagatctca 120
tgcaaagctt ccggctatat attttcagac aatggggtta actgggtacg ccaggccccg 180
ggtcagggac tggagtggat gggttggatc aatacaaaga ttggtaatcc tacatacgca 240
cagggattta cggggcgatt cgtattctca ctcgatacct ctataagcac aacctacctt 300
cagataagct ccttgcaagc aggtgatacc gctgtgtact actgcgcacg ggaacacgac 360
tattattacg gtatggatgt gtggggtcaa gggaccacag tgactgttag cagcggcggc 420
ggaggatccg gaggcggagg aagtggtggc gggggttcac aaagcgctct cacacaacca 480
ccaagtgcca gtgggtcccc aggacaaagt gttacaatct cctgcactgg gacctcatct 540
gatgtggggg ggtacaatta tgtaagctgg taccaacatc atccaggaaa ggctccaaaa 600
ttgatgatct atgaagtgtc taagcggcct tcaggagttc cggacaggtt ctctgggtca 660
aaaagtgcca tcacggcgtc acttacgatt tctggcctcc ttaccgaaga tgaagccgac 720
tactactgct cagcatggga cgattccctg aacgcggatg tattcggggg tggcaccaaa 780
gttacggtcc tg 792
<210> 15
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Ser Asp Asn Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Lys Ile Gly Asn Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Thr Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr
165 170 175
Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln
180 185 190
His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys
195 200 205
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Ala Ile
210 215 220
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Leu Thr Glu Asp Glu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Asp Val Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
260
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr
100 105 110
Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
115
<210> 18
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 18
atggagtgga gttgggtctt tctcttcttc ctgtctgtaa cgactggcgt gcattcacag 60
gtgcaacttg tacagagcgg cgttgaagtg aaaaaacccg gcgcaagtgt gaaagtcagc 120
tgcaaagcgt caggctacac gttcacgaat tattacatgt attgggttag gcaggcacct 180
ggacaggggc tggagtggat gggtggcata aacccttcta atggcggaac caactttaac 240
gagaagttta agaaccgagt aacactcacg actgatagca gtacgaccac ggcgtacatg 300
gaacttaaaa gcctccaatt tgacgataca gctgtgtact attgcgccag acgcgattac 360
cggttcgaca tgggcttcga ctattggggt cagggaacga cggtcacagt cagttctggg 420
ggaggaggta gtggaggggg agggagtggg ggcggaggta gtgagatagt tttgacgcag 480
tccccggcaa ctctgtccct gtcacctggt gaaagggcca ccctgagctg ccgggcgtca 540
aaaggggtat ccacgagcgg atattcctat ttgcattggt accagcaaaa acccggtcag 600
gctccgaggc ttttgattta cttggcgtcc tatctggaaa gcggagttcc cgctcgcttt 660
tcaggctccg gtagcggtac agattttact ctcacgattt cttccctgga gccggaagac 720
tttgcggtat attattgtca gcatagtcgc gacctccctc ttacattcgg aggaggtacg 780
aaggtcgaaa ttaaa 795
<210> 19
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu
195 200 205
Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265
<210> 20
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Met Lys Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Ile Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Phe Pro His Ile Phe Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtgagc 120
tgcaagacca gcggcaacac cttcaccaac tacgccctgc actgggtgcg ccaggccccc 180
ggccagggcc tggagtggat gggcggcatg aagcccagcg gcggcagcac cagcatcgcc 240
cagaagttcc agggccgcgt gaccatgacc cgcgacaaga gcaccagcac cgtgtacatg 300
gagctgagca gcctgaccag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg cgacctgttc 360
ccccacatct tcggcaacta ctacggcatg gacatctggg gccagggcac caccgtgacc 420
gtgagcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgacatc 480
gtgatgaccc agagcccccc cagcctgagc gccagcgtgg gcgaccgcgt gaccatcacc 540
tgccgcgcca gccagagcat cagcagctac ctgaactggt accagcagaa gcccggcaag 600
gcccccaagc tgctgatcta cgccaccagc agcctgcagt acggcgtgcc cagccgcttc 660
agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc ctgaccatca gcagcctgca gcccgaggac 720
ttcgccacct actactgcca gggcagctac agcaccccct acaccttcgg ccagggcacc 780
aaggtggaga tcaag 795
<210> 23
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 23
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Met Lys Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Ile Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Phe Pro His Ile Phe Gly Asn Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
165 170 175
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
195 200 205
Thr Ser Ser Leu Gln Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ala Cys Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 26
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 26
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
atgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcagcagcgt gaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggcggcac cttcagcagc tacgcctaca gctgggtgcg ccaggccccc 180
ggccagggcc tggagtggat gggcggcatc atccccagct tcggcaccgc caactacgcc 240
cagaagttcc agggccgcgt gaccatcacc gccgacgaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gagctgagca gcctgcgcag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg cggccccatc 360
gtggccacca tcacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcagcta cgtgctgacc 480
cagcccccca gcgtgagcgt ggcccccggc aagaccgcca ccatcgcctg cggcggcgag 540
aacatcggcc gcaagaccgt gcactggtac cagcagaagc ccggccaggc ccccgtgctg 600
gtgatctact acgacagcga ccgccccagc ggcatccccg agcgcttcag cggcagcaac 660
agcggcaaca ccgccaccct gaccatcagc cgcgtggagg ccggcgacga ggccgactac 720
tactgcctgg tgtgggacag cagcagcgac caccgcatct tcggcggcgg caccaagctg 780
accgtgctg 789
<210> 27
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ser Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Ile Val Ala Thr Ile Thr Pro Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Thr Ile Ala
165 170 175
Cys Gly Gly Glu Asn Ile Gly Arg Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg
195 200 205
Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr
210 215 220
Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Arg Ile Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260
<210> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 30
atggaatggt cctgggtctt ccttttcttc ctctctgtta ccactggcgt tcacagccaa 60
tcagcactta cgcaacctgc tagcgttagt ggtagtccag gtcagagcat cacaatttca 120
tgtactggga cctccagcga tgtaggagga tacaactacg tgtcatggta tcagcagcac 180
cccggcaagg cccctaagct tatgatctac gacgtctcaa acaggcccag tggtgttagt 240
aacaggttta gcggatcaaa atctggaaat acagcgagtc tcactatttc cgggttgcaa 300
gctgaggatg aagctgacta ttattgttct tcatacacat cttcatcaac aagagtattt 360
gggacaggaa caaaagtgac agtcttgggt ggtggaggca gtgggggagg aggtagtggc 420
ggcggtgggt cagaagtcca actcttggaa agcggcgggg gcctcgtaca acctggtggc 480
agtctgagac tgtcatgcgc ggcaagcgga ttcactttct catcttatat aatgatgtgg 540
gttagacaag cgccagggaa aggcttggaa tgggtaagtt caatctaccc gtctggcggg 600
attacgttct acgctgatac ggtgaaaggg aggttcacga tttctcgaga caactccaag 660
aatacgctgt atcttcagat gaactctctc cgagccgaag ataccgcagt atactactgc 720
gcacgcatta aactgggcac cgttaccaca gttgattact ggggccaggg tacgctcgtg 780
acggtctcta gc 792
<210> 31
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 31
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val
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85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
100 105 110
Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
115 120 125
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 32
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 32
aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300
ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360
tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420
cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480
actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatc 525
<210> 33
<211> 603
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> Description of Unknown:
Cytomegalovirus sequence
<400> 33
aagcttggga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctact 600
aga 603
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 34
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp
20
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
<210> 37
<211> 225
<212> DNA
<213> bos taurus
<400> 37
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 38
<211> 237
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 38
tagataactg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60
cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatctta 237
<210> 39
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 39
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtgagc 120
tgcaaggcca gcggcttccg cctgaccacc aacggcatca gctgggtgcg ccaggccccc 180
ggccagggcc tggagtggat gggctggatc agcgccggcg gcggccccac caactacgcc 240
cagaagctgc agggccgcgt gaccatgacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gagctgcgca gcctgcgcag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccaa gggcctgtac 360
ggcaccaagg acgcctgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgg cggcggcggc 420
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agccagagcg tgctgaccca gccccccagc 480
gtgagcgagg tgcccggcca gcgcgtgacc atcagctgca gcggcggcgg cagcaacatc 540
ggcagcaacg ccgtgaactg gtaccagcac ttccccggca aggcccccaa gctgctgatc 600
tactacaacg acctgctgcc cagcggcgtg agcgaccgct tcagcgccag caagagcggc 660
accagcgcca gcctggccat cagcggcctg cgcagcgagg acgaggccga ctactactgc 720
gccgcctggg acgacaacct gagcgcctac gtgttcgcca ccggcaccaa ggtgaccgtg 780
ctggagagca agtacggccc cccctgcccc ccctgccccg cccccgagtt cctgggcggc 840
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc 900
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc caggaggacc ccgaggtgca gttcaactgg 960
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgcgagga gcagttcaac 1020
agcacctacc gcgtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 1080
gagtacaagt gcaaggtgag caacaagggc ctgcccagca gcatcgagaa gaccatcagc 1140
aaggccaagg gccagccccg cgagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccaggaggag 1200
atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1260
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1320
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agccgcctga ccgtggacaa gagccgctgg 1380
caggagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1440
cagaagagcc tgagcctgag cctgggcaag ggaggtggcg ggtcaggcgg aggtggtagt 1500
ggcggcggtg ggagtattcc tcctcacgtc caaaagtcag taaataatga tatgatagtc 1560
actgataata atggtgctgt aaagttccca cagctttgca agttttgcga tgtcaggttt 1620
tctacctgcg ataatcagaa gagctgcatg agcaattgct ctattacatc catctgtgaa 1680
aagccgcagg aggtatgtgt agcagtatgg agaaagaacg atgaaaacat tacactcgaa 1740
accgtttgcc acgacccaaa acttccatat cacgatttta tactcgaaga tgcggcaagt 1800
cccaaatgca taatgaaaga gaagaaaaaa ccaggcgaaa cgttttttat gtgtagttgc 1860
agtagcgatg agtgcaacga taatataatc ttctcagaag agtataacac ttctaaccca 1920
gac 1923
<210> 40
<211> 641
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Arg Leu
35 40 45
Thr Thr Asn Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Gly Gly Gly Pro Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Gly Thr Lys Asp Ala Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
145 150 155 160
Val Ser Glu Val Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln His Phe Pro
180 185 190
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Leu Pro Ser
195 200 205
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
210 215 220
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Ser Ala Tyr Val Phe Ala Thr Gly Thr
245 250 255
Lys Val Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
385 390 395 400
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys
500 505 510
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
515 520 525
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
530 535 540
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
545 550 555 560
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
565 570 575
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
580 585 590
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
595 600 605
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
610 615 620
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
625 630 635 640
Asp
<210> 41
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 41
atggagtggt cttgggtatt cctctttttt cttagcgtca ccacaggtgt tcactcccaa 60
gttcaacttg tgcaaagcgg ctccgagttg aagaaacctg gggcaagcgt gaagatctca 120
tgcaaagctt ccggctatat attttcagac aatggggtta actgggtacg ccaggccccg 180
ggtcagggac tggagtggat gggttggatc aatacaaaga ttggtaatcc tacatacgca 240
cagggattta cggggcgatt cgtattctca ctcgatacct ctataagcac aacctacctt 300
cagataagct ccttgcaagc aggtgatacc gctgtgtact actgcgcacg ggaacacgac 360
tattattacg gtatggatgt gtggggtcaa gggaccacag tgactgttag cagcggcggc 420
ggaggatccg gaggcggagg aagtggtggc gggggttcac aaagcgctct cacacaacca 480
ccaagtgcca gtgggtcccc aggacaaagt gttacaatct cctgcactgg gacctcatct 540
gatgtggggg ggtacaatta tgtaagctgg taccaacatc atccaggaaa ggctccaaaa 600
ttgatgatct atgaagtgtc taagcggcct tcaggagttc cggacaggtt ctctgggtca 660
aaaagtgcca tcacggcgtc acttacgatt tctggcctcc ttaccgaaga tgaagccgac 720
tactactgct cagcatggga cgattccctg aacgcggatg tattcggggg tggcaccaaa 780
gttacggtcc tggagagcaa gtacggcccc ccctgccccc cctgccccgc ccccgagttc 840
ctgggcggcc ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc 900
cgcacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaggaccc cgaggtgcag 960
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc ccgcgaggag 1020
cagttcaaca gcacctaccg cgtggtgagc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 1080
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc aacaagggcc tgcccagcag catcgagaag 1140
accatcagca aggccaaggg ccagccccgc gagccccagg tgtacaccct gccccccagc 1200
caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgagc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1260
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1320
ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gccgcctgac cgtggacaag 1380
agccgctggc aggagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1440
cactacaccc agaagagcct gagcctgagc ctgggcaagg gaggtggcgg gtcaggcgga 1500
ggtggtagtg gcggcggtgg gagtattcct cctcacgtcc aaaagtcagt aaataatgat 1560
atgatagtca ctgataataa tggtgctgta aagttcccac agctttgcaa gttttgcgat 1620
gtcaggtttt ctacctgcga taatcagaag agctgcatga gcaattgctc tattacatcc 1680
atctgtgaaa agccgcagga ggtatgtgta gcagtatgga gaaagaacga tgaaaacatt 1740
acactcgaaa ccgtttgcca cgacccaaaa cttccatatc acgattttat actcgaagat 1800
gcggcaagtc ccaaatgcat aatgaaagag aagaaaaaac caggcgaaac gttttttatg 1860
tgtagttgca gtagcgatga gtgcaacgat aatataatct tctcagaaga gtataacact 1920
tctaacccag ac 1932
<210> 42
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe
35 40 45
Ser Asp Asn Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Lys Ile Gly Asn Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Thr Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr
165 170 175
Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln
180 185 190
His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys
195 200 205
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Ala Ile
210 215 220
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Leu Thr Glu Asp Glu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Asp Val Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
355 360 365
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His
500 505 510
Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly
515 520 525
Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
530 535 540
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
545 550 555 560
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
565 570 575
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
580 585 590
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
595 600 605
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
610 615 620
Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
625 630 635 640
Ser Asn Pro Asp
<210> 43
<211> 1935
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 43
atggagtgga gttgggtctt tctcttcttc ctgtctgtaa cgactggcgt gcattcacag 60
gtgcaacttg tacagagcgg cgttgaagtg aaaaaacccg gcgcaagtgt gaaagtcagc 120
tgcaaagcgt caggctacac gttcacgaat tattacatgt attgggttag gcaggcacct 180
ggacaggggc tggagtggat gggtggcata aacccttcta atggcggaac caactttaac 240
gagaagttta agaaccgagt aacactcacg actgatagca gtacgaccac ggcgtacatg 300
gaacttaaaa gcctccaatt tgacgataca gctgtgtact attgcgccag acgcgattac 360
cggttcgaca tgggcttcga ctattggggt cagggaacga cggtcacagt cagttctggg 420
ggaggaggta gtggaggggg agggagtggg ggcggaggta gtgagatagt tttgacgcag 480
tccccggcaa ctctgtccct gtcacctggt gaaagggcca ccctgagctg ccgggcgtca 540
aaaggggtat ccacgagcgg atattcctat ttgcattggt accagcaaaa acccggtcag 600
gctccgaggc ttttgattta cttggcgtcc tatctggaaa gcggagttcc cgctcgcttt 660
tcaggctccg gtagcggtac agattttact ctcacgattt cttccctgga gccggaagac 720
tttgcggtat attattgtca gcatagtcgc gacctccctc ttacattcgg aggaggtacg 780
aaggtcgaaa ttaaagagag caagtacggc cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag 840
ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 900
agccgcaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg 960
cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgcgag 1020
gagcagttca acagcaccta ccgcgtggtg agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1080
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag 1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1200
agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1320
accccccccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccgcct gaccgtggac 1380
aagagccgct ggcaggaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg agcctgggca agggaggtgg cgggtcaggc 1500
ggaggtggta gtggcggcgg tgggagtatt cctcctcacg tccaaaagtc agtaaataat 1560
gatatgatag tcactgataa taatggtgct gtaaagttcc cacagctttg caagttttgc 1620
gatgtcaggt tttctacctg cgataatcag aagagctgca tgagcaattg ctctattaca 1680
tccatctgtg aaaagccgca ggaggtatgt gtagcagtat ggagaaagaa cgatgaaaac 1740
attacactcg aaaccgtttg ccacgaccca aaacttccat atcacgattt tatactcgaa 1800
gatgcggcaa gtcccaaatg cataatgaaa gagaagaaaa aaccaggcga aacgtttttt 1860
atgtgtagtt gcagtagcga tgagtgcaac gataatataa tcttctcaga agagtataac 1920
acttctaacc cagac 1935
<210> 44
<211> 645
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 44
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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645
<210> 45
<211> 1935
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 45
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
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aagagccgct ggcaggaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
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<210> 46
<211> 645
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
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645
<210> 47
<211> 1929
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
atggagtgga gctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccaccggcgt gcacagccag 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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<210> 49
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 49
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<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
355 360 365
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His
500 505 510
Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly
515 520 525
Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
530 535 540
Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser
545 550 555 560
Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn
565 570 575
Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro
580 585 590
Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
595 600 605
Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser
610 615 620
Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr
625 630 635 640
Ser Asn Pro Asp
<210> 51
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 51
atgtgtcatc agcagctggt gatttcttgg ttctctttag tgtttctggc cagccctctg 60
gtcgccatct gggagctcaa gaaggatgtg tacgtcgtgg agctcgattg gtaccccgat 120
gcccccggtg aaatggtcgt gctcacttgt gacacccccg aagaggatgg catcacatgg 180
actttagatc agtccagcga ggtgctggga agcggcaaga ctttaacaat ccaagttaag 240
gagttcggag acgccggaca gtatacttgt cacaagggcg gcgaagtgct gagccattct 300
ttactgttat tacataagaa ggaggacggc atctggagca ccgacatcct caaggaccag 360
aaggagccca aaaacaagac cttcttacgt tgtgaggcca aaaactattc cggcagattt 420
acttgttggt ggctgacaac catcagcaca gatttaacct ttagcgtgaa gagctctcgt 480
ggaagcagcg accctcaagg tgtgacatgt ggagccgcca ccctcagcgc cgaaagggtt 540
cgtggcgata ataaagaata cgagtatagc gtggagtgcc aagaagacag cgcttgcccc 600
gctgccgaag aatctttacc catcgaggtg atggtcgacg ccgtccacaa gctgaagtac 660
gaaaactaca catcctcctt cttcatcaga gatatcatca agcccgatcc ccccaagaat 720
ctgcagctga aacctttaaa gaattctcgt caagttgaag tgagctggga gtatcccgac 780
acttggtcca ccccccactc ctacttcagc ctcaccttct gcgtgcaagt tcaaggcaaa 840
tctaaaaggg agaagaagga cagagtgttt acagacaaga ccagcgctac cgtgatctgt 900
cgtaagaacg cctccatcag cgtgagggct caagatcgtt attacagctc cagctggagc 960
gaatgggctt ccgtgccttg ttctgtgccc ggtgtgggcg tgcccggcgt gggcagaaat 1020
ctccccgtcg ccacccccga tcccggaatg ttcccttgtt tacaccattc ccagaattta 1080
ttaagggccg tgagcaacat gctgcaaaag gccagacaga cactggagtt ctacccttgc 1140
accagcgagg agattgatca cgaggacatc accaaggaca aaaccagcac agtggaggct 1200
tgtttacctc tggaactcac caagaacgag tcttgtttaa actccagaga gaccagcttt 1260
atcaccaacg gcagctgttt agcctctcgt aaaaccagct tcatgatggc tttatgttta 1320
agcagcatct acgaggattt aaagatgtac caagttgaat tcaagaccat gaacgccaag 1380
ttattaatgg atcccaagag gcagatcttt ttagaccaga acatgctggc cgtgatcgac 1440
gagctgatgc aagctttaaa cttcaactcc gaaaccgtgc cccagaaaag cagcctcgag 1500
gagcccgact tctacaaaac aaaaattaag ctgtgcatct tattacacgc ctttaggatt 1560
cgtgccgtga ccatcgatcg tgtcatgagc tatttaaacg cttcctag 1608
<210> 52
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Val
325 330 335
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Val Ile Pro Val Ser Gly
340 345 350
Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp
355 360 365
Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr
370 375 380
Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr
385 390 395 400
Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro
420 425 430
Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu
435 440 445
Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu
450 455 460
Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val
465 470 475 480
Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu
485 490 495
Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met
500 505 510
Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile
515 520 525
Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
530 535
<210> 53
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 53
atgtgtcctc agaagctgac aattagttgg ttcgccattg ttctcctcgt ctcaccactt 60
atggcaatgt gggaactgga aaaagacgtt tacgtggttg aggttgattg gactcccgac 120
gccccaggtg aaaccgtaaa tctgacctgt gacacacctg aggaagatga catcacctgg 180
accagtgacc agcgccacgg agtgataggg agtgggaaga cattgacaat cactgtaaaa 240
gagtttctcg acgctggaca atacacatgt cacaagggag gcgaaacact ctctcatagc 300
cacttgctgt tgcacaagaa ggagaacggc atatggtcca cagagattct caagaatttc 360
aagaataaaa ccttcctcaa gtgcgaagcc cctaactata gtgggaggtt tacttgctca 420
tggctcgtgc agcgcaatat ggacctgaag ttcaacatta aaagttctag ctcatcccca 480
gactcacgcg ccgtgacatg tgggatggca agcctcagcg ccgagaaagt aacattggat 540
cagagagact atgagaaata ttccgtgagc tgccaagaag acgttacctg tccaaccgcc 600
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tattccacaa gttttttcat aagagacata atcaagcctg accccccaaa aaatctccag 720
atgaagccac tgaaaaattc tcaagtcgag gttagttggg aatatccaga ttcttggtca 780
actccacaca gttatttctc tcttaagttt ttcgttcgca tacagcggaa aaaggagaag 840
atgaaggaaa ccgaggaagg gtgcaatcaa aaaggagctt tcttggtaga gaaaacatcc 900
actgaagtcc agtgcaaagg tggtaacgtg tgcgtccagg ctcaggatag atactataac 960
tcatcctgct caaaatgggc ttgcgtccca tgccgcgtac gaagcgtgcc aggagtagga 1020
gttccaggtg ttggccgggt catacctgta agtggtcccg ctcggtgtct ctctcagtct 1080
cggaatctcc ttaaaacaac agacgacatg gtaaaaacag cccgggagaa attgaaacac 1140
tactcttgca cagccgaaga cattgatcat gaagacatca cccgagacca gacctcaaca 1200
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ctgtgcctcg gctctatcta cgaggacctt aagatgtacc aaaccgaatt ccaagccatc 1380
aacgctgcat tgcaaaatca taatcatcaa cagataattc tcgataaggg tatgctcgta 1440
gctatagatg agcttatgca gtcacttaac cacaacggtg agaccttgag gcaaaaacca 1500
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tttagtacca gggtggtaac tataaacagg gtaatgggtt acctctcttc cgcctga 1617
<210> 54
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Val
325 330 335
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Val Ile Pro Val Ser Gly
340 345 350
Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp
355 360 365
Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr
370 375 380
Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr
385 390 395 400
Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro
420 425 430
Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu
435 440 445
Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu
450 455 460
Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val
465 470 475 480
Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu
485 490 495
Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met
500 505 510
Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile
515 520 525
Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
530 535
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 57
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 58
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 59
<211> 335
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 59
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335
<210> 60
<211> 193
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 60
Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg
1 5 10 15
Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys
20 25 30
Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile
35 40 45
Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu
50 55 60
His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr
65 70 75 80
Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu
85 90 95
Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe
100 105 110
Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile
115 120 125
Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu
130 135 140
Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala
145 150 155 160
Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe
165 170 175
Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser
180 185 190
Ala
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> source
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 62
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(150)
<223> This sequence may encompass 1-30 'Gly Gly Gly Gly Ser'
repeating units
<220>
<221> source
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150
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1 5 10

Claims (90)

1.一种重组溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括与免疫检查点蛋白特异性结合的ScFv，其中所述ScFv与TGFβRII胞外结构域(TGFβRIIecto)融合。
2.根据权利要求1所述的重组溶瘤HSV，其中所述ScFv衍生自抗PD-1单克隆抗体或抗PD-L1单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的重组溶瘤HSV，其中所述ScFv衍生自抗PD-1单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
5.根据权利要求4所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性。
6.根据权利要求3所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv包括与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:13具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
7.根据权利要求6所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv与SEQ ID NO:15具有至少95％同一性。
8.根据权利要求3所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv包括与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
9.根据权利要求8所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性。
10.根据权利要求2所述的重组溶瘤HSV，其中所述ScFv衍生自抗PD-L1单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-L1 ScFv包括与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
12.根据权利要求11所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-L1 ScFv与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性。
13.根据权利要求10所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-L1 ScFv包括与SEQ ID NO:24具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
14.根据权利要求13所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-L1 ScFv与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性。
15.根据权利要求10所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-1ScFv包括与SEQ ID NO:28具有至少95％同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的轻链可变区序列。
16.根据权利要求15所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗PD-L1 ScFv与SEQ ID NO:31具有至少95％同一性。
17.根据权利要求1所述的重组溶瘤HSV，其中所述ScFv通过Fc区与TGFβRIIecto融合。
18.根据权利要求1所述的重组溶瘤HSV，其中所述核酸构建体包括与编码所述融合蛋白的序列可操作地连接的能够在哺乳动物细胞中操作的启动子。
19.根据权利要求18所述的重组溶瘤HSV，其中所述启动子选自由EF1α/HTLV、CMV和Jet组成的组。
20.根据前述权利要求中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述核酸构建体包括编码位于编码所述ScFv的序列的5'的信号肽的序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中TGFβRII胞外结构域包括与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的重组溶瘤HSV，其中TGFβRII胞外结构域包括SEQ ID NO:7。
23.根据权利要求17所述的重组溶瘤HSV，其中所述Fc区是IgG1 Fc区或IgG4 Fc区。
24.根据权利要求23所述的重组溶瘤HSV，其中所述Fc区与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性。
25.根据权利要求24所述的重组溶瘤HSV，其中所述Fc区包括SEQ ID NO:5。
26.根据权利要求23所述的重组溶瘤HSV，其中所述Fc区与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。
27.根据权利要求26所述的重组溶瘤HSV，其中所述Fc区包括SEQ ID NO:2。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的重组溶瘤HSV，其进一步包括编码IL12的基因。
29.根据权利要求28所述的重组溶瘤HSV，其中所述编码IL12的基因编码与人IL12(SEQID NO:52)具有至少90％同一性的多肽。
30.根据权利要求28所述的重组溶瘤HSV，其中所述编码IL12的基因编码与鼠类IL12(SEQ ID NO:54)具有至少90％同一性的多肽。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述IL12基因与能够在哺乳动物细胞中操作的第二启动子可操作地连接。
32.根据权利要求31所述的重组溶瘤HSV，其中所述启动子选自由EF1α/HTLV、CMV和Jet组成的组。
33.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:11)。
34.根据权利要求33所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:40。
35.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:15)。
36.根据权利要求37所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:42。
37.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:19)。
38.根据权利要求41所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:44。
39.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:23)。
40.根据权利要求33所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:46。
41.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:27)。
42.根据权利要求37所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:48。
43.一种重组溶瘤HSV，其包括编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包括通过Fc4区(SEQ ID NO:2)与TGFβRIIecto(SEQ ID NO:7)连接的抗PD-1ScFv(SEQ ID NO:31)。
44.根据权利要求41所述的重组溶瘤HSV，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:50。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的重组溶瘤HSV，其进一步包括编码人IL12的基因。
46.根据权利要求45所述的重组溶瘤HSV，其中所述编码人IL12的基因编码SEQ IDNO:52的多肽或与其具有至少95％同一性的多肽。
47.根据前述权利要求中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV是HSV-1。
48.根据权利要求33所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV衍生自HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株F、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株JS1。
49.根据权利要求34所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV衍生自HSV病毒株17。
50.根据前述权利要求中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP34.5编码基因。
51.根据权利要求36所述的重组溶瘤HSV，其中缺失所述ICP34.5编码基因的全部或部分。
52.根据权利要求36或37所述的重组溶瘤HSV，其中将编码所述融合蛋白的所述核酸构建体和/或所述编码IL12的基因插入到ICP34.5编码基因座中。
53.一种在治疗癌症的方法中使用的重组溶瘤HSV，其中所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求1至38中任一项所述的溶瘤HSV。
54.在一种方法中使用的根据权利要求53所述的重组溶瘤HSV，其中所述方法包括通过静脉内、腔内、腹膜内、瘤内或瘤周递送来施用所述溶瘤HSV。
55.根据权利要求53或54所述的重组溶瘤HSV，其中所述方法包括向患者施用多于一个剂量的所述溶瘤HSV。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述癌症是实体瘤。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述受试者是人。
58.根据权利要求53至56中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述受试者是狗。
59.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至58中任一项所述的重组溶瘤HSV。
60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述溶瘤HSV的浓度为至少106/ml。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述溶瘤HSV的浓度为至少107/ml。
62.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求1至61中任一项所述的溶瘤HSV或药物组合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述受试者是人。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述受试者是狗。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其包括通过静脉内、动脉内、腔内、瘤内或瘤周递送来施用所述溶瘤HSV。
66.根据权利要求65所述的方法，其包括向所述受试者施用多于一个剂量的所述溶瘤HSV。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
68.一种融合蛋白，其包括与免疫检查点蛋白结合的单链可变片段(ScFv)、TGFβRII胞外结构域(TGFβRIIecto)和将所述ScFv与所述TGFβRIIecto连接的Fc抗体区。
69.根据权利要求68所述的融合蛋白，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1或PD-L1。
70.根据权利要求69所述的融合蛋白，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
71.根据权利要求70所述的融合蛋白，其中所述ScFv衍生自BB9抗PD-1单克隆抗体、RG1H10抗PD-1单克隆抗体或派姆单抗。
72.根据权利要求71所述的融合蛋白，其中所述ScFv包括与SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的序列。
73.根据权利要求69所述的融合蛋白，其中所述免疫检查点蛋白是PD-L1。
74.根据权利要求73所述的融合蛋白，其中所述ScFv衍生自Combi5抗PD-L1单克隆抗体、H6B1LEM抗PD-L1单克隆抗体或阿维鲁单抗。
75.根据权利要求74所述的融合蛋白，其中所述ScFv包括与SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:27或SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的序列。
76.根据权利要求68至75中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGFβRIIecto包括与SEQ IDNO:7具有至少95％同一性的氨基酸序列。
77.根据权利要求76所述的融合蛋白，其中所述TGFβRIIecto包括SEQ ID NO:7。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的融合蛋白，其中所述Fc是IgG1 Fc或IgG4Fc。
79.根据权利要求68所述的融合蛋白，其中所述Fc是人Fc。
80.根据权利要求79所述的融合蛋白，其中所述Fc包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列。
81.一种条件培养基组合物，其包含根据权利要求68至80中任一项所述的融合蛋白。
82.根据权利要求81所述的条件培养基组合物，其中细胞上清液是无病毒的。
83.一种药物组合物，其包含根据权利要求68至80中任一项所述的融合蛋白。
84.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求83所述的药物组合物。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者是人。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者是狗。
87.一种核酸构建体，其包括编码根据权利要求68至80中任一项所述的融合蛋白的核酸序列。
88.根据权利要求87所述的核酸构建体，其中编码融合蛋白的所述核酸序列与启动子可操作地连接。
89.根据权利要求88所述的核酸构建体，其中所述启动子是真核启动子。
90.根据权利要求89所述的核酸构建体，其中所述启动子能够在哺乳动物细胞中操作。
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