KR20190038419A - 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 심부전의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드와 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 이를 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 심부전 예방 및 치료용 약학적 조성물은 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질을 동시에 발현시키는 방법이다. SERCA2a 단백질에 의한 심근세포의 소멸방지 및 활성 증가뿐만 아니라, CCN5 단백질에 의한 심장 세포 및 조직의 섬유화 억제를 통해 상승적 치료효과를 발휘하여 다양한 병인에 의해 유도된 복잡한 질환인 심부전을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HEART FAILURE}
본 발명은 심부전의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드와 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 이를 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
심부전(Heart failure, HF)은 혈액을 충진 혹은 박출하는 심실의 펌프기능이 구조 및 기능적으로 손상되어 복합적 증상이 나타나는 질환이다. 심부전은 진단 후 5년 이내의 사망률이 50% 이상으로 암보다 사망률이 높은 질병이다. 전 세계적으로 심부전 환자들의 규모는 3천 8백만명 정도로 추정되고 있으며, 고령화에 따라 유병률 또한 증가하는 추세이다. 하지만, 심부전의 치료는 근원적 치료방법이 없으며, 질환의 진행과정만을 늦출 수 있다. 따라서, 의학적 관리에 따라 많은 치료 비용이 발생하여 환자에게 큰 부담이 되고 있다(Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824).
심부전의 발병 원인은 심장상태, 유전적 결함, 전신성 질병들에서 기인하는 광범위한 심장 질환들이다. 심부전의 발병 원인과 관련된 질환으로는 허혈성, 고혈압성, 심장 판막성 질환이 대표적이며, 유전적 또는 후천적 원인의 일차적 심근병증, 아밀로이드증 등을 포함하는 이차적 심근병증, 선천성 심장질환, 심막 질환 등이 있다(Maron BJ. et al., Circulation., 2006; 113: 1807-1816). 다양한 심장 질환으로부터 발병된 심부전은 심장구조의 변형 및 기능이상을 나타내는 병리적 심장 리모델링이 일어난다. 구체적으로, 심근세포의 크기, 모양 및 기능의 변형으로 인해 세포 수준의 리모델링과 세포 외 간질(extracellular matrix, ECM)의 과잉 축적으로 심장조직의 섬유화로 생겨나는 조직 수준의 리모델링이 나타난다. 이러한 심장의 병리적 리모델링은 심근세포에서는 전사적, 신호전달, 구조적, 전기생리학적, 기능적 역할들의 질환적 변화를 수반한다.
심장근육의 세포 외 간질(ECM)은 심장근육 세포의 효율적인 수축과 이완의 기계적 기능을 지지해주는 정교한 구조물이며, 심장 근육내의 미세환경에서 적절한 힘의 전달, 전기적 신호 전송, 세포간의 교신, 대사물질의 교환 등을 촉진시키는 역할을 한다. 심장 벽의 스트레스의 증가, 손상 및 질병 등이 세포 외 간질에 섬유화를 진행시켜 심근세포와 근섬유의 수축과 이완의 운동기능에 손상을 일으킨다(Li AH. et al., Circ Res., 2014; 114(5): 916-27).
또한, 병리적 리모델링이 심장근육의 수축과 이완의 기능이상과 심근세포의 소멸을 초래한다. 세포 수준에서 심근세포의 비대와 사망은 심근 흥분-수축 연동작용(excitation-contraction coupling, EC)에 영향을 주며 심근세포의 수축, 세포생존, 에너지대사 관련 미토콘드리아의 기능, 산화적 스트레스의 조절하는 분자적 기전에도 병리적 변화를 가져온다(Koitabashi N., et al., Nat. rev. Cardiol., 2012; 9:147-157).
심장 조직에서는 근섬유아세포의 생성과 섬유화, 혈관 평활근의 경직, 혈관 내피세포의 기능이상 및 면역세포들의 염증작용들을 촉진하는 등 병리적 구조변형이 진행된다. 이러한 세포 수준의 질병진행은 심근세포의 비대와 사망, 혈관 소실, 섬유화, 염증화, 대사적 기능이상, 전기생리학적인 리모델링 등의 통합적 과정을 통해 조직 수준의 리모델링으로 이어져 심부전을 일으킨다(Burchfield JS et al., Circulation. 2013; 128: 388-400).
심부전 환자의 치료제로 지난 40여 년 동안 신경호르몬성 차단제들이 사용되어 왔다. 하지만, 심부전 치료제들은 증상을 완화하고 심장의 과부하 스트레스를 감소시키는 효능에도 불구하고 심부전 환자들의 예후는 발병 5년 후 50%, 10년 후 90% 사망률에 도달할 정도로 매우 나쁘다. 또한, 심부전이 중증으로 진행되면 심장보조기와 심장이식술 외에 치료방법이 없는 상태이다. 따라서, 근본적인 심부전의 치료와 심장을 회복시키는 새로운 치료법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
새로운 치료법과 관련하여, 최근 활발히 진행되는 치료제 개발분야는 질환과 관련된 신호체계를 조절하는 약물, 세포치료제, miRNA, 유전자 치료법 등이 있다. 상기 치료제들 중 일부 약물은 동물 심부전 질환모델이나 소규모 임상 II상에서 효과가 있음이 보고된 바 있다(Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824, VonLueder TG. et al., Nat. Rev. Cardiol., 2015; 12: 730-740).
특히, 심장 질환의 질병기전에 관해서 유전자 수준의 이해, 치료용 유전자 발굴, 유전자 운반체의 디자인과 포장기술, 전달기법의 비약적 발전 등으로 인해 동물에서 심장질환 치료에 대한 다양한 전임상 실험이 이루어지고 있다(Gorski PA, et al.Cell Metabol. 2015; 21: 183-194).
최근 심부전 동물모델에서 아데노-부속 바이러스로 AAV-SERCA2a 유전자를 전달할 경우, 실험동물의 생존률이 증가할 뿐만 아니라, 심장 수축력이 증가된다는 연구결과가 보고된 바 있다. 하지만, AAV-SERCA2a의 250명의 대규모 임상환자들이 참여한 임상 IIb 연구에서 심부전에 대한 유전자 치료가 돼지, 양, 개, 심지어 영장류의 실험 결과와 다르게 유효성 있는 임상결과를 나타내지 못했다(Rincon M Y. et al., Cardiovas. Res., 2015; 108: 4-20).
심부전 치료제 약물개발에서도 임상 II상에서 치료 효과를 나타낸 신약물질들이 임상 III상에서 기대 이하의 약효나 실패를 보이는 사례들이 보고된 바 있다(Vaduganathan M, et al., Nat. Rev. Cardiol., 2013; 10: 85-97).
현재 심부전 치료제들은 증상을 완화하고 심장의 과부하 스트레스를 감소시키는데 초점을 맞추고 있다. 하지만, 치료제의 효능에도 불구하고 심부전 환자들의 예후는 발병 5년 후 50%, 10년 후 90% 사망률에 도달할 정도로 매우 비관적인 상태이다. 심부전 치료제 개발분야에서 새롭게 이해되는 질병의 기전들 중에 심장펌프 기능에 직접적 영향을 주는 섬유화를 포함한 심장 리모델링과 심근세포들의 손상이 상호 작용하여 질환의 생성, 진행 및 예후에 상호 밀접하게 연결되어 있고 악순환의 고리를 형성한다는 사실이 밝혀졌다.
따라서, 하나의 약물표적이나 질병기전의 치료가 심부전 치료에 불충분한 결과를 야기할 수 있으므로, 새로운 세포수준의 기능 회복과 심장 조직학적 리모델링을 치료하는 복합 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이다.
Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824 Maron BJ. et al., Circulation., 2006; 113: 1807-1816 Koitabashi N. et al., Nat. rev. Cardiol., 2012; 9:147-157 Li AH. et al., Circ Res., 2014; 114(5): 916-27 VonLueder TG. et al., Nat. Rev. Cardiol., 2015; 12: 730-740 Gorski PA, et al. Cell Metabol. 2015; 21: 183-194 Rincon M Y. et al., Cardiovas. Res., 2015; 108: 4-20 VonLueder TG. et al., Nat. Rev. Cardiol., 2015; 12: 730-740 Burchfield JS et al., Circulation., 2013; 128: 388-400
이에 본 발명자들은 효과적인 심부전 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 발현벡터, 및 재조합 바이러스가 여러 병인으로 심부전을 유발시킨 마우스 모델에서 심부전으로 인한 기능이상에 대해 상승적 치료효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 유전자 컨스트럭트가 적재된 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자 컨스트럭트, 재조합 발현벡터 또는 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 개체에 투여하는 단계를 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법을 제공한다.
심부전의 공통적인 특징은 심근세포들이 소멸되고 심장조직의 섬유화가 진행되는 것이며, 이러한 심장의 구조적 리모델링으로 인해 심장 펌프의 기능이상이 유발된다. 하지만, 심근세포 소멸과 심장조직의 섬유화는 질병 발전단계에 따라 다르게 나타나고, 상호작용하여 악순환을 나타낼 수 있다. 따라서, 심근세포의 소멸과 심장조직의 섬유화를 동시에 치료하는 것이 가장 효과적인 치료법이 될 수 있다.
본 발명의 심부전 예방 및 치료용 약학적 조성물은 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질을 동시에 발현시키는 방법이다. SERCA2a 단백질에 의한 심근세포의 소멸방지 및 활성 증가뿐만 아니라, CCN5 단백질에 의한 심장 세포 및 조직의 섬유화 억제를 통해 상승적 치료효과를 발휘하여 다양한 병인에 의해 유도된 복잡한 질환인 심부전을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 pTR-CMV-SERCA2a 벡터구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 pTR-CMV-CCN5 벡터구조를 나타낸 도면이다.
도 1c는 pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 벡터구조를 나타낸 도면이다.
도 1d는 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a 벡터구조를 나타낸 도면이다.
도 2a는 pTR-CMV-SERCA2a, pTR-CMV-CCN5, pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5의 세포 내 발현과 세포 외 발현을 확인한 도면이다.
도 2b는 pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 또는 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a로 형질전환 시킨 세포에서 발현한 SERCA2a 단백질의 Ca2+ 재흡수 활성을 비교한 도면이다(n=5, **<0.01).
도 2c는 pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 또는 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a로 형질전환 시킨 세포에서의 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질 발현 정도를 확인한 도면이다.
도 3은 허혈-재관류 손상을 일으켜 심부전을 유발시킨 마우스를 이용한 동물실험의 개요도를 나타낸 도면이다.
도 4a는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 4b는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 4c는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 CCN5 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, **<0.01).
도 5는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장을 적출하여 촬영한 사진이다: 빨간선으로 표시된 부위는 심장 조직이 경색된 부위를 나타낸다.
도 6은 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장을 적출하여 심장 조직 단면을 Picrosirius red 방법으로 염색한 사진이다: 빨간선으로 표시된 부위는 심장 조직이 전층경색된 부위를 나타낸다.
도 7은 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 적출한 심장 내 경색 부위 비율을 정량화한 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 8은 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심초음파검사 (Echocardiography)를 통해 수축분율을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01, ***<0.001).
도 9a는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 혈류 역학을 측정하여 ESPVR(end-systolic pressure volume relationship)을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01, ***<0.001).
도 9b는 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 혈류 역학을 측정하여 EDPVR(end-diastolic pressure volume relationship)을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 10은 횡행 대동맥 수축을 통해 심부전을 유발시킨 마우스를 이용한 동물실험의 개요도를 나타낸 도면이다.
도 11a는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 11b는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 11c는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 CCN5 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, **<0.01).
도 12는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장을 적출하여 심장 조직 단면을 Masson-trichrome staining 방법으로 염색한 사진이다.
도 13은 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심초음파검사를 통해 수축분율을 측정한 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 14a는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 혈류 역학을 측정하여 ESPVR(end-systolic pressure volume relationship)을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 14b는 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 혈류 역학을 측정하여 EDPVR(end-diastolic pressure volume relationship)을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 15는 안지오텐신 II (AngII)를 주입하여 심부전을 유발시킨 마우스를 이용한 동물실험의 개요도를 나타낸 도면이다.
도 16a는 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 16b는 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 SERCA2a 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, **<0.01).
도 16c는 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장 조직 내 발현하는 CCN5 단백질의 발현 정도를 비교한 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 17은 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심장을 적출하여 심장 조직 단면을 Masson-trichrome staining 방법으로 염색한 사진이다.
도 18은 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심초음파분석을 통해 좌심실벽 두께(Left ventricular wall thickness)를 측정하여 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
도 19는 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스에 AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 바이러스를 투여한 후, 심초음파검사를 통해 수축분율을 나타낸 도면이다(n=5, *<0.05, **<0.01).
본 발명의 일 측면은, (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다. 이때, 상기 뉴클레오타이드는 mRNA 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "SERCA2a 단백질"이란, Salcoplasmic reticulum Calcium Atpase 2a의 약어로, 근소포체 내로 ATP 에너지를 사용하여 칼슘을 재흡수하는 기능을 하는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 상기 SERCA2a 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 SERCA2a 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 13으로 표시되는 서열일 수 있다.
또한, 상기 SERCA2a 단백질의 단편이란, SERCA2a 단백질의 활성을 유지하는 한, 야생형의 SERCA2a의 N-말단 및/또는 C-말단의 일부가 절단된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 SERCA2a 단백질의 단편은 N-말단 또는 C-말단으로부터 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 20 또는 1 내지 10 개의 아미노산이 절단되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CCN5 단백질"이란, 혈관계 질환, 혈관신생, 종양생성, 섬유증 질환 유발, 세포 분화 및 생존과 같은 세포기능 조절에 다양한 역할을 하는 CCN족에 속하는 기질세포 단백질을 의미한다. CCN5 단백질은 다른 CCN족 단백질과 다르게 C-말단 도메인이 없으며, WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L 등으로도 불린다. 또한, CCN5 단백질은 250개의 아미노산 서열의 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. CCN5 단백질은 N-말단에 22개의 아미노산 분비 유도 서열이 있어 세포 밖으로 분비되어 신호전달 단백질의 기능을 한다.
구체적으로, 상기 CCN5 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 14로 표시되는 서열일 수 있다.
또한, 상기 CCN5 단백질의 단편이란, CCN5 단백질의 활성을 유지하는 한, 야생형의 CCN5의 N-말단 및/또는 C-말단의 일부가 절단된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CCN5 단백질의 단편은 N-말단 또는 C-말단으로부터 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5 개의 아미노산이 절단되는 것일 수 있다.
상기 (i)와 (ii)의 뉴클레오타이드 사이에 위치하는 자가-절단(self-cleavage) 서열을 포함할 수 있다. 상기 자가-절단(self-cleavage) 서열은 Piconabiridea, Iflaviruses, Tetraviridae, Discistroviridae 등 positive stranded RNA 바이러스에서 유래한 2A 펩타이드, 혹은 Rotaviruses, Cypoviruses, Totovirudae등 Double stranded RNA 바이러스에서 유래한 2A 펩타이드 서열일 수 있다(Garry A Luke, et al Journal of General virology., 2008; 89: 1036-1042).
대표적으로 연구에 많이 사용되는 Porcine teschovirus-1, Thosea asigna virus, equine rhinitis A virus 또는 Foot-and-mouth disease virus에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드가 SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드와 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 사이에 존재할 수 있다. 구체적으로 자가-절단 서열은 Porcine teschovirus-1에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 또한, 상기 자가-절단 서열은 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 Porcine teschovirus-1에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 Thosea asigna virus에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 equine rhinitis A virus에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 9로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기 Foot-and-mouth disease virus에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 11로 표시되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상기의 대표적인 자가절단 서열인 2A 펩타이드 서열을 제외하고도 다양한 자가 절단 서열이 존재하는데 Positive stranded RNA 바이러스 중 포유류에 존재하는 Picornaviridae 2A 서열 (예, Encephalomyocaditis virus, Theiler's murine encephalomyelitis virus, Theiler's-like virus, Saffold virus, equine rhinitis B virus, bovine rhinovirus, Ljungan virus, Seneca Valley virus, duck hepatitis virus)과 곤충에 존재하는 Iflaviruses (예, infectious flacherie virus, Ectropisobliqua picorna-like virus, Perina nuda picorna-like virus), Tetraviruses (예, Euprosterna elaeasa virus, Providence virus), 또는 Dicistroviridae (예, cricket paralysis virus, Drosophila C virus, Acute bee paralysis virus, Kashmir bee virus, Israeli acute bee paralysis virus)에서 유래한 2A 서열이 존재한다. 또한 Double stranded RNA 바이러스 중 포유류에 존재하는 Rotaviruse 2A 서열 (예, Porcine rotavirus A, Bovine rotavirus C, Human rotavirus C, adult diarrhea virus), 곤충에 존재하는 Cypoviruses 2A 서열 (예, Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, Lymantria dispar cypovirus, Dendrolimus punctatus cypovirus, Operophtera brumata cypovirus), 그리고 Penaeid Shrimp에 존재하는 Totiviridae 2A 서열 (예, infectious myonecrosis virus) 등이 존재하며 2A 서열은 다양하게 존재할 수 있으며, 상기 구체예로 한정되지 않는다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트는 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 (i)-(ii)의 순서로 (i) 및 (ii)의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 유전자 컨스트럭트의 일구체예인 SERCA2a-P2A-CCN5가 세포에서 발현되면, SERCA2a 단백질은 근소포체 막에 삽입될 수 있으며, CCN5 단백질은 세포외로 배출이 일어날 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자 컨스트럭트의 일구체예인 CCN5-P2a-SERCA2a가 세포에서 발현되면, SERCA2a 단백질은 근소포체 막에 삽입될 수 있으며, CCN5 단백질은 세포외로 배출이 일어날 수 있다.
또한, 상기 (i) 또는 (ii)의 유전자 컨스트럭트에 프로모터 서열이 작동적으로 연결될(operatively linked) 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "작동적으로 연결"된 것이란, 뉴클레오타이드 발현을 조절하는 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 뉴클레오타이드 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절한다.
구체적으로, SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질 뉴클레오타이드에 결합된 프로모터는, 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 SERCA2a 단백질 또는 CCN5 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 또는 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 또한 근육과 심장에 특이적으로 발현을 늘리기 위해서 포유동물 세포의 유전체 서열을 조합한 합성 프로모터(Synthetic muscle- and Cardiac-restricted promoter, SPC5-12)를 포함한다. 상기 프로모터는 심장세포에서 특이적으로 작동되는 것일 수 있으나, 모든 세포에서 작동하는 것일 수도 있다.
일구체예로, 상기 프로모터는 i) 프로모터-SERCA2a-P2A-프로모터-CCN5, ii) 프로모터-CCN5-P2A-SERCA2a, iii) 프로모터-SERCA2a-P2A-CCN5 또는 iv) 프로모터-CCN5-P2A-SERCA2a 형태로 연결된 것일 수 있다.
상기 프로모터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 또한 근육과 심장제한 합성 프로모터(Synthetic muscle- and Cardiac-restricted promoter, SPC5-12)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 리포좀을 이용하여 세포내로 전달시킬 수 있다. 리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성되며, SERCA2a 단백질 유전자 및 CCN5 단백질 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면으로 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 SERCA2a 단백질 유전자 및 CCN5 단백질 유전자를 운반할 수 있다.
본 발명에서, 유전자 컨스트럭트를 포함하는 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시될 수 있다. 또한, 본 발명에서 유전자 컨스트럭트를 포함하는 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세주입법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 유전자 컨스트럭트가 적재된 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 필수적인 조절 요소가 작동 가능하게 연결된 유전자 제작물을 의미한다.
또한, 상기 발현벡터는 세포가 단백질 분비를 촉진하기 위하여 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열들을 포함할 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 코스미드 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 플라스미드 벡터는 상업적으로 개발된 pUC18 플라스미드, pBAD플라스미드, pIDTSAMRT-AMP 플라스미드 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
상기 바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus; AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 및 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노 부속 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아데노바이러스는 중간 정도의 유전체 크기, 조작의 편이성, 높은 타이터, 광범위한 타겟세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 유전체의 양 말단은 100 내지 200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함할 수 있으며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전체의 E1 영역(E1A 및 E1B)를 더 포함할 수 있다.
다만, 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스를 이용할 수 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다.
따라서, 본 발명의 SERCA2a 단백질 및 CCN5 단백질 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/ 또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입될 수 있다. 일구체예로, SERCA2a 단백질 및 CCN5 단백질 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트는 E3 영역에 삽입될 수 있다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105% 정도까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2kb를 추가적으로 패킹할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 외래 서열은 아데노바이러스의 유전체에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A 내지 F의 서브그룹을 갖는다. 일구체예로, 서브 그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5에서 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 수득할 수 있다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다.
상기 레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, SERCA2a 유전자 및 CCN5 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트는 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산할 수 있다. 비리온을 생성하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자는 발현하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 발현하지 않는 패키징 세포주를 구축하여 이용할 수 있다.
상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력이 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다. 전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 SERCA2a 유전자 및 CCN5 유전자가 포함된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미를 동시 형질전환시켜 SERCA2a 유전자 및 CCN5 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 가지고 있는 AAV를 제조할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스, 렌티바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터 유래된 벡터도, CCN5 단백질의 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 운반하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 유전자 컨스트럭트, 재조합 발현벡터 또는 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 제제일 경우, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랑 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 주사제(Injections)로 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 상기 약학 조성물이 바이러스인 경우, 성인 기준 1일 1.0x103 내지 1.0x1020 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0x103 내지 1.0x1020, 1.0x108 내지 1.0x1016, 1.0x1012 내지 1.0x1015 또는 1.0x1013 내지 1.0x1014의 양으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물이 플라스미드 벡터인 경우, 성인 기준 1일 0.1 ㎍/1 ㎕ 내지 1 ㎎/1 ㎕의 농도로 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물이 플라스미드 벡터인 경우, 투여량은 0.1 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖ 또는 그 이상, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질을 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여하며, 비경구 투여는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 조직에 직접 주입하는 방법 등을 포함한다.
본 명세서에서 "허용가능한 담체"는 모든 아래의 물질 중 일부 혹은 모든 용매, 희석제, 액체 운반체, 분산제, 현탁 보조제, 표면활성제, 등장제, 농축제, 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제, 또는 그 유사제로 특정한 투여량에 적합한 것을 포함한다. Gennaro 저 Mack Publishing, Easton, Pa., 1995년 출간 Remington's Pharmaceutical Sciences Ed, 는 공지의 기술과 조성으로 의약적 조성물에 사용되는 다양한 담체를 제시한다. 의약적으로 수용 가능한 담체의 약제학적 조성의 예는 아래의 것을 포함하며 이것으로 제한되지 않는다. 글루코스, 수크로스의 당, 옥수수전분, 감자전분등의 전분, 소디움카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로어스, 셀룰로오스 아세테이트등의 셀룰로오스와 이의 유도체; 파우더 형태의 트라가간트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아버터, 좌약용 왁스, 땅콩버터, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 대두유등의 부형제; 프로필렌 글라이콜등의 글라이콜; 에틸올레이트, 에틸라우레이트등의 에스테르; 한천; 마그네슘 하이드록사이드, 알미늄 하이드록사이드등의 완충제; 알긴산; 발열성 물질제거 증류수; 등장 식염수; 링거액; 에틸알코올과 인산염 완충수 및 라우릴 황산 나트륨과 스테아린산 마그네슘 및 착색제, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미료, 향미제 및 방향제, 항산화제등이 화합물 제조자의 판단에 의해 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 심부전 질환에 걸릴 수 있거나, 심부전을 앓고 있는 인간 또는 인간 이외의 포유동물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 적재된 발현벡터; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 적재된 발현벡터를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 SERCA2a 단백질 또는 이의 단편은 상기 유전자 컨스트럭트에서 상술한 바와 동일하다. 상기 CCN5 단백질 또는 이의 단편은 상기 유전자 컨스트럭트에서 상술한 바와 동일하다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 CCN5 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 상기 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 심장세포에서 특이적으로 작동되는 것일 수 있으나, 모든 세포에서 작동하는 것일 수도 있다.
상기 프로모터는 상술한 바와 같으며, 구체적으로 CMV 프로모터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트는 "SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 적재된 발현벡터; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 적재된 발현벡터를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물"에서 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 개체에 투여하는 단계; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 심부전 질환에 걸릴 수 있거나, 심부전을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물일 수 있다.
상기 (i) 및 (ii) 단계의 투여가 동시에 진행될 수 있다. 또한, 상기 (i) 또는 (ii) 단계 투여 후 시간 간격을 두고 나머지 단계의 투여를 진행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) SERCA2a 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 투여하는 단계; 및 (ii) CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 심부전 질환에 걸릴 수 있거나, 심부전을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물일 수 있다.
상기 (i) 및 (ii) 단계의 투여가 동시에 진행될 수 있다. 또한, 상기 (i) 또는 (ii) 단계 투여 후 시간 간격을 두고 나머지 단계의 투여를 진행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 유전자 컨스트럭트의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 재조합 발현벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 재조합 바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 유전자 컨스트럭트의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 재조합 발현벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 재조합 바이러스의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 실험예와 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예와 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 제조, 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 유전자 컨스트럭트 및 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 제작
CCN5 단백질과 SERCA2a 단백질을 각각 그리고 동시에 발현하기 위하여, pTR-CMV-SERCA2a, pTR-CMV-CCN5, pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5, pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a 유전자 컨스트럭트를 제작하였다(도 1a 내지 도 1d).
SERCA2a 부분은 인간의 SERCA2a 단백질의 cDNA 서열 전체로 이루어져 있다. 이어서 연결한 P2A 부분은 porcine teschovirus-1에서 유래한 자가 절단(self-cleavage) 부위로서 22개의 아미노산을 암호화하는 염기서열로 이루어져 있다. 마지막으로 CCN5 부분은 인간의 CCN5 단백질의 cDNA 서열 전체로 이루어져 있다.
pTR-CMV-luciferase에서 luciferase 부분을 제거하고 SERCA2a-P2A-CCN5 유전자 컨스트럭트를 대신 삽입하여 pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 재조합 플라스미드를 완성하였다. 상기 재조합 플라스미드에 의해 만들어지는 단백질은 P2A 부위의 21번 아미노산인 글리신과 22번 아미노산인 프롤린 사이의 자가 절단에 의해 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질로 나누어지게 된다. SERCA2a 단백질은 소포체 막에 머물러서 본연의 기능을 할 수 있다. 또한, CCN5 단백질은 소포체 내로 이동한 다음 시그널 펩타이드(signal peptide)가 절단된 형태로 세포 외로 분비되어 본연의 기능을 할 수 있다. 반대로 pTR-CMV-luciferase에서 luciferase 부분을 제거하고 CCN5-P2a-SERCA2a 유전자 컨스트럭트를 대신 삽입하여 pTR-CMV-CCN5-P2a-SERCA2a 재조합 플라스미드 또한 제작하였다. 이또한 P2a 서열의 같은 기능으로 인해 CCN5와 SERCA2a단백질이 나누어지게 된다.
자가 보완적인 아데노-부속 바이러스(AAV, serotype 9)를 제작하기 위해 pds-AAV2-EGFP 벡터에 인간 CCN5 유전자 및 SERCA2a 유전자를 클로닝하였다. 바이러스 패키징과 바이러스의 전달효율을 향상시키기, AAV 벡터제작 시, eGFP 시퀀스를 제거하였다. 재조합 AAV는 293T 세포를 이용해 제작하였다. 세포배양액에 있는 AAV 입자들을 모아서 황산암모늄(ammonium sulfate)으로 석출시키고, 이는 이오딕사놀 그래디언트(iodixanol gradient)를 이용한 초원심 분리를 통해 정제하였다. 원심분리를 사용하여 이오딕사놀을 Lactate Ringer's 용액과 교환하는 다수의 희석과 농축 공정을 거쳐서 AAV 입자들을 농축화하였다. AAV 농도는 정량적 RT-PCR과 SDS-PAGE를 이용하여 수치화하였다.
실험방법 1. 칼슘 재흡수 실험 (Uptake assay)
유전자를 발현시킨 293T 세포주는 40 mM 이미다졸(imidazole), 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 300 mM sucrose 및 0.5 mM DTT가 포함된 pH 7.0의 용액에 균질화 시키고, 500 ㎍의 용해물을 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM NaN3, 0.5 M EGTA, 40 mM 농도의 이미다졸을 pH 7.0 uptake 반응 버퍼에 첨가하여 방사선 동위원소가 포함된 pCa 6 (0.0185 μmol) 칼슘을 이용하여 흡수실험을 시행하였다. 1 μM의 Ruthenium red(Sigma Aldrich)을 처리하고 37℃ 온도에서 3분 동안 기다린 후, 5 mM의 K-oxalate와 Mg-ATP(Sigma Aldrcih)를 처리하며 반응을 시작하였다. 1분 간격으로 4분까지 500 ㎕의 반응물을 0.45 ㎛ 필터(Millipore)에 걸러내어 신틸레이션계수기(scintillation counter, Beckman)을 이용하여 cpm(count per minute)을 측정하였다.
실험방법 2. 웨스턴 블랏
세포 또는 심장조직을 브로드-스펙트럼 프로테아제 저해제 칵테일(Calbiochem)이 첨가된 최소 부피의 50 mM Tris-HCl, pH 7.4인 용액에서 균질화시켰다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 폴리 비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Schleicher & Schuell)으로 옮겼다. 5% (w/v) 탈지유로 1시간 동안 블로킹하고 TBST로 세척한 후, 멤브레인을 SERCA2a 항체(21st century biochemical), CCN5 항체(Sigma aldrich), GAPDH 항체(Sigma-Aldrich)와 함께 반응시켰다. 이어서 멤브레인을 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA, USA)와 함께 반응시키고 화학발광기질(Dogen)을 사용하여 현상하였다. LAS 소프트웨어를 사용하여 촬영하고 정량화하였다.
실험방법 3. 조직염색
동물 모델들로부터 심장 조직을 취한 후 실온에서 5일 10%(w/v) 포르말린으로 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 표본을 파라핀에 매립하고 조직 블록을 7 ㎛의 두께로 절단하였다. 심장 섬유화정도 및 경색정도를 확인하기 위하여 Picrosirius red(Sigma Aldrich)와 Masson-Trichrome(Sigma Aldrich) 염색한 후 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
실험방법 4. 심초음파 검사를 통한 심근기능 측정
마우스를 Ketamine(95 ㎎/㎏)과 xylazine(5 ㎎/㎏)를 복강주사하여 마취시키고 심초음파 검사를 진행하였다. 2차원 영상과 M-모드 추적기능을 통하여 기록하고 수축분율(Fractional shortening)과 심실 크기의 비율을 결정하였다(GE Vivid Vision).
실험방법 5. 혈류 역학(hemodynamics)을 통한 심근기능 측정
in vivo 상태에서의 혈류 역학 측정은 1.2Fr pressure-volume conductance catheter(Scisense, Ontario, Canada)를 이용하여 진행하였다. 마우스를 Ketamine (95 ㎎/㎏)과 xylazine (5 ㎎/㎏) 복강내 주사하여 마취시키고 기관절제술을 통하여 삽관하고 기계적인 공기흐름을 7 ㎕/g 1회 호홉량(tidal volume)과 분당 120번의 호흡으로 맞추어 환기시켰다. PV(pressure-volume) catheter를 좌심실에 비치시키고 pressure-volume 데이터를 IOX2 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(EMKA technologies).
실시예 1. 단백질 발현 확인
본 발명의 재조합 플라스미드에 의한 SERCA2a와 CCN5 단백질의 발현을 관찰하기 위하여 실험예 1에서 제조한 pTR-CMV-SERA2a, pTR-CMV-CCN5 또는 pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5를 리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 배양세포 내로 전달하였다. 얻어낸 세포와 배양액을 실험방법 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 SERCA2a, CCN5 및 GAPDH 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 단일 프로모터에서 발현된 SERCA2a 단백질은 세포질에, CCN5 단백질은 세포 밖으로 분비된 것을 확인하였다(도 2a).
또한, pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5와 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a의 단백질 발현 정도와 활성을 비교하기 위해, 실험예 1에서 제조한 pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5와 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a를 리포펙타민을 이용하여 배양세포 내로 전달하였다. 얻어낸 세포와 배양액을 실험방법 1과 동일한 방법으로 칼슘 재흡수 실험을 수행하였다.
그 결과, SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현정도는 큰 차이를 보이지 않았으나, 칼슘 재흡수 활성은 pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a를 발현시킨 세포에서 활성이 낮았다(도 2b 및 도 2c).
이는 CCN5 단백질이 분비되는 단백질이라는 특성에 기인한 것으로, SERCA2a- CCN5의 순서로 발현시켰을 경우 두 단백질 모두 정상적인 구조의 발현되지만, CCN5-SERCA2a의 순서로 발현시켰을 경우 CCN5 단백질에 이어 해독되는 SERCA2a 단백질이 원래의 토폴로지(topology)와 반대의 비정상적 단백질이 생성될 수 있음을 시사한다.
I. 심부전 치료 효과 확인
본 발명의 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드; 및 SERCA2a 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스의 심부전 치료효과를 확인하기 위해, 여러 병인으로 심부전을 유발시킨 마우스를 이용하였다.
심부전 유발 마우스는 마우스의 심부전 모델인 허혈-재관류 손상(Ischemia-Reperfusion injury) 유도 심부전, 횡행 대동맥 수축(Transverse Aortic Constriction) 유도 심부전, 안지오텐신 II(Angiotensin II) 유도 심부전 모델을 제작하였다. 상기 심부전 유발 마우스를 AAV9-Contrl, AAV9-SERCA2a 투여군, AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5으로 나누어 심부전 치료효과를 비교하였다.
실험예 1. 허혈-재관류 손상(Transmural ischemia-reperfusion injury) 심부전 유도 마우스에서의 심부전 치료효과 확인
실험예 1.1. 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스 제작 및 재조합 바이러스 투여
8주령 내지 10주령의 B6C3F1 마우스에 Ketamine(95 ㎎/㎏)과 xylazine (5mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시키고 수술을 진행하였다. 좌전하행 관상동맥 (Left anterior descending coronary artery)에 1 ㎜ 직경의 PE10 튜빙(polyethylene 10 tubing)을 혈관 상단에 두고 묶음으로써 허혈을 유도하였다. 30분 후 묶음을 풀고 PE10 튜빙을 제거하여 재관류를 유도하였다. 재관류를 유도함과 동시에 각 마우스에 1x1011 vg(viral genome)의 AAV9-Control, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5를 꼬리정맥을 통하여 주입하였다. 4주 후에 심근기능 측정 및 조직분석을 실시하였다(도 3).
실험예 1.2. CCN5 단백질 및/또는 SERCA2a 단백질 발현 확인
먼저, 바이러스 유전체의 효과적인 전달 결과를 확인하기 위해, SERCA2a 단백질과 CCN5의 단백질 발현을 실험방법 2과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
그 결과, AAV9-Control 투여군과 비교하여, AAV9-CCN5 투여군에서 CCN5 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였으며, AAV9-SERCA2a 투여군에서 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다. 또한, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서도 CCN5 단백질 및 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다(도 4a 내지 도 4c).
실험예 1.3. 심장 경색부위 감소 효과 확인
또한, 허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스의 심장을 적출하여 심장사진 촬영 및 실험방법 3와 동일한 방법으로 조직을 염색하였다.
그 결과, AAV9-Control 투여군의 경색부위(Infarct Area) 와 비교하였을 때, AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군 및 AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군의 경색부위 크기가 유의미하게 감소하였다. 특히, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군의 경색부위 크기가 현저하게 감소하였다(도 5 및 도 6). 또한, 전체 심장부위에서 경색부위의 비율을 정량화하여 나타낸 그래프에서도 AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서 경색부위의 비율이 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 7).
실험예 1.4. 심장 수축력 증가효과 확인
실제로 심장조직의 형태학적인 변화가 심장의 수축력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 심초음파 분석실험(Echocardiography) 및 혈류역학분석(Hemodynamics)을 진행하였다.
심장 수축력의 바로미터인 수축분율(Fractional shortening, FS)을 측정하기 위해 실험방법 4와 동일한 방법으로 심초음파 분석을 진행하였다. 그 결과, 허혈-재관류 손상으로 인해 감소된 수축분율이 AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군, 및 AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서 각각 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서는 현저하게 수축분율이 증가하였다(도 8).
또한, 심장 수축력을 정밀하게 분석하기 위해, 실험방법 5과 동일한 방법으로 혈류역학을 분석하였다. 그 결과, 수축기 심근력의 척도인 ESPVR(end-systolic pressure volume relationship)의 경우 허혈-재관류 손상에 의해 감소하였으며, AAV9-SERCA2a 투여군에서 유의미하게 ESPVR가 증가하였지만, AAV9-CCN5 투여군에서는 유의미하게 증가되지 않았다. 이는 CCN5의 연구에서 알려진 바와 동일한 현상으로 CCN5가 심부전에 영향을 미치지 못한다는 사실을 뒷받침한다. 또한, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서는 ESPVR가 현저하게 증가하였다(도 9a).
또한, 이완기 심근력의 척도인 EDPVR(end-diastolic pressure volume relationship)의 경우 허혈-재관류 손상에 의해 상승하는 것을 확인하였으며, AAV9-CCN5 투여군에서는 EDPVR가 유의미하게 감소하였지만, AAV9-SERCA2a 투여군에서는 유의미한 감소하지 않았다. 이는 선행연구 결과와 같은 실험결과로서 SERCA2a단백질이 이완기 심부전에 영향을 미치지 못한다는 사실을 뒷받침한다. 또한, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서는 EDPVR가 현저하게 감소하였다(도 9b).
이를 통해, AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a의 병용투여에 따른 상승적인 치료효과를 확인하였다.
실험예 2. 횡행 대동맥 수축(Transverse Aortic Constriction) 심부전 유도 마우스에서의 심부전 치료효과 확인
실험예 2.1. 횡행 대동맥 수축 심부전 유도 마우스 제작 및 재조합 바이러스 투여
8주령 내지 10주령의 B6C3F1 Ketamine(95 ㎎/㎏)과 xylazine (5 ㎎/㎏)을 복강내 주사하여 마취시키고 수술을 진행하였다. 근위 흉골 2 내지 3 ㎜를 세로 절개하여 대동맥궁의 시야를 확보하였다. 그 후, 무명동맥과 경동맥 사이를 27 게이지 바늘로 연결한 후 묶고 바늘을 제거함으로써 경칩을 유도하였다. 경칩으로 심부전을 유도하고 8주 후 각 마우스에 1x1011 vg의 AAV9-Control, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a 또는 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5를 꼬리정맥을 통하여 주입하였다. 8주 후에 심근기능 측정 및 조직분석을 실시하였다(도 10).
실험예 2.2. CCN5 단백질 및/또는 SERCA2a 단백질 발현 확인
먼저, 바이러스 유전체의 효과적인 전달 결과를 확인하기 위해 SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현을 실험방법 2과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 그 결과, AAV9-Control 투여군과 비교하여, AAV9-CCN5 투여군에서 CCN5 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였으며, AAV9-SERCA2a 투여군에서 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다. 또한, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서도 CCN5 단백질 및 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다(도 11a 내지 도 11c).
실험예 2.3. 심장 내강 크기 감소 효과 확인
허혈-재관류 손상 심부전 유도 마우스의 심장을 적출하여 실험방법 3와 동일한 방법으로 심장조직을 Masson-trichrome 염색하였다. 그 결과, AAV9-Control 투여군의 심장의 내강 크기가 증가한 것을 확인하였으며, AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군 및 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 심장의 내강 크기가 감소한 것을 확인하였다. 특히, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 현저히 줄어든 내강 크기를 확인하였다. 또한, 심부전에 의한 심장섬유화 정도도 AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군 및 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 감소한 것을 확인하였다(도 12).
실험예 2.4. 심장 수축력 증가효과 확인
실제로 심장조직의 형태학적인 변화가 심장의 수축력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 심초음파 분석실험(Echocardiography) 및 혈류역학분석(Hemodynamics)을 진행하였다.
심장 수축력의 바로미터인 수축분율(Fractional shortening, FS)을 측정하기 위해 실험방법 4와 동일한 방법으로 심초음파 분석을 진행하였다. 그 결과, 대동맥 수축으로 인해 감소된 수축분율이 AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군, 및 AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서 각각 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 현저하게 수축분율이 증가하였다(도 13).
또한, 심장 수축력을 정밀하게 분석하기 위해, 실험방법 5과 동일한 방법으로 혈류역학을 분석하였다. 그 결과, 수축기 심근력의 척도인 ESPVR(end-systolic pressure volume relationship)의 경우 대동맥 수축에 의해 감소하였으며, AAV9-SERCA2a 투여군에서 유의미하게 ESPVR가 증가하였지만, AAV9-CCN5 투여군에서는 유의미하게 증가되지 않았다. 또한, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 ESPVR가 현저하게 증가하였다(도 14a).
또한, 이완기 심근력의 척도인 EDPVR(end-diastolic pressure volume relationship)의 경우 허혈-재관류 손상에 의해 상승하는 것을 확인하였으며, AAV9-CCN5 투여군에서는 EDPVR가 유의미하게 감소하였지만, AAV9-SERCA2a 투여군에서는 유의미한 감소하지 않았다. 또한, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 EDPVR가 현저하게 감소하였다(도 14b). 이를 통해, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5의 상승적인 치료효과를 확인하였다.
실험예 3. 안지오텐신 II(Ang II) 주입 심부전 유도 마우스에서의 심부전 치료효과 확인
실험예 3.1. 안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스 제작 및 재조합 바이러스 투여
8주령 내지 10주령의 B6C3F1 Ketamine(95 ㎎/㎏)과 xylazine (5 ㎎/㎏)을 복강내 주사하여 마취시키고 안지오텐신 II(Angiotensin II, Ang II)를 피하에 주입하는 방법으로 심부전을 유도하였다. 삼투성 소형 펌프(Alzet 1002, Alzet)을 이용하여 안지오텐신 II를 하루에 3 ㎎/㎏의 농도로 2주동안 피하에 주입하였다. Ang II로 심부전을 유도하고 2주 후 각 마우스에 1x1011 vg의 AAV9-Control, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a 또는 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5를 꼬리정맥을 통하여 주입하였다. 4주 후에 심근기능 측정 및 조직분석을 실시하였다(도 15).
실험예 3.2. CCN5 단백질 및/또는 SERCA2a 단백질 발현 확인
먼저, 바이러스 유전체의 효과적인 전달 결과를 확인하기 위해, SERCA2a 단백질과 CCN5 단백질의 발현을 실험방법 2과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
그 결과, AAV9-Control 투여군과 비교하여, AAV9-CCN5 투여군에서 CCN5 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였으며, AAV9-SERCA2a 투여군에서 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다. 또한, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서도 CCN5 단백질 및 SERCA2a 단백질의 발현이 유의미하게 증가된 것을 확인하였다(도 16a 내지 도 16c).
실험예 3.3. 심장 내강 크기 감소효과 및 내벽두께 변화 확인
안지오텐신 II 주입 심부전 유도 마우스의 심장을 적출하여 실험방법 3와 동일한 방법으로 심장조직을 Masson-trichrome 염색하였다.
그 결과, AAV9-Control 투여군의 심장의 내강 크기가 증가한 것을 확인하였으며, AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군 및 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 심장의 내강 크기가 감소한 것을 확인하였다. 특히, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 현저히 줄어든 내강 크기를 확인하였다(도 17).
또한, 심장 내벽두께를 측정하기 위해 실시예 6과 동일한 방법으로 심장초음파분석을 진행하였다. 심장 내벽두께의 변화를 정량화하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 안지오텐신 II 주입으로 인해 심장 내벽두께가 감소한 것을 확인하였으며, AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군 및 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 심장 내벽두께가 유의미하게 증가한 것을 확인하였다(도18).
실험예 3.4. 심장 수축력 증가효과 확인
실제로 심장조직의 형태학적인 변화가 심장의 수축력에 영향을 미치는지 확인하기 위해 심초음파 분석실험(Echocardiography) 및 혈류역학분석(Hemodynamics)을 진행하였다.
심장 수축력의 바로미터인 수축분율(Fractional shortening, FS)을 측정하기 위해 실험방법 4와 동일한 방법으로 심초음파 분석을 진행하였다. 그 결과, 대동맥 수축으로 인해 감소된 수축분율이 AAV9-CCN5 투여군, AAV9-SERCA2a 투여군, 및 AAV9-CCN5 및 AAV9-SERCA2a 병용투여군에서 각각 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 투여군에서 현저하게 수축분율이 증가하였다(도 19). 이를 통해 AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5의 상승적인 치료효과를 확인하였다.
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Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp Gly 785 790 795 800 Leu Pro Ala Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile Met 805 810 815 Asn Lys Pro Pro Arg Asn Pro Lys Glu Pro Leu Ile Ser Gly Trp Leu 820 825 830 Phe Phe Arg Tyr Leu Ala Ile Gly Cys Tyr Val Gly Ala Ala Thr Val 835 840 845 Gly Ala Ala Ala Trp Trp Phe Ile Ala Ala Asp Gly Gly Pro Arg Val 850 855 860 Ser Phe Tyr Gln Leu Ser His Phe Leu Gln Cys Lys Glu Asp Asn Pro 865 870 875 880 Asp Phe Glu Gly Val Asp Cys Ala Ile Phe Glu Ser Pro Tyr Pro Met 885 890 895 Thr Met Ala Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Cys Asn Ala Leu 900 905 910 Asn Ser Leu Ser Glu Asn Gln Ser Leu Leu Arg Met Pro Pro Trp Glu 915 920 925 Asn Ile Trp Leu Val Gly Ser Ile Cys Leu Ser Met Ser Leu His Phe 930 935 940 Leu Ile Leu Tyr Val Glu Pro Leu Pro Leu Ile Phe Gln Ile Thr Pro 945 950 955 960 Leu Asn Val Thr Gln Trp Leu Met Val Leu Lys Ile Ser Leu Pro Val 965 970 975 Ile Leu Met Asp Glu Thr Leu Lys Phe Val Ala Arg Asn Tyr Leu Glu 980 985 990 Pro Ala Ile Leu 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Leu Val Cys Gln Pro 65 70 75 80 Gly Ala Gly Pro Gly Gly Arg Gly Ala Leu Cys Leu Leu Ala Glu Asp 85 90 95 Asp Ser Ser Cys Glu Val Asn Gly Arg Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Thr 100 105 110 Phe Gln Pro His Cys Ser Ile Arg Cys Arg Cys Glu Asp Gly Gly Phe 115 120 125 Thr Cys Val Pro Leu Cys Ser Glu Asp Val Arg Leu Pro Ser Trp Asp 130 135 140 Cys Pro His Pro Arg Arg Val Glu Val Leu Gly Lys Cys Cys Pro Glu 145 150 155 160 Trp Val Cys Gly Gln Gly Gly Gly Leu Gly Thr Gln Pro Leu Pro Ala 165 170 175 Gln Gly Pro Gln Phe Ser Gly Leu Val Ser Ser Leu Pro Pro Gly Val 180 185 190 Pro Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys 195 200 205 Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg 210 215 220 Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe 245 250 <210> 4 <211> 750 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag 60 gtgcgtaccc agctgtgccc 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from equine rhinitis A virus (ERAV) <400> 10 ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60 cctggacct 69 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> self-cleavage sequence derived from FMDV 2A <400> 11 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 12 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> self-cleavage sequence derived from FMDV 2A <400> 12 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gacct 75 <210> 13 <211> 2994 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggagaacg cgcacaccaa gacggtggag gaggtgctgg gccacttcgg cgtcaacgag 60 agtacggggc tgagcctgga acaggtcaag aagcttaagg agagatgggg ctccaacgag 120 ttaccggctg aagaaggaaa aaccttgctg gaacttgtga ttgagcagtt tgaagacttg 180 ctagttagga ttttattact ggcagcatgt atatcttttg ttttggcttg gtttgaagaa 240 ggtgaagaaa caattacagc ctttgtagaa ccttttgtaa ttttactcat attagtagcc 300 aatgcaattg tgggtgtatg 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cgcttctgcc gactggagac ccagcgccgc ctgtgcctgt ccaggccctg cccaccctcc 720 aggggtcgca gtccacaaaa cagtgccttc tag 753

Claims (27)

  1. (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드; 및 (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 SERCA2a 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 SERCA2a 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 서열인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 CCN5 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 4로 표시되는 서열인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (i)와 (ii)의 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치하는 자가-절단(self-cleavage) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 자가-절단(self-cleavage) 서열은 Porcine teschovirus-1, Thoseaasigna virus, equine rhinitis A virus 또는 Foot-and-mouth disease virus에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 자가-절단 서열은 Porcine teschovirus-1에서 유래한 2A 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 것인, 유전자 컨스트럭트.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 자가-절단 서열은 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트에 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 (i)-(ii)의 순서로 (i) 및 (ii)의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 유전자 컨스트럭트.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV(cytomegalo virus)프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 근육과 심장제한 합성 프로모터(Synthetic muscle- and Cardiac-restricted promoter)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트가 적재된 재조합 발현벡터.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 코스미드 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 재조합 발현벡터.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 바이러스는 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 재조합 바이러스.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 바이러스는 아데노-부속 바이러스 바이러스인 것을 특징으로 하는, 재조합 바이러스.
  18. 제1항의 유전자 컨스트럭트, 제13항의 재조합 발현벡터 또는 제15항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법.
  20. SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스; 및 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 심부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 개체에 투여하는 단계; 및
    (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 적재된 발현벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 (i) 및 (ii) 단계의 투여가 동시에 진행되는 것을 특징으로 하는, 심부전 예방 또는 치료방법.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 (i) 또는 (ii) 단계 투여 후 소정의 시간 간격을 두고 나머지 단계의 투여를 진행하는 것을 특징으로 하는, 심부전 예방 또는 치료방법.
  25. (i) SERCA2a 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 투여하는 단계; 및
    (ii) CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 심부전 예방 또는 치료방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 (i) 및 (ii) 단계의 투여가 동시에 진행되는 것을 특징으로 하는, 심부전 예방 또는 치료방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 (i) 또는 (ii) 단계 투여 후 소정의 시간 간격을 두고 나머지 단계의 투여를 진행하는 것을 특징으로 하는, 심부전 예방 또는 치료방법.
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