CN111465697A - 用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物 - Google Patents

用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗心力衰竭的药物组合物。具体地，本发明涉及包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的多核苷酸和编码CCN5蛋白质或其片段的多核苷酸的基因构建体，以及用于预防或治疗心力衰竭的包含相同的构建体作为有效成分的药物组合物。根据本发明的用于预防和治疗心力衰竭的药物组合物用于共表达SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的方法。药物组合物被设计成通过SERCA2a蛋白质的防止心肌细胞损失和增加心肌细胞活性的功能以及CCN5蛋白质的抑制心脏细胞和组织纤维化的功能发挥协同治疗效果，可用于预防或治疗作为由多种病因诱发的复杂病症的心力衰竭。

Description

用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物。具体地，本发明涉及包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列和编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体，并且涉及包含所述基因构建体作为活性成分的用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物。
背景技术
心力衰竭(HF)是这样的疾病，其中由于填充或喷射血液的心室泵功能的结构性和功能性损伤而发生复合症状。心力衰竭是比癌症具有更高死亡率的疾病，并且其诊断5年内的死亡率为50％以上。估计全世界心力衰竭患者的数量为3800万人，并且其患病率也随年龄而增加。然而，对于心力衰竭没有根本的治愈方法，并且目前的治疗仅能够减缓该病的进展。因此，对心力衰竭的医护导致治疗成本很大，这对患者是很大的负担(BraunwaldE.Lancet,2015；385:812-824)。
心力衰竭由起因于心脏病症、遗传缺陷和系统性疾病的多种心脏疾病引起。与心力衰竭的发作相关的疾病典型地包括缺血性疾病、高血压疾病和心血管疾病，并且还包括原发性心肌病、继发性心肌病，包括淀粉样变性、先天性心脏病、心包疾病等，所述疾病由于遗传性或获得性原因而发展(Maron BJ.等,Circulation.,2006；113:1807-1816)。由多种心脏疾病发展而来的心力衰竭导致病理学心脏重塑，所述病理学心脏重塑导致心脏的结构改变和功能紊乱。具体地，关于重塑，存在由心肌细胞的大小、形状和功能的改变引起的细胞水平上的重塑，以及由起因于胞外基质(ECM)的过度积累的心脏组织纤维化引起的组织水平上的重塑。此种病理学心脏重塑涉及疾病相关的心肌细胞中转录、信号转导、结构、电生理和功能作用的改变。
心肌胞外基质(ECM)是复杂结构，其支持心肌细胞的有效收缩和舒张的机械功能，并且在促进心肌内的微环境中的力的充分传递、电信号传送、胞内通讯、代谢物交换等方面起作用。心脏壁中增加的应力、损伤和疾病导致胞外基质中纤维化的进展，由此导致运动机能(如心肌细胞和肌纤维的收缩和舒张)的损伤(Li AH.等,Circ Res.,2014；114(5):916-27)。
此外，病理学重塑导致心肌收缩和舒张功能紊乱以及心肌细胞的消失。细胞水平的心肌细胞的肥大和死亡影响心肌兴奋-收缩偶联并且还导致调节心肌细胞收缩、细胞存活、与能量代谢相关的线粒体功能以及氧化应激的分子机制的病理学变化(KoitabashiN.,等,Nat.rev.Cardiol.,2012；9:147-157)。
心脏组织经历病理学结构改变如促进肌成纤维细胞的产生和纤维化，血管平滑肌的硬化，血管内皮细胞的功能紊乱，以及免疫细胞的炎性作用。此种细胞水平上的疾病进展通过综合过程如心肌细胞的肥大和死亡、血管损失、纤维化、炎症、代谢功能紊乱以及电生理学重塑导致组织水平上的重塑，由此导致心力衰竭(Burchfield JS等,Circulation.2013；128:388-400)。
过去40年神经激素阻断剂已被用作心力衰竭患者的治疗。然而，尽管心力衰竭治疗可有效减轻症状并减少心脏中过载的应力，心力衰竭患者的预后非常差，其死亡率在发作5年后达到50％并且在发作10年后达到90％。此外，在心力衰竭进展严重的情况下，不存在心脏辅助装置和心脏移植以外的治疗方法。因此，急需要开发用于心力衰竭的基本治愈方法和恢复心脏的新疗法。
关于新疗法，近年来活跃地进行治疗开发的领域包括调节疾病相关的信号传导系统的药物、细胞疗法、miRNA以及基因疗法。在以上疗法中，已经报道了一些药物在动物心力衰竭疾病模型中或在小规模II期临床试验中是有效的(Braunwald E.Lancet,2015；385:812-824,VonLueder TG.等,Nat.Rev.Cardiol.,2015；12:730-740)。
特别地，由于在基因水平上对心脏疾病的疾病机制的理解、治疗基因的发现、基因载体的设计和包装技术、递送技术的快速开发等而已经在动物中进行了用于治疗心脏疾病的多种临床前试验(Gorski PA等,Cell Metabol.2015；21:183-194)。
近年来，数个研究已经报道了在心力衰竭动物模型中递送SERCA2a基因导致提高的存活率以及提高的心脏收缩性。然而，在大量临床患者(多至250人)参与的利用表达SERCA2a的重组腺相关病毒AAV-SERCA2a的IIb期临床试验中，与在猪、绵羊、狗、甚至灵长类动物中的实验结果不同，用于心力衰竭的基因疗法未显示有效的临床益处(Rincon M Y.等,Cardiovas.Res.,2015；108:4-20)。
甚至在用于治疗心力衰竭的药物的开发中，已经报道了这样的情况，其中已经在II期临床试验中显示治疗效果的新药物显示低于预期的效力或以在III期临床试验中失败告终(Vaduganathan M,等,Nat.Rev.Cardiol.,2013；10:85-97)。
目前用于心力衰竭的治疗聚焦于减轻症状和减少心脏中过载的应力。然而，尽管所述治疗是有效的，但心力衰竭患者的预后令人非常悲观，其在发作5年后的死亡率达到50％并且在发作10年后的死亡率达到90％。已经发现，在开发用于心力衰竭的治疗的领域，最近了解的疾病机制中，涉及直接影响心脏泵功能的纤维化的心脏重塑以及心肌细胞的损伤彼此相互作用以致其紧密相连，从而影响疾病的发展、进展和预后，并形成恶性循环。
因此，因为单一药物靶点或疾病机制的治疗可能导致心力衰竭治疗中不充分的结果，需要研究新的复合治疗以实现细胞水平上的功能恢复并且治疗心脏组织学重塑。
发明内容
技术问题
本发明人进行研究以开发用于心力衰竭的有效治疗，并且作为结果，已经确定各自包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列和编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体、表达载体和重组病毒在通过多种病因诱发心力衰竭的小鼠模型中对由心力衰竭引起的功能紊乱显示协同治疗效果，由此完成本发明。
问题的解决方案
在本发明的一个方面，提供基因构建体，所述基因构建体包含(i)编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列；和(ii)编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列。
在本发明的另一个方面，提供载有所述基因构建体的重组表达载体。
在本发明的又另一个方面，提供包含所述基因构建体的重组病毒。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含所述基因构建体、所述重组表达载体或所述重组病毒作为活性成分。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括向对象施用所述药物组合物的步骤。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含载有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体；和载有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含含有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒；和含有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：向对象施用(i)载有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体；和(ii)载有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：向对象施用(i)含有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒；和(ii)含有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒。
发明的有益效果
心力衰竭的一个常见特征是心肌细胞消失并且心脏组织纤维化进展，并且心脏的此种结构重塑引起心脏泵的功能紊乱。然而，心肌细胞的消失和心脏组织的纤维化可以取决于疾病进展的阶段而有所不同，并且可以彼此相互作用从而显示恶性循环。因此，同时治疗心肌细胞的消失和心脏组织的纤维化可能是最有效的治疗。
本发明的用于预防和治疗心力衰竭的药物组合物使得SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质被同时表达。所述药物组合物可以通过由SERCA2a蛋白质实现的预防心肌细胞消失及心肌细胞活性的提高以及由CCN5蛋白质实现的预防心脏细胞和组织的纤维化而发挥协同治疗作用，并且因此可有效用于预防或治疗作为由多种病因诱发的复杂疾病的心力衰竭。
附图说明
图1a图示pTR-CMV-SERCA2a载体的结构。
图1b图示pTR-CMV-CCN5载体的结构。
图1c图示pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5载体的结构。
图1d图示pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a载体的结构。
图2a图示pTR-CMV-SERCA2a、pTR-CMV-CCN5和pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5的细胞内表达和细胞外表达的结果。
图2b图示比较在用pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5或pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a转化的细胞中表达的SERCA2a蛋白质的Ca2+再摄取活性的结果(n＝5，**<0.01)。
图2c图示用pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5或pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a转化的细胞中SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达水平的结果。
图3图示使用已经由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠的动物实验的概念图。
图4a图示鉴定在通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达的结果。
图4b图示比较在通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质表达水平的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图4c图示比较在通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照，AAV9-SERCA2a，AAV9-CCN5，AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒获得的心脏组织中CCN5蛋白质表达水平的结果(n＝5，**<0.01)。
图5图示照片，所述照片显示从这样获得的小鼠提取的心脏：向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒的：用红线标记的区域指示心脏组织梗塞的区域。
图6图示照片，所述照片显示从这样获得的小鼠提取的心脏：通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒，并且使用天狼猩红法(Picrosirius red method)对心脏组织进行横截面染色：用红线标记的区域指示心脏组织透壁(transmurally)梗塞的区域。
图7图示通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒获得的提取的心脏中，梗塞区域的比例的量化结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图8图示显示通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒，然后进行超声波心动描记术获得的缩短分数的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01，***<0.001)。
图9a图示显示通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照，AAV9-SERCA2a，AAV9-CCN5，AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒，然后测量血液动力学获得的收缩末期压力-容积关系(ESPVR)的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01，***<0.001)。
图9b图示显示通过向由缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5重组病毒，然后测量血液动力学获得的舒张末期压力容积关系(EDPVR)(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图10图示使用由横向主动脉缩窄(transverse aortic constriction)诱发心力衰竭的小鼠的动物实验的概念图。
图11a图示鉴定通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达的结果。
图11b图示比较通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质的表达水平的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图11c图示比较通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中CCN5蛋白质的表达水平的结果(n＝5，**<0.01)。
图12图示照片，该照片显示从这样获得的小鼠提取的心脏：通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，并且使用Masson三色染色法对心脏组织的横截面进行染色。
图13图示显示通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，然后进行超声波心动描记术获得的缩短分数的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图14a图示显示通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，然后测量血液动力学获得的收缩末期压力-容积关系(ESPVR)的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图14b图示显示通过向由横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，然后测量血液动力学获得的舒张末期压力容积关系(EDPVR)的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图15图示使用通过输注血管紧张素II(AngII)诱发心力衰竭的小鼠的动物实验的概念图。
图16a图示鉴定通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达结果。
图16b图示比较通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中SERCA2a蛋白质的表达水平的结果(n＝5，**<0.01)。
图16c图示比较通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒获得的心脏组织中CCN5蛋白质的表达水平的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图17图示照片，该照片显示从这样获得的小鼠提取的心脏：通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，并且使用Masson三色染色法对心脏组织的横截面进行染色。
图18图示显示通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，然后进行超声波心动描记术获得的左心室壁厚的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
图19图示显示通过向由输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠施用AAV9-对照、AAV9-SERCA2a、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5重组病毒，然后进行超声波心动描记术获得的缩短分数的结果(n＝5，*<0.05，**<0.01)。
具体实施方式
在本发明的一个方面，提供基因构建体，所述基因构建体包含(i)编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列；和(ii)编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列。此处，核苷酸序列可以是mRNA的形式。
如本文中使用的，术语“SERCA2a蛋白质”，作为肌浆网钙ATP酶2a的简称，是指功能为利用ATP能量引起钙再摄取到肌浆网中的蛋白质。具体地，SERCA2a蛋白质可以具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列。此外，编码SERCA2a蛋白质的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13所示的序列。
此外，SERCA2a蛋白质的片段可以是通过截短野生型SERCA2a的N-末端和/或C-末端的部分获得的片段，只要片段保持SERCA2a蛋白质的活性即可。具体地，SERCA2a蛋白质的片段可以是通过自N-末端或C-末端截短1至100、1至50、1至20、或1至10个氨基酸获得的片段。
如本文中使用的，术语"CCN5蛋白质"是指属于CCN家族的基质细胞蛋白质，其在细胞功能如血管疾病诱发、新生血管形成、肿瘤发生、纤维化疾病诱发、细胞分化和存活的调节中起不同作用。CCN5蛋白质，与其他CCN家族蛋白质不同，不具有C-端结构域并且也被称为WISP-2、HICP、Cop1、CTGF-L等。此外，CCN5蛋白质由具有250个氨基酸的单个多肽链组成。由于N末端的22个氨基酸的分泌前导序列，CCN5蛋白质被分泌到细胞外并且作为信号转导蛋白质发挥功能。
具体地，CCN5蛋白质可以具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。此外，编码CCN5蛋白质的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14所示的序列。
此外，CCN5蛋白质的片段可以是通过截短野生型CCN5的N-末端和/或C-末端的部分获得的片段，只要片段保持CCN5蛋白质的活性即可。具体地，CCN5蛋白质的片段可以是通过自N-末端或C-末端截短1至30、1至20、1至10或1至5个氨基酸获得的片段。
所述基因构建体可以进一步包含位于核苷酸序列(i)和核苷酸序列(ii)之间的自剪切序列。所述自剪切序列可以是源自正链RNA病毒如小RNA病毒科(Picornaviridae)、软腐病病毒(Iflavirus)、四体病毒科(Tetraviridae)和双顺反子病毒科(Discistroviridae)的2A肽序列，或源自双链RNA病毒如轮状病毒(Rotavirus)、质型多角体病毒(Cypovirus)和整体病毒科(Totiviridae)的2A肽序列(Garry A Luke等,Journalof General Virology,2008；89:1036-1042)。
编码典型地广泛用于研究的源自猪捷申病毒-1、Thosea asigna病毒、马鼻炎A病毒或口蹄疫病毒的2A肽的核苷酸序列可以存在于编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸和编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸之间。具体地，所述自剪切序列可以为，但不限于编码源自猪捷申病毒-1的2A肽的核苷酸序列。此外，所述自剪切序列可以是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
编码源自猪捷申病毒-1的2A肽的核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以是SEQID NO:6所示的核苷酸序列。
编码源自Thosea asigna病毒的2A肽的核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
编码源自马鼻炎A病毒的2A肽的核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以是SEQID NO:10所示的核苷酸序列。
编码源自口蹄疫病毒的2A肽的核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的核苷酸序列。此外，编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以是SEQID NO:12所示的核苷酸序列。
除了作为代表性自剪切序列的2A肽序列，存在多种自剪切序列，在正链RNA病毒中，包括存在于哺乳动物中的小RNA病毒科2A序列(例如，源自脑心肌炎病毒(Encephalomyocaditis virus)、Theiler鼠脑脊髓炎病毒(Theiler's murineencephalomyelitis virus)、Theiler样病毒(Theiler's-like virus)、Saffold病毒、马鼻炎B病毒(equine rhinitis B virus)、牛鼻病毒(bovine rhinovirus)、Ljungan病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)、鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus))，和源自存在于昆虫中的软腐病病毒(例如，传染性软化病病毒(infectious flacherie virus)、茶尺蠖小RNA样病毒(Ectropisobliqua picorna-like virus)、榕透翅毒蛾小RNA样病毒(Perinanuda picorna-like virus))，四体病毒(例如，刺峨β四体病毒(Euprosterna elaeasavirus)、Providence病毒)，或双顺反子病毒科(例如，蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysisvirus)、果蝇C病毒(Drosophila C virus)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysisvirus)、克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus)、以色列急性蜜蜂麻痹病毒(Israeliacute bee paralysis virus))的2A序列。此外，在双链RNA病毒中，其实例可以包括存在于哺乳动物中的轮状病毒2A序列(例如，源自猪轮状病毒A、牛轮状病毒C、人轮状病毒C、成人腹泻病毒)，存在于昆虫中的质型多角体病毒2A序列(例如，源自家蚕胞质多角体病病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)、中国舞毒蛾质型多角体病毒(Lymantria dispar cypovirus)、马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatuscypovirus)、冬尺蠖蛾质型多角体病毒(Operophtera brumata cypovirus))，以及存在于对虾(Penaeid Shrimp)中的整体病毒科2A序列(例如，源自传染性肌坏死病毒(infectiousmyonecrosis virus))。同样，可以存在多种2A序列，并且这些不限于以上。
此外，在所述基因构建体中，可以在5'至3'方向上以(i)-(ii)的次序包含核苷酸序列(i)和(ii)。当在细胞中表达SERCA2a-P2A-CCN5(基因构建体的一个实施方案)时，SERCA2a蛋白质可以被插入在肌浆网膜中，而CCN5蛋白质可以被分泌到细胞外。此外，当在细胞中表达CCN5-P2A-SERCA2a(本发明的基因构建体的一个实施方案)时，SERCA2a蛋白质可以被插入在肌浆网膜中，而CCN5蛋白质可以被分泌到细胞外。
此外，(i)或(ii)的基因构建体可以含有与其可操作连接的启动子序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”是指核苷酸表达调控序列(如启动子、信号序列、或一系列转录因子结合位点)和其他核苷酸序列之间的功能性连接。所述调控序列调控所述其他核苷酸序列的转录和/或翻译。
具体地，与编码SERCA2a蛋白质或CCN5蛋白质的核苷酸序列连接的启动子可以在动物细胞中(优选在哺乳动物细胞中)操作以调控SERCA2a基因或CCN5基因的转录。所述启动子可以包括来源于哺乳动物病毒的启动子和来源于哺乳动物细胞基因组的启动子。此外，所述启动子包括意在增加肌肉和心脏特异性表达的通过将哺乳动物细胞的基因组序列组合获得的合成启动子(合成的肌肉和心脏限制性启动子，SPC5-12)。所述启动子可以特异性地在心脏细胞中操作，并且也可以在任何细胞中操作。
在一个实施方案中，所述启动子可以i)启动子-SERCA2a-P2A-启动子-CCN5，ii)启动子-CCN5-P2A-SERCA2a，iii)启动子-SERCA2a-P2A-CCN5，或iv)启动子-CCN5-P2A-SERCA2a的形式连接。
所述启动子可以选自由以下各项组成的组的任一种：巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、和人GM-CSF基因启动子，以及合成的肌肉和心脏限制性启动子(SPC5-12)。然而，所述启动子不限于此。具体地，所述启动子可以是CMV启动子。
此外，本发明的基因构建体可以使用脂质体递送到细胞中。脂质体是由分散在水相中的磷脂自动形成的，并且包含SERCA2a基因和CCN5基因的脂质体可以通过机制如内吞作用、吸附至细胞表面，或与浆细胞膜融合而与细胞相互作用，由此将SERCA2a基因和CCN5基因递送到细胞中。
在本发明中，当基于包含基因构建体的病毒载体制备本发明的药物组合物时，可以根据本领域中已知的病毒感染方法来进行施用药物组合物的方法。此外，在本发明中，当所述基因构建体被包含在裸重组DNA分子或质粒中时，显微注射法、脂质体介导的转染方法、DEAE-葡聚糖处理法、以及基因轰炸法(bombardment method)可用于将基因引入细胞中。
在本发明的另一个方面，提供载有所述基因构建体的重组表达载体。
如本文中使用的，术语“表达载体”是指能够在目标宿主细胞中表达目标蛋白质的重组载体，所述重组载体是含有与基因插入物可操作连接以使所述基因插入物被表达的必要调控元件的基因构建体。
此外，所述表达载体可以含有信号序列以促进细胞的蛋白质分泌。插入的核酸序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包含ATG起始密码子和连续序列。通过引入适当的转录或翻译增强元件可以提高表达效率。
所述表达载体可以选自由以下各项组成的组的任一种：质粒载体和粘粒载体。
所述质粒载体可以包括但不限于市售质粒如pUC18，pBAD和pIDTSAMRT-AMP。
在本发明的又另一个方面，提供包含所述基因构建体的重组病毒。
所述病毒可以选自由以下各项组成的组的任一种：腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒等。具体地，所述病毒可以是(但不限于)腺相关病毒。
腺病毒因其基因组大小中等、易于操作、滴度高、靶细胞范围广泛以及感染性出色而被广泛用作基因转移载体。其基因组两侧可以存在100bp至200bp的作为DNA复制和包装的必要顺式作用元件的反向末端重复(ITR)。腺病毒还可以包含编码参与病毒DNA复制的蛋白质的基因组的E1区(E1A和E1B)。
在腺病毒载体中，可以使用缺少E1区的无复制能力的腺病毒。另一方面，将E3区从常规腺病毒载体缺失以提供外源基因的插入位点。
因此，本发明的包含SERCA2a基因和CCN5基因的基因构建体可以被插入在缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或E3区中。在一个实施方案中，包含SERCA2a基因和CCN5基因的基因构建体可以被插入在E3区中。
此外，因为多达约105％的野生型基因组可以被包装在腺病毒中，所以在腺病毒中可以额外地包装约2kb。因此，要被插入到腺病毒中的外源序列可以被额外地连接至腺病毒基因组。
腺病毒具有42种不同的血清型和亚组A至F。在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体可以获得自属于C亚组的5型腺病毒。关于5型腺病毒的生化和遗传信息是已知的。
要由腺病毒递送的外源基因以与附加体相同的方式复制，并且因此对宿主细胞具有非常低的遗传毒性。
逆转录病毒被广泛用作基因转移载体，因为逆转录病毒能够将其基因插入宿主基因组中并且递送大量的外源遗传物质，并且其能够感染广谱的细胞。为了构建逆转录病毒载体，包含SERCA2a基因和CCN5基因的基因构建体可以被插入到逆转录病毒基因组中而不是逆转录病毒序列中以制备无复制能力的病毒。为了生产病毒粒子，可以构建并使用表达gag、pol和env基因而不表达长端重复(LTR)和Ψ序列的包装细胞系。
腺相关病毒(AAV)适合用作本发明的基因递送系统，因为其能够感染非分裂细胞并且具有感染多种类型的细胞的能力。专利号为5,139,941和4,797,368的美国专利中公开了AAV载体的构建和使用的细节。典型地，具有包含SERCA2a基因和CCN5基因的基因构建体的AAV可以通过共转化含有两侧具有两个AAV末端重复的包含SERCA2a基因和CCN5基因的基因构建体的质粒和包含缺少末端重复的野生型AVV编码序列的表达质粒来制备。
来源于牛痘病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒的载体也可用于将要被递送的CCN5基因和目标核苷酸序列递送到细胞中。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的基因构建体、重组表达载体或重组病毒作为活性成分。
当将本发明的药物组合物制备成制剂时，其中包含的药学上可接受的载体的实例可以包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
药物组合物的剂型可以根据使用方法而有所不同，并且可以被制成注射剂。
考虑患者年龄、性别、状态、活性成分在体内的吸收程度、失活率以及组合使用的药物来合理地确定本发明的药物组合物的剂量；并且当药物组合物是病毒时，对于成人，所述药物组合物可以1.0×103至1.0×1020病毒基因组/天的量施用。具体地，对于成人，本发明的药物组合物可以1.0×103至1.0×1020、1.0×108至1.0×1016、1.0×1012至1.0×1015或1.0×1013至1.0×1014病毒基因组/天的量施用。
此外，当药物组合物是质粒载体时，对于成人，所述药物组合物可以0.1μg/1μl至1mg/1μl/天的浓度施用。此外，当药物组合物是质粒载体时，所述剂量可以包括0.1ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml以上，并且包括其间的所有值和范围。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质作为活性成分。
本发明的药物组合物经肠胃外施用，并且所述肠胃外施用包括静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、腹膜内注射、经皮施用、直接注射到组织中的方法等。
如本文中使用的，术语“可接受的载体”是指以下物质中的一些或全部并且包括适用于特殊剂量的那些：溶剂、稀释剂、液体溶媒、分散剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Alfanso R.Gennaro的Remington药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，1995，Macna Publishing Co.Easton，PA)呈现了在已知技术和组合物的情况下用于药物组合物的多种载体。药物组合物的药学上可接受的载体的实例包括但不限于以下：葡萄糖，蔗糖，淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和纤维素乙酸酯；粉末形式的黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂如可可脂，栓剂蜡，花生酱，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油和大豆油；二醇如丙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原蒸馏水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇和磷酸盐缓冲水，十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，着色剂，着色剂，释放剂，涂布剂，增甜剂，调味剂和芳香剂，抗氧化剂等可以根据化合物制造者的判断而包含。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括向对象施用所述药物组合物的步骤。
此处，对象可以为哺乳动物，优选为人。具体地，对象可以为患有心力衰竭或处于心力衰竭风险中的人或非人哺乳动物。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含：载有包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的表达载体；和载有包含编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的表达载体。
SERCA2a蛋白质或其片段是如以上针对基因构建体所述的。CCN5蛋白质或其片段是如以上针对基因构建体所述的。
此外，所述基因构建体可以含有与其可操作连接的启动子序列。
具体地，与编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列连接的启动子可以优选地在动物细胞中并且更优选地在哺乳动物细胞中操作以调控CCN5基因的转录。所述启动子包括来源于哺乳动物病毒的启动子和来源于哺乳动物细胞基因组的启动子。所述启动子可以特异性地在心脏细胞中操作，并且也可以在任意细胞中操作。
所述启动子是如上所述的，并且具体可以为CMV启动子。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含：含有包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的重组病毒；和含有包含编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的重组病毒。
包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体和包含编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体是如以上针对“用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含：载有包含编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的表达载体；和载有包含编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的基因构建体的表达载体”所述的。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：(i)向对象施用载有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体；和(ii)向所述对象施用载有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体。
此处，对象可以为哺乳动物，优选为人。具体地，对象可以为患有心力衰竭或处于心力衰竭风险中的人或另一种哺乳动物。
施用步骤(i)和(ii)可以同时进行。此外，在施用步骤(i)或(ii)后，剩余的施用步骤可以一定的时间间隔进行。
在本发明的仍又另一个方面，提供用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：(i)施用含有编码SERCA2a蛋白质的核苷酸序列的重组病毒；以及(ii)施用含有编码CCN5蛋白质的核苷酸序列的重组病毒。
此处，对象可以为哺乳动物，优选为人。具体地，对象可以为患有心力衰竭或处于心力衰竭风险中的人或另一种哺乳动物。
施用步骤(i)和(ii)可以同时进行。此外，在施用步骤(i)或(ii)后，剩余的施用步骤可以一定的时间间隔进行。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的基因构建体用于预防或治疗心力衰竭的用途。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的重组表达载体用于预防或治疗心力衰竭的用途。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的重组病毒用于预防或治疗心力衰竭的用途。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的基因构建体用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的重组表达载体用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
在本发明的仍又另一个方面，提供本发明的重组病毒用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
发明的方式
下文中，将通过实验例和实施例来详细描述本发明。然而，以下实验例和实施例仅用于说明本发明，并且本发明不限于以下制备例和实施例。
制备例1.构建基因构建体和AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5
构建基因构建体PTR-CMV-SERCA2a、pTR-CMV-CCN5、pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5和pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a以单独或同时表达CCN5蛋白质和SERCA2a蛋白质(图1a至1d)。
SERCA2a部分由人SERCA2a蛋白质的完整的cDNA序列组成。接下来连接的P2A部分是来源于猪捷申病毒-1的自剪切位点并且由编码22个氨基酸的核苷酸序列组成。最后，CCN5部分由人CCN5蛋白质的完整的cDNA序列组成。
通过从pTR-CMV-荧光素酶载体中除去荧光素酶部分并且在其位置插入SERCA2a-P2A-CCN5基因构建体完成pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5重组质粒。由所述重组质粒产生的蛋白质通过在P2A位点的第21个氨基酸甘氨酸和第22个氨基酸脯氨酸之间的自剪切被分为SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质。SERCA2a蛋白质可以保留在内质网膜中并且发挥其固有的功能。此外，CCN5蛋白质可以迁移到内质网中然后以信号肽被切除的形式被分泌到细胞外，由此发挥其固有功能。作为对比，还通过从pTR-CMV-荧光素酶载体除去荧光素酶部分并且在其位置插入CCN5-P2A-SERCA2a基因构建体来构建pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a重组质粒。同样，通过P2A序列的相同功能将由此产生的蛋白质分为SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质。
为了制备自我互补的腺相关病毒(AAV，血清型9)，将人CCN5基因和SERCA2a基因克隆到pds-AAV2-EGFP载体中。为了改善病毒包装和病毒递送效率，在AAV载体构建期间除去eGFP序列。使用293T细胞构建重组AAV。收集细胞培养物中的AAV颗粒并且利用硫酸铵沉淀。通过使用碘克沙醇梯度的超速离心纯化所得物。以利用离心将碘克沙醇替换为乳酸盐林格氏溶液的方式通过若干稀释和富集工序富集AAV颗粒。使用定量RT-PCR和SDS-PAGE量化AAV浓度。
实验方法1.钙摄取测定
将表达所述基因的293T细胞系在pH 7.0含40mM咪唑、10mM NaF、1mM EDTA、300mM蔗糖和0.5mM DTT的溶液中均质化，并将500μg裂解物加入至摄取反应缓冲液(pH 7.0，100mM KCl、5mM MgCl2、5mM NaN3、0.5M EGTA和40mM咪唑)中。使用含放射性同位素的钙pCa6(0.0185μmol)进行摄取实验。用1μM钌红(Sigma Aldrich)进行处理并将所得物在37℃的温度静置3分钟。然后，使得反应开始同时用5mM K-草酸盐和Mg-ATP(Sigma Aldrich)进行处理。将500μl的反应产物通过0.45μm滤器(Millipore)以1分钟的间隔过滤达4分钟，并且使用闪烁计数器(Beckman)测量每分钟的计数(cpm)。
实验方法2.蛋白质印迹法
在已加入有广谱蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)的最小体积的50mM Tris-HCl溶液(pH 7.4)中将细胞或心脏组织均质化。通过SDS-PAGE分离蛋白质并将其转移至聚偏二氟乙烯膜(Schleicher&Schuell)。在用5％(w/v)脱脂奶封闭1小时并用TBST洗涤后，使所述膜与SERCA2a抗体(21st Century Biochemical)、CCN5抗体(Sigma Aldrich)和GAPDH抗体(Sigma-Aldrich)反应。然后将所述膜与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA，USA)反应并使用化学发光底物(Dogen)显影。给所得物拍照并使用LAS软件定量。
实验方法3.组织染色
从动物模型取得心脏组织，然后在室温用10％(w/v)福尔马林固定5天。然后，用PBS进行洗涤。将各样品包埋在石蜡中并将组织块切成7μm厚的切片。为了检查心脏纤维化和梗塞的程度，将所得物用天狼猩红(Sigma Aldrich)和Masson三色(Sigma Aldrich)染色。然后，在光学显微镜下进行观察。
实验方法4.通过超声波心动描记术测量心肌功能
通过腹膜内注射克他命(ketamine)(95mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(5mg/kg)将小鼠麻醉，并进行超声波心动描记术。通过2维成像和M模式追踪功能进行记录，并且确定缩短分数和心室尺寸比(GE Vivid Vision)。
实验方法5.通过血液动力学测量心肌功能
使用1.2Fr压力-容积电导导管(Scisense Inc.，渥太华，加拿大)进行体内血液动力学测量。通过腹膜内注射克他命(95mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)将小鼠麻醉，通过气管造口术进行插管，并且通过将机械气流调节至7μl/g的潮流气量和120次呼吸/分钟进行通气。将压力-容积(PV)导管置于左心室中并且使用IOX2软件(emka TECHNOLOGIES)分析压力-容积数据。
实施例1.蛋白质表达的鉴定
为了观察本发明的重组质粒的SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达，使用lipofectamine将实验例1中制备的pTR-CMV-SERA2a、pTR-CMV-CCN5或pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5递送到培养的细胞中。以与实验方法2中相同的方式对获得的细胞和培养物进行蛋白质印迹法，以检查SERCA2a，CCN5和GAPDH蛋白质的表达。
作为结果，确定在由单个启动子表达的情况下，SERCA2a蛋白质保留在胞质中而CCN5蛋白质被分泌到细胞外(图2a)。
此外，为了比较实验例1中制备的pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5和pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a的蛋白质表达水平和活性，使用lipofectamine递送到培养的细胞中。以与实验方法1相同的方式对获得的细胞和培养物进行钙摄取测定。
作为结果，在SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质之间在表达水平方面没有观察到显著差异，并且表达pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a的细胞显示低的钙再摄取活性(图2b和2c)。
这是由于CCN5蛋白质是分泌蛋白质的特性所致，表明当以SERCA2a-CCN5的次序表达SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质时，两种蛋白质都以其正常结构被表达，而当以CCN5-SERCA2a的次序表达SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质时，在CCN5蛋白质之后被翻译的SERCA2a蛋白质可能作为异常蛋白质而生产，其具有的拓扑结构与其原本的拓扑结构相反。
I.鉴定心力衰竭治疗效果
为了鉴定本发明的包含含有编码SERCA2a蛋白质的核苷酸序列和编码CCN5蛋白质的核苷酸序列的基因构建体的重组病毒的心力衰竭治疗效果，使用通过多种病因诱发心力衰竭的小鼠。
对于被诱发心力衰竭的小鼠，制备缺血-再灌注损伤诱发的心力衰竭模型，横向主动脉缩窄诱发的心力衰竭模型，和血管紧张素II诱发的心力衰竭模型。被诱发心力衰竭的小鼠被分成AAV9-对照、AAV9-SERCA2a施用组、AAV9-CCN5施用组、和AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组，并且比较其心力衰竭治疗效果。
实验例1.鉴定已经通过缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠的心力衰竭治疗效果
实验例1.1.已经通过缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠的制备和重组病毒注射
通过腹膜内注射克他命(95mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)将8至10周龄的B6C3F1小鼠麻醉并进行手术。通过将直径为1mm的聚乙烯10(PE10)管置于冠状动脉左前降支的顶部并进行打结来诱发缺血。30分钟后，通过把结打开并移除PE10管来引起再灌注。在引起再灌注的同时，经由尾静脉给每只小鼠注射1×1011病毒基因组(vg)的AAV9-对照、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a或AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5。4周后，进行心肌功能测量和组织学分析(图3)。
实验例1.2.鉴定CCN5蛋白质和/或SERCA2a蛋白质的表达
首先，为了鉴定是否进行了病毒基因组的有效递送，以与实验方法2中相同的方式通过蛋白质印迹法检查SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达。
作为结果，确定与AAV9-对照施用组相比，在AAV9-CCN5施用组中CCN5蛋白质的表达显著增加，并且在AAV9-SERCA2a施用组中SERCA2a蛋白质的表达显著正常化。此外，确定在AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组中，CCN5蛋白质和SERCA2a蛋白质的表达显著增加(图4a至4c)。
实验例1.3.鉴定减少心脏梗塞区域的效果
此外，从通过缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠提取心脏并拍照。以与实验方法3中相同的方式进行组织染色。
作为结果，与AAV9-对照施用组的梗塞区域相比，AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组以及AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组显示显著减小的梗塞区域尺寸。特别地，AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组显示显著减小的梗塞区域尺寸(图5和6)。此外，即使由通过量化梗塞区域占全部心脏区域的比例获得的图表也确定了AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组显示显著减小的梗塞区域比例(图7)。
实验例1.4.鉴定提高心脏收缩性的效果
进行超声波心动描记术和血液动力学以鉴定心脏组织中的形态学变化是否实际影响心脏收缩性。
为了测量缩短分数(FS，心脏收缩性的参数)，以与实验方法4中相同的方式进行超声波心动描记术。作为结果，确定由缺血-再灌注损伤减小的缩短分数在AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组、及AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组中显著恢复。特别地，AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合组显示显著提高的缩短分数(图8)。
此外，以与实验方法5中相同的方式进行血液动力学测量以精确分析心脏收缩性。作为结果，缺血-再灌注损伤使收缩末期压力-容积关系(ESPVR，收缩期心肌力量的参数)减小。AAV9-SERCA2a施用组显示显著提高的ESPVR，而AAV9-CCN5施用组不显示显著提高的ESPVR。该现象与CCN5的研究中已知的现象相同，从而支持这样的事实，即CCN5不影响心力衰竭。此外，AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合组显示协调提高的ESPVR(图9a)。
此外，确定在缺血-再灌注损伤后舒张末期压力-容积关系(EDPVR，舒张期心肌力量的参数)提高。AAV9-CCN5施用组显示显著减小的EDPVR而AAV9-SERCA2a施用组不显示显著减小的EDPVR。该实验结果与之前的研究的实验结果相同，从支持这样的事实，即SERCA2a蛋白质不影响舒张期心力衰竭。此外，AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组显示显著减小的EDPVR(图9b)。
基于这些数据，确定通过组合施用AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a获得协同治疗效果。
实验例2.鉴定对已经通过横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠的心力衰竭治疗效果
实验例2.1.已经通过横向主动脉缩窄诱发心力衰竭的小鼠的制备和重组病毒注射
通过腹膜内注射克他命(95mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)将8至10周龄的B6C3F1小鼠麻醉并进行手术。将2mm至3mm的近端胸骨纵向切开以保证主动脉弓的视野。之后，将27规(gauge)针用于在无名动脉和颈动脉之间进行连接。然后，进行打结并将针移除，由此引起横向主动脉的缩窄。通过缩窄诱发心力衰竭8周后，经由尾静脉给每只小鼠注射1×1011vg的AAV9-对照、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a或AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5。8周后，进行心肌功能测量和组织学分析(图10)。
实验例2.2.鉴定CCN5蛋白质和/或SERCA2a蛋白质的表达
首先，为了鉴定是否进行了病毒基因组的有效递送，以与实验方法2中相同的方式通过蛋白质印迹法检查SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达。作为结果，确定与AAV9-对照施用组相比，在AAV9-CCN5施用组中CCN5蛋白质的表达显著提高，并且在AAV9-SERCA2a施用组中SERCA2a蛋白质的表达显著提高。此外，确定即使是在AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组中，CCN5蛋白质和SERCA2a蛋白质的表达也显著提高(图11a至11c)。
实验例2.3.鉴定减小心脏内部尺寸大小的效果
从已经通过缺血-再灌注损伤诱发心力衰竭的小鼠中提取心脏，并以与实验方法3中相同的方式用Masson-三色对心脏组织进行染色。作为结果，确定AAV9-对照施用组显示增加的心脏内部尺寸大小；并且确定AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组及AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示减小的心脏内部尺寸大小。特别地，确定AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著减小的内部尺寸大小。此外，确定AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组及AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示由心力衰竭引起的心脏纤维化程度减小(图12)。
实验例2.4.鉴定增加心脏收缩性的效果
进行超声波心动描记术和血液动力学分析以鉴定心脏组织中的形态学变化是否实际影响心脏收缩性。
为了测量缩短分数(FS，心脏收缩性的参数)，以与实验方法4中相同的方式进行超声波心动描记术。作为结果，确定由主动脉缩窄减小的缩短分数在AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组、及AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组中显著恢复。特别地，AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著提高的缩短分数(图13)。
此外，以与实验方法5中相同的方式进行血液动力学分析以精确分析心脏收缩性。作为结果，主动脉缩窄使收缩末期压力-容积关系(ESPVR，收缩期心肌力量的参数)减小。AAV9-SERCA2a施用组显示显著恢复的ESPVR而AAV9-CCN5施用组不显示显著恢复的ESPVR。此外，AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著提高的ESPVR(图14a)。
此外，确定在缺血-再灌注损伤后舒张末期压力容积关系(EDPVR，舒张期心肌力量的参数)提高。AAV9-CCN5施用组显示显著减小的EDPVR而AAV9-SERCA2a施用组不显示显著减小的EDPVR。此外，AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著减小的EDPVR(图14b)。基于此，确定通过AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5获得协同治疗效果。
实验例3.在已经通过输注血管紧张素II(Ang II)诱发心力衰竭的小鼠中鉴定心力衰竭治疗效果
实验例3.1.已经通过输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠的制备和重组病毒注射
通过腹膜内注射克他命(95mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)将8至10周龄的B6C3F1小鼠麻醉，并通过皮下输注血管紧张素II(Ang II)诱发心力衰竭。使用小型渗透泵(Alzet1002，Alzet)将血管紧张素II以3mg/kg/天的浓度皮下输注2周。用Ang II诱发心力衰竭2周后，经由尾静脉给每只小鼠注射1×1011病毒基因组(vg)的AAV9-对照、AAV9-CCN5、AAV9-SERCA2a或AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5。4周后，进行心肌功能测量和组织学分析(图15)。
实验例3.2.鉴定CCN5蛋白质和/或SERCA2a蛋白质的表达
首先，为了鉴定是否进行了病毒基因组的有效递送，以与实验方法2中相同的方式通过蛋白质印迹法检查SERCA2a蛋白质和CCN5蛋白质的表达。
作为结果，确定与AAV9-对照施用组相比，在AAV9-CCN5施用组中CCN5蛋白质的表达显著恢复，并且在AAV9-SERCA2a施用组中SERCA2a蛋白质的表达显著恢复。此外，确定即使是在AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组中，CCN5蛋白质和SERCA2a蛋白质的表达也显著增加(图16a至16c)。
实验例3.3.鉴定减小心脏内部尺寸大小的效果和心脏内壁厚度的变化
从已经通过输注血管紧张素II诱发心力衰竭的小鼠中提取心脏，并以与实验方法3中相同的方式用Masson-三色对心脏组织进行染色。
作为结果，确定AAV9-对照施用组显示增加的心脏内部尺寸大小；并且确定AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组及AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示减小的心脏内部尺寸大小。特别地，确定AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著减小的内腔大小(图17)。
此外，以与实施例6相同的方式进行超声波心动描记术以测量心脏的内壁厚度。心脏内壁厚度的变化被量化并以图表呈现。
作为结果，确定输注血管紧张素II使心脏内壁厚度减小，并且确定AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组及AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示心脏内壁厚度的显著恢复的增加(图18)。
实验例3.4.鉴定提高心脏收缩性的效果
进行超声波心动描记术和血液动力学以鉴定心脏组织中的形态学变化是否实际影响心脏收缩性。
为了测量缩短分数(FS，心脏收缩性的参数)，以与实验方法4中相同的方式进行超声波心动描记术。作为结果，确定已经由主动脉缩窄减小的缩短分数在AAV9-CCN5施用组、AAV9-SERCA2a施用组、及AAV9-CCN5和AAV9-SERCA2a组合施用组中显著恢复。特别地，AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5施用组显示显著恢复的缩短分数(图19)。基于此，确定通过AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5获得协同治疗效果。
序列表
<110> 贝特基因
<120> 用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物
<130> PCB807071BPG
<150> KR 2017/127442
<151> 2017-09-29
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 997
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Glu Asn Ala His Thr Lys Thr Val Glu Glu Val Leu Gly His Phe
1 5 10 15
Gly Val Asn Glu Ser Thr Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Lys Lys Leu
20 25 30
Lys Glu Arg Trp Gly Ser Asn Glu Leu Pro Ala Glu Glu Gly Lys Thr
35 40 45
Leu Leu Glu Leu Val Ile Glu Gln Phe Glu Asp Leu Leu Val Arg Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Ala Ala Cys Ile Ser Phe Val Leu Ala Trp Phe Glu Glu
65 70 75 80
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ala Phe Val Glu Pro Phe Val Ile Leu Leu
85 90 95
Ile Leu Val Ala Asn Ala Ile Val Gly Val Trp Gln Glu Arg Asn Ala
100 105 110
Glu Asn Ala Ile Glu Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Pro Glu Met Gly Lys
115 120 125
Val Tyr Arg Gln Asp Arg Lys Ser Val Gln Arg Ile Lys Ala Lys Asp
130 135 140
Ile Val Pro Gly Asp Ile Val Glu Ile Ala Val Gly Asp Lys Val Pro
145 150 155 160
Ala Asp Ile Arg Leu Thr Ser Ile Lys Ser Thr Thr Leu Arg Val Asp
165 170 175
Gln Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Ile Lys His Thr Asp
180 185 190
Pro Val Pro Asp Pro Arg Ala Val Asn Gln Asp Lys Lys Asn Met Leu
195 200 205
Phe Ser Gly Thr Asn Ile Ala Ala Gly Lys Ala Met Gly Val Val Val
210 215 220
Ala Thr Gly Val Asn Thr Glu Ile Gly Lys Ile Arg Asp Glu Met Val
225 230 235 240
Ala Thr Glu Gln Glu Arg Thr Pro Leu Gln Gln Lys Leu Asp Glu Phe
245 250 255
Gly Glu Gln Leu Ser Lys Val Ile Ser Leu Ile Cys Ile Ala Val Trp
260 265 270
Ile Ile Asn Ile Gly His Phe Asn Asp Pro Val His Gly Gly Ser Trp
275 280 285
Ile Arg Gly Ala Ile Tyr Tyr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val
290 295 300
Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Pro Ala Val Ile Thr Thr Cys Leu Ala
305 310 315 320
Leu Gly Thr Arg Arg Met Ala Lys Lys Asn Ala Ile Val Arg Ser Leu
325 330 335
Pro Ser Val Glu Thr Leu Gly Cys Thr Ser Val Ile Cys Ser Asp Lys
340 345 350
Thr Gly Thr Leu Thr Thr Asn Gln Met Ser Val Cys Arg Met Phe Ile
355 360 365
Leu Asp Arg Val Glu Gly Asp Thr Cys Ser Leu Asn Glu Phe Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Ile Gly Glu Val His Lys Asp Asp Lys
385 390 395 400
Pro Val Asn Cys His Gln Tyr Asp Gly Leu Val Glu Leu Ala Thr Ile
405 410 415
Cys Ala Leu Cys Asn Asp Ser Ala Leu Asp Tyr Asn Glu Ala Lys Gly
420 425 430
Val Tyr Glu Lys Val Gly Glu Ala Thr Glu Thr Ala Leu Thr Cys Leu
435 440 445
Val Glu Lys Met Asn Val Phe Asp Thr Glu Leu Lys Gly Leu Ser Lys
450 455 460
Ile Glu Arg Ala Asn Ala Cys Asn Ser Val Ile Lys Gln Leu Met Lys
465 470 475 480
Lys Glu Phe Thr Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Lys Ser Met Ser Val
485 490 495
Tyr Cys Thr Pro Asn Lys Pro Ser Arg Thr Ser Met Ser Lys Met Phe
500 505 510
Val Lys Gly Ala Pro Glu Gly Val Ile Asp Arg Cys Thr His Ile Arg
515 520 525
Val Gly Ser Thr Lys Val Pro Met Thr Ser Gly Val Lys Gln Lys Ile
530 535 540
Met Ser Val Ile Arg Glu Trp Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Arg Cys
545 550 555 560
Leu Ala Leu Ala Thr His Asp Asn Pro Leu Arg Arg Glu Glu Met His
565 570 575
Leu Glu Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Tyr Glu Thr Asn Leu Thr Phe
580 585 590
Val Gly Cys Val Gly Met Leu Asp Pro Pro Arg Ile Glu Val Ala Ser
595 600 605
Ser Val Lys Leu Cys Arg Gln Ala Gly Ile Arg Val Ile Met Ile Thr
610 615 620
Gly Asp Asn Lys Gly Thr Ala Val Ala Ile Cys Arg Arg Ile Gly Ile
625 630 635 640
Phe Gly Gln Asp Glu Asp Val Thr Ser Lys Ala Phe Thr Gly Arg Glu
645 650 655
Phe Asp Glu Leu Asn Pro Ser Ala Gln Arg Asp Ala Cys Leu Asn Ala
660 665 670
Arg Cys Phe Ala Arg Val Glu Pro Ser His Lys Ser Lys Ile Val Glu
675 680 685
Phe Leu Gln Ser Phe Asp Glu Ile Thr Ala Met Thr Gly Asp Gly Val
690 695 700
Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ile Gly Ile Ala Met Gly
705 710 715 720
Ser Gly Thr Ala Val Ala Lys Thr Ala Ser Glu Met Val Leu Ala Asp
725 730 735
Asp Asn Phe Ser Thr Ile Val Ala Ala Val Glu Glu Gly Arg Ala Ile
740 745 750
Tyr Asn Asn Met Lys Gln Phe Ile Arg Tyr Leu Ile Ser Ser Asn Val
755 760 765
Gly Glu Val Val Cys Ile Phe Leu Thr Ala Ala Leu Gly Phe Pro Glu
770 775 780
Ala Leu Ile Pro Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp Gly
785 790 795 800
Leu Pro Ala Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile Met
805 810 815
Asn Lys Pro Pro Arg Asn Pro Lys Glu Pro Leu Ile Ser Gly Trp Leu
820 825 830
Phe Phe Arg Tyr Leu Ala Ile Gly Cys Tyr Val Gly Ala Ala Thr Val
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Gly Ala Ala Ala Trp Trp Phe Ile Ala Ala Asp Gly Gly Pro Arg Val
850 855 860
Ser Phe Tyr Gln Leu Ser His Phe Leu Gln Cys Lys Glu Asp Asn Pro
865 870 875 880
Asp Phe Glu Gly Val Asp Cys Ala Ile Phe Glu Ser Pro Tyr Pro Met
885 890 895
Thr Met Ala Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Cys Asn Ala Leu
900 905 910
Asn Ser Leu Ser Glu Asn Gln Ser Leu Leu Arg Met Pro Pro Trp Glu
915 920 925
Asn Ile Trp Leu Val Gly Ser Ile Cys Leu Ser Met Ser Leu His Phe
930 935 940
Leu Ile Leu Tyr Val Glu Pro Leu Pro Leu Ile Phe Gln Ile Thr Pro
945 950 955 960
Leu Asn Val Thr Gln Trp Leu Met Val Leu Lys Ile Ser Leu Pro Val
965 970 975
Ile Leu Met Asp Glu Thr Leu Lys Phe Val Ala Arg Asn Tyr Leu Glu
980 985 990
Pro Ala Ile Leu Glu
995
<210> 2
<211> 2991
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggagaacg cgcacaccaa gacggtggag gaggtgctgg gccacttcgg cgtcaacgag 60
agtacggggc tgagcctgga acaggtcaag aagcttaagg agagatgggg ctccaacgag 120
ttaccggctg aagaaggaaa aaccttgctg gaacttgtga ttgagcagtt tgaagacttg 180
ctagttagga ttttattact ggcagcatgt atatcttttg ttttggcttg gtttgaagaa 240
ggtgaagaaa caattacagc ctttgtagaa ccttttgtaa ttttactcat attagtagcc 300
aatgcaattg tgggtgtatg gcaggaaaga aatgctgaaa atgccatcga agcccttaag 360
gaatatgagc ctgaaatggg caaagtgtat cgacaggaca gaaagagtgt gcagcggatt 420
aaagctaaag acatagttcc tggtgatatt gtagaaattg ctgttggtga caaagttcct 480
gctgatataa ggttaacttc catcaaatct accacactaa gagttgacca gtcaattctc 540
acaggtgaat ctgtctctgt catcaagcac actgatcccg tccctgaccc acgagctgtc 600
aaccaagata aaaagaacat gctgttttct ggtacaaaca ttgctgctgg gaaagctatg 660
ggagtggtgg tagcaactgg agttaacacc gaaattggca agatccggga tgaaatggtg 720
gcaacagaac aggagagaac accccttcag caaaaactag atgaatttgg ggaacagctt 780
tccaaagtca tctcccttat ttgcattgca gtctggatca taaatattgg gcacttcaat 840
gacccggttc atggagggtc ctggatcaga ggtgctattt actactttaa aattgcagtg 900
gccctggctg tagcagccat tcctgaaggt ctgcctgcag tcatcaccac ctgcctggct 960
cttggaactc gcagaatggc aaagaaaaat gccattgttc gaagcctccc gtctgtggaa 1020
acccttggtt gtacttctgt tatctgctca gacaagactg gtacacttac aacaaaccag 1080
atgtcagtct gcaggatgtt cattctggac agagtggaag gtgatacttg ttcccttaat 1140
gagtttacca taactggatc aacttatgca cctattggag aagtgcataa agatgataaa 1200
ccagtgaatt gtcaccagta tgatggtctg gtagaattag caacaatttg tgctctttgt 1260
aatgactctg ctttggatta caatgaggca aagggtgtgt atgaaaaagt tggagaagct 1320
acagagactg ctctcacttg cctagtagag aagatgaatg tatttgatac cgaattgaag 1380
ggtctttcta aaatagaacg tgcaaatgcc tgcaactcag tcattaaaca gctgatgaaa 1440
aaggaattca ctctagagtt ttcacgtgac agaaagtcaa tgtcggttta ctgtacacca 1500
aataaaccaa gcaggacatc aatgagcaag atgtttgtga agggtgctcc tgaaggtgtc 1560
attgacaggt gcacccacat tcgagttgga agtactaagg ttcctatgac ctctggagtc 1620
aaacagaaga tcatgtctgt cattcgagag tggggtagtg gcagcgacac actgcgatgc 1680
ctggccctgg ccactcatga caacccactg agaagagaag aaatgcacct tgaggactct 1740
gccaacttta ttaaatatga gaccaatctg accttcgttg gctgcgtggg catgctggat 1800
cctccgagaa tcgaggtggc ctcctccgtg aagctgtgcc ggcaagcagg catccgggtc 1860
atcatgatca ctggggacaa caagggcact gctgtggcca tctgtcgccg catcggcatc 1920
ttcgggcagg atgaggacgt gacgtcaaaa gctttcacag gccgggagtt tgatgaactc 1980
aacccctccg cccagcgaga cgcctgcctg aacgcccgct gttttgctcg agttgaaccc 2040
tcccacaagt ctaaaatcgt agaatttctt cagtcttttg atgagattac agctatgact 2100
ggcgatggcg tgaacgatgc tcctgctctg aagaaagccg agattggcat tgctatgggc 2160
tctggcactg cggtggctaa aaccgcctct gagatggtcc tggcggatga caacttctcc 2220
accattgtgg ctgccgttga ggaggggcgg gcaatctaca acaacatgaa acagttcatc 2280
cgctacctca tctcgtccaa cgtcggggaa gttgtctgta ttttcctgac agcagccctt 2340
ggatttcccg aggctttgat tcctgttcag ctgctctggg tcaatctggt gacagatggc 2400
ctgcctgcca ctgcactggg gttcaaccct cctgatctgg acatcatgaa taaacctccc 2460
cggaacccaa aggaaccatt gatcagcggg tggctctttt tccgttactt ggctattggc 2520
tgttacgtcg gcgctgctac cgtgggtgct gctgcatggt ggttcattgc tgctgacggt 2580
ggtccaagag tgtccttcta ccagctgagt catttcctac agtgtaaaga ggacaacccg 2640
gactttgaag gcgtggattg tgcaatcttt gaatccccat acccgatgac aatggcgctc 2700
tctgttctag taactataga aatgtgtaac gccctcaaca gcttgtccga aaaccagtcc 2760
ttgctgagga tgcccccctg ggagaacatc tggctcgtgg gctccatctg cctgtccatg 2820
tcactccact tcctgatcct ctatgtcgaa cccttgccac tcatcttcca gatcacaccg 2880
ctgaacgtga cccagtggct gatggtgctg aaaatctcct tgcccgtgat tctcatggat 2940
gagacgctca agtttgtggc ccgcaactac ctggaacctg caatactgga g 2991
<210> 3
<211> 250
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Arg Gly Thr Pro Lys Thr His Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Ser Lys Val Arg Thr Gln Leu Cys Pro Thr Pro Cys Thr Cys
20 25 30
Pro Trp Pro Pro Pro Arg Cys Pro Leu Gly Val Pro Leu Val Leu Asp
35 40 45
Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Arg Arg Leu Gly Glu Pro Cys
50 55 60
Asp Gln Leu His Val Cys Asp Ala Ser Gln Gly Leu Val Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Ala Gly Pro Gly Gly Arg Gly Ala Leu Cys Leu Leu Ala Glu Asp
85 90 95
Asp Ser Ser Cys Glu Val Asn Gly Arg Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Thr
100 105 110
Phe Gln Pro His Cys Ser Ile Arg Cys Arg Cys Glu Asp Gly Gly Phe
115 120 125
Thr Cys Val Pro Leu Cys Ser Glu Asp Val Arg Leu Pro Ser Trp Asp
130 135 140
Cys Pro His Pro Arg Arg Val Glu Val Leu Gly Lys Cys Cys Pro Glu
145 150 155 160
Trp Val Cys Gly Gln Gly Gly Gly Leu Gly Thr Gln Pro Leu Pro Ala
165 170 175
Gln Gly Pro Gln Phe Ser Gly Leu Val Ser Ser Leu Pro Pro Gly Val
180 185 190
Pro Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys
195 200 205
Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg
210 215 220
Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe
245 250
<210> 4
<211> 750
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag 60
gtgcgtaccc agctgtgccc gacaccatgt acctgcccct ggccacctcc ccgatgcccg 120
ctgggagtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgcc gggtatgtgc acggcggctg 180
ggggagccct gcgaccaact ccacgtctgc gacgccagcc agggcctggt ctgccagccc 240
ggggcaggac ccggtggccg gggggccctg tgcctcttgg cagaggacga cagcagctgt 300
gaggtgaacg gccgcctgta tcgggaaggg gagaccttcc agccccactg cagcatccgc 360
tgccgctgcg aggacggcgg cttcacctgc gtgccgctgt gcagcgagga tgtgcggctg 420
cccagctggg actgccccca ccccaggagg gtcgaggtcc tgggcaagtg ctgccctgag 480
tgggtgtgcg gccaaggagg gggactgggg acccagcccc ttccagccca aggaccccag 540
ttttctggcc ttgtctcttc cctgccccct ggtgtcccct gcccagaatg gagcacggcc 600
tggggaccct gctcgaccac ctgtgggctg ggcatggcca cccgggtgtc caaccagaac 660
cgcttctgcc gactggagac ccagcgccgc ctgtgcctgt ccaggccctg cccaccctcc 720
aggggtcgca gtccacaaaa cagtgccttc 750
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于猪捷申病毒-1的自剪切序列
<400> 5
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于猪捷申病毒-1的自剪切序列
<400> 6
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于Thosea asigna病毒的自剪切序列
<400> 7
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于Thosea asigna病毒的自剪切序列
<400> 8
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于马鼻炎A病毒(ERAV)的自剪切序列
<400> 9
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于马鼻炎A病毒(ERAV)的自剪切序列
<400> 10
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于FMDV 2A的自剪切序列
<400> 11
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于FMDV 2A的自剪切序列
<400> 12
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 13
<211> 2994
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
atggagaacg cgcacaccaa gacggtggag gaggtgctgg gccacttcgg cgtcaacgag 60
agtacggggc tgagcctgga acaggtcaag aagcttaagg agagatgggg ctccaacgag 120
ttaccggctg aagaaggaaa aaccttgctg gaacttgtga ttgagcagtt tgaagacttg 180
ctagttagga ttttattact ggcagcatgt atatcttttg ttttggcttg gtttgaagaa 240
ggtgaagaaa caattacagc ctttgtagaa ccttttgtaa ttttactcat attagtagcc 300
aatgcaattg tgggtgtatg gcaggaaaga aatgctgaaa atgccatcga agcccttaag 360
gaatatgagc ctgaaatggg caaagtgtat cgacaggaca gaaagagtgt gcagcggatt 420
aaagctaaag acatagttcc tggtgatatt gtagaaattg ctgttggtga caaagttcct 480
gctgatataa ggttaacttc catcaaatct accacactaa gagttgacca gtcaattctc 540
acaggtgaat ctgtctctgt catcaagcac actgatcccg tccctgaccc acgagctgtc 600
aaccaagata aaaagaacat gctgttttct ggtacaaaca ttgctgctgg gaaagctatg 660
ggagtggtgg tagcaactgg agttaacacc gaaattggca agatccggga tgaaatggtg 720
gcaacagaac aggagagaac accccttcag caaaaactag atgaatttgg ggaacagctt 780
tccaaagtca tctcccttat ttgcattgca gtctggatca taaatattgg gcacttcaat 840
gacccggttc atggagggtc ctggatcaga ggtgctattt actactttaa aattgcagtg 900
gccctggctg tagcagccat tcctgaaggt ctgcctgcag tcatcaccac ctgcctggct 960
cttggaactc gcagaatggc aaagaaaaat gccattgttc gaagcctccc gtctgtggaa 1020
acccttggtt gtacttctgt tatctgctca gacaagactg gtacacttac aacaaaccag 1080
atgtcagtct gcaggatgtt cattctggac agagtggaag gtgatacttg ttcccttaat 1140
gagtttacca taactggatc aacttatgca cctattggag aagtgcataa agatgataaa 1200
ccagtgaatt gtcaccagta tgatggtctg gtagaattag caacaatttg tgctctttgt 1260
aatgactctg ctttggatta caatgaggca aagggtgtgt atgaaaaagt tggagaagct 1320
acagagactg ctctcacttg cctagtagag aagatgaatg tatttgatac cgaattgaag 1380
ggtctttcta aaatagaacg tgcaaatgcc tgcaactcag tcattaaaca gctgatgaaa 1440
aaggaattca ctctagagtt ttcacgtgac agaaagtcaa tgtcggttta ctgtacacca 1500
aataaaccaa gcaggacatc aatgagcaag atgtttgtga agggtgctcc tgaaggtgtc 1560
attgacaggt gcacccacat tcgagttgga agtactaagg ttcctatgac ctctggagtc 1620
aaacagaaga tcatgtctgt cattcgagag tggggtagtg gcagcgacac actgcgatgc 1680
ctggccctgg ccactcatga caacccactg agaagagaag aaatgcacct tgaggactct 1740
gccaacttta ttaaatatga gaccaatctg accttcgttg gctgcgtggg catgctggat 1800
cctccgagaa tcgaggtggc ctcctccgtg aagctgtgcc ggcaagcagg catccgggtc 1860
atcatgatca ctggggacaa caagggcact gctgtggcca tctgtcgccg catcggcatc 1920
ttcgggcagg atgaggacgt gacgtcaaaa gctttcacag gccgggagtt tgatgaactc 1980
aacccctccg cccagcgaga cgcctgcctg aacgcccgct gttttgctcg agttgaaccc 2040
tcccacaagt ctaaaatcgt agaatttctt cagtcttttg atgagattac agctatgact 2100
ggcgatggcg tgaacgatgc tcctgctctg aagaaagccg agattggcat tgctatgggc 2160
tctggcactg cggtggctaa aaccgcctct gagatggtcc tggcggatga caacttctcc 2220
accattgtgg ctgccgttga ggaggggcgg gcaatctaca acaacatgaa acagttcatc 2280
cgctacctca tctcgtccaa cgtcggggaa gttgtctgta ttttcctgac agcagccctt 2340
ggatttcccg aggctttgat tcctgttcag ctgctctggg tcaatctggt gacagatggc 2400
ctgcctgcca ctgcactggg gttcaaccct cctgatctgg acatcatgaa taaacctccc 2460
cggaacccaa aggaaccatt gatcagcggg tggctctttt tccgttactt ggctattggc 2520
tgttacgtcg gcgctgctac cgtgggtgct gctgcatggt ggttcattgc tgctgacggt 2580
ggtccaagag tgtccttcta ccagctgagt catttcctac agtgtaaaga ggacaacccg 2640
gactttgaag gcgtggattg tgcaatcttt gaatccccat acccgatgac aatggcgctc 2700
tctgttctag taactataga aatgtgtaac gccctcaaca gcttgtccga aaaccagtcc 2760
ttgctgagga tgcccccctg ggagaacatc tggctcgtgg gctccatctg cctgtccatg 2820
tcactccact tcctgatcct ctatgtcgaa cccttgccac tcatcttcca gatcacaccg 2880
ctgaacgtga cccagtggct gatggtgctg aaaatctcct tgcccgtgat tctcatggat 2940
gagacgctca agtttgtggc ccgcaactac ctggaacctg caatactgga gtag 2994
<210> 14
<211> 753
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag 60
gtgcgtaccc agctgtgccc gacaccatgt acctgcccct ggccacctcc ccgatgcccg 120
ctgggagtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgcc gggtatgtgc acggcggctg 180
ggggagccct gcgaccaact ccacgtctgc gacgccagcc agggcctggt ctgccagccc 240
ggggcaggac ccggtggccg gggggccctg tgcctcttgg cagaggacga cagcagctgt 300
gaggtgaacg gccgcctgta tcgggaaggg gagaccttcc agccccactg cagcatccgc 360
tgccgctgcg aggacggcgg cttcacctgc gtgccgctgt gcagcgagga tgtgcggctg 420
cccagctggg actgccccca ccccaggagg gtcgaggtcc tgggcaagtg ctgccctgag 480
tgggtgtgcg gccaaggagg gggactgggg acccagcccc ttccagccca aggaccccag 540
ttttctggcc ttgtctcttc cctgccccct ggtgtcccct gcccagaatg gagcacggcc 600
tggggaccct gctcgaccac ctgtgggctg ggcatggcca cccgggtgtc caaccagaac 660
cgcttctgcc gactggagac ccagcgccgc ctgtgcctgt ccaggccctg cccaccctcc 720
aggggtcgca gtccacaaaa cagtgccttc tag 753

Claims (33)

1.基因构建体，所述基因构建体包含：
(i)编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列；和
(ii)编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列。
2.权利要求1的基因构建体，其特征在于，所述SERCA2a蛋白质是SEQ ID NO:1表示的氨基酸。
3.权利要求2的基因构建体，其特征在于，编码所述SERCA2a蛋白质的所述核苷酸序列是SEQ ID NO:2表示的序列。
4.权利要求1的基因构建体，其特征在于，所述CCN5蛋白质是SEQ ID NO:3表示的氨基酸。
5.权利要求4的基因构建体，其特征在于，编码所述CCN5蛋白质的所述核苷酸序列是SEQ ID NO:4表示的序列。
6.权利要求1的基因构建体，其特征在于，所述基因构建体包含位于所述核苷酸序列(i)和(ii)之间的自剪切序列。
7.权利要求6的基因构建体，其特征在于，所述自剪切序列是编码源自猪捷申病毒-1、Thosea asigna病毒、马鼻炎A病毒或口蹄疫病毒的2A肽的核苷酸序列。
8.权利要求6的基因构建体，其特征在于，所述自剪切序列是编码源自猪捷申病毒-1的2A肽的核苷酸序列。
9.权利要求6的基因构建体，其特征在于，所述自剪切序列是SEQ ID NO:6表示的核苷酸序列。
10.权利要求1的基因构建体，其特征在于，所述基因构建体在5’至3’方向上以(i)-(ii)的次序含有所述核苷酸序列(i)和(ii)。
11.权利要求1的基因构建体，其特征在于，所述基因构建体还含有与其可操作连接的启动子序列。
12.权利要求11的基因构建体，其特征在于，所述启动子是选自由以下各项组成的组的任一种：巨细胞病毒启动子，腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5K启动子，SV40启动子，HSV tk启动子，RSV启动子，EF1α启动子，金属硫蛋白启动子，β-肌动蛋白启动子，人IL-2基因启动子，人IFN基因启动子，人IL-4基因启动子，人淋巴毒素基因启动子，人GM-CSF基因启动子，以及合成的肌肉和心脏限制性启动子。
13.载有权利要求1至12中任一项的基因构建体的重组表达载体。
14.权利要求13的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自由以下各项组成的组的任一种：质粒载体和粘粒载体。
15.重组病毒，所述重组病毒包含权利要求1至12中任一项的基因构建体。
16.权利要求15的重组病毒，其特征在于，所述病毒选自由以下各项组成的组的任一种：腺病毒，腺相关病毒(AAV)，逆转录病毒，慢病毒，单纯疱疹病毒和牛痘病毒。
17.权利要求15的重组病毒，其特征在于，所述病毒是腺相关病毒。
18.用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1的基因构建体，权利要求13的重组表达载体或权利要求15的重组病毒作为活性成分。
19.用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括将权利要求18的药物组合物施用于对象的步骤。
20.用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含载有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体；和载有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体。
21.用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物，所述药物组合物包含含有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒；和含有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的重组病毒。
22.用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：(i)向对象施用载有编码SERCA2a蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体；和(ii)向所述对象施用载有编码CCN5蛋白质或其片段的核苷酸序列的表达载体。
23.权利要求22的方法，其特征在于，施用步骤(i)和(ii)同时进行。
24.权利要求22的方法，其特征在于，在施用步骤(i)或(ii)后，剩余的施用步骤以一定时间间隔进行。
25.用于预防或治疗心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：(i)施用含有编码SERCA2a蛋白质的核苷酸序列的重组病毒；以及(ii)施用含有编码CCN5蛋白质的核苷酸序列的重组病毒。
26.权利要求25的方法，其特征在于，施用步骤(i)和(ii)同时进行。
27.权利要求25的方法，其特征在于，在施用步骤(i)或(ii)后，剩余的施用步骤以一定时间间隔进行。
28.权利要求1的基因构建体用于预防或治疗心力衰竭的用途。
29.权利要求13的重组表达载体用于预防或治疗心力衰竭的用途。
30.权利要求15的重组病毒用于预防或治疗心力衰竭的用途。
31.权利要求1的基因构建体用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
32.权利要求13的重组表达载体用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
33.权利要求15的重组病毒用于制备用于预防或治疗心力衰竭的药物组合物的用途。
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