JP2021520830A - Ｃｄ４７タンパク質に結合する融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Ｃｄ４７タンパク質に結合する融合タンパク質およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、1×10-8Mまたはより低いKD値でCD47タンパク質に結合することができる融合タンパク質およびその使用を提供する。上記の融合タンパク質は、CD47タンパク質とSIRPαとの相互作用を特異的に遮断することができ、且つ血液凝固反応を起こすことがなく、さらに、腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制することができる。【選択図】なし

Description

技術領域
本発明は、CD47タンパク質に結合する融合タンパク質およびその使用に関するものである。上記融合タンパク質は、CD47タンパク質とSIRPαとの相互作用を特異的に遮断することができ、且つ血液凝固反応を起こすことがなく、さらに、腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制することができる。
背景技術
CD47タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーに属し、赤血球を含めて多くの細胞表面に発現する膜貫通型糖タンパク質である。CD47の配位子は、インテグリン（intergrins）、トロンボスポンジンタンパク質1（thrombospondin-1）およびシグナル調節タンパク質（SIRPs）を含む。CD47は、細胞遊走、T細胞、樹状細胞活性化、軸索成長などを含めて複数種類の生物的機能に影響を与える。このほかには、CD47は、SIRPαとの相互作用によって貪食細胞による食作用を阻害し、血球などの正常細胞が貪食細胞により貪食されないように保護する。調べによれば、正常組織細胞によるCD47の発現のほか、多くの腫瘍細胞がCD47を過剰に発現し、また、貪食細胞表面のSIRPαに結合することによって貪食細胞の腫瘍細胞貪食を阻止し、これも、腫瘍の免疫監視逃避機構であることが分かった。CD47タンパク質とSIRPαの相互作用遮断によって、腫瘍増殖を抑制することができる（Theocharides APA, et al., 2012）。
しかしながら、従来のCD47タンパク質とSIRPαの相互作用遮断に用いられる試薬は、認識活性が限られており、CD47タンパク質との親和力がいつも不十分であり、且つ、腫瘍への抑制役割に限界がある。一方で、従来標的CD47の抗体系医薬品には、貧血誘発または血小板減少の副作用がある（白銀鵬など、Chin J Clin Oncol., 2017 Vol 44. No.7）。CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を効果的に遮断することができる副作用の小さい新規治療法を早急に開発しなければならない。
発明内容
本発明は、CD47タンパク質に結合する融合タンパク質およびその使用を提供する。上記融合タンパク質は、CD47タンパク質に特異的に結合することができる。本発明に記載の融合タンパク質は、1）高い親和力でCD47タンパク質に特異的に結合し、2）CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を特異的に遮断し、3）血液凝固反応を起こすことがなく、4）腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制し、5）CD47/SIRPα相互作用によって誘導されるアポトーシスシグナルを阻害し、および/または、6）被験者に安全であり、体を傷害する副作用がない特性の少なくとも1種類を含む。本発明は、さらに、上記融合タンパク質の調製方法および使用を提供する。
一方で、本発明は、CD47タンパク質に特異的に結合することができ、且つ、1）1×10-8Mまたはより低いKD値でCD47タンパク質に結合し、2）CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を特異的に遮断し、3）血液凝固反応を起こすことがなく、および4）腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する特徴の少なくとも一つを含む、融合タンパク質を提供する。
ある実施形態において、上記CD47タンパク質は、ヒトCD47タンパク質である。
ある実施形態において、上記CD47タンパク質は、細胞表面に発現するCD47タンパク質である。
ある実施形態において、上記腫瘍または腫瘍細胞は、CD47陽性である。
ある実施形態において、上記腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍および/またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれる。
ある実施形態において、上記融合タンパク質は、上記CD47タンパク質に特異的に結合することができるヒトSIRPαドメインおよび免疫グロブリンFc領域を含有し、ここで、上記ヒトSIRPαドメインと上記免疫グロブリンFc領域が、直接的または間接的に連結している。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1のドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1のIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1における33〜149番目のアミノ酸残基、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。
ある実施形態において、本発明に記載のヒトSIRPαドメインは、SEQ ID NO: 1-20、62-65のいずれかで表されるアミノ酸配列、およびそれと少なくとも80%（例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%）配列相同性を有するアミノ酸配列を含有する。
ある実施形態において、本発明に記載の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 21-61のいずれかで表されるアミノ酸配列、およびそれと少なくとも80%（例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%）配列相同性を有するアミノ酸配列を含有する。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体は、1つまたは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。
ある実施形態において、上記突然変異体は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109およびV132の群から選ばれる1個または複数の残基にアミノ酸置換を含有する。
ある実施形態において、上記突然変異体は、R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sの群から選ばれるアミノ酸置換を1個または複数有する。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、SEQ ID NO: 1-20、62-65のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する。
ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、IgGのFc領域を有する。
ある実施形態において、上記IgGは、ヒトIgGである。ある実施形態において、上記IgGは、IgG1および/またはIgG4の群から選ばれる。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインは、上記免疫グロブリンFc領域のN端に位置する。
ある実施形態において、上記ヒトSIRPαドメインと上記免疫グロブリンFc領域が、リンカーによって連結されている。
ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO: 67- 68のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する。
ある実施形態において、上記融合タンパク質は、SEQ ID NO:21-61のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の核酸分子または本発明に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
一方で、本発明は、上記融合タンパク質を発現させる条件で、本発明に記載の宿主細胞を培養する、本発明に記載の融合タンパク質を調製する方法を提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質、核酸分子、ベクターおよび/または宿主細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む組成物を提供する。
一方で、本発明は、腫瘍または自己免疫疾患の予防または治療のための医薬品および/またはキットの調製における本発明に記載の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および/または組成物の用途を提供する。ある実施形態において、上記腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれる。ある実施形態において、上記自己免疫疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および関節リウマチの群から選ばれる。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質または組成物を投与することを含む、CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断する方法を提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質または組成物を上記腫瘍または腫瘍細胞と接触させることを含む、腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する方法を提供する。ある実施形態において、上記接触は、インビトロで行う。
一方で、本発明は、被験者へ本発明に記載の融合タンパク質または組成物を治療有効量投与する、被験者における腫瘍または自己免疫疾患の予防または治療のための方法を提供する。ある実施形態において、上記腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれる。ある実施形態において、上記自己免疫疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および関節リウマチの群から選ばれる。
当該技術分野における当業者は、以降の詳細な記載からの本開示のその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本開示の例としての実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本開示の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、公開されている具体的な実施形態を変更しても良い。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載があくまでも例であり、本発明を限定するものではない。
附図説明
本発明に係る具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
図1は、ベクターpTMの物理構造模式図を示す。
図2は、SIRPα短縮ドメインおよびその突然変異体とCD47の間の相互作用を測定する方法模式図を示す。
図3は、SIRPα短縮ドメイン突然変異体のフローサイトメトリー濃縮スクリーニング結果を示す。
図4は、SIRPα短縮ドメインおよびその変異体の配列整列態様を示す。
図5は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47タンパク質を認識した結果を示す。
図6A〜6Bは、本発明に記載の融合タンパク質がヒトCD47タンパク質を認識する特異性を示す。
図7は、本発明に記載の融合タンパク質によるヒトCD47タンパク質およびその他のタンパク質への認識の態様を示す。
図8は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47タンパク質とその配位子SIRPαの結合をTTI-621と競合的に遮断することを示す。
図9A〜9Cは、本発明に記載の融合タンパク質がRaji細胞、Jurkat細胞およびA549細胞表面CD47タンパク質を認識した結果を示す。
図10A〜10Cは、本発明に記載の融合タンパク質およびTTI-621がRaji細胞、Jurkat細胞およびA549細胞表面CD47タンパク質を認識した結果を示す。
図11は、本発明に記載の融合タンパク質とHu5F9-G4との抗凝血反応の結果を示す。
図12A〜12Bは、本発明に記載の融合タンパク質による腫瘍活性の抑制を示す。
図13A〜13Bは、赤血球および血小板に対しての本発明に記載の融合タンパク質とTTI-621による影響を比較することを示す。
図14は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47タンパク質を認識した結果を示す。
図15は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47タンパク質とその配位子SIRPαの結合を競合的に遮断することを示す。
図16は、本発明に記載の融合タンパク質とHu5F9-G4との抗凝血反応の結果を示す。
図17は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47-Fc誘導Jurkat-CSR細胞アポトーシスを効果的に遮断することを示す。
図18Aは、本発明に記載の融合タンパク質によるマウス末梢血における赤血球含有量への影響を示す。
図18Bは、本発明に記載の融合タンパク質によるマウス末梢血における血小板含有量への影響を示す。
図19は、本発明に記載の融合タンパク質によるマウスインビボ腫瘍増殖抑制役割を示す。
図20は、本発明に記載の融合タンパク質によるマウス体重への影響を示す。
具体実施形態
以下、本願発明の実施形態を、所定の具体的な実施例によって説明するが、当業者が、本明細書に公開された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。
融合タンパク質
一方で、本発明は、CD47タンパク質に特異的に結合することができ、以1×10-8Mまたはより低いKD値、例えば、9×10-9Mよりも高くなく、8×10-9Mよりも高くなく、7×10-9Mよりも高くなく、6.2×10-9Mよりも高くなく、6×10-9Mよりも高くなく、5×10-9Mよりも高くなく、4.8×10-9Mよりも高くなく、4.5×10-9Mよりも高くなく、2×10-9Mよりも高くなく、1.5×10-9Mよりも高くなく、または1×10-10Mよりも高くなくまたはこれ以上低いKD値でCD47タンパク質に結合する融合タンパク質を提供する。
本発明に記載の融合タンパク質は、CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を特異的に遮断することによって、貪食細胞の腫瘍細胞貪食を活性化し、または、ある所定の細胞アポトーシスシグナルを抑制することができる場合もある。なお、本発明に記載の融合タンパク質は、血液凝固反応を起こすことがなく、例えば、血液凝固プレートに、上記融合タンパク質および赤血球溶液を入れてから、赤血球をメッシュ状に平らに敷き広げないように穴の底部に沈み込ませるように、この血液凝固プレートでテストする。上記融合タンパク質は、さらに、腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制することができ、例えば、腫瘍面積または腫瘍体積を減少し、または、腫瘍が罹った被験者の生存率を向上することができる。上記融合タンパク質は、さらに、被験者の体重および/または死亡率にマイナスの影響を与えることがなく、安全に被験者へ投与されることができる。なお、本発明に記載の融合タンパク質は、限定される免疫グロブリンFc領域由来によらず、調製および取得が容易である。
本発明において、融合タンパク質という用語は、通常、複合ポリペプチド、即ち2種類（またはより多くの種類）のポリペプチドからなる単一で連続したアミノ酸配列を指す。融合タンパク質は、一般的に、組換え核酸方法または化学合成方法を利用して人工的に調製することによって得られる。
本発明において、インテグリン関連タンパク質（integrin associated protein, IAP）とも称するCD47タンパク質という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するものである。上記CD47タンパク質は、膜インテグリン（membrane integrins）、トロンボスポンジンタンパク質-1（thrombospondin-1, TSP-1）またはシグナル調節タンパク質α（signal-regulatory protein alpha, SIRPα）に結合することができる。CD47タンパク質は、細胞膜表面に発現することができる。上記CD47タンパク質は、所定のインテグリンタンパク質、Gタンパク質およびコレステロールからなる超分子複合体でありうる。本発明において、上記CD47タンパク質は、GenBankデータベースアクセッション番号がCEJ95640.1であるヒトCD47タンパク質でありうる。本発明において、上記CD47タンパク質は、SEQ ID NO:66で表されるアミノ酸配列を含有して良い。
本発明において、CD47陽性という用語は、通常、生体または細胞表面に発現するCD47タンパク質、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体の特性を指す。CD47陽性細胞は、CD47を過剰発現する細胞であって良い。通常、上記CD47陽性細胞を、疾患インジケーターとして良い。例えば、疾患の場合、上記CD47陽性細胞表面におけるCD47タンパク質密度が、このような細胞の正常条件で有するCD47タンパク質密度を上回る。ある実施形態において、上記腫瘍または腫瘍細胞は、CD47陽性であっても良い。例えば、上記腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍および/またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれて良い。
本発明において、KDという用語は、KDと置換可能に使用されて良く、通常、M（mol/L）の単位の所定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指す。KDは、物質ABとそれを解離した物質Aと物質Bとの濃度により算出されてよい。KD =c（A）*c（B）/c（AB）。その式によれば、KD値が大きいほど、多く解離され、物質A、B間における親和性が弱くなってしまい、逆に、KD値が小さいほど、少なく解離され、物質A、B間における親和性が強くなっていることを表す。
本発明において、SIRPαという用語は、通常、SIRPファミリー由来の調節性膜糖タンパク質を指す。上記SIRPαは、CD47タンパク質の配位子として、CD47タンパク質を認識することができる。SIRPαは、細胞外領域にN末端の領域がCD47との結合を媒介する免疫グロブリンスーパーファミリー様ドメインを3個有する膜貫通タンパク質である。上記SIRPαは、主に貪食細胞、樹状細胞および神経細胞表面に発現する。上記SIRPαの細胞質領域（cytoplasmic region）は、ラット、マウスおよびヒトで高度に保存されている。上記SIRPαは、多型性（polymorphism）が存在するが、CD47タンパク質に対する認識および結合に影響を与えない。
本発明において、ヒトSIRPαドメインという用語は、通常、ヒトSIRPα、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む。本発明において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1のドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1における33〜149番目のアミノ酸残基、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。ヒトにおいて、SIRPαタンパク質が、主に、１つは、（ヒトSIRPα変異体1またはV1型）のアミノ酸配列のGenBankにおけるアクセッション番号がNP_542970.1（そのアミノ酸配列がSEQ ID NO: 62で表され、ここで、31〜504番目のアミノ酸残基が成熟SIRPαドメインを構成する）であり、もう１つは、（変異体2またはV2型）上記変異体1またはV1型と異なるアミノ酸を13個含有し、且つそのアミノ酸配列のGenBankにおけるアクセッション番号がCAA71403.1である２種類の態様を有する。
本発明において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。
本発明において、細胞外ドメインという用語は、通常、タンパク質において細胞膜外にある機能ドメインを指す。ある実施形態において、上記細胞外ドメインとは、ヒトSIRPαドメインの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を指す。例えば、上記ヒトSIRPαドメインの細胞外ドメインは、3つの免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF)ドメインおよび複数のグリコシル化部位を含有して良い。上記ヒトSIRPαドメインの細胞外ドメインは、配位子（例えばCD47タンパク質）に特異的に結合することで、シグナル伝達機能を達成することができる。上記ヒトSIRPαドメインの細胞外ドメインは、例えば血清、インスリン、増殖因子、EGF、PDGFおよび神経栄養因子などのように、複数種類のマイトジェン活性化によってリン酸化を生じる。
本発明において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。本発明において、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。例えば、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1における33〜149番目のアミノ酸残基、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。
本発明において、IgVドメインという用語は、通常、抗体可変ドメインと類似するIg様ドメインを指す。免疫グロブリンドメインは、IgV、IgC1、IgC2およびIgIの4種類に分けられて良い。IgVドメインは、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖、T細胞受容体などを含む異なるタンパク質ファミリー中に存在して良い。ヒトSIRPαは、上記IgVドメインで高度な多型性を示している。例えば、上記ヒトSIRPα変異体1のIgVドメインは、ヒトSIRPαドメインとヒトCD47タンパク質の結合を媒介することができる（Seiffert, M.et al.(2001)Blood 97,2741-9、Vernon-ffilson, E.F.et al.(2000)Eur J Immunol 30, 2130-7）。
例えば、上記ヒトSIRPα変異体1、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体は、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列を含有して良い。例えば、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1のIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。例えば、上記ヒトSIRPα変異体1のIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体は、SEQ ID NO: 65で表されるアミノ酸配列（即ち、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列における38〜145番目の残基）を含有して良い。又、例えば、上記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含んで良い。上記ヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体は、SEQ ID NO: 63で表されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列における33〜149番目の残基）を含有して良い。
本発明に記載のヒトSIRPαドメインは、SEQ ID NO: 1-20、62-65から選ばれるいずれかで表されるアミノ酸配列を含有して良い。
本発明において、突然変異体という用語は、通常、突然変異したタンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。上記突然変異は、野生型と異なる点を示しても良い。例えば、上記突然変異は、野生型に基づきアミノ酸配列の構造性変化を発生して良い。例えば、上記野生型は、上記構造性変化の不足の代表的な表現型であっても良い。例えば、上記突然変異体は、ヒトSIRPαドメインおよびその断片（ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、ヒトSIRPα変異体1のドメイン、その断片またはヒトSIRPα変異体1における33〜149番目のアミノ酸残基、その断片を含めて）を野生型とし、突然変異することによって得られる突然変異体であって良い。
本発明において、上記突然変異体は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132の群から選ばれる1個または複数の残基にアミノ酸置換を含有して良い。上記アミノ酸置換において、アミノ酸残基の位置が、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列を基準として決められる残基番号でありうる。ここでは、「残基Xn」とは、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列中でn番目に相当する残基Xを指し、ここでnが正整数であり、Xが任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、「残基I61」は、SEQ ID NO:62で表されるアミノ酸配列中で61番目に相当するアミノ酸残基Iを意味する。
本発明において、「アミノ酸置換Xn」は、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列中でn番目に相当する残基Xにアミノ酸置換が起こり、ここで、nが正整数であり、Xが任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、「アミノ酸置換I61」が、SEQ ID NO:62で表されるアミノ酸配列中で61番目に相当するアミノ酸残基Iにアミノ酸置換が起こったことを示す。
本発明において、あるアミノ酸配列中であるアミノ酸残基がもう１個のアミノ酸配列中であるアミノ酸残基に「相当する」とは、通常、最適化条件でアミノ酸配列整列を行うことにより得られるアミノ酸残基対応関係を指す。上記配列整列は、当該技術分野における当業者の周知の手段、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLEやMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどに従って行われる。当該技術分野における当業者は、比較している全長配列における最適な整列を達成するに必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列のための適切なパラメータを決定可能である。
本発明に記載のアミノ酸置換は、非保存的置換であって良い。上記非保存的置換は、非保存的に標的タンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸残基を変え、例えば、ある種類の側鎖大きさまたはある種類の特性（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を異なる側鎖大きさまたは異なる特性（例えば、疎水性）を有するアミノ酸残基に変えることを含んで良い。
上記アミノ酸置換は、保存的置換であっても良い。上記保存的置換は、保存的に標的タンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸残基を変え、例えば、ある種類の側鎖大きさまたはある種類の特性（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を同一または同様の側鎖大きさまたは同一または同様の特性（例えば、同じく親水性）を有するアミノ酸残基に変えることを含んで良い。このような保存的置換は、通常、産生されたタンパク質の構造または機能に大きく影響することがない。本発明において、上記融合タンパク質、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体としてのアミノ酸配列変異体は、タンパク質構造またはその機能（例えば、CD47とその配位子の結合を遮断する能力）を明らかに変化させない保存的アミノ酸置換を含んで良い。
例として、下記各群において、1群ごとの各アミノ酸間の相互置換が本発明中で保存的置換と見られ、
非極性側鎖を含むアミノ酸群：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。
非帯電した極性側鎖を含むアミノ酸群：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン。
負帯電した極性側鎖を含むアミノ酸群：アスパラギン酸およびグルタミン酸。
正帯電した塩基性アミノ酸：リシン、アルギニンおよびヒスタジン。
フェニル基を持つアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
ある実施形態において、上記突然変異体は、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sの群から選ばれる1個または複数のアミノ酸置換を1個または複数含んで良い。
本発明において、アミノ酸置換「XnY/Z」は、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列中でn番目に相当する残基Xがアミノ酸残基Yまたはアミノ酸残基Zに置換され、ここで、nが正整数であり、X、YおよびZがそれぞれ独立的に任意のアミノ酸残基の略語であり、且つXがYまたはZと異なることを指す。例えば、アミノ酸置換「I61L/V/F」は、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列中で61番目に相当する残基Iがアミノ酸残基L、VまたはFに置換されることを指す。
例えば、本発明に記載の融合タンパク質は、
（1）I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100GおよびV132L、
（2）I61V、E77N、Q82S、K83RおよびE84H、
（3）I61F、V63I、K83R、E84KおよびV132I、
（4）I61L、E77Q、E84D、R107NおよびV132I、
（5）I61L、V63I、E77K、K83R、E84DおよびN100G、
（6）I61V、E77H、Q82R、K83R、E84HおよびR107S、
（7）I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109RおよびV132R、
（8）I61L、E77M、Q82G、K83R、E84DおよびV132L、
（9）I61L、
（10）I61F、D95H、L96S、G109HおよびV132S、
（11）I61F、D95H、L96S、K98R、G109HおよびV132S、
（12）I61L、E77Q、E84D、V93A、R107NおよびV132I、
（13）E77K、L96S、N100K、G109HおよびV132L、
（14）I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100DおよびV132I、
（15）I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100DおよびV132L、
（16）I61V、E77N、Q82S、K83R、E84HおよびV93A、
（17）I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98RおよびN100E、
（18）I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100DおよびG109R、
（19）I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98RおよびN100G、および、
（20）I61L、V63I、E77N、Q82GおよびE84G、
から選ばれるアミノ酸置換群を有して良い。
本発明において、ヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン（例えばSEQ ID NO: 63で表されるアミノ酸配列、すなわち、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列における33〜149番目の残基）に基づいて、それぞれ以上の（1）〜（20）のアミノ酸置換群を有するSIRPαドメインの変異体が、順次にM1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135およびM145と命名される。これらの突然変異体は、順次に例えばSEQ ID NO: 1-SEQ ID NO:20のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有して良い。
本発明において、ヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン（例えばSEQ ID NO: 63で表されるアミノ酸配列、すなわち、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列における33〜149番目の残基）およびヒトIgG1 Fc（例えばSEQ ID NO: 67で表されるアミノ酸配列）を有する融合タンパク質は、例えばSEQ ID NO: 61で表されるアミノ酸配列を含有するSS002と命名されて良い。
本発明において、免疫グロブリンFc領域という用語は、通常、断片結晶化可能領域（Fragment crystallizable region, Fc region）とも称する抗体のY字型構造の基部領域を指す。IgG、IgAおよびIgD抗体アイソフォームにおいて、Fc領域が、抗体における2本の重鎖の第2および第3の定常ドメインからの２個の同一タンパク質断片で構成されて良い。IgMおよびIgEのFc領域は、ポリペプチド鎖ごとに重鎖定常ドメインを３つ含んで良い。IgGのFc領域は、高度に保存されているN-グリコシル化部位を有する。ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域はIgGのFc領域を含んで良い。ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、重鎖定常領域のCH2およびCH3領域を含んで良い。ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、ヒンジ領域を含んで良い。例えば、上記免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO:67-68から選ばれるいずれかで表されるアミノ酸配列を含有して良い。
本発明において、IgGという用語は、通常、免疫グロブリンG（Immunoglobulin G）を指す。IgGは、ヒト免疫グロブリンの１つである。IgG分子におけるγ鎖の抗原性の違いに基づいて、ヒトIgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の4つのサブタイプを有する。本発明において、IgG1という用語は、通常、Fc受容体と高い親和性を持つ、IgGにおける最大な割合になるサブタイプを指す。例えば、上記IgGはヒトIgGでありうる。又、例えば、上記IgGは、IgG1および/またはIgG4の群から選ばれて良い。
本発明において、上記融合タンパク質は、上記CD47タンパク質に特異的に結合することができるヒトSIRPαドメインおよび免疫グロブリンFc領域を含んで良く、ここで、上記ヒトSIRPαドメインが上記免疫グロブリンFc領域と直接的または間接的に連結されている。例えば、上記ヒトSIRPαドメインは、上記免疫グロブリンFc領域のN端に位置して良い。例えば、上記ヒトSIRPαドメインは、C端が上記免疫グロブリンFcのN端と直接的または間接的に連結されて良い。例えば、上記ヒトSIRPαドメインは上記免疫グロブリンFcとリンカーによって連結されて良い。本発明において、上記リンカーは、ペプチド リンカーであって良い。
本発明において、上記SS002に基づいて、それぞれ以上の（1）〜（20）のいずれかのアミノ酸置換群を含む本発明に記載の融合タンパク質が、順次にSS002M1、SS002M5、SS002M12、SS002M35、SS002M37、SS002M41、SS002M57、SS002M67、SS002M81、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M99、SS002M102、SS002M111、SS002M122、SS002M126、SS002M130、SS002M135およびSS002M145と命名されて良い。これらの融合タンパク質は、例えばSEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 40で表されるアミノ酸配列を順次に含んで良い。
本発明において、ヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン（SEQ ID NO: 63で表されるアミノ酸配列、すなわち、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列における33〜149番目の残基を含めて）に基づきそれぞれ以上の（1）〜（20）のいずれかのアミノ酸置換群およびヒトIgG4 Fc（例えばSEQ ID NO: 68で表されるアミノ酸配列）を含む本発明に記載の融合タンパク質が順次にSS002M1G4、SS002M5G4、SS002M12G4、SS002M35G4、SS002M37G4、SS002M41G4、SS002M57G4、SS002M67G4、SS002M81G4、SS002M82G4、SS002M84G4、SS002M91G4、SS002M99G4、SS002M102G4、SS002M111G4、SS002M122G4、SS002M126G4、SS002M130G4、SS002M135G4およびSS002M145G4と命名されて良い。これらの融合タンパク質は、例えばSEQ ID NO: 41-SEQ ID NO: 60のいずれかで表されるアミノ酸配列を順次に含有して良い。
ある実施形態において、本発明に記載の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 61のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有して良い。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチドおよび/またはアミノ酸配列は、少なくとも、上記タンパク質またはポリペプチドと同一または同様の機能を備える変異体または相同体を含むことを分かるべきである。
本発明において、上記変異体は、上記タンパク質および/または上記ポリペプチド（例えば、ヒトSIRPαドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体、または上記融合タンパク質）のアミノ酸配列中で1個または複数のアミノ酸を置換、欠失または付加したタンパク質またはポリペプチドであっても良い。例えば、上記機能性変異体は、少なくとも1個、例えば1〜30個、1〜20個もしくは1〜10個、又、例えば1個、2個、3個、4個または5個のアミノ酸に置換、欠失および/または挿入されることによって、アミノ酸改変を有するタンパク質またはポリペプチドを含んで良い。上記機能性変異体は、基本的に、変化（例えば置換、欠失または付加）する前の上記タンパク質や上記ポリペプチドの生物的特性を保持することができる。例えば、上記機能性変異体は、変化する前の上記タンパク質や上記ポリペプチドの少なくとも60%、70%、80%、90%、または100%の生物活性（例えばCD47タンパク質に特異的に結合する能力）を保持することができる。
本発明において、上記相同体は、上記タンパク質および/又は上記ポリペプチド（例えば、ヒトSIRPαドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体、または上記融合タンパク質）のアミノ酸配列と、少なくとも約85%（例えば、少なくとも約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或いはより高い）配列相同性を備えるタンパク質またはポリペプチドであって良い。
本発明において、上記相同性とは、通常、2個または複数の配列間の相似性、類似性または相関性を指す。「配列相同性パーセント」は、2本の整列しようとする配列を比較ウインドウにわたって比較することにより、2本の配列において同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）或いは同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が存在する位置の数を勘定して、マッチする位置の数を算出し、マッチする位置の数を比較ウインドウにおける位置総数（即ち、ウインドウの大きさ）で除算し、その結果に100を乗算して、配列相同性パーセントを得る。配列相同性パーセントを特定するための整列は、当該技術分野における周知の様々な手段、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNやMegalign（DNASTAR）ソフトウェアに従って実現される。当該技術分野における当業者は、比較している全長配列範囲や、対象配列領域における最大整列を達成するに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列整列のための適切なパラメータを決定可能である。上記相同性は、FASTAおよびBLASTアルゴリズムで測定することもできる。FASTAアルゴリズムは、W.R.PearsonおよびD.J.Lipmanの“生物学的配列比較のために改善されたツール”、米国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.）、85：2444-2448、1988、およびD.J.LipmanおよびW.R.Pearsonの“タンパク質相似性の高速高感度な検索”、Science、227：1435-1441、1989に記載されている。BLASTアルゴリズムは、S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.MyersおよびD.Lipmanの“基本的な局所的整列（alignment）検索ツール”、分子生物学誌、215：403-410、1990に記載されている。
核酸分子、ベクター、宿主細胞
その一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質をコードすることができる核酸分子を1種類または複数種類提供する。
ある実施形態において、上記核酸分子は、本発明に記載の融合タンパク質を完全にコードすることができる。例えば、1種類の核酸分子によって、上記の融合タンパク質を取得することができる。ある実施形態において、上記核酸分子は、本発明に記載の融合タンパク質の一部をコードすることができる。例えば、2種類以上の異なる上記核酸分子によって、上記の融合タンパク質を取得することができる。例えば、上記の核酸分子は、本発明に記載の融合タンパク質における上記ヒトSIRPαドメイン（例えば、上記ヒトSIRPαの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体、上記ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体、上記ヒトSIRPα変異体1のドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体）をコードすることができる。又、例えば、上記核酸分子は、上記融合タンパク質における上記免疫グロブリンFc領域をコードすることができる。
一方で、本発明は、本発明に記載の核酸分子を1種類または複数種類含む1種類または複数種類のベクターを提供する。一方で、本発明は、本発明に記載の核酸分子または本発明に記載のベクターを含む1種類の細胞（例えば宿主細胞）を提供する。
本発明において、核酸分子という用語は、通常、その天然環境から単離され、または人工合成された任意長さの単離形態であるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドまたはそのアナログを指す。本発明に記載の核酸分子は、単離されたものであって良い。例えば、それは、（i）インビトロでの増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅と、（ii）クローン組換えと、（iii）精製、例えば、酵素消化およびゲル電気泳動分画と、或いは、（iv）合成、例えば、化学合成とによって産生または合成されてよい。ある実施形態において、上記単離された核酸は、組換えDNAの技術で調製される核酸分子である。本発明において、当該技術分野における周知の様々な手法によって上記した抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を調製することができ、それらの手法が、制限断片の操作によって、または、合成オリゴヌクレオチドによる重複伸長PCRによって構築され得ることを含むがこれに限定されない。具体的な手引きは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. ,1989、およびAusubeらCurrent Protocols in Molecular Biology ,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y., 1993に見出すことができる。
本発明において、ベクターという用語は、通常、挿入された核酸分子を宿主細胞中および/または宿主細胞間に運搬する、適当な宿主で自己複製できる核酸分子を指す。上記ベクターは、主にDNAまたはRNAを細胞に挿入するためのベクター、主にDNAまたはRNAを複製するためのベクター、および主にDNAまたはRNAを転写および/または翻訳するための発現ベクターを含む。上記ベクターは、さらに、上記機能を複数種類有するベクターを含む。上記ベクターは、適当な宿主細胞を導入する場合、ポリペプチドに転写して翻訳することができるポリヌクレオチドでありうる。上記ベクターは、通常、上記ベクターからなる適当な宿主細胞を培養することによって、所望の発現産物を産生することができる。本発明において、上記ベクターに、上記核酸分子を1種類または複数種類含んで良い。例えば、上記ベクターは、上記融合タンパク質をコードするために必要なあらゆる核酸分子を含んで良い。この場合、本発明に記載の融合タンパク質を取得するには上記ベクターがただ１つ必要である。ある実施形態において、上記ベクターは、上記融合タンパク質の一部をコードする1個の核酸分子、例えば、本発明に記載の融合タンパク質における上記ヒトSIRPαドメインをコードする核酸分子、又、例えば、上記融合タンパク質における上記免疫グロブリンFc領域をコードする核酸分子を含んで良い。この場合、本発明に記載の融合タンパク質を取得するには、異なるベクターが2個以上必要である。
なお、上記ベクターには、その他の遺伝子、例えば適合な宿主細胞中および適合な条件で該ベクターへの選択が許容される標識遺伝子をさらに含んで良い。なお、上記ベクターは、さらに、コード領域が適切な宿主中で正しく発現することが許容される発現調節因子を含んで良い。このような調節因子は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写やmRNA翻訳を調節するその他の調節因子などを含めて、当該技術分野における当業者の周知のものである。ある実施形態において、上記発現調節配列が調節可能なものである。上記発現調節配列の具体な構造は、生物種や細胞種の機能により変化するが、通常、例えばTATAボックス、キャッピング配列、およびCAAT配列などそれぞれ転写および翻訳の開始を関与する5’非転写配列並びに5’および3’非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現調節配列は、機能的に連結された核酸を転写制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含んで良い。本発明において、上記ベクターは、pTMベクターでありうる。
本発明において、宿主細胞、細胞、宿主という用語は、置換可能に使用され、通常、本発明に記載の核酸分子からなるプラスミドやベクターを含有可能か、既に含有中であり、又は、本発明に記載の融合タンパク質、その断片、またはその突然変異体を発現することができる単独細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。上記細胞は、単一宿主細胞の子世代を含んでよい。子世代の細胞は、天然的、非予期的若しくは意図的な突然変異によって、形態またはゲノムが本来の親細胞とかならずしも完全に同一ではないかもしれないが、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現すれば良い。上記した宿主細胞は、本発明に記載のベクターを利用して、細胞をインビトロトランスフェクトすることにより得られる。上記した宿主細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）であって良く、真核細胞（例えば酵母細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞あるいは骨髄腫細胞）であっても良い。本発明において、上記宿主細胞は、CHO細胞でありうる。
組成物、調製方法および使用
一方で、本発明は、上記融合タンパク質を発現させる条件で、宿主細胞を培養することを含む、上記融合タンパク質を調製する方法を提供することができる。
一方で、本発明は、上記の融合タンパク質、上記の核酸分子、上記のベクターおよび/または上記の宿主細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む組成物を提供することができる。
本発明において、薬学的に許容可能なアジュバントという用語は、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/又は非イオン界面活性剤等を含んでよい。
上記薬学的に許容可能なアジュバントは、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/又は非イオン界面活性剤等を含んでよい。
本発明において、当該技術分野における従来技術手段、例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy、19版、Gennaro編集、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1995に公開された技術に従って、上記医薬品組成物を医薬用可能なベクターまたは希釈剤およびいかなるその他の既知の補助剤および賦形剤と一緒に調製して操作する。
本発明において、上記組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下ストレージによる投与のために調製されることができる。
本発明において、上記組成物は、腫瘍増殖抑制に使用されて良い。例えば、本発明の組成物は、疾患（例えば腫瘍または自己免疫疾患）の発展や進行を抑制または遅延したり、（例えば腫瘍の大きさを低減し、ひいては、基本的に腫瘍を消去し）、および/又は、疾患状態を低減および/又は安定させることができる。
本発明に記載の医薬品組成物は、治療有効量の上記融合タンパク質を含んで良い。上記治療有効量は、進行リスクがある被験者の病気（例えば腫瘍または自己免疫疾患）及び/又はそのいかなる合併症を予防及び/又は治療（少なくとも一部治療）するための用量である。
一方で、本発明は、腫瘍または自己免疫疾患の予防または治療のための医薬品および/またはキットの調製における本発明に記載の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および/または組成物の用途を提供する。
本発明において、腫瘍という用語は、通常、生体で局所的な組織細胞過形成により形成される新作物を指し、また、このような新作物が、占拠性ブロックが多いため、新生物とも称する。新作物の細胞特性および生体への有害性度合いによって、腫瘍も良性腫瘍と悪性腫瘍の2種類に分けられ、悪性腫瘍を総称して癌と呼ぶ。本発明に記載の腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍および/またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれて良い。
本発明において、CD47陽性血液腫瘍という用語は、通常、各種の白血病、リンパ腫および骨髄腫を含むCD47を過剰発現する血液腫瘍を指す。上記白血病は、通常、感染阻止に寄与しない白血球を過剰に産生することにより、血液を構成するその他の部分、例えば血小板および赤血球が無理やり占拠されている血液のガンである。白血病では、急性または慢性の白血病に分類されて良い。白血病は、例えば、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄増殖性疾患/腫瘍（MPDS）および骨髄異形成症候群の態様でありうる。上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、不活性および侵攻型非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）などを指すことが可能である。上記骨髄腫は、多発性骨髄腫（MM）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫（heavy chain myeloma）、軽鎖骨髄腫（light chian myeloma）またはベンス−ジョーンズ骨髄腫（Bence-Jones myeloma）を指すことも可能である。
本発明において、CD47陽性固形腫瘍という用語は、通常、臨床診察、例えばX線撮影、CTスキャン、Bモード超音波画像または触診により腫瘍塊を診察可能なCD47を過剰発現する固形腫瘍または腫瘍塊を指す。類別として、主にがん腫（carcinoma）および肉腫（sarcoma）を有する。例えば、上記CD47陽性固形腫瘍は、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、星細胞腫、多形性膠芽細胞腫および腎細胞癌などを含有可能である。
本発明において、上記自己免疫疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および関節リウマチを含んで良い。
本発明において、クローン病という用語は、通常、胃腸管のどんな箇所でも発生可能な原因不明の炎症性腸疾患のひとつを指す。上記クローン病および慢性非特異性潰瘍性大腸炎は、両者とも炎症性腸疾患（IBD）と総称する。
本発明において、アレルギー性喘息という用語は、通常、複数種類の細胞、特に肥満細胞、好酸性顆粒球およびTリンパ球が関与する慢性気道炎症を指す。
本発明において、関節リウマチという用語は、通常、関節症を主とする慢性全身性自己免疫疾患の１つを指す。
一方で、本発明に記載の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および/または組成物は、上記腫瘍または上記自己免疫疾患を予防または治療するために使用される。
一方で、本発明は、被験者に本発明に記載の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主細胞および/または組成物を投与することを含む腫瘍または自己免疫疾患を予防または治療する方法を提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質または組成物を（例えば、必要のある被験者あるいは細胞または生物学試料に）投与することを含む、CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断する方法を提供する。
一方で、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質または組成物を上記腫瘍または腫瘍細胞と接触させることを含む、腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する方法を提供する。例えば、上記接触は、インビトロで行う。
本発明において、被験者という用語は、通常、いかなるヒトまたは非ヒト動物を指す。非ヒト動物という用語は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類動物、ヤギ、羊、犬、牛、鳥、両生動物、爬虫類動物などを含んで良い。
本発明において、約という用語は、通常、所定の数値の0.5%-10%以上または以下の範囲、例えば所定の数値の0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%の以上または以下の範囲に変動することを意味する。
本発明において、含むという用語は、通常、含むこと、備えること、含有することや、有することを指す。場合によって、であること、からなることという意味もある。
以下の実施例は、どんな理論にもよらず、本発明の要件、方法やシステムの作用形態を釈明することに過ぎなく、本願発明の範囲を制限するものではない。
実施例
実施例1 変異体の選別
アミノ酸配列が例えばSEQ ID NO:63（すなわち、SEQ ID NO:62中で33〜149番目の残基）で表されるヒトSIRPα変異体1（NP_542970.1）の短縮ドメインを取り、Discovery Studio（chuangtengテクノロジー）ソフトウェアで該短縮ドメインにおけるヒトCD47（CEJ95640.1）との相互作用の構造を構築し、2個のタンパク質における相互作用を関与する部位と相互作用モデルを理論に解析し、該短縮ドメインにおける直接または間接にCD47との相互作用を関与するアミノ酸部位がI61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132を特定した（ここで、これらのアミノ酸置換中でアミノ酸残基の位置が、SEQ ID NO: 62で表されるアミノ酸配列によるナンバリングカウントを行った）。これらの作用部位にランダム突然変異を引き起こし、突然変異体ライブラリーを構築した。そして、該突然変異体ライブラリーをベクターpTM上にクローンした。上記pTMベクターは、シグナルペプチド 、膜貫通領域配列（例えば図1に示された）を含み、細胞表面に該ベクターにクローンされた遺伝子を表現可能である。
構築された突然変異体ライブラリー発現ベクターを、CHO細胞（ATCC）にトランスフェクションすることによって、突然変異体ライブラリーを細胞表面上に表現・発現させた。そして、FITC蛍光でCD47タンパク質（Shenzhou Biological Technology Dexian Liability Company）を標識し、CD47-FITCを取得し、CD47-FITCとCHO細胞表面の該短縮ドメインの突然変異体の間における結合活性の強さによって、フローサイトメトリー技術を利用してCD47-FITCと結合可能な突然変異体の濃縮度別検出を行った。検出についての具体的原理は、蛍光分子レベルの高さによって該短縮ドメインおよび突然変異体と蛍光分子含有CD47タンパク質との結合の結果を表現する図2に参照可能である。
濃縮度別検出を四回経由して、CD47-FITCとの結合の強い細胞（例えば図3に示された）を採集した。そしてそのmRNAを抽出、反転写してcDNAを取得し、該短縮ドメイン突然変異体の遺伝子をシーケンシング解析した（例えば図4に示された）。シーケンシング結果によれば、上記部位I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109、V132に異なる突然変異部位の組合わせが存在することを示した。
結果から、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109および/またはV132残基に異なる突然変異部位の組合わせを導入することによって、CD47に特異的に認識することができるヒトSIRPα変異体1短縮ドメインの突然変異体を取得することができることが分かった。
さらなる解析すれば、上記突然変異部位における可能な突然変異が起こった後のアミノ酸種類がI61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H、V132L/R/I/Sであったことを特定した。
これらの突然変異を包含した突然変異体は、それぞれM1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135およびM145と命名され、それぞれ例えばSEQ ID NO:1-20のいずれかで表されるアミノ酸配列を順次に含有すると共に、SEQ ID NO: 63で表されるアミノ酸配列に基づいて、それぞれ例えば
（1）I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100GおよびV132L、
（2）I61V、E77N、Q82S、K83RおよびE84H、
（3）I61F、V63I、K83R、E84KおよびV132I、
（4）I61L、E77Q、E84D、R107NおよびV132I、
（5）I61L、V63I、E77K、K83R、E84DおよびN100G、
（6）I61V、E77H、Q82R、K83R、E84HおよびR107S、
（7）I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109RおよびV132R、
（8）I61L、E77M、Q82G、K83R、E84DおよびV132L、
（9）I61L、
（10）I61F、D95H、L96S、G109HおよびV132S、
（11）I61F、D95H、L96S、K98R、G109HおよびV132S、
（12）I61L、E77Q、E84D、V93A、R107NおよびV132I、
（13）E77K、L96S、N100K、G109HおよびV132L、
（14）I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100DおよびV132I、
（15）I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100DおよびV132L、
（16）I61V、E77N、Q82S、K83R、E84HおよびV93A、
（17）I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98RおよびN100E、
（18）I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100DおよびG109R、
（19）I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98RおよびN100G、および、
（20）I61L、V63I、E77N、Q82GおよびE84G
のアミノ酸突然変異組合わせを順次に有する。
実施例2 融合タンパク質結合活性測定
実施例1におけるヒトSIRPα変異体1の短縮ドメイン（野生型SIRPα短縮ドメインとも称する）および実施例1で得たヒトSIRPαドメインの突然変異体（すなわち、M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135およびM145）を、それぞれヒトIgG1-Fc（そのアミノ酸配列が例えばSEQ ID NO:67で表される）と融合して発現させ、対応するSIRPα突然変異体1の短縮ドメイン-ヒトFc融合タンパク質（融合タンパク質と略称する）を取得し、これらの融合タンパク質をそれぞれSS002、SS002M1、SS002M5、SS002M12、SS002M35、SS002M37、SS002M41、SS002M57、SS002M67、SS002M81、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M99、SS002M102、SS002M111、SS002M122、SS002M126、SS002M130、SS002M135およびSS002M145と命名した。これらの融合タンパク質が、それぞれSEQ ID NO:61、21-40のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する。
Figure 2021520830
例として、融合タンパク質SS002、SS002M12、SS002M5、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130を選んで生物活性解析を行った。
ELISA法で、SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130などの各融合タンパク質とCD47分子の親和力を測定した。
1g/mlの標的抗原CD47-Hisで、ELISAストリップを被覆し、4℃で一晩放置した。PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を入れて、37℃でブロッキングを1時間行った。そして、それぞれSS002、SS002M5、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130を加え、37℃で1時間反応した。そして、PBSTによる洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体（Goat Anti human IgG HRP、Thermo Fisher Scientific）を加えて、室温下で30分間反応した。そして、PBSTで板の洗浄を5回繰り返し、吸取紙で残留液をできるだけ吸いきれた。1ウェルごとにTMB（eBioscience）を100 ml加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1〜5min置き、1ウェルごとに2N H2SO4を100 mL加えて基質反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、各融合タンパク質とCD47分子の親和力を解析した（例えば図5に示された）。
図5の結果から、SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130などの各融合タンパク質が、何れもCD47分子を効果的に認識することができたことを示した。
実施例3 親和力解析
例として、Biacore法でSS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130などの各融合タンパク質とCD47分子の親和力を測定し、結果が例えば以下の表2に示した通りである。
Figure 2021520830
表2の結果から、SS002、SS002M5、SS002M12、SS002M82、SS002M84、SS002M91、SS002M102、SS002M130などの各融合タンパク質が、何れもCD47分子を高い親和力で認識することができたことを示した。
実施例4 融合タンパク質種属認識特異性
融合タンパク質SS002およびSS002M91を例として、特異性認識活性を解析した。
融合タンパク質の種属解析を行うために、1mg/mLのヒト（Human）CD47およびマウス（Mouse）CD47（Shenzhou Biological Technology Dexian Liability Company）で、それぞれELISAストリップを被覆し、4℃で一晩放置し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を加えて、37℃で1時間ブロッキングした。そして、それぞれSS002、SS002M91を加えて、37℃で1時間反応した。PBSTによる洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体（Goat Anti human IgG HRP、Thermo Fisher Scientific）を加えた、室温で30分間反応した。そして、PBSTで板の洗浄を5回繰り返し、吸取紙で残留液滴をできるだけ吸いきれた。そして、1ウェルごとにTMB（eBioscience）を100 ml加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1〜5min放置し、1ウェルごとに2N H2SO4を100 mL加えて基質反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、融合タンパク質と異種属CD47の結合能を解析した（融合タンパク質SS002とSS002M91の実験結果が、それぞれ例えば図6A、6Bに示された）。
図6A〜6Bの結果から、SS002、SS002M91が、何れもヒトCD47分子を特異的に認識することができ、且つ、マウスCD47分子を認識しなかったことを示した。
実施例5 融合タンパク質の標的抗原に対する特異的認識
融合タンパク質SS002およびSS002M91を例として、1mg/mlのSS002、SS002M91、牛乳（Beijing Bomeide Biotechnology Co., Ltd）、BSA（BOVOGEN）、CD19（Shenzhou Biological Technology Dexian Liability Company）、TROP2（Shenzhou Biological Technology Dexian Liability Company）、CD47（Beijing Maigeboer Biological Technology Co.,Ltd.）、CD38（Shenzhou Biological Technology Dexian Liability Company）、Gas6（R&D）などの各タンパク質およびAXL（ACRO Biosystems）でそれぞれELISAストリップを被覆し、4℃で一晩放置し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を加えて、37℃で1時間ブロッキングし、それぞれSS002またはSS002M91を入れて、37℃で1時間反応し、PBSTによる洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体（Goat Anti human IgG HRP、Thermo Fisher Scientific）を加え、室温で30分間反応し、PBSTで板の洗浄を5回繰り返し、吸取紙上で残留液滴をできるだけ吸いきれ、1ウェルごとにTMB（eBioscience）を100 ml加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1〜5min放置し、1ウェルごとに2N H2SO4を100 mL加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450nmにおけるOD値を読み取り、融合タンパク質と上記各タンパク質の結合能を解析した（例えば図7に示された）。
図7の結果から、融合タンパク質SS002、SS002M91がヒトCD47分子しか認識しなく、且つ、その他の各種のタンパク質との交叉反応がいずれもなかったことを示した。
実施例6 融合タンパク質によるCD47/SIRPα相互作用の特異的遮断
SS002M91を例として、CD47/SIRPαの相互作用を特異的に遮断する活性を解析し、米国の同類品種を発現するTTI-621（CN105073780Aを参照）を陽性対照とした。
1μg/ml のSIRPα-Hisで、ELISAストリップを被覆し、4℃で一晩放置し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を加え、37℃で1時間ブロッキングし、10%のウシ胎児血でそれぞれSS002M91およびTTI-621を勾配希釈しながら、試料にBiotin-Fc-CD47を最終濃度が2μg/mlになるまで入れて、37℃で30minプレインキュベートし、一次抗体とした。PBSTによるELISAストリップ洗浄後、一次抗体を入れて、37℃で1時間インキュベートした。そして、PBSTによって5回洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識アビジン（Streptavidin-HRP、Jiaxuan Biotechnology Co., Ltd）を加えて、37℃で30分間インキュベートし、PBSTによって5回洗浄して、1ウェルごとにTMB（eBioscience）を100 μL加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1〜5min放置し、1ウェルごとに2N H2SO4を100μL加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、SIRPα融合タンパク質によるCD47/SIRPαの遮断作用を解析した（例えば図8に示された）。
図8の結果から、SS002M91、TTI-621が、何れもCD47とその配位子SIRPαの結合を競合的に遮断可能であり、しかしながら、融合タンパク質SS002M91の遮断活性がTTI-621よりも明らかに高かったことを示した。SS002M91のIC50値が5.47μg/mL、TTI-621のIC50値が493.5μg/mLであった。
実施例7 融合タンパク質による腫瘍細胞表面のCD47分子の特異的な認識
融合タンパク質SS002とSS002M91を例として、腫瘍細胞表面のCD47分子の認識活性解析を行った。
フローサイトメーター（BD Calibur）によって、それぞれSS002、SS002M91がRaji細胞、Jurkat細胞およびA549細胞表面のCD47分子を特異的に認識する活性を測定した。それぞれ対数増殖期の上記細胞を採取し、細胞密度を5×106個/mLになるように調整して、氷上で10min予冷した。2%FBS含有予冷生理食塩水で、SIRPα融合タンパク質SS002、SS002M91を異なる濃度に希釈した。細胞を100μL取り、同体積の上記希釈されたSIRPα融合タンパク質を加えて、4℃で光のあたらない所に30min反応した。完了後、2%FBS含有予冷生理食塩水で細胞を2回洗浄した。100μLの希釈されたPE標識ヤギ抗ヒトIgG-Fc二次抗体（PE-Goat anti-human IgG Fc Secondary Antibody、eBioscience）で細胞を再懸濁させ、4℃で光のあたらない所に30min反応した。反応完了後、2%FBS含有予冷生理食塩水で細胞を2回洗浄した。1%のポリホルムアルデヒドで細胞を400μL 再懸濁させた。フローサイトメーター（BD Calibur）によって融合タンパク質と細胞表面CD47の結合能を解析した（例えば図9A〜9Cに示されたように、図9A〜9Cにそれぞれ融合タンパク質SS002およびSS002M91がRaji細胞、Jurkat細胞およびA549細胞の表面CD47を特異的に認識したことを示した）。
結果から、融合タンパク質SS002M91がRaji細胞、Jurkat細胞およびA549細胞表面CD47を特異的に認識可能であり、該認識活性がSS002よりも明らかに高く、且つ用量依存性があったことを示した。ここで、Raji細胞に結合するEC50値について、SS002M91が197.0ng/mL、SS002が1140.0ng/mLであった（例えば図9Aに示された）。Jurkat細胞に結合するEC50値について、SS002M91が796.0ng/mL、SS002が4529.0ng/mLであった（例えば図9Bに示された）。A549細胞に結合するEC50値について、SS002M91が321.9ng/mL、SS002が1655.0ng/mLであった（例えば図9Cに示された）。
同様に、本実施例に記載の上記方法を利用して、SS002M91とTTI-621がRaji細胞（例えば図10Aに示された）、Jurkat細胞（例えば図10Bに示された）、A549細胞（例えば図10Cに示された）細胞表面のCD47分子を認識する活性を比較した。結果によれば、Raji細胞に結合する場合、SS002M91の最高蛍光強度が約1200、TTI-621の最高蛍光強度が約600であり、Jurkat細胞に結合する場合、SS002M91の最高蛍光強度が約5000、TTI-621の最高蛍光強度が約3000であり、A549細胞に結合する場合、SS002M91の最高蛍光強度が約180、TTI-621の最高蛍光強度が約60であったので、SS002M91が腫瘍細胞表面のCD47分子を特異的に認識する最高蛍光強度がTTI-621よりも明らかに高かった一方で、Raji細胞に結合する場合、SS002M91のEC50値が13.06ng/mL、TTI-621のEC50値が40.37ng/Mlであり、Jurkat細胞に結合する場合、SS002M91のEC50値が28.09ng/mL、TTI-621のEC50値が53.92ng/Mlであり、A549細胞に結合する場合、SS002M91のEC50値が26.95ng/mL、TTI-621のEC50値が1003ng/mLであったので、腫瘍細胞表面のCD47分子を特異的に認識するSS002M91の半分の有効用量がTTI-621よりも顕著に優れたことを示した。腫瘍細胞表面のCD47分子を特異的に認識する場合、SS002M91がTT1-621よりも顕著に優れたことが分かった。
実施例8 血液凝固反応測定
SS002およびSS002M91を例として、CD47抗体Hu5F9-G4を（Guerriero J L、Sotayo A、Ponichtera H E、et al. Class IIa HDAC inhibition reduces breast tumours and metastases through anti-tumour macrophages.[J]. Nature、2017、543(7645)：428.432およびGholamin S、Mitra SS、Feroze AH et al. Disrupting the CD47-SIRPα anti-phagocytic axis by a humanized anti-CD47 antibody is an efficacious treatment for malignant pediatric brain tumors. Sci. Transl. Med 2017を参照）対照として、血液凝固活性解析を行った。
健常ドナー由来の全血によってヒト赤血球を調製した（ボランティアから末梢血を採血）。PBSで全血を5倍希釈後、3回洗浄して、新鮮な1%の赤血球溶液を調製した。血液凝固プレートにおける各穴に、50μLの濃度の異なるSIRPα融合タンパク質SS002、SS002M91および抗CD47抗体Hu5F9-G4を入れて、また、各穴にそれぞれ1%の赤血球溶液を50μL加えて、軽く均一に混合し、37℃、5%CO2の条件で一晩インキュベートした。そして、赤血球を全て凝集させ、穴の底部に沈み込ませ、敷き広げてメッシュ状に平らになれば、100% の凝集（++++）とし、また、赤血球を穴の底部に沈み込ませ、ドット状になれば、（-）を基準とする非凝集とし、上記プレートを画像判読した（図11に示された）。
図11の結果から、融合タンパク質SS002M91とSS002が赤血球凝集を誘導することがなく、CD47抗体Hu5F9-G4が一定の用量範囲で赤血球凝集を著しく引き起こすことができたことを示した。
実施例9 インビボ抗腫瘍活性能力測定
融合タンパク質SS002M91を例として、インビボ抗腫瘍活性解析を行った。
B-NSGマウスでRaji-Luc細胞を接種し、SS002M91抗体抗腫瘍活性を評価するように、腫瘍モデルを作成した。8週齢の雌B-NSGマウス（Beijing baiaosaitu gene Biotechnology Co., Ltd）を実験動物として選び、Raji-Luc細胞（Beijing baiaosaitu gene Biotechnology Co., Ltd）を測定する。Raji-Luc細胞をルシフェラーゼレポーター遺伝子に導入することによって得られた安定細胞株を、所望の数に蘇生培養してから、対数期増殖細胞を採集し、5×106個/0.2mLの濃度に懸濁させた。そして、0.2mL/匹で尾静脈によりB-NSGマウスに接種した。接種後0日目、3日目に、小動物イメージャで腫瘍増殖様子および体重を観察し、そして、3日目に、腫瘍画像シグナルの適度な（約1.00×106 P/S）マウスを12匹選んで、ランダムに6匹を1群として、溶媒対照群（G1、生理食塩水）と、投与用量が10mg/kgである実験群（G2、SS002M91）の2群に群分けると共に、群分け後の当日および3日目に、合計2回投与した。マウス腫瘍増殖様子およびマウス生存率を観察した（それぞれ図12A、12Bに示された）。
結果によれば、群分け投与後の10日目に、対照群の腫瘍平均蛍光強度が6.75×108P/S、投与群の腫瘍平均蛍光強度が1.76×106P/Sであり、抑制率が約95%であったことを示した。
実施例10 赤血球および血小板への影響測定
融合タンパク質SS002M91を例として、B-NSGマウスをモデルとし、インビボ安全性予備評価を行った。
8週齢の雌B-NSGマウスを18匹選んで（Beijing baiaosaitu gene Biotechnology Co., Ltd）、ランダムに6匹を1群として、溶媒対照群（生理食塩水投与）、実験群（融合タンパク質SS002M91投与）および陽性対照群（TTI-621投与）の3群に群分け、マウスに対して、10mg/kgの投与用量で投与し、そして、群分け後の当日、3日目、7日目に合計3回投与し、また、3回目投与の翌日（すなわち、8日目）に、マウス末梢血における赤血球と血小板の含有量を解析した（赤血球含有量と血小板含有量がそれぞれ図13Aと図13Bに示された）。
結果によれば、対照群に比べて、SS002M91が赤血球（P=0.4483）を誘発しなく、血小板（P=0.9199）が著しく低減し、TTI-621が血小板（P=0.9447）を小さく影響したとしても、赤血球（P=0.0246）を低減したことを示した。
実施例11 異なるサブタイプIgG Fc融合による融合タンパク質活性影響
実施例2における融合タンパク質構築方法によれば、実施例1で得られたSIRPαドメインの突然変異体M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135およびM145をそれぞれヒトIgG4-Fc（そのアミノ酸配列がSEQ ID NO:68に示された）と融合して発現させ、対応するSIRPα突然変異体1の短縮ドメイン-ヒトFc融合タンパク質（融合タンパク質と略称する）を得て、これらの融合タンパク質をそれぞれSS002M1G4、SS002M5G4、SS002M12G4、SS002M35G4、SS002M37G4、SS002M41G4、SS002M57G4、SS002M67G4、SS002M81G4、SS002M82G4、SS002M84G4、SS002M91G4、SS002M99G4、SS002M102G4、SS002M111G4、SS002M122G4、SS002M126G4、SS002M130G4、SS002M135G4およびSS002M145G4（そのアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO：41-60で表される）と命名した。
例として、融合タンパク質SS002M91G4が選ばれ、生物活性解析を行った。
実施例2における結合活性測定方法によると、SS002M91G4の抗原CD47への結合活性を解析し、結果が図14に示された。図14の結果から、SS002M91G4が、良好なCD47抗原結合活性を有し、EC50値が0.0157μg/mLであり、SS002M91のEC50（0.0195μg/mL）とほぼ一致したことを示した。
実施例6におけるCD47/SIRPα相互作用の特異な遮断解析方法によれば、SS002M91G4によるCD47/SIRPα相互作用の遮断活性を解析し、結果を図15に示した。図15の結果から、SS002M91G4が、良好なCD47/SIRPα相互作用遮断活性を有し、IC50値が3.46μg/mLであり、SS002M91のIC50値（5.47μg/mL）とほぼ一致したことを示した。
以上の結果から、異なるサブタイプIgGFcの融合が本発明に構築された融合タンパク質活性を大きく影響することがなかったことが分かった。
実施例12 融合タンパク質血液凝固反応測定
SS002M91G4を例として、実施例8における血液凝固反応測定の方法を参照しながら、IgG4 Fcに基づく上記融合タンパク質の血液凝固反応を評価した。健常ドナー由来の全血によってヒト赤血球を調製した。全血を、リン酸塩緩衝液(PBS)で5倍希釈後、3回洗浄して、新鮮な1%の赤血球溶液を調製した。血液凝固プレートにおける各穴に、50μLの濃度の異なる融合タンパク質SS002M91G4、陽性対照TTI-621および抗CD47抗体Hu5F9-G4を入れて、また、各穴にそれぞれ1%の赤血球溶液を50μL加え、軽く均一に混合し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。一晩インキュベート後、上記プレートを画像判読した。判読標準は、赤血球を全て凝集させ、穴の底部に沈み込ませ、敷き広げてメッシュ状に平らになれば、100% の凝集（++++）とし、赤血球を穴の底部に沈み込ませ、ドット状になれば、非凝集（-）とした。
結果が図16に示した。結果によれば、IgG4 Fcに基づく融合タンパク質SS002M91G4がTTI-621と赤血球凝集を引き起こすことがなく、CD47抗体Hu5F9-G4が一定の用量範囲で赤血球凝集を著しく引き起こしたことを示した。
実施例13 融合タンパク質生物活性解析
SS002M91G4を例として、Jurkat-CSR細胞（ImmuneOnco Biopharmaceuticals (Shanghai) Co.,Ltd.）系譜を利用して、TTI-621を陽性対照としてIgG4 Fcに基づく上記融合タンパク質の生物活性を評価した。
CD47-Fcタンパク質（Cat#12283-H02H、Sino Biological）を0.2μg/mLに希釈し、1ウェルごとにタンパク質希釈液を50μL加えて、また、それぞれTTI-621およびSS002M91G4を0.4mg/mLに希釈し、そして、異なる濃度に勾配希釈して、1ウェルごとに50μL加えて、37℃、5%CO2で培養インキュベーター中でCD47-Fcと45min共インキュベートした。Jurkat-CSR細胞を取り、密度を5×105/mLに調整して、1ウェルごとに細胞懸濁液を100μL加えると同時に、ブランク対照群を設置し、37℃、5%CO2で培養インキュベーター中でタンパク質混合液と20時間共培養した。培養完了後、1ウェルごとにCCK-8（Dojindo、Dojindo Molecular Technologies, Inc.）を20μL加えて、37℃、5%CO2で培養インキュベーター中で4時間培養した。マイクロプレートリーダーで450nm波長におけるOD値を測定して、以下、次式により細胞増殖抑制率を計算した。
抑制率%＝（OD450（試料）−OD450（ブランク）/ （OD450（Jurkat-CSR）−OD450（ブランク））×100
Jurkat-CSR細胞系譜の原理によれば、CD47/SIRPα相互作用によって、標的細胞アポトーシスを誘導することができ、また、CD47/SIRPα相互作用を抑制する抑制剤を入れることにより、該アポトーシスシグナルを遮断した。抑制剤の作用が強くなるにつれて、アポトーシスシグナルが十分に遮断される。結果が図17に示された。結果によれば、SS002M91G4は、CD47-Fc誘導Jurkat-CSR細胞アポトーシスを明らかに遮断することができ、遮断効果がTTI-621よりも強く、IC50がTTI-621の約1/100であったことを示した。このことから、SS002M91G4のCD47/SIRPα相互作用を遮断する生物活性がTTI-621よりも著しく優れたことが分かった。
実施例14 異なるIgGサブタイプFc融合タンパク質によるインビボ抗腫瘍活性および赤血球血小板への影響
融合タンパク質SS002M91、SS002M91G4を例として、インビボ抗腫瘍活性および赤血球血小板の影響を解析した。
NOD/SCIDマウスに対してRaji細胞を皮下接種し、ヒトリンパ腫皮下移植腫瘍モデルを構築し、SS002M91、SS002M91G4のインビボ抗腫瘍活性を評価した。
6〜7週齢の雌NOD/SCIDマウス（Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.）を選んで、Raji細胞を10%ウシ胎児血清含有RPMI1640培養液に培養した。対数増殖期の1×107 Raji細胞を採集して、適切な濃度になるようにPBSで再懸濁させ、matrigel（BD MatrigelTM）と1:1で混合後、マウス皮下腫瘍の接種に用いられた。接種後、腫瘍平均体積が約98.6 mm3になってから、腫瘍の大きさによって、6匹を1群として、ランダムに4群に群分けした（すなわち、溶媒対照群、SS002M91群、SS002M91G4群およびTTI-621群）。10mg/kgの投与用量で、週2回合計2週間腹腔内注射で投与した（上記4群が、それぞれPBS溶液、SS002M91、SS002M91G4およびTTI-621を対応して投与された）。
最終投与してから6日後、実験を完了させ、採血して血液ルーチン検査を行い、マウス末梢血中で赤血球および血小板の含有量（赤血球含有量および血小板含有量がそれぞれ図18Aおよび図18Bに示された）を解析した。投与期間にマウス腫瘍増殖様子を観察し、相対腫瘍増殖抑制率（TGI）から治療効果を評価した（結果が図19に示された）、同時に、動物体重変化と死亡状況から、安全性評価を行った（結果が図20に示された）。TGI（%）、すなわち、相対腫瘍増殖抑制率の計算式は、TGI% =（1-T/C）×100%であった。ここで、TとCは、それぞれ、ある所定の時点における治療群（例えばSS002M91群、SS002M91G4群およびTTI-621群）と対照群（すなわち、溶媒対照群）の相対腫瘍体積（RTV）または腫瘍重量（TW）であった。
結果によれば、SS002M91群、SS002M91G4群、TTI-621群（10mg/kg）が、薬物中止後6日目に、ともに腫瘍抑制効果を顕著にもたらし、相対腫瘍増殖抑制率TGI(%)がそれぞれ74.09%、66.65%および54.75%になり、溶媒対照群に対して何れも統計的な大きい違いがあった（何れもp値<0.01）。SS002M91群、SS002M91G4群は、腫瘍抑制効果が類似し、且つ、陽性対照TTI-621群よりも優れたことを示した。
治療期間にともに死亡した動物がなく、著しい薬物毒性が示されてなく、耐性が良好であった。血液ルーチン検査結果から、陽性対照TTI-621群に比べて、SS002M91群が赤血球と血小板が少し低下し、TTI-621群が血小板も少し低下し、しかし、SS002M91G4が赤血球に明らかな影響がなかったことを示した。
以上、解釈又は例示による詳しい説明を記載したが、添付の請求項の範囲を限定するわけではない。当業者にとっては、これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが明らかであり、且つ、添付の請求項および該当する実施形態の範囲に属する。

Claims (24)

  1. CD47タンパク質に特異的に結合し、且つ、以下
    （a）1×10-8Mまたはより低いKD値でCD47タンパク質に結合し、
    （b）CD47タンパク質とSIRPαとの相互作用を特異的に遮断し、
    （c）血液凝固反応を起こさなく、および
    （d）腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する特性の少なくとも一つを含む、
    融合タンパク質。
  2. 前記CD47タンパク質は、ヒトCD47タンパク質である、
    請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. 前記CD47タンパク質に特異的に結合することができるヒトSIRPαドメインおよび免疫グロブリンFc領域を含有し、ここで、前記ヒトSIRPαドメインと前記免疫グロブリンFc領域が直接的または間接的に連結している、
    請求項1〜2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  4. 前記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαの細胞外ドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む、
    請求項3に記載の融合タンパク質。
  5. 前記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPαのIgVドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む、
    請求項3〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1のドメイン、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む、
    請求項3〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ヒトSIRPαドメインは、ヒトSIRPα変異体1における33〜149番目のアミノ酸残基、その断片、またはその中で1個または複数のアミノ酸に置換されたその突然変異体を含む、
    請求項3〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記突然変異体は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109およびV132の群から選ばれる1個または複数の残基にアミノ酸置換を有する、
    請求項7に記載の融合タンパク質。
  9. 前記突然変異体は、R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sの群から選ばれるアミノ酸置換を1個または複数有する、
    請求項8に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ヒトSIRPαドメインは、SEQ ID NO: 1-20、62-65のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する、
    請求項3〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記免疫グロブリンFc領域は、IgGのFc領域を有する、
    請求項3〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記IgGは、IgG1および/またはIgG4の群から選ばれる、
    請求項11に記載の融合タンパク質。
  13. 前記ヒトSIRPαドメインは、前記免疫グロブリンFc領域のN端に位置する、
    請求項3〜12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記免疫グロブリンFc領域は、SEQ ID NO: 67-68のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する、
    請求項3〜13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  15. SEQ ID NO:21-61のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する、
    請求項1〜14のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  16. 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする、
    核酸分子。
  17. 請求項16に記載の核酸分子を含む、
    ベクター。
  18. 請求項16に記載の核酸分子または請求項17に記載のベクターを含む、
    宿主細胞。
  19. 前記融合タンパク質を発現させる条件で、請求項18に記載の宿主細胞を培養することを含む、
    請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質を調製する方法。
  20. 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクターおよび/または請求項18に記載の宿主細胞、および任意選択で薬学的に許容可能なアジュバントを含む、
    組成物。
  21. 腫瘍または自己免疫疾患の予防または治療のための医薬品および/またはキットの調製における請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項17に記載のベクター、請求項18に記載の宿主細胞および/または請求項20に記載の組成物の用途。
  22. 前記腫瘍は、CD47陽性血液腫瘍および/またはCD47陽性固形腫瘍の群から選ばれる、
    請求項21に記載の用途。
  23. 前記自己免疫疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および/または関節リウマチの群から選ばれる、
    請求項21に記載の用途。
  24. 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項20に記載の組成物を投与することを含む、
    CD47タンパク質とSIRPαとの相互作用を遮断する方法。
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