TW201943728A - 結合ｃｄ４７蛋白的融合蛋白及其應用 - Google Patents
結合ｃｄ４７蛋白的融合蛋白及其應用Info
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Abstract
本申請涉及一種結合CD47蛋白的融合蛋白及其應用，所述融合蛋白能夠以1×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合。所述融合蛋白可特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用，且不引起凝血反應。本申請所述融合蛋白還可以抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
Description
本申請涉及一種結合CD47蛋白的融合蛋白及其應用。所述融合蛋白可特異性地阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用，不引起凝血反應，且可抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
CD47蛋白是一種跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族成員，在包括紅細胞在內許多細胞表面表達。CD47的配體包括整合素(intergrins)、凝血栓蛋白1(thrombospondin-1)以及信號調節蛋白(SIRPs)。CD47影響多種生物學功能，包括細胞遷移，T細胞、樹突狀細胞活化，軸突發育等。除此之外，CD47藉由與SIRPα相互作用可抑制巨噬細胞的吞噬作用，保護血細胞等正常細胞不被巨噬細胞吞噬。研究發現，除正常組織細胞表達CD47以外，許多腫瘤細胞過度表達CD47，並藉由與巨噬細胞表面的SIRPα相結合而阻止巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，這被視為腫瘤逃避機體免疫監視的一種機制。阻斷CD47蛋白和SIRPα的相互作用，可抑制腫瘤增長(Theocharides APA,et al.,2012)。
然而，現有的用於阻斷CD47蛋白和SIRPα相互作用的試劑識別活性有限，其與CD47蛋白的親和力往往不足，且對腫瘤的抑制能 力有限。另一方面，現有靶向CD47的抗體類藥物存在引起貧血反應或者血小板減少的副作用(白銀鵬等，Chin J Clin Oncol.,2017 Vol 44.No.7)。亟需開發能夠有效阻斷CD47蛋白和SIRPα相互作用、且副作用小的新型療法。
本申請提供了一種結合CD47蛋白的融合蛋白及其應用。所述融合蛋白可以特異性結合CD47蛋白。本申請所述的融合蛋白具有下列性質中的至少一種：1)以較高的親和力特異性與CD47蛋白相結合；2)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；3)不引起凝血反應；4)抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖；5)阻斷由CD47/SIRPα相互作用而誘導的凋亡信號；和/或，6)對受試者安全沒有傷害身體的副作用。本申請還提供了所述融合蛋白的製備方法和應用。
一方面，本申請提供了一種融合蛋白，其可特異性結合CD47蛋白，並且具有以下特徵中的至少一項：1)以1×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合；2)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；3)不引起凝血反應；以及4)抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
在某些實施方式中，所述CD47蛋白為人CD47蛋白。
在某些實施方式中，所述CD47蛋白為在細胞表面表達的CD47蛋白。
在某些實施方式中，所述腫瘤或腫瘤細胞為CD47陽性。
在某些實施方式中，所述腫瘤選自下組：CD47陽性血液腫瘤和/或CD47陽性實體瘤。
在某些實施方式中，所述融合蛋白包括能夠特異性結合所述CD47蛋白的人SIRPα結構域和免疫球蛋白Fc區，其中所述人SIRPα結構域與所述免疫球蛋白Fc區直接或間接相連。
在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含人SIRPα的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含人SIRPα的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含人SIRPα變體1的結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含人SIRPα變體1的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含人SIRPα變體1中第33位-第149位的胺基酸殘基、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
在某些實施方式中，本申請所述人SIRPα結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-20、62-65，以及，與其具有至少80%(例如，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同源性的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請所述的融合蛋白包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-61中，以及，與其具有至少80%(例如，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同源性的胺基酸序列。
在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體包含1個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加。
在某些實施方式中，所述突變體在選自下組的一個或多個殘基處包含胺基酸取代：I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和V132。
在某些實施方式中，所述突變體包含一個或多個選自下組的胺基酸取代：R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-20、62-65。
在某些實施方式中，所述免疫球蛋白Fc區包含IgG的Fc區。
在某些實施方式中，所述IgG為人IgG。在某些實施方式中，所述IgG選自下組：IgG1和/或IgG4。
在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域位於所述免疫球蛋白Fc區的N端。
在某些實施方式中，所述人SIRPα結構域與所述免疫球蛋白Fc區藉由連接子相連。
在某些實施方式中，所述免疫球蛋白Fc區包含包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：67-68。
在某些實施方式中，所述融合蛋白包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-61。
另一方面，本申請提供了核酸分子，其編碼本申請所述的融合蛋白。
另一方面，本申請提供了載體，其包含本申請所述的核酸分子。
另一方面，本申請提供了宿主細胞，其包含本申請所述的核酸分子或本申請所述的載體。
另一方面，本申請提供了製備本申請所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述融合蛋白表達的條件下，培養本申請所述的宿主細胞。
另一方面，本申請提供了組合物，其包含本申請所述的融合蛋白、核酸分子、載體和/或宿主細胞，以及任選地藥學上可接受的佐劑。
另一方面，本申請提供了本申請所述的融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞和/或組合物在製備藥物和/或試劑盒中的用途，其中所述藥物和/或試劑盒用於預防或治療腫瘤或自免疫疾病。在某些實施方式中，所述腫瘤選自下組：CD47陽性血液腫瘤或CD47陽性實體瘤。在某些實施方式中，所述自免疫疾病選自下組：克羅恩氏病、過敏性哮喘和類風濕性關節炎。
另一方面，本申請提供了阻斷CD47蛋白與SIRPα相互作用的方法，所述方法包括施用本申請所述的融合蛋白或組合物。
另一方面，本申請提供了抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，所述方法包括使本申請所述的融合蛋白或組合物與所述腫瘤或腫瘤細胞接觸。在某些實施方式中，所述接觸在體外發生。
另一方面，本申請提供了預防或治療受試者中的腫瘤或自免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本申請所述的融 合蛋白或組合物。在某些實施方式中，所述腫瘤選自下組：CD47陽性血液腫瘤或CD47陽性實體瘤。在某些實施方式中，所述自免疫疾病選自下組：克羅恩氏病、過敏性哮喘和類風濕性關節炎。
本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本公開的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本公開的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本公開的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明書如下：
第1圖顯示的是載體pTM的物理結構示意圖。
第2圖顯示的是檢測SIRPα截短結構域及其突變體與CD47間相互作用的方法示意圖。
第3圖顯示的是SIRPα截短結構域突變體流式富集篩選結果。
第4圖顯示的是SIRPα截短結構域及其變體的序列比對情況。
第5圖顯示的是本申請所述融合蛋白識別CD47蛋白的結果。
第6A及6B圖顯示的是本申請所述融合蛋白識別人CD47蛋白的特異性。
第7圖顯示的是本申請所述融合蛋白對人CD47蛋白及其他蛋白的識別情況。
第8圖示的是本申請所述融合蛋白與TTI-621競爭性阻斷CD47蛋白與其配體SIRPα的結合。
第9A至9C圖顯示的是本申請所述融合蛋白識別Raji細胞、Jurkat細胞及A549細胞表面CD47蛋白的結果。
第10A至10C圖1顯示的是本申請所述融合蛋白和TTI-621識別Raji細胞、Jurkat細胞及A549細胞表面CD47蛋白的結果。
第11圖顯示的是本申請所述融合蛋白和Hu5F9-G4抗凝血反應的結果。
第12A及12B圖顯示的是本申請所述融合蛋白抑制腫瘤的活性。
第13A及13B圖顯示的是比較本申請所述融合蛋白和TTI-621對紅細胞和血小板的影響。
第14圖顯示的是本申請所述融合蛋白識別CD47蛋白的結果。
第15圖顯示的是本申請所述融合蛋白競爭性阻斷CD47蛋白與其配體SIRPα的結合。
第16圖顯示的是本申請所述融合蛋白和Hu5F9-G4抗凝血反應的結果。
第17圖顯示的是本申請所述融合蛋白有效阻斷CD47-Fc誘導的Jurkat-CSR細胞凋亡。
第18A圖顯示的是本申請所述融合蛋白對小鼠外周血中紅細胞含量的影響。
第18B圖顯示的是本申請所述融合蛋白對小鼠外周血中血小板含量的影響。
第19圖顯示的是本申請所述融合蛋白對小鼠體內腫瘤生長的抑制作用。
第20圖顯示的是本申請所述融合蛋白對小鼠體重的影響。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
一方面，本申請提供了一種融合蛋白，其可以特異性結合CD47蛋白，以1×10-8M或更低的K D 值與CD47蛋白相結合，例如：所述K D 值不高於9×10-9M、不高於8×10-9M、不高於7×10-9M、不高於6.2×10-9M、不高於6×10-9M、不高於5×10-9M、不高於4.8×10-9M、不高於4.5×10-9M、不高於2×10-9M、不高於1.5×10-9M、或不高於1×10-10M或更低。
在某些情形中，本申請所述的融合蛋白也可特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用，從而激活巨噬細胞吞噬腫瘤細胞，或者抑制某些特定細胞凋亡的凋亡信號。此外，本申請所述的融合蛋白可不引起凝血反應，例如，用血凝板進行測試，向其中加入所述融合蛋白和紅細胞溶液後，紅細胞沉於孔底而不平鋪呈網狀。所述融合蛋白還可以抑制腫 瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖，例如，可以使腫瘤面積或腫瘤體積減少，或可以使攜帶腫瘤的受試者的存活率提高。所述融合蛋白還可以安全地向受試者施用，其不會對受試者的體重和/或死亡率產生負面影響。此外，本申請所述的融合蛋白易於製備和獲得，並不局限於特定的免疫球蛋白Fc區來源。
在本申請中，術語“融合蛋白”通常是指一種複合多肽，即由兩種(或更多種)多肽組成的單個連續胺基酸序列。融合蛋白一般可以使用重組核酸的方法或化學合成的方法人工製備得到。
在本申請中，術語“CD47蛋白”又稱整聯蛋白相關蛋白(integrin associated protein,IAP)，其屬於免疫球蛋白超家族。所述CD47蛋白可與膜整合素(membrane integrins)、凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)或信號調節蛋白α(signal-regulatory protein alpha,SIRPα)結合。CD47蛋白可以表達於細胞膜表面。所述CD47蛋白可以為由特定的整聯蛋白、G蛋白及膽固醇組成的超分子複合物。在本申請中，所述CD47蛋白可為人CD47蛋白，其在GenBank數據庫的登錄號為CEJ95640.1。在本申請中，所述CD47蛋白可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。
在本申請中，術語“CD47陽性”通常是指在生物體或細胞表面表達CD47蛋白、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體的特性。CD47陽性細胞可以為過表達CD47的細胞。所述CD47陽性細胞通常可以作為疾病的指示。例如在疾病情況下，所述CD47陽性細胞表面CD47蛋白密度會超過該種細胞在正常條件下所具有的CD47蛋白密度。在某些實施方式中，所述腫瘤或腫瘤細胞可為CD47陽性。例如，所述腫瘤可選自下組：CD47陽性血液腫瘤和/或或CD47陽性實體瘤。
在本申請中，術語“K D ”可與“KD”互換使用，通常是指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，單位為M(mol/L)。K D 可藉由物質AB和其解離得到的物質A和物質B的濃度來計算：K D =c(A) *c(B)/c(AB)。由該公式可知，K D 值越大，說明解離越多，代表物質A、B之間的親和力越弱；反之，K D 值越小，說明解離越少，代表物質A、B之間的親和力越強。
在本申請中，術語“SIRPα”通常是指來自SIRP家族的調節性膜糖蛋白。所述SIRPα能夠識別CD47蛋白，可作為CD47蛋白的配體。SIRPα是一種跨膜蛋白，其胞外區可具有3個免疫球蛋白超家族樣區域，其中N末端的區域介導與CD47的結合。所述SIRPα主要表達於巨噬細胞、樹突狀細胞和神經細胞表面。所述SIRPα的細胞質區域(cytoplasmic region)在大鼠、小鼠和人中高度保守。所述SIRPα存在多形性(polymorphism)，但是不影響其與CD47蛋白的識別和結合。
在本申請中，術語“人SIRPα結構域”通常包括人SIRPα、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在本申請中，所述人SIRPα結構域可以包含人SIRPα的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。所述人SIRPα結構域可以包含人SIRPα的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。所述人SIRPα結構域可以包含人SIRPα變體1的結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。所述人SIRPα結構域可以包含人SIRPα變體1中第33位-第149位的胺基酸殘基、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在人類中，SIRPα蛋白主要有兩種形式，一種形式(人SIRPα變體1或V1型)的胺基酸序列在GenBank中的登錄號為NP_542970.1(其胺基酸序列如SEQ ID NO：62 所示，其中第31-504位胺基酸殘基可構成成熟型SIRPα結構域)。另一種形式(變體2或V2型)與所述變體1或V1型有13個不同的胺基酸，並且其胺基酸序在GenBank中的登錄號為CAA71403.1。
在本申請中，所述人SIRPα結構域可包含人SIRPα的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
在本申請中，術語“胞外結構域”通常是指蛋白中位於細胞膜外的功能結構區域。在某些實施方式中，所述胞外結構域可以指人SIRPα結構域的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。例如，所述人SIRPα結構域的胞外結構域可以包含三個免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域和多個糖基化位點。所述人SIRPα結構域的胞外結構域可以與特異性配體(例如CD47蛋白)相結合，實現信號轉導功能。所述人SIRPα結構域的胞外結構域也可以被多種有絲分裂原活化而發生磷酸化，如血清、胰島素、生長因子、EGF、PDGF以及神經營養因子等。
在本申請中，所述人SIRPα結構域可包含人SIRPα的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。在本申請中，所述人SIRPα結構域可包含人SIRPα變體1、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。例如，所述人SIRPα結構域可以包含人SIRPα變體1中第33位-第149位的胺基酸殘基、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
在本申請中，術語“IgV結構域”通常是指類似於抗體可變結構域的Ig樣結構域。免疫球蛋白結構域可分為四類：IgV、IgC1、IgC2和IgI。IgV結構域可存在於不同的蛋白質家族中，包括免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，T細胞受體等。人SIRPα可以在所述IgV結構域呈高度多形性。例如，所述人SIRPα變體1的IgV結構域可以介導人SIRPα結構域與人 CD47蛋白的結合(Seiffert,M.et al.(2001)Blood 97,2741-9；Vernon-ffilson,E.F.et al.(2000)Eur J Immunol 30,2130-7)。
例如，所述人SIRPα變體1、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體可包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。例如，所述人SIRPα結構域可包含人SIRPα變體1的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。例如，所述人SIRPα變體1的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列(即SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中的第38-145位殘基)。又例如，所述人SIRPα結構域可包含人SIRPα變體1的截短結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。所述人SIRPα變體1的截短結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體可包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列(即SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中的第33-149位殘基)。
本申請所述的人SIRPα結構域可包含選自下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-20、62-65。
在本申請中，術語“突變體”通常是指發生突變的蛋白質、多肽或胺基酸序列。所述突變可以指與野生型相比的不同之處。例如，所述突變可以為在野生型基礎上發生了胺基酸序列的結構性變化。例如，所述野生型可以為缺乏所述結構性變化的典型表型。例如，所述突變體可以將人SIRPα結構域、其片段(包括人SIRPα的IgV結構域、其片段、人SIRPα變體1的結構域、其片段或人SIRPα變體1中第33位-第149位的胺基酸殘基、其片段)視為野生型，突變後得到的突變體。
在本申請中，所述突變體可在選自下組的一個或多個殘基處包含胺基酸取代：I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132。所述胺基酸取代中胺基酸殘基的位置可以是根據SEQ ID NO：62所示胺基酸序列為基準確定的殘基編號。其中，“殘基Xn”是指相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第n位的殘基X，其中n為正整数，X為任意胺基酸殘基的缩写。例如，“殘基I61”表示相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第61位的胺基酸殘基I。
在本申請中，“胺基酸取代Xn”是指在相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第n位的殘基X處發生胺基酸取代，其中n為正整数，X為任意胺基酸殘基的缩写。例如，“胺基酸取代I61”表示在相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第61位的胺基酸殘基I處發生胺基酸取代。
在本申請中，某胺基酸序列中的某胺基酸殘基“相應於”另一胺基酸序列中的某胺基酸殘基通常是指，在優化條件下進行胺基酸序列比對時所獲得的胺基酸殘基對應關係。所述序列比對可藉由本領域技術人員了解的方式進行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)軟體等。本領域技術人員能夠確定用於比對的適當參數，包括在所比較的全長序列中實現最優比對所需要的任何算法。
本申請所述的胺基酸取代可以為非保守取代。所述非保守取代可包括以非保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有不同側鏈大小或不同特性(例如，疏水性)的胺基酸殘基。
所述胺基酸取代也可以為保守取代。所述保守取代可包括以保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大 小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有相同或相似側鏈大小或者相同或相似特性(例如，仍為親水性)的胺基酸殘基。這樣的保守取代通常不會對所產生的蛋白質的結構或功能帶來很大影響。在本申請中，作為所述融合蛋白、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體的胺基酸序列變體可包括不顯著改變蛋白質結構或其功能(例如，阻斷CD47與其配體結合的能力)的保守胺基酸取代。
作為示例，下述各組中每組內各胺基酸間的相互取代在本申請中可被認為是保守取代：
具有非極性側鏈的胺基酸組：丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸。
不帶電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸，半胱胺酸，酪胺酸，天冬醯胺和穀胺醯胺。
帶負電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：天冬胺酸和谷胺酸。
帶正電荷的鹼性胺基酸：賴胺酸、精胺酸和組胺酸。
帶苯基的胺基酸：苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸。
在某些實施方式中，所述突變體可包含一個或多個選自下組的一個或多個胺基酸取代：I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在本申請中，胺基酸取代“XnY/Z”是指相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第n位的殘基X被取代為胺基酸殘基Y或者胺基酸殘基Z，其中n為正整数，X、Y和Z分别独立地為任意胺基酸殘基的缩写，且X不同於Y或Z。例如，胺基酸取代“I61L/V/F”是指相應於SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中第61位的殘基I被取代為胺基酸殘基L、V或F。
例如，本申請所述的融合蛋白可包括選自下述的胺基酸取代組：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；(9)I61L；(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E； (18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；和，(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G。
在本申請中，在人SIRPα變體1的截短結構域(如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，即SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中的第33-149位殘基)的基礎上，分別包含以上(1)-(20)的胺基酸取代組的SIRPα結構域的變體可依次被命名為M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135和M145。這些突變體可依次包含如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20中一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，包含人SIRPα變體1的截短結構域(如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，即SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中的第33-149位殘基)和人IgG1 Fc(如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列)的融合蛋白可被命名為SS002，其包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
在本申請中，術語“免疫球蛋白Fc區”通常是指抗體結構Y形結構的基座區域，又叫做片段可結晶區(Fragment crystallizable region,Fc region)。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，Fc區可由兩個相同的蛋白質片段組成，其來自抗體兩條重鏈的第二和第三恆定結構域；IgM和IgE的Fc區可在每條多肽鏈中含有三個重鏈恆定結構域。IgG的Fc區具有高度保守的N-糖基化位點。在某些實施方式中，所述免疫球蛋白Fc區可包含IgG的Fc區。在某些實施方式中，所述免疫球蛋白Fc區可包含重鏈恆 定區的CH2和CH3區域。在某些實施方式中，所述免疫球蛋白Fc區可包含鉸鏈區。例如，所述免疫球蛋白Fc區可包含選自下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：67-68。
在本申請中，術語“IgG”通常是指免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)。IgG是人的免疫球蛋白之一。根據IgG分子中的γ鏈抗原性差異，人IgG有四個亞型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在本申請中，術語“IgG1”通常是指IgG中占比最高的一類亞型，與Fc受體有較高親和性。例如，所述IgG可為人IgG。又例如，所述IgG可選自下組：IgG1和/或IgG4。
在本申請中，所述融合蛋白包括能够特異性結合所述CD47蛋白的人SIRPα結構域和免疫球蛋白Fc區，其中所述人SIRPα結構域可以與所述免疫球蛋白Fc區直接或间接相连。例如，所述人SIRPα結構域可位於所述免疫球蛋白Fc區的N端。例如，所述人SIRPα結構域的C端可以與所述免疫球蛋白Fc的N端直接或間接連接。例如，所述人SIRPα結構域可以與所述免疫球蛋白Fc藉由連接子相連。在本申請中，所述連接子可以為肽連接子。
在本申請中，在所述SS002的基礎上，分別包含以上(1)-(20)中一項胺基酸取代組的本申請所述融合蛋白可依次被命名為SS002M1、SS002M5、SS002M12、SS002M35、SS002M37、SS002M41、SS002M57、SS002M67、SS002M81、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M99、SS002M102、SS002M111、SS002M122、SS002M126、SS002M130、SS002M135和SS002M145。這些融合蛋白可依次包含如SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本申請中，包含在人SIRPα變體1的截短結構域(其包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列，即SEQ ID NO：62所示胺基酸序列中的第33-149位殘基)基礎上分別含有以上(1)-(20)中一項的胺基酸取代組和人IgG4 Fc(如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列)的本申請所述融合蛋白可依次被命名為SS002M1G4、SS002M5G4、SS002M12G4、SS002M35G4、SS002M37G4、SS002M41G4、SS002M57G4、SS002M67G4、SS002M81G4、SS002M82G4、SS002M84G4、SS002M91G4、SS002M99G4、SS002M102G4、SS002M111G4、SS002M122G4、SS002M126G4、SS002M130G4、SS002M135G4和SS002M145G4。這些融合蛋白可依次包含如SEQ ID NO：41-SEQ ID NO：60中一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請所述的融合蛋白可包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：61。
在本申請中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該所述蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本申請中，所述變體可以為，在所述蛋白質和/或所述多肽(例如，人SIRPα結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體；或所述融合蛋白)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，所述功能性變體可包含已經通過至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。所述功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白質或所述多肽的生物學特性。例如，所述功能性變體可保持改變之前 的所述蛋白質或所述多肽的至少60%，70%，80%，90%，或100%的生物學活性(例如特異性結合CD47蛋白的能力)。
在本申請中，所述同源物可以為，與所述蛋白質和/或所述多肽(例如，人SIRPα結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體；或所述融合蛋白)的胺基酸序列具有至少約80%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，所述同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。所述同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”， Science，227：1435-1441，1989。對BLAST算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
在另一方面，本申請提供一種或多種核酸分子，其可編碼本申請所述的融合蛋白。
在某些實施方式中，所述核酸分子可以完整編碼本申請所述的融合蛋白。例如，利用一種核酸分子即可獲得所述的融合蛋白。在某些實施方式中，所述核酸分子可以編碼本申請所述融合蛋白的一部分。例如，利用兩種以上不同的所述核酸分子可獲得所述的融合蛋白。例如，所述的核酸分子可以編碼本申請所述的融合蛋白中所述人SIRPα結構域(例如，所述人SIRPα的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體、所述人SIRPα的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體、所述人SIRPα變體1的結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體)。又例如，所述核酸分子可以編碼所述融合蛋白中所述免疫球蛋白Fc區。
在另一方面，本申請提供一種或多種載體，其可包含本申請所述的一種或多種核酸分子。在另一方面，本申請提供一種細胞(例如宿主細胞)，其可包含本申請所述的核酸分子或本申請所述的載體。
在本申請中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由克隆重組產生的，(iii)純化的，例如 藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，所述分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼所述抗體或其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，具體操作可參見Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.,1993。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。所述載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。所述載體還包括具有多種上述功能的載體。所述載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含所述載體的合適的宿主細胞，所述載體可以產生期望的表達產物。在本申請中，所述載體中可包含一種或多種所述核酸分子。例如，所述載體可以含有所有編碼所述融合蛋白所需的核酸分子。此時，獲得本申請所述的融合蛋白只需使用一個所述載體。在某些實施方式下，所述載體可以包含一個編碼所述融合蛋白的部分的核酸分子，例如，包含編碼本申請所述的融合蛋白中所述人SIRPα結構域的核酸分子；又例如，所述載體可包含編碼所述融合蛋白中所述免疫球蛋白Fc區的核酸分子。此時，獲得本申請所述的融合蛋白需要使用兩個以上不同的載體。
此外，所述載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，所述載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，所述表達控制序列為可調的元件。所述表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。在本申請中，所述載體可以是pTM載體。
在本申請中，術語“宿主細胞”、“細胞”、“宿主”可以互換地使用，通常是指可以或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述的融合蛋白、其片段或變體的個體細胞，細胞系或細胞培養物。所述宿主細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。所述宿主細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。所述宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HeLa細胞，HEK293細胞，COS-1細胞，NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在本申請中，所述宿主細胞可以是CHO細胞。
在另一方面，本申請可提供製備所述融合蛋白的方法，所述方法可包括在使得所述融合蛋白表達的條件下，培養宿主細胞。
在另一方面，本申請可提供一種組合物，其可包含所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的載體和/或所述的宿主細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金属複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本申請中，可按照本領域的常規技術手段將所述藥物組合物與可藥用載體或稀釋劑以及任何其他已知的輔劑和賦形劑配製在一起，例如按照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995中公開的技術進行操作。
在本申請中，所述組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
在本申請中，所述組合物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本申請的組合物可以抑制或延緩疾病(例如腫瘤或自免疫疾病)的發展或進展，(例如，可以減小腫瘤大小，甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
本申請所述的藥物組合物可以包含治療有效量的所述融合蛋白。所述治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中疾病(例如腫瘤或自免疫疾病)和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面，本申請提供本申請所述的融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞和/或組合物在製備藥物和/或試劑盒中的用途，其中所述藥物和/或試劑盒可用於預防或治療腫瘤或自免疫疾病。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指機體局部組織細胞增生所形成的新生物，由於這種新生物多呈占位性塊狀凸起，也稱贅生物。根據新生物的細胞特性及對機體的危害性程度，又將腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩類，癌症是惡性腫瘤的總稱。本申請中所述的腫瘤可以所述腫瘤選自下組：CD47陽性血液腫瘤和/或CD47陽性實体瘤。
在本申請中，術語“CD47陽性血液腫瘤”通常是指過表達CD47的血液腫瘤，其中可包括各類白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。所述“白血病”通常是指血液的一種癌症，其中產生了過多的對抵抗感染不起作用的白細胞，由此擠佔了組成血液的其他部分，如血小板和紅細胞。白血病可分為急性或慢性白血病。白血病的某些形式可以為，例如，急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性粒細胞白血病(CML)、骨髓增殖性失調/腫瘤(MPDS)和骨髓增生異常綜合症。所述“淋巴瘤”可以指霍奇金淋巴瘤、惰性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤(小細胞和大細胞)等。所述骨髓瘤可以指多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞骨髓瘤、重鏈骨髓瘤(heavy chain myeloma)、輕鏈骨髓瘤(light chian myeloma)或本斯-瓊斯氏骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。
在本申請中，術語“CD47陽性實體瘤”通常是指過表達CD47的實體瘤或有形瘤，其可以藉由臨床檢查，例如，X線攝片、CT掃描、B超或者觸診檢查出有形腫塊。主要類別可包括癌症(carcinoma)和肉瘤(sarcoma)。例如，所述CD47陽性實體瘤可以包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、星形細胞癌、膠質母細胞瘤和腎細胞癌等。
在本申請中，所述自免疫疾病可包括克羅恩氏病、過敏性哮喘和類風濕性關節炎。
在本申請中，術語“克羅恩氏病”通常是指一種原因不明的腸道炎症性疾病，在胃腸道的任何部位均可發生。所述克羅恩氏病和慢性非特異性潰瘍性結腸炎兩者統稱為炎症性腸病(IBD)。
在本申請中，術語“過敏性哮喘”通常是指由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的慢性氣道炎症。
在本申請中，術語“類風濕性關節炎”通常是指一種以關節病變為主的慢性全身自身免疫性疾病。
另一方面，本申請所述的融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞和/或組合物。其可用於預防或治療所述腫瘤或所述自免疫疾病。
另一方面，本申請提供了預防或治療腫瘤或自免疫疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本申請所述的融合蛋白、核酸分子、載體、宿主細胞和/或組合物。
另一方面，本申請提供了一種阻斷CD47蛋白與SIRPα相互作用的方法，所述方法可包括施用(例如，向有需要的受試者或細胞或生物學樣品施用)本申請所述的融合蛋白或組合物。
另一方面，本申請提供了一種抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，所述方法可包括使本申請所述的融合蛋白或組合物與所述腫瘤或腫瘤細胞接觸。例如，所述接觸可在體外發生。
在本申請中，術語“受試者”通常是指任何人或非人動物。術語“非人動物”可包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、山羊、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
在本申請中，術語“包含”通常是指包括、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的裝置、方法和系統的工作方式，而不用於限制本申請發明的範圍。
獲取人SIRPα變體1(NP_542970.1)的截短結構域，其胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示(即SEQ ID NO：62中第33-149位殘基)，用Discovery Studio(創騰科技)軟體構建該截短結構域中與人CD47(CEJ95640.1)相互作用的結構，理論分析兩個蛋白中參與相互作用的位點以及相互作用模式，確定該截短結構域中直接或間接參與與CD47相互作用的胺基酸位點為I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132(其中，這些胺基酸取代中胺基酸殘基的位置以SEQ ID NO：62所示胺基酸序列為准進行計數編號)。對這些作 用位點進行隨機突變，並構建突變體庫。然後，將該突變體庫選殖到載體pTM上。所述pTM載體含有信號肽、跨膜區序列(如第1圖所示)，其可在細胞表面展示選殖入該載體的基因。
將構建的突變體庫表達載體轉染至CHO細胞(ATCC)，使突變體庫展示表達在細胞表面上。然後，用FITC螢光標記CD47蛋白(義翹神州)獲得CD47-FITC，根據CD47-FITC與CHO細胞表面該截短結構域的突變體之間結合活性強弱，利用流式細胞技術富集篩選能與CD47-FITC結合的突變體。篩選的具體原理可參見第2圖，其中該截短結構域及突變體與帶螢光分子CD47蛋白結合，結合的結果即可以藉由螢光分子水平的高低來體現。
經過四輪篩選富集，收集與CD47-FITC結合較強的細胞(如第3圖所示)。然後提取其mRNA，反轉錄後獲得cDNA，對該截短結構域突變體的基因進行測序分析(如第4圖4=所示)。測序結果顯示，前述位點I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132存在不同的突變位點組合。
從結果可知，在I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和/或V132殘基處引入不同的突變位點組合，可獲得可特異性識別CD47的人SIRPα變體1截短結構域的突變體。
進一步分析後確定上述突變位點可能的突變後的胺基酸種類：I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H、V132L/R/I/S。
將包含這些突變的突變體分別命名為M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135和M145，其分別依次包括如SEQ ID NO：1-20中任一項所示的胺基酸序列，同時，這些其突變體在SEQ ID NO：63所示胺基酸序列的基礎上分別依次具有如下的胺基酸突變組合：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；(9)I61L；(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A； (17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；和，(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G。
將實施例1中的人SIRPα變體1的截短結構域(或稱為野生型SIRPα截短結構域)和實施例1獲得的人SIRPα結構域的突變體(即M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135和M145)分別與人IgG1-Fc(其胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示)融合表達，獲得其所對應的SIRPα突變體1的截短結構域-人Fc融合蛋白(簡稱融合蛋白)，將這些融合蛋白分別命名為SS002、SS002M1、SS002M5、SS002M12、SS002M35、SS002M37、SS002M41、SS002M57、SS002M67、SS002M81、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M99、SS002M102、SS002M1 11、SS002M122、SS002M126、SS002M130、SS002M135和SS002M145。這些融合蛋白分別包含SEQ ID NO：61、21-40中任一項所示的胺基酸序列。
作為舉例，選擇融合蛋白SS002、SS002M12、SS002M5、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130進行生物學活性分析。
利用ELISA法測定SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130等各融合蛋白與CD47分子的親和力。
用1g/ml靶抗原CD47-His包被ELISA板條，於4℃過夜。用PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，於37℃封閉1小時。然後分別向其加入SS002、SS002M5、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130，於37℃反應1小時。然後，用PBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，於室溫反應30分鐘。然後，用PBST重複洗板5遍，用吸水紙儘量拍幹殘留液。每孔加入100ml TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100mL 2N H2SO4終止受質反應。用酶標儀於450nm處讀取OD值，分析各融合蛋白與CD47分子的親和力(如第5圖所示)。
第5圖的結果顯示，SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130等各融合蛋白均能有效識別CD47分子。
作為舉例，利用Biacore方法測定SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130等各融合蛋白與CD47分子的親和力，結果如下表2所示。
表2的結果顯示，SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130等各融合蛋白均可高親和力識別CD47分子。
以融合蛋白SS002和SS002M91為例，進行特異性識別活性分析。
為進行融合蛋白的種屬分析，將1mg/mL人(Human)CD47和小鼠(Mouse)CD47(北京義翹神州生物技術有限公司)分別包被ELISA板條，於4℃過夜；用PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，於37℃封閉1小時。然後分別加入SS002、SS002M91，於37℃反應1小時。用PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，於室溫反應30分鐘。然後，用 PBST重複洗板5遍，用吸水紙儘量拍幹殘留液滴。然後每孔加入100ml TMB(eBioscience)，於室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100mL 2N H2SO4終止受質反應。用酶標儀於450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與不同種屬CD47的結合能力(融合蛋白SS002和SS002M91的實驗結果分別如第6A及6B圖所示)。
第6A及6B圖的結果顯示，SS002、SS002M91均能特異性識別人CD47分子，且不識別小鼠CD47分子。
以融合蛋白SS002和SS002M91為例，將1mg/ml SS002、SS002M91與牛奶(北京博邁德生物技術有限公司)、BSA(BOVOGEN)、CD19(北京義翹神州生物技術有限公司)、TROP2(北京義翹神州生物技術有限公司)、CD47(北京麥格珀爾生物科技有限公司)、CD38(北京義翹神州生物技術有限公司)、Gas6(R&D)等各蛋白以及AXL(ACRO Biosystems)分別包被ELISA板條，於4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入SS002或SS002M91，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，室溫反應30分鐘；PBST重複洗板5遍，在吸水紙上儘量拍幹殘留液滴；每孔加入100ml TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100mL 2N H2SO4終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與上述各蛋白結合能力(如第7圖所示)。
第7圖的結果顯示，融合蛋白SS002、SS002M91只識別人CD47分子，並且與其他的各種蛋白均無交叉反應。
以SS002M91為例，進行特異性阻斷CD47/SIRPα相互作用活性分析，並將表達美國同類品種TTI-621(參見CN105073780A)作為陽性對照。
將1μg/ml SIRPα-His包被ELISA板條，於4℃過夜；用PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；使用10%的胎牛血分別梯度稀釋SS002M91和TTI-621，並在樣品中加入Biotin-Fc-CD47至終濃度2μg/ml，於37℃預孵育30min，作為一抗。用PBST洗滌ELISA板條後，加入一抗，於37℃孵育1小時。然後，用PBST洗5遍，加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，於37℃孵育30分鐘；用PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止受質反應，用酶標儀於450nm處讀取OD值，分析SIRPα融合蛋白對CD47/SIRPα的阻斷作用(如第8圖所示)。
第8圖的結果顯示，SS002M91、TTI-621均能競爭性阻斷CD47與其配體SIRPα的結合，然而，融合蛋白SS002M91阻斷活性顯著高TTI-621。SS002M91的IC50值為5.47μg/mL，而TTI-621的IC50值為493.5μg/mL。
以融合蛋白SS002和SS002M91為例，進行腫瘤細胞表面的CD47分子識別活性分析。
利用流式分析技術(BD Calibur)分別檢測SS002、SS002M91特異性識別Raji細胞、Jurkat細胞及A549細胞表面的CD47分子的活性。分別收集對數生長期對的前述細胞，調整細胞密度至5×106個/mL，冰上預冷10min。用含2%FBS的預冷的生理鹽水將SIRPα融合 蛋白SS002、SS002M91稀釋成不同濃度。取100μL細胞，加入等體積前述稀釋SIRPα融合蛋白，於4℃避光反應30min。結束後，用含2%FBS的預冷的生理鹽水洗滌細胞兩次。用100μL稀釋的PE標記山羊抗人IgG-Fc二抗(PE-Goat anti-human IgG Fc Secondary Antibody，eBioscience)重懸細胞，於4℃避光反應30min。反應結束後，用含2% FBS的預冷的生理鹽水洗滌細胞兩次。用400μL 1%多聚甲醛重懸細胞。流式細胞儀(BD Calibur)分析融合蛋白與細胞表面CD47的結合能力(如第9A至9C圖所示，第9A至9C圖分別顯示融合蛋白SS002和SS002M91特異性識別Raji細胞、Jurkat細胞及A549細胞的表面CD47)。
結果顯示，融合蛋白SS002M91能特異性識別Raji細胞、Jurkat細胞及A549細胞表面CD47，該識別活性明顯高於SS002且呈劑量依賴性。其中對於與Raji細胞結合的EC50值，SS002M91為197.0ng/mL，SS002為1140.0ng/mL(如第9A圖所示)。對於與Jurkat細胞結合的EC50值，SS002M91為796.0ng/mL，SS002為4529.0ng/mL(如第9B圖所示)。對於與A549細胞結合的EC50值，SS002M91為321.9ng/mL，SS002為1655.0ng/mL(如第9C圖所示)。
同樣地，用本實施例中所述方法，比較SS002M91與TTI-621的識別Raji細胞(如第10A圖所示)、Jurkat細胞(如第10B圖所示)、A549細胞(如第10C圖所示)細胞表面CD47分子的活性。結果顯示，一方面，SS002M91特異性識別腫瘤細胞表面的CD47分子的最高螢光強度明顯高於TTI-621：SS002M91與Raji細胞結合的最高螢光強度約為1200，而TTI-621與Raji細胞結合的最高螢光強度約為600；SS002M91與Jurkat細胞結合的最高螢光強度約為5000，而TTI-621與Jurkat細胞結合的最高螢光強度約為3000；SS002M91與A549細胞結合的最高螢光 強度約為180，而TTI-621與A549細胞結合的最高螢光強度約為60。另一方面，SS002M91特異性識別腫瘤細胞表面的CD47分子的半數優效劑量顯著優勢於TTI-621：SS002M91與Raji細胞結合的EC50值為13.06ng/mL，而TTI-621與Raji細胞結合的EC50值為40.37ng/Ml；SS002M91與Jurkat細胞結合的EC50值為28.09ng/mL，而TTI-621與Jurkat細胞結合的EC50值為53.92ng/Ml；SS002M91與A549細胞結合的EC50值為26.95ng/mL，而TTI-621與A549細胞結合的EC50值為1003ng/mL。可見SS002M91特異性識別腫瘤細胞表面的CD47分子顯著優於TT1-621。
以SS002和SS002M91為例，進行凝血活性分析，以CD47抗體Hu5F9-G4(參見Guerriero J L，Sotayo A，Ponichtera H E，et al.Class IIa HDAC inhibition reduces breast tumours and metastases through anti-tumour macrophages.[J].Nature，2017，543(7645)：428.432以及Gholamin S，Mitra SS，Feroze AH et al.Disrupting the CD47-SIRPα anti-phagocytic axis by a humanized anti-CD47 antibody is an efficacious treatment for malignant pediatric brain tumors.Sci.Transl.Med 2017)作為對照。
利用來自健康供體的全血來製備人紅細胞(採集自志願者的外周血)。用PBS將全血稀釋5倍後，洗滌3次，並製備成新鮮的1%紅細胞溶液。向血凝板各孔中加入50μL的不同濃度的SIRPα融合蛋白SS002、SS002M91及抗CD47抗體Hu5F9-G4，再向每孔中加入50μL 1%的紅細胞溶液，輕輕混勻，並於37℃、5%CO2條件下孵育過夜。然後，以紅細胞全部凝集，沉於孔底，平鋪呈網狀，即為100%凝集(++++)；紅 細胞沉於孔底呈點狀即為不凝集(-)為標準，對所述平板拍照判讀(如第11圖所示)。
第11圖的結果顯示，融合蛋白SS002M91與SS002沒有誘導紅細胞凝集，而CD47抗體Hu5F9-G4在一定的劑量範圍內可顯著引起紅細胞凝集。
以融合蛋白SS002M91為例，進行體內抑制腫瘤活性分析。
藉由B-NSG小鼠接種Raji-Luc細胞建立腫瘤模型，評價SS002M91抗體抑制腫瘤活性。選擇雌性、8周齡的B-NSG小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)作為實驗動物、Raji-Luc細胞(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)進行檢測。將Raji-Luc細胞轉入螢光素報告基因獲得的穩定細胞系，復蘇培養至所需數量後，收集對數期生長細胞，懸浮至5×106個/0.2mL濃度。然後，按0.2mL/隻藉由尾靜脈接種到B-NSG小鼠。接種後，於第0天、第3天用小動物成像儀觀察腫瘤生長情況及體重，並於第3天挑選腫瘤成像信號適中(約1.00×106P/S)的12隻小鼠，將其隨機分組分配到2個組中，每組6隻，分為溶劑對照組(G1，生理鹽水)和實驗組(G2，SS002M91)，實驗組給藥劑量為10mg/kg，並在分組當天以及分組後第3天給藥，共給藥2次。觀察小鼠腫瘤生長情況以及小鼠生存率(分別如第12A及12B圖所示)。
結果顯示，分組給藥後第10天，對照組的腫瘤平均螢光强度為6.75×108P/S，而給藥組的腫瘤平均螢光强度為1.76×106P/S，抑制率約95%。
以融合蛋白SS002M91為例，以B-NSG小鼠為模型，進行體內安全性初步評價。
挑選18隻雌性、8周齡的B-NSG小鼠(北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)，隨機分組分配到3個組中：溶劑對照組(施用生理鹽水)、實驗組(施用融合蛋白SS002M91)和陽性對照組(施用TTI-621)，每組6隻；對小鼠進行給藥，給藥劑量為10mg/kg，在分組當天、第3天、第7天給藥，共給藥3次；在第3次給藥後次日(即第8天)，分析小鼠外周血中紅細胞以及血小板含量(紅細胞含量和血小板含量分別如第13A圖和第13B圖所示)。
結果顯示，與對照組相比，SS002M91沒有引起紅細胞(P=0.4483)、血小板(P=0.9199)顯著降低；而TTI-621儘管對血小板影響較小(P=0.9447)，卻引起了紅細胞降低(P=0.0246)。
根據實施例2中融合蛋白構建方法，將實施例1獲得的SIRPα結構域的突變體M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135和M145分別與人IgG4-Fc(其胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示)融合表達，獲得其所對應的SIRPα突變體1的截短結構域-人Fc融合蛋白(簡稱融合蛋白)，將這些融合蛋白分別命名為SS002M1G4、SS002M5G4、SS002M12G4、SS002M35G4、SS002M37G4、SS002M41G4、SS002M57G4、SS002M67G4、SS002M81G4、SS002M82G4、SS002M84G4、SS002M91G4、SS002M99G4、SS002M102G4、SS002M111G4、SS002M122G4、SS002M126G4、SS002M130G4、 SS002M135G4和SS002M145G4(其胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41-60所示)。
作為舉例，選擇融合蛋白SS002M91G4進行生物學活性分析。
根據實施例2中結合活性測定方法，分析SS002M91G4結合抗原CD47的活性，結果如第14圖所示。第14圖的結果說明，SS002M91G4具有良好的結合CD47抗原的活性，EC50值為0.0157μg/mL，與SS002M91的EC50(0.0195μg/mL)基本一致。
根據實施例6中特異性阻斷CD47/SIRPα相互作用分析方法，分析SS002M91G4阻斷CD47/SIRPα相互作用的活性，結果如第15圖所示。第15圖的結果說明，SS002M91G4具有良好的阻斷CD47/SIRPα相互作用的活性，IC50值為3.46μg/mL，與SS002M91的IC50值(5.47μg/mL)基本一致。
由以上的結果可知，不同亞型IgG Fc融合對本申請所構建的融合蛋白的活性並無明顯影響。
以SS002M91G4為例，參考實施例8中凝血反應檢測的方法，評價基於IgG4 Fc的所述融合蛋白的凝血反應。利用來自健康供體的全血來製備人紅細胞。將全血用磷酸鹽緩衝液(PBS)進行5倍稀釋後，洗滌3次，並備成新鲜的1%红細胞溶液。向血凝板各孔中加入50μL的不同濃度融合蛋白SS002M91G4、陽性對照TTI-621及抗CD47抗體Hu5F9-G4，再向每孔中加入50μL 1%紅細胞溶液，輕輕混勻，並在37℃、5%CO2下孵育過夜。孵育過夜後，對所述平板拍照判讀。判讀標準：紅細胞全部凝 集，沉於孔底，平鋪呈網狀，即為100%凝集(++++)，紅細胞沉於孔底呈點狀即為不凝集者(-)。
結果如第16圖所示。結果說明基於IgG4 Fc的融合蛋白SS002M91G4與TTI-621沒有引起紅細胞凝集，而CD47抗體Hu5F9-G4則在一定的劑量範圍內顯著引起紅細胞凝集。
以SS002M91G4為例，利用Jurkat-CSR細胞(宜明昂科生物醫藥技術(上海)有限公司)體系，評價基於IgG4 Fc的所述融合蛋白的生物學活性，同時以TTI-621作為陽性對照。
將CD47-Fc蛋白(Cat#12283-H02H，Sino Biological)稀釋至0.2μg/mL，每孔加入50μL蛋白稀釋液；再分別將TTI-621及SS002M91G4稀釋至0.4mg/mL，隨後梯度稀釋至不同濃度，每孔加入50μL，37℃，5%CO2培養箱中與CD47-Fc共孵育45min。取Jurkat-CSR細胞調整密度至5×105/mL，每孔加入100μL細胞懸液，同時設置空白對照組，37℃，5%CO2培養箱中與蛋白混合液共培養20小時。培養結束後，每孔加入20μL CCK-8(Dojindo，日本同仁化學研究所)，37℃、5%CO2培養箱中培養4小時。酶標儀450nm波長下測定OD值，以下列公式計算細胞生長抑制率：抑制率%==(OD450(樣品)-OD450(空白)/(OD450(Jurkat-CSR)-OD450(空白))×100
根據Jurkat-CSR細胞體系的原理，CD47/SIRPα相互作用，可以誘導靶細胞凋亡；加入抑制CD47/SIRPα相互作用的抑制劑，該凋亡信號被阻斷。抑制劑的作用越強，凋亡信號被阻斷地越充分。結果如第17圖所示。結果顯示，SS002M91G4能顯著阻斷CD47-Fc誘導的 Jurkat-CSR細胞凋亡，阻斷效果强於TTI-621，IC50約為TTI-621的1/100。由此可見，SS002M91G4阻斷CD47/SIRPα相互作用的生物學活性顯著優於TTI-621。
以融合蛋白SS002M91、SS002M91G4為例，進行體內抑制腫瘤活性分析及對紅細胞血小板的影響。
藉由NOD/SCID小鼠皮下接種Raji細胞，建立人淋巴瘤皮下移植腫瘤模型，評價SS002M91、SS002M91G4的體內抑制腫瘤活性。
選擇雌性、6-7周齡NOD/SCID小鼠(上海靈暢生物科技有限公司)，Raji細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中。收集指數生長期的1×107 Raji細胞，PBS重懸至適合濃度並與matrigel(BD MatrigelTM)1：1混合後用於小鼠皮下腫瘤接種。接種後，待腫瘤平均體積大約為98.6mm3時，根據腫瘤大小隨機分為4組(即溶媒對照組、SS002M91組、SS002M91G4組和TTI-621組)，每組6隻。腹腔注射給藥(上述4組分別對應給藥PBS溶液、SS002M91、SS002M91G4和TTI-621)，每次給藥劑量為10mg/kg，每週給藥兩次，共給藥兩周。
末次給藥後6天結束實驗，取血進行血常規檢測，分析小鼠外周血中紅細胞以及血小板含量(紅細胞含量和血小板含量分別如第18A圖和第18B圖表示)。給藥期間觀察小鼠腫瘤生長情況，根據相對腫瘤抑制率(TGI)進行療效評價(結果如第19圖所示)，同時根據動物體重變化和死亡情況進行安全性評價(結果如第20圖所示)。TGI(%)，即相對腫瘤抑制率的計算公式如下：TGI%=(1-T/C)×100%。其中T和C分 別為治療組(例如SS002M91組、SS002M91G4組和TTI-621組)和對照組(即溶媒對照組)在某一特定時間點的相對腫瘤體積(RTV)或瘤重(TW)。
結果說明，SS002M91組、SS002M91G4組、TTI-621組(10mg/kg)在停藥後第六天時均表現出顯著的抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGI(%)分別為74.09%，66.65%和54.75%，相對溶媒對照組統計學上均有顯著性差異(p值均<0.01)。SS002M91組、SS002M91G4組抑瘤作用相似且優於陽性對照TTI-621組。
治療期間均無動物死亡，沒有表現明顯的藥物毒性，耐受良好。血常規檢測結果顯示，與陽性對照TTI-621組相比，SS002M91組紅細胞及血小板有所降低，TTI-621組血小板也略有下降，然而SS002M91G4對紅細胞影響無明顯影響。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本文所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
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Claims (24)
- 一種融合蛋白，其特異性結合CD47蛋白，並且具有以下特性中的至少一項：(a)以1×10 -8M或更低的 K D 值與CD47蛋白相結合；(b)特異性阻斷CD47蛋白與SIRPα的相互作用；(c)不引起凝血反應；以及(d)抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
- 如申請專利範圍第1項所述的融合蛋白，其中該CD47蛋白為人CD47蛋白。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項所述的融合蛋白，其包括能够特異性結合該CD47蛋白的人SIRPα結構域和免疫球蛋白Fc區，其中該人SIRPα結構域與所述免疫球蛋白Fc區直接或间接相连。
- 如申請專利範圍第3項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域包含人SIRPα的胞外結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
- 如申請專利範圍第3至4項中任一項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域包含人SIRPα的IgV結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
- 如申請專利範圍第3至5項中任一項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域包含人SIRPα變體1的結構域、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
- 如申請專利範圍第3至6項中任一項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域包含人SIRPα變體1中第33位-第149位的胺基酸殘基、其片段，或者其中經過1個或多個胺基酸取代的其突變體。
- 如申請專利範圍第7項所述的融合蛋白，其中該突變體在選自下組的一個或多個殘基處包含胺基酸取代：I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和V132。
- 如申請專利範圍第8項所述的融合蛋白，其中該突變體包含一個或多個選自下組的胺基酸取代：R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
- 如申請專利範圍第3至9項中任一項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-20、62-65。
- 如申請專利範圍第3至10項中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含IgG的Fc區。
- 如申請專利範圍第11項所述的融合蛋白，其中該IgG選自下組：IgG1和/或IgG4。
- 如申請專利範圍第3至12項中任一項所述的融合蛋白，其中該人SIRPα結構域位于所述免疫球蛋白Fc區的N端。
- 如申請專利範圍第3至13項中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：67-68。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述的融合蛋白，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：21-61。
- 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至15項中任一項所述的融合蛋白。
- 一種載體，其包含申請專利範圍第16項所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第16項所述的核酸分子或申請專利範圍第17所述的載體。
- 一種製備申請專利範圍第1至15項中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括在使得所述融合蛋白表達的條件下，培養申請專利範圍第18項所述的宿主細胞。
- 一種組合物，其包含申請專利範圍第1至15項中任一項所述的融合蛋白、申請專利範圍第16項所述的核酸分子、申請專利範圍第17項所述的載體和/或申請專利範圍第18項所述的宿主細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
- 一種申請專利範圍第1至15項中任一項所述的融合蛋白、申請專利範圍第16項所述的核酸分子、申請專利範圍第17項所述的載體、申請專利範圍第18項所述的宿主細胞和/或申請專利範圍第20項所述的組合物在製備藥物和/或試劑盒中的用途，其中該藥物和/或試劑盒用於預防或治療腫瘤或自免疫疾病。
- 如申請專利範圍第21項所述的用途，其中該腫瘤選自下組：CD47陽性血液腫瘤和/或CD47陽性實體瘤。
- 如申請專利範圍第21項所述的用途，其中該自免疫疾病選自下組：克羅恩氏病、過敏性哮喘和/或類風濕性關節炎。
- 一種阻斷CD47蛋白與SIRPα相互作用的方法，該方法包括施用申請專利範圍第1至15項中任一項所述的融合蛋白或申請專利範圍第20項所述的組合物。
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