CN113905762A

CN113905762A - 特发性肺纤维化的药物靶点

Info

Publication number: CN113905762A
Application number: CN201980096731.1A
Authority: CN
Inventors: 汤楠; 武慧娟
Original assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin
Current assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2022-01-07
Also published as: AU2024201372A1; AU2019448656C1; EP3976110A4; AU2019448656A1; US20220275055A1; JP2023133615A; AU2019448656B2; EP3976110A1; WO2020237588A1; CA3141918A1; JP2022535797A; KR20220011680A

Abstract

本发明提供了一种用于特发性肺纤维化的药物靶点及其用途。所述药物靶点是肺的AT2细胞中的AREG信号传导。所述药物靶点可用于筛选治疗和/或预防动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物。

Description

特发性肺纤维化的药物靶点

背景技术

纤维化是由损伤引起的结缔组织的增厚和瘢痕化，其特征在于成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质(ECM)成分的积累。这种疾病通常在包括肺、肝和肾等器官中观察到，会导致组织结构破坏，并导致器官功能的严重受损^1,2。事实上，纤维化几乎可以在每个器官中发生，并且是多种慢性疾病的终末期器官衰竭和死亡的主要原因³。肺纤维化的一个共同特点是肺的气囊(肺泡)周围的成纤维细胞过度增殖⁴。广泛的生物医学研究已确定，成纤维细胞数量的增加加上它们在肺中过多的ECM沉积，最终导致肺泡结构破坏，肺顺应性降低，并破坏气体交换功能^5-7。

最常见的肺纤维化类型是特发性肺纤维化(IPF)。这种障碍最终会影响整个肺叶，但它始于发生在外围区域的微小纤维化病变，并缓慢向内进展，这种纤维化最终可导致呼吸衰竭^8,9。IPF是一种致死性疾病，从诊断之时起的中位生存时间仅为2～4年¹⁰。从科学上讲，IPF的病理进展的机制和本质尚未被完全了解，但多项研究已表明来自肺泡上皮细胞的特定亚群——肺泡II型(AT2)细胞对IPF发病具有作用^4,11。

肺纤维化患者的肺顺应性降低，气体交换被破坏，最终导致呼吸衰竭和死亡。据估计，在美国，每200名65岁以上的成年人中就有1名患有IPF，中位生存时间为2～4年。在中国，IPF的发病率估计为3～5/100,000，约占所有间质性肺病的65％。诊断通常在50至70岁之间，男女之比为1.5至2:1。患者的生存时间通常只有2～5年。

目前，IPF无法治愈。两种已知的药物，尼达尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone)对用力肺活量在超过一年的降低率上具有相似的作用。尽管两种药物都显示出降低死亡率的趋势，但这两种药物未显示出能显著增加生存时间。主要原因之一是目前尚无肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的理想药物靶点，以便筛选治疗肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的候选药物。

发明内容

本发明涉及用于特发性肺纤维化的药物靶点及其用途。所述药物靶点是肺的AT2细胞中的AREG信号传导。所述药物靶点可用于筛选来治疗和/或预防动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物。本发明还提供了一种使用所述药物靶点筛选用于治疗动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的候选药物的方法。

首先，本发明提供了一种用于特发性肺纤维化的药物靶点。所述药物靶点是肺的AT2细胞中的AREG信号传导，其在后文中被称为AREG靶点。

在本发明中发现，在所有IPF样本的AT2细胞中检测到AREG，但在对照肺的AT2细胞中未检测到AREG。

在本发明中发现，在进行或未进行PNX的受试者的对照肺中，不能检测到AREG信号。在进行或未进行PNX的受试者的对照肺的AT2细胞中，不能检测到AREG信号。

在本发明中还进一步发现，在Cdc42 AT2基因无效的肺的AT2细胞中，可以检测到AREG。在PNX后，Cdc42 AT2基因无效肺的肺中，AREG的表达水平逐渐升高。

因此，在进行性纤维化小鼠模型和肺纤维化患者的AT2细胞中，AREG的表达水平均被显著上调。

在本发明中还发现，AT2细胞中的AREG的过表达足以诱导肺纤维化。

优选地，AT2细胞中的AREG的异位表达足以诱导肺纤维化。

优选地，所述AREG靶点是来自于受试者肺的AT2细胞中的AREG。

优选地，所述AREG靶点是来自于受试者肺的AT2细胞中的AREG的受体。

优选地，所述AREG靶点是来自于受试者肺的成纤维细胞中的EGFR。

本发明证实，α-SMA阳性的成纤维细胞中的EGFR信号传导的强度取决于AT2细胞中的AREG的表达。

本发明证实，降低受试者肺的AT2细胞中的AREG表达水平，显著减弱Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺纤维化的发展。

因此，本发明表明AREG及其受体EGFR是治疗纤维化的治疗靶点。

其次，本发明提供了一种产生Areg AT2过表达的转基因小鼠的方法，其中AREG在肺AT2细胞中特异性过表达。

优选地，所述方法包括，在强力霉素处理后，在AT2细胞中特异性诱导Areg表达的步骤。优选地，所产生的转基因小鼠是Spc-rtTA；teto-Areg小鼠。优选地，所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠具有由SEQ ID NO：18示出的特征序列。

优选地，可以使用下述引物序列进行鉴定所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

第三，本发明提供了一种转基因小鼠，其中AREG在肺的AT2细胞中特异性过表达。所述小鼠是Areg AT2过表达的转基因小鼠。

优选地，在所述转基因小鼠中，经强力霉素处理后，Areg的表达在AT2细胞中被特异性诱导。优选地，所述转基因小鼠是Spc-rtTA；teto-Areg小鼠。优选地，所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠具有由SEQ ID NO：18示出的特征序列。

优选地，所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠可以使用下述引物序列进行鉴定：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

第四，本发明提供了肺的AT2细胞中的AREG和/或它在成纤维细胞中的受体EGFR，作为治疗动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物靶点的用途。

第五，本发明提供了AREG靶点或上述转基因小鼠，在用于筛选治疗动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。

第六，本发明提供了AREG的检测剂和/或其受体EGFR的检测剂，在制造诊断动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的诊断试剂盒中的用途。

优选地，所述试剂盒可用于来自疑似患有肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的受试者的样品。所述样品可以是活检组织。例如，活检组织可以是所述受试者的肺组织。优选地，所述活检组织可以是受试者肺叶的下部、中部或上部。如果可以在受试者肺叶的上部检测到AREG，则所述受试者可以被诊断为患有严重的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)。最常见的肺纤维化类型被认为是特发性肺纤维化，其中纤维化病变始于肺叶的外围，并朝肺叶的中心发展，然后是肺叶的上部，并最终导致呼吸衰竭。

第七，本发明提供了靶向肺的AT2细胞中的AREG和/或其受体(例如成纤维细胞中的EGFR)的物质，在制造治疗动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。

优选地，所述物质是肺的AT2细胞中的AREG的抑制剂，或肺的成纤维细胞中的EGFR的抑制剂。

所述动物可以是小鼠、兔、大鼠、犬、猪、马、奶牛、绵羊、猴或黑猩猩。

本发明涵盖了本文中叙述的特定实施方式的所有组合。

附图说明

图1显示构建AT2细胞中的Cdc42基因被特异性缺失的小鼠品系。

图2显示AT2细胞中的Cdc42基因的外显子2缺失之前和之后的Cdc42 DNA序列的片段。

图3显示AT2细胞中Cdc42基因的缺失，在PNX后肺泡再生或肺泡稳态期间损害AT2细胞的分化。

图4显示AT2细胞中Cdc42的缺失，导致经PNX处理后的小鼠发生进行性肺纤维化。

图5显示AT2细胞中Cdc42的缺失，导致未经PNX处理的老年小鼠进行性肺纤维化。

图6显示在Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺中，α-SMA⁺成纤维细胞灶的发展。

图7显示在Cdc42 AT2基因无效的肺的AT2细胞中有AREG强烈且特异性的表达。

图8显示在人类肺纤维化患者的AT2细胞中，有AREG强烈且特异性的表达。

图9显示teto-Areg的序列。

图10显示在强力霉素处理后，Areg的表达在Spc-rtTA；teto-Areg小鼠的AT2细胞中被特异性诱导了。在AT2细胞中过表达AREG足以诱导肺纤维化。

图11显示在缺失AT2细胞中的Areg基因的外显子3之前和之后的Areg DNA序列的片段。

图12显示在Cdc42 AT2基因无效的肺的AT2细胞中，Areg基因的缺失显著减弱了肺纤维化的发展。

图13显示靶向AREG及其受体EGFR，以便治疗IPF和其他纤维化疾病。

具体实施方式

特定实施方式和实例的描述是通过说明而不是限制的方式提供。本领域技术人员将会容易地认识到可以对各种不同的非关键性参数进行改变或修改，以产生基本上相似的结果。

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性肺病，其特征是肺功能的进行性且不可逆的下降。症状通常包括逐渐出现呼吸短促和干咳。其他变化可能包括感觉疲倦和杵状指。并发症可能包括肺动脉高压、心力衰竭、肺炎或肺栓塞。

肺的肺泡上皮由I型(AT1)和II型(AT2)肺泡细胞的组合组成。AT2细胞是肺泡干细胞，并且可以在肺泡稳态和损伤后修复期间分化成AT1细胞^12,13。最终构成成人肺中几乎95％的肺泡表面的AT1细胞是大的鳞状细胞，起到薄的气血屏障的上皮部分的作用¹⁴。在IPF组织中，异常增生的AT2细胞通常位于成纤维细胞灶附近¹⁵，并且临床中，在IPF组织中经常发现影响AT2细胞功能的基因突变^16,17。此外，最新进展通过鉴定IPF肺的分子表达谱发现，在IPF肺的AT2细胞中，TGFβ信号传导(许多纤维化疾病中共同的纤维化信号传导)被激活了¹⁸。这些多方面的证据合在一起证明了AT2细胞在肺纤维化中具有明显的病理学影响，但AT2生理异常和进行性肺纤维化的确切病理机制仍有待阐明。

在给动物用药他莫昔芬(tamoxifen)后，Sftpc基因启动子驱动的重组酶(Spc-CreER)特异性缺失AT2细胞中的基因。CreER小鼠系统常用于诱导性基因敲除的研究。

双调蛋白(AREG)是表皮生长因子家族的成员。AREG合成为膜锚定的前体蛋白，它可以作为近分泌因子直接作用于相邻细胞。在通过细胞膜蛋白酶(TACE/ADAM17)的蛋白水解处理后，AREG被分泌出来并发挥自分泌或旁分泌因子的作用。AREG是表皮生长因子受体(EGFR)的配体，EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶。通过与EGFR结合，AREG可以激活控制细胞存活、增殖和分化的重要的细胞内信号传导级联^19-21。

在生理上，AREG在乳腺、骨骼组织和卵母细胞的发育和成熟中发挥重要作用^20,22。在正常条件下，AREG在除胎盘之外的成年组织中只有低表达水平。然而，AREG表达的慢性升高被显示与某些病理状况相关。AREG的表达升高与银屑病样皮肤表型和某些炎性病症相关²³。多项研究描述了AREG在肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和前列腺癌，以及一些血液和间充质癌中的致癌活性^24,25。此外，AREG可能参与对几种癌症治疗的耐受性^26,27。

研究表明，在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，TGFβ可以激活AREG的表达²⁸。已显示，在肝纤维化、囊性纤维化和多囊肾病中，AREG的表达水平升高²³。因此可以假设在这些纤维化疾病、特别是特发性肺纤维化(IPF)期间，AREG可能促进纤维发生细胞的生长和存活。然而从科学上讲，IPF的病理进展的机制和本质尚未被完全了解²⁹。尽管推测AREG可能在IPF发展中发挥作用，但在进行性肺纤维化过程中表达AREG的细胞仍然是未知的。此外，由于缺乏进行性肺纤维化小鼠模型，在进行性肺纤维化中靶向AREG的作用也是未知的。

在本发明的一个实施方式中，显示了在进行或未进行PNX的受试者的对照肺中检测不到AREG信号，并且进一步，在进行或未进行PNX的受试者的对照肺的AT2细胞中检测不到AREG信号。

在本发明的一个实施方式中，显示了在经PNX处理的Cdc42 AT2基因无效的肺或老年Cdc42 AT2基因无效的小鼠的AT2细胞中可以检测到AREG。在PNX后，在Cdc42 AT2基因无效肺的肺中，AREG表达水平逐渐升高，值得注意的是，在所有IPF样本的AT2细胞中都检测到AREG。因此，本发明首次显示了，在进行性纤维化小鼠模型和肺纤维化患者的AT2细胞中，AREG的表达水平被显著上调。

在本发明的一个实施方式中，产生了转基因小鼠，在该转基因小鼠中，AREG在肺的AT2细胞中特异性过表达。所述转基因小鼠在肺中具有明显的纤维化变化。

在本发明的一个实施方式中，产生了转基因小鼠，在该转基因小鼠中，Areg基因和Cdc42基因均是无效(null)的。这种转基因小鼠是Areg&Cdc42 AT2双重基因无效小鼠。与在Cdc42 AT2基因无效的肺中出现显著肺纤维化相比，Areg&Cdc42 AT2双重基因无效小鼠的肺在PNX后第21天显示出极少纤维化。因此，降低AREG的表达水平显著减弱了Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺纤维化的发展。因此，本发明提出，AREG及其受体EGFR是治疗纤维化的治疗靶点。AREG指肺的AT2细胞中的AREG，EGFR指肺的成纤维细胞上的EGFR。

在本发明的一个实施方式中，显示了阻断AREG及其受体EGFR可以是治疗IPF和其他纤维化疾病的治疗方法。

实施例

方法

小鼠和存活曲线记录

之前已经描述了Rosa26-CAG-mTmG(Rosa26-mTmG)和Cdc42^flox/flox小鼠³⁰。所有实验均按照国立生物科学研究所实验动物护理和使用指南中的建议进行。为了监测小鼠的存活率，在PNX处理后，每周对对照和Cdc42 AT2基因无效小鼠进行称重。一旦小鼠达到预先确定的终点标准，就将小鼠处死。我们根据预先确定的标准定义终点^31,32。

构建Spc-CreER；rtTA(Spc-CreER)敲入小鼠。将CreERT2、p2a和rtTA元件通过酶法连接并插入到小鼠的内源Sftpc基因中。插入位点是内源Sftpc基因的终止密码子，然后在rtTA的3’末端处创建新的终止密码子。使用CRISPR/Cas9技术，将CreERT2-p2a-rtTA片段插入到基因组中。

构建Areg^flox/flox小鼠

按照以前的工作构建Areg^flox/flox小鼠³³。简而言之，通过loxp锚定Areg外显子3。将loxp1(GACACGGATCCATAACTTCGTATAATG TATGCTATACGAAGTTATCGAGTC(SEQ ID NO：3))插入到Areg DNA的第3704位中，并将loxp2(CCGCGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACTAGTCCAACG(SEQ ID NO：4))插入到Areg DNA的第4208位中。在他莫昔芬诱导的Cre-loxP重组后，将Areg基因的外显子3缺失，从而阻断AREG的功能。

构建teto-Areg小鼠

将四环素响应元件插入到CMV启动子驱动的Areg之前，当用强力霉素(Dox)处理小鼠时可以诱导Areg的表达。四环素响应元件的序列显示如下：

5’TCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGA3’(SEQ ID NO：5)。

在Areg cDNA之前插入极小CMV启动子，以使Areg过表达。CMV启动子的序列显示如下：

5’GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGC CTATATAAGCAGAGCT3’(SEQ ID NO：6)。

Areg cDNA的序列显示如下：

5’ATGAGAACTCCGCTGCTACCGCTGGCGCGCTCAGTGCTGTTGCTGCTGGTCTTAGGCTCAGGCCATTATGCAGCTGCTTTGGAGCTCAATGACCCCAGCTCAGGGAAAGGCGAATCGCTTTCTGGGGACCACAGTGCCGGTGGACTTGAGCTTTCTGTGGGAAGAGAGGTTTCCACCATAAGCGAAATGCCTTCTGGCAGTGAACTCTCCACAGGGGACTACGACTACTCAGAGGAGTATGATAATGAACCACAAATATCCGGCTATATTATAGATGATTCAGTCAGAGTTGAACAGGTGATTAAGCCCAAGAAAAACAAGACAGAAGGAGAAAAGTCTACAGAAAAACCCAAAAGGAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAGGCAGAAGGAATAAGAAGAAAAAGAATCCATGCACTGCCAAGTTTCAGAACTTTTGCATTCATGGCGAATGCAGATACATCGAGAACCTGGAGGTGGTGACATGCAATTGTCATCAAGATTACTTTGGTGAACGGTGTGGAGAAAAATCCATGAAGACTCACAGCGAGGATGACAAGGACCTATCCAAGATTGCAGTAGTAGCTGTCACTATCTTTGTCTCTGCCATCATCCTCGCAGCTATTGGCATCGGCATCGTTATCACAGTGCACCTTTGGAAACGATACTTCAGGGAATATGAAGGAGAAACAGAAGAAAGAAGGAGGCTTCGACAAGAAAACGGGACTGTGCATGCCATTGCCTAG3’(SEQ ID NO：7)。

将四环素响应元件、CMV启动子和Areg cDNA通过酶法连接并插入到小鼠基因组中。teto-Areg的序列显示如下：

5’TCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGAGAACTCCGCTGCTACCGCTGGCGCGCTCAGTGCTGTTGCTGCTGGTCTTAGGCTCAGGCCATTATGCAGCTGCTTTGGAGCTCAATGACCCCAGCTCAGGGAAAGGCGAATCGCTTTCTGGGGACCACAGTGCCGGTGGACTTGAGCTTTCTGTGGGAAGAGAGGTTTCCACCATAAGCGAAATGCCTTCTGGCAGTGAACTCTCCACAGGGGACTACGACTACTCAGAGGAGTATGATAATGAACCACAAATATCCGGCTATATTATAGATGATTCAGTCAGAGTTGAACAGGTGATTAAGCCCAAGAAAAACAAGACAGAAGGAGAAAAGTCTACAGAAAAACCCAAAAGGAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAGGCAGAAGGAATAAGAAGAAAAAGAATCCATGCACTGCCAAGTTTCAGAACTTTTGCATTCATGGCGAATGCAGATACATCGAGAACCTGGAGGTGGTGACATGCAATTGTCATCAAGATTACTTTGGTGAACGGTGTGGAGAAAAATCCATGAAGACTCACAGCGAGGATGACAAGGACCTATCCAAGATTGCAGTAGTAGCTGTCACTATCTTTGTCTCTGCCATCATCCTCGCAGCTATTGGCATCGGCATCGTTATCACAGTGCACCTTTGGAAACGATACTTCAGGGAATATGAAGGAGAAACAGAAGAAAGAAGGAGGCTTCGACAAGAAAACGGGACTGTGCATGCCATTGCCTAG3’(SEQ ID NO：18)。

在Spc-rtTA；teto-Areg小鼠中，在强力霉素处理后，在AT2细胞中特异性诱导Areg的表达。

用于对teto-Areg序列进行测序的引物序列：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

肺切除术(PNX)

8周龄雄性小鼠，每隔一天注射一次他莫昔芬(剂量：75mg/kg)，共注射4次。在注射最后一剂量他莫昔芬后的第14天，将小鼠麻醉并连接到呼吸机(Kent Scientific,Topo)。在第四肋间处切开胸壁并去除左肺叶。

肺功能测试

使用侵入性肺功能测试系统(DSI

PFT控制器)测量肺功能参数。首先将小鼠麻醉，然后将气管内插管插入到它们的气管中。从阻力和顺应性测试获得动脉顺应性结果。从压力容积测试获得用力肺活量结果。

苏木精和曙红(H&E)染色和免疫染色

将肺用4％多聚甲醛(PFA)充盈，并在4℃，在4％PFA中连续固定24小时。然后将肺在30％蔗糖中进行冷冻保护并包埋在OCT(Tissue Tek)中。

H&E染色实验遵循标准的H&E方案。简单来说，将载片用水清洗以除去OCT。将细胞核用苏木精(Abcam,ab150678)染色2分钟，并将细胞质用曙红(Sigma,HT110280)染色3分钟。在脱水和澄清步骤后，将切片用中性树脂密封。

免疫荧光染色实验遵循以前描述的方案³⁴。简单来说，在除去OCT后，将肺切片用3％BSA/0.1％TritonX-100/PBS封闭1小时，然后将切片与一抗在4℃孵育过夜。在载片用0.1％TritonX-100/PBS清洗3次后，将载片与二抗在室温孵育2小时。

本文中使用的一抗如下所列：

本文中使用的二抗如下所列：

对于p-SMAD2染色实验来说，在组织固定过程中，在4％PFA中添加1×磷酸酶抑制剂(Bimake,B15002)。pSMAD2染色采用酪胺信号放大法。

将人类肺组织，在4℃，用4％PFA固定24小时，在30％蔗糖中进行冷冻保护并包埋在OCT中。所有实验均在北京生命科学研究所和北京中日友好医院两者的机构审查委员会的批准下进行。

统计分析。所有数据均被呈现为平均值±s.e.m.(如图例中所示)。图中呈现的数据收集自使用不同小鼠在不同日期进行的多个独立实验。除非另有说明，否则图中呈现的大部分数据均是基于至少三次独立实验。样品间差异的推断的统计学显著性使用双尾未配对学生(Student’s)t-检验来评估。

分离小鼠AT2细胞

在注射了4剂量的他莫昔芬后，如以前所述分离出Spc-CreER,Rosa26-mTmG小鼠的肺²³。简单来说，将麻醉小鼠用中性蛋白酶(Worthington-Biochem,LS02111)和DNase I(Roche,10104159001)充盈。在BD FACS Aria II和III装置中，使用单细胞选择模式，基于GFP荧光直接分选出AT2细胞。

定量RT-PCR(qPCR)

使用Zymo Research RNA小量制备试剂盒(R2050)，从全肺或原代AT2细胞分离总RNA。使用两步cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6210A/B)，按照制造商的建议进行反转录反应。qPCR使用CFX96 Touch^TM实时PCR检测系统进行。将靶基因的mRNA水平用Gapdh mRNA水平进行归一化。用于qPCR的引物如下所列。

用于qPCR的引物如下所列。

AREG ELISA

使用小鼠AREG免疫测定试剂盒(R&D Systems,DY989)，检测全肺裂解物的AREG浓度。具体来说，将整个肺叶在液氮中研磨，然后使用细胞裂解缓冲液裂解。然后将肺裂解物添加到使用的微孔板的孔中。在反应后，测量450nm处的吸光值。使用人类areg免疫测定试剂盒(abnova,B0RB01090J00018)，检测人类肺组织裂解物的AREG浓度。简单来说，将人类肺组织在液氮中研磨，然后使用细胞裂解缓冲液裂解。然后将肺裂解物添加到使用的微孔板的孔中。在反应后，测量450nm处的吸光值。所有实验均在北京生命科学研究所和北京中日友好医院两者的机构审查委员会的批准下进行。

用于对缺失Cdc42的外显子2之前和之后的Cdc42 DNA序列片段进行测序的引物序列：

正向：CTGCCAACCATGACAACCTAA(SEQ ID NO：1)；

反向：AGACAAAACAACAAGGTCCAG(SEQ ID NO：2)。

用于对缺失Areg的外显子3之前和之后的Areg DNA序列片段进行测序的引物序列：

正向：AAACAAAACAAGCTGAAATGTGG(SEQ ID NO：14)；

反向：AAGGCCTTTAAGAACAAGTTGT(SEQ ID NO：15)。

实施例1.Cdc42 AT2基因无效小鼠的构建和表征

为了构建进行性肺纤维化动物模型，通过在肺泡II型细胞(AT2)中特异性敲除Cdc42基因而产生了Cdc42 AT2基因无效小鼠。

为了特异性缺失AT2细胞中的Cdc42基因，将带有Spc-CreER等位基因的小鼠与Cdc42侧翼带有loxp位点(floxed)(Cdc42^flox/flox)小鼠杂交(图1A)。在Cdc42^flox/flox小鼠中，Cdc42基因的外显子2(其含有Cdc42基因的翻译起始外显子)的侧翼带有两个loxp位点。在Spc-CreER；Cdc42^flox/flox小鼠中，在他莫昔芬处理后，通过Cre/loxp介导的重组特异性缺失AT2细胞中的Cdc42基因的外显子2(图1B)。Spc-CreER；Cdc42^flox/flox小鼠被命名为Cdc42AT2基因无效小鼠。

图2中示出在缺失Cdc42基因的外显子2之前和之后，Cdc42 DNA序列的片段。

我们对对照和Cdc42 AT2基因无效小鼠进行了PNX，并在PNX后第21天分析了肺泡再生和AT2细胞的分化(图3A)。如图3A中所示，将对照和Cdc42 AT2基因无效小鼠的200μm肺切片，用针对GFP、Pdpn和Prospc的抗体进行免疫染色。在PNX后第21天，在未植入假体的对照肺中观察到许多新分化的AT1细胞和新形成的肺泡(图3B)。然而，在Cdc42 AT2基因无效肺中，在PNX后第21天，很少的AT2细胞分化成AT1细胞，并且没有新肺泡形成(图3B)。观察到，在Cdc42 AT2基因无效肺的外围区域中的肺泡被严重地过度拉伸(图3B)。

在正常稳态条件下，AT2细胞缓慢自我更新并分化成AT1细胞，以建立新的肺泡。为了检查Cdc42是否为稳态期间AT2细胞分化所需，我们在小鼠2月龄时缺失了AT2细胞中的Cdc42基因，并分析了直至小鼠12月龄时的AT2细胞的命运。在12个月时收集了对照和未进行PNX处理的Cdc42基因无效小鼠的肺(图3C)。图像示出了，用针对GFP、Pdpn和Prospc的抗体染色的最大强度的肺切片的200μm Z-投影。在12月龄对照小鼠的肺中，我们观察到许多新肺泡的形成(图3D)。然而，在12月龄Cdc42基因无效小鼠(未经历PNX)的肺中，我们观察到增大的肺泡，并且没有任何新AT1细胞的形成(图3D)。

在PNX后，对Cdc42 AT2基因无效和对照小鼠进行了更长时间的观察(图4A)。令人吃惊的是，在PNX后第21天，一些Cdc42 AT2基因无效小鼠显示出显著的体重减轻和呼吸率提高。事实上，在PNX后第60天，几乎50％的经PNX处理的Cdc42 AT2基因无效小鼠达到终点安乐死的预定健康状况标准(图4B)，并且到PNX后第180天，约80％的经PNX处理的Cdc42AT2基因无效小鼠达到它们的终点(图4B)。

对PNX后的对照和Cdc42 AT2基因无效小鼠的H&E染色揭示出，Cdc42 AT2基因无效小鼠在它们的终点时，肺中存在严重的纤维化(图4D与图4C相比)。为了确定Cdc42AT2基因无效小鼠在PNX后何时开始发生肺纤维化的时间点，在PNX后，在各个不同时间点使用H&E染色分析了Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺(图4D)。PNX后第21天之前，某些Cdc42 AT2基因无效肺的胸膜下区表现出组织增厚的迹象(图4D)。在终点之前，致密的纤维化已进展到大多数Cdc42 AT2基因无效肺的中心(图5D)。我们在PNX后和老年Cdc42基因无效小鼠中观察到的情况类似于IPF的特征性进展，其中纤维化病变首先发生在肺的外周，随后朝肺叶的中心向内进展。

除了在Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺的这些致密纤维化区域中检测到I型胶原蛋白的强免疫荧光信号(图4E)之外，我们还观察到在Cdc42 AT2基因无效小鼠中，每个肺叶中表达I型胶原蛋白的区域的比例在PNX后逐渐提高(图4F)。我们的qPCR分析也显示，从PNX后第21天起，I型胶原蛋白的mRNA表达水平逐渐升高(图4G)。此外，与它们的经PNX处理的对照小鼠相比，从PNX后第21天起，在经PNX处理的Cdc42 AT2基因无效小鼠中观察到肺顺应性逐渐降低(图4H)，考虑到在肺变得纤维化时已知常常发生肺顺应性的降低，这是一个有趣的发现。

由于在12月龄Cdc42 AT2基因无效小鼠中发现AT2分化受损和肺泡增大(图3D)，因此分析了从10月龄到24月龄的未进行PNX处理的对照和Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺(图5A)。即使对照小鼠达到24月龄，在对照小鼠的肺中也从未观察到纤维化变化(图5B)。在Cdc42 AT2基因无效小鼠达到10月龄之前，我们没有发现显著的纤维化变化(图5C)。还观察到在12个月之前，纤维化已经开始在Cdc42 AT2基因无效肺的胸膜下区中有明显发展，并在12个月后朝肺的中心进展(图5C)。

成纤维细胞灶被认为是进行性肺纤维化的相关形态学标志物，并且被认为是在进行性肺纤维化中纤维化反应起始和/或持续存在的位点³⁵。成纤维细胞灶含有增殖的α-SMA⁺成纤维细胞。在PNX后第21天，用针对α-SMA的抗体对Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺进行染色(图6A)。观察到，在Cdc42 AT2基因无效肺的相对正常的肺泡区域中，一些α-SMA⁺成纤维细胞开始聚集到AT2细胞簇附近(区域1，图6A)。并且肺的致密纤维化区域充满α-SMA⁺成纤维细胞(区域2，图6A)。此外，通过使用针对α-SMA和增殖标志物Ki67两者的抗体进行免疫染色，我们显示在PNX后第21天，α-SMA⁺细胞的细胞增殖在Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺中急剧增加。这些结果表明，增殖的α-SMA⁺成纤维细胞促进Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺纤维化的发展(图6B)。

总的来说，在经PNX处理的小鼠中，AT2细胞中Cdc42的丢失导致进行性肺纤维化。此外，这种进行性肺纤维化表型也从12月龄左右开始，发生在未经PNX处理的Cdc42 AT2基因无效小鼠中。所有这些结果证实，AT2细胞中Cdc42的缺失导致小鼠中的IPF样进行性肺纤维化，因此建立了IPF样进行性肺纤维化的小鼠模型，其可用于研究人类IPF疾病。

实施例2.Cdc42 AT2基因无效小鼠的序列表征

对Spc-CreER,Cdc42^flox/-小鼠进行基因组纯化和PCR扩增。然后纯化Cdc42的flox和基因无效条带，并使用如下所述的引物进行测序：

CTGCCAACCATGACAACCTAA(SEQ ID NO：1)；

AGACAAAACAACAAGGTCCAG(SEQ ID NO：2)。

图2中示出了在缺失Cdc42基因的外显子2之前或之后的Cdc42 DNA序列的片段。

实施例3.在PNX处理后，在Cdc42 AT2基因无效肺的AT2细胞中双调蛋白(AREG)被强烈表达

在Cdc42 AT2基因无效的纤维化模型中，Cdc42 AT2基因无效肺在PNX后第21天开始显示出纤维化变化(图4D)。我们已表征了PNX处理后的对照和Cdc42基因无效的AT2细胞(图7A)。通过RNA测序分析和定量PCR(qPCR)两者，观察到Areg是Cdc42AT2基因无效肺的AT2细胞中在PNX后第21天上调最大的基因之一(图7B)。通过免疫染色，观察到在PNX后第21天，可以在Cdc42 AT2基因无效肺的AT2细胞中检测到AREG(图7C)。在PNX后第21天，在对照肺中未能检测到AREG信号(图7C)，这与人类组织图谱的信息一致，即AREG的表达在成年肺组织中处于可检测水平之下。此外，AREG信号在AT2细胞中特异性检测到。通过AREG ELISA试剂盒，测量了AREG蛋白在Cdc42 AT2基因无效肺中的表达。观察到，在Cdc42 AT2基因无效小鼠的肺中，从PNX后第21天到PNX后第60天AREG的表达水平逐渐升高(图7D)。

实施例4.AREG在肺纤维化患者的AT2细胞中强烈表达

如在实施例3中所示，在Cdc42 AT2基因无效小鼠中观察到AREG的表达水平与肺纤维化的进展之间的正相关性。分析了在2位供体和3个IPF肺中AREG的表达水平。引人注目的是，观察到在所有IPF样本的AT2细胞(表达HTII-280的细胞)中均检测到AREG，但在供体肺的AT2细胞中未检测到AREG(图8A)。通过AREG ELISA试剂盒，测量了IPF患者和自体免疫诱导的肺纤维化患者的肺中的AREG的表达。发现在IPF患者和自体免疫诱导的肺纤维化患者的肺中，AREG的表达水平显著升高(图8B)。

总之，这些结果显示，在进行性纤维化小鼠模型和肺纤维化患者两者的AT2细胞中，AREG的表达水平被显著上调。

实施例5.在AT2细胞中过表达AREG足以诱导肺纤维化

teto-Areg小鼠的产生

将四环素响应元件插入到CMV启动子驱动的Areg之前，使得当用强力霉素(Dox)处理小鼠时可以诱导Areg的表达。四环素响应元件的序列如下所示：

将最小CMV启动子插入到Areg cDNA之前，以便过表达Areg。CMV启动子的序列如下所示：

5’GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGG CCTATATAAGCAGAGCT3’(SEQ ID NO：6)。

Areg cDNA的序列如下所示：

将四环素响应元件、CMV启动子和Areg CDNA酶法连接并插入到小鼠基因组中。teto-Areg的序列如下所示：

5’TCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGAGAACTCCGCTGCTACCGCTGGCGCGCTCAGTGCTGTTGCTGCTGGTCTTAGGCTCAGGCCATTATGCAGCTGCTTTGGAGCTCAATGACCCCAGCTCAGGGAAAGGCGAATCGCTTTCTGGGGACCACAGTGCCGGTGGACTTGAGCTTTCTGTGGGAAGAGAGGTTTCCACCATAAGCGAAATGCCTTCTGGCAGTGAACTCTCCACAGGGGACTACGACTACTCAGAGGAGTATGATAATGAACCACAAATATCCGGCTATATTATAGATGATTCAGTCAGAGTTGAACAGGTGATTAAGCCCAAGAAAAACAAGACAGAAGGAGAAAAGTCTACAGAAAAACCCAAAAGGAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAGGCAGAAGGAATAAGAAGAAAAAGAATCCATGCACTGCCAAGTTTCAGAACTTTTGCATTCATGGCGAATGCAGATACATCGAGAACCTGGAGGTGGTGACATGCAATTGTCATCAAGATTACTTTGGTGAACGGTGTGGAGAAAAATCCATGAAGACTCACAGCGAGGATGACAAGGACCTATCCAAGATTGCAGTAGTAGCTGTCACTATCTTTGTCTCTGCCATCATCCTCGCAGCTATTGGCATCGGCATCGTTATCACAGTGCACCTTTGGAAACGATACTTCAGGGAATATGAAGGAGAAACAGAAGAAAGAAGGAGGCTTCGACAAGAAAACGGGACTGTGCATGCCATTGCCTAG3’(SEQ ID NO：18)(图9)。

用于对teto-Areg序列进行测序的引物序列如下所示：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

为了评估AT2细胞中AREG表达升高的功能，产生了Areg AT2过表达的转基因小鼠，其中Areg可以在AT2细胞中被特异性过表达。首先，产生在四环素响应性启动子元件(tetO)控制之下表达Areg的转基因小鼠。将带有Spc-rtTA等位基因的小鼠与带有teto-Areg等位基因的小鼠杂交，以便得到带有Spc-rtTA；teto-Areg的后代小鼠。当将Spc-rtTA；teto-Areg小鼠暴露于四环素类似物强力霉素(Dox)时，在AT2细胞中特异性诱导了Areg的表达。将Spc-rtTA；teto-Areg小鼠命名为Areg^AT2OE小鼠(图10A)。

Areg^AT2OE小鼠用含有Dox的水处理21天(图10B)。然后收集经过或未经过Dox处理的Areg^AT2OE小鼠的肺，用于进行分析。qPCR分析显示，在经Dox处理后，Areg^AT2OE小鼠的AT2细胞中显著诱导了Areg mRNA的表达(图10C)。H&E染色显示，经Dox处理的Areg^AT2OE小鼠的肺具有明显的纤维化变化(图10D)。纤维化区域中的许多细胞表达高水平的α-SMA(图10E)。

这些结果第一次表明了，AT2细胞中AREG的异位表达足以诱导肺纤维化。

实施例6.Areg AT2基因无效小鼠的构建

产生Areg^flox/flox小鼠：Areg^flox/flox小鼠按照以前的工作产生³³。简单来说，通过loxp锚定Areg外显子3。将loxp1(GACACGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGAGTC(SEQ ID NO：3))插入到Areg DNA的第3704位中，并将loxp2(CCGCGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACTAGTCCAACG(SEQ ID NO：4))插入到Areg DNA的第4208位中。在他莫昔芬诱导的Cre-loxP重组后，使Areg外显子3缺失，因此阻断了AREG功能。

图11中示出了在缺失Areg基因的外显子3之前或之后的Areg DNA序列的片段。

实施例7.在Cdc42 AT2基因无效细胞中缺失Areg基因显著减缓了肺纤维化的发展

考虑到AT2细胞中AREG的纤维化功能，评估了在Cdc42 AT2基因无效肺中降低Cdc42 AT2基因无效细胞中AREG的表达是否会减弱纤维化的发展。产生了Areg flox小鼠，其中在Areg基因的外显子3的侧翼带有两个loxp位点。分析了其中整个身体中缺失Areg基因的小鼠。Areg^-/-小鼠能够存活并且是能生育的，这表明Areg基因对于小鼠的存活和发育来说不是必需的。通过几代杂交后，我们获得了Areg&Cdc42 AT2双重基因无效小鼠，其中在AT2细胞中的Areg和Cdc42基因均被缺失。

然后，研究了在Cdc42 AT2基因无效细胞中缺失Areg基因的影响。在PNX之前14天，将对照、Cdc42 AT2基因无效和Areg&Cdc42 AT2双重基因无效的小鼠暴露于4剂量的他莫昔芬(图12A)。在PNX后的多个时间点分析了这些小鼠的肺。在PNX后第21天，qPCR分析显示，在PNX后第21天，Areg&Cdc42双重基因无效AT2细胞中的Areg表达水平没有升高，证实了该AT2细胞中的Areg基因的缺失(图12B)。

AREG与EGFR结合，其可以激活EGFR的磷酸化。使用针对GFP(标记AT2细胞)、p-EGFR和α-SMA的抗体，通过免疫染色实验，检查了α-SMA⁺成纤维细胞中的p-EGFR表达。在Cdc42AT2基因无效的肺中观察到，α-SMA阳性的成纤维细胞中强表达p-EGFR(图12C)。在Areg&Cdc42 AT2双重基因无效的肺中，不仅检测到少得多的α-SMA阳性的成纤维细胞，而且观察到p-EGFR的表达水平降低(图12C)。这证实了α-SMA阳性的成纤维细胞中，EGFR信号传导的强度取决于AT2细胞中的AREG的表达。此外，在PNX后第21天，Areg&Cdc42 AT2双重基因无效的肺显示出极少的纤维化，与此相比在Cdc42 AT2基因无效的肺中出现显著的肺纤维化(图12D)。生存曲线也显示出，Areg&Cdc42 AT2双重基因无效的小鼠具有比Cdc42 AT2基因无效的小鼠显著延长的寿命(图12E)。

总之，这些结果证实，在AT2细胞中降低AREG的表达水平显著减弱Cdc42 AT2基因无效的小鼠的肺纤维化的发展。这些结果还表明，AREG及其受体EGFR是治疗纤维化的治疗靶点。

实施例8.Areg AT2基因无效的小鼠的序列表征

对Spc-CreER,Areg^flox/-小鼠进行基因组纯化和PCR扩增。然后，纯化Areg的flox和基因无效条带，并使用下述引物进行测序：

AAACAAAACAAGCTGAAATGTGG(SEQ ID NO：14)；

AAGGCCTTTAAGAACAAGTTGT(SEQ ID NO：15)。

实施例9.靶向AREG及其受体EGFR以治疗IPF和其他纤维化疾病

考虑到在α-SMA阳性的成纤维细胞中，EGFR可以被AREG激活(图12C)这一事实，研究了抑制AREG受体EGFR的活性对肺纤维化的进展的影响。将经PNX处理的Cdc42AT2基因无效小鼠，从PNX后第6天到PNX后第30天，仅用PBS处理或用EGFR抑制剂吉非替尼(Gefitnib)处理(图13A)。发现吉非替尼治疗也显著抑制Cdc42 AT2基因无效的小鼠的肺中纤维化的发展(图13B)。

总之，这些结果证实了，阻断AREG及其受体EGFR是治疗IPF和其他纤维化疾病的理想治疗方法。

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23 (！！！失效引用！！！).

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序列表

<110> 北京生命科学研究所

<120> 特发性肺纤维化的药物靶点

<130> RYP1918235.1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

ctgccaacca tgacaaccta a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

agacaaaaca acaaggtcca g 21

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gacacggatc cataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcgagt c 51

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

ccgcggataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat actagtccaa cg 52

<210> 5

<211> 271

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag 60

aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt 120

taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg 180

atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt 240

cgagtttacc actccctatc agtgatagag a 271

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

ggtaggcgtg tacggtggga ggcctatata agcagagct 39

<210> 7

<211> 747

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

atgagaactc cgctgctacc gctggcgcgc tcagtgctgt tgctgctggt cttaggctca 60

ggccattatg cagctgcttt ggagctcaat gaccccagct cagggaaagg cgaatcgctt 120

tctggggacc acagtgccgg tggacttgag ctttctgtgg gaagagaggt ttccaccata 180

agcgaaatgc cttctggcag tgaactctcc acaggggact acgactactc agaggagtat 240

gataatgaac cacaaatatc cggctatatt atagatgatt cagtcagagt tgaacaggtg 300

attaagccca agaaaaacaa gacagaagga gaaaagtcta cagaaaaacc caaaaggaag 360

aaaaagggag gcaaaaatgg aaaaggcaga aggaataaga agaaaaagaa tccatgcact 420

gccaagtttc agaacttttg cattcatggc gaatgcagat acatcgagaa cctggaggtg 480

gtgacatgca attgtcatca agattacttt ggtgaacggt gtggagaaaa atccatgaag 540

actcacagcg aggatgacaa ggacctatcc aagattgcag tagtagctgt cactatcttt 600

gtctctgcca tcatcctcgc agctattggc atcggcatcg ttatcacagt gcacctttgg 660

aaacgatact tcagggaata tgaaggagaa acagaagaaa gaaggaggct tcgacaagaa 720

aacgggactg tgcatgccat tgcctag 747

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

aaggtcggtg tgaacggatt tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

cgttgaattt gccgtgagtg gag 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

gcagatacat cgagaacctg gag 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

ccttgtcatc ctcgctgtga gt 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

cctcagggta ttgctggaca ac 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

cagaaggacc ttgtttgcca gg 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

aaacaaaaca agctgaaatg tgg 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

aaggccttta agaacaagtt gt 22

<210> 16

<211> 1128

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

tgttctattt taaagtacag gtaatcatgc atgagaagtc aaaaccttta aaactgtcaa 60

acagtgggct gctgtgtgtg gcatttgctg ccaaccatga caacctaagt tcaacttaag 120

agcccaacaa tggaaaaaga ccccttcaag ttgtcctctg ccatctacac atacaccaaa 180

gcaggacaca ggtatgtaca gaattcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 240

gttcgaacga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcgctagact agtacgcgtg 300

tacaccttgt aattgctgct ctgagcaagt tgccattttt tctttttaga ggttttcagt 360

catagcagta atgctagttc tggtttgagt ggctgagcct gttgctaggg gaaaaaagta 420

tggatttaaa cataaatcaa taaaataatt gtctttaatt tcttcttagg acaagatcta 480

atttgaaata ttaaaagtgg atacaaaact gtttccgaaa tgcagacaat taagtgtgtt 540

gttgttggtg atggtgctgt tggtaaaaca tgtctcctga tatcctacac aacaaacaaa 600

ttcccatcgg aatatgtacc aactgtaagt ataaaggctt tttactagca aaagattgta 660

atgtagtgtc tgtccattgg aaaacacttg gcctgcctgc agtatttttg actgtcttgc 720

cctttaaaaa aaattaaatt ttactacctt tattactttg tggggtgtgt gttataactt 780

cgtataatgt atgctatacg aagttatggt accgaattca gtttctggac cttgttgttt 840

tgtcttaagt atcaaagtag aacagtgacc gatatattcc ttttattttt ttttttcttc 900

cctgagactg ggtttctctg tgtagccctt gctgttctgt aactcactct gtgagtggcc 960

tcaaactcag agatccgcct gccttgggca aggaaggtgc tataaaaaga gtctcgtgtg 1020

gtatatgaag tatagtttgt gaaagctgct tcagtgtgag cacacacgca ttatatgcaa 1080

gaccaattgc agcccgaaga atactctaaa aaatgactca ctgcccag 1128

<210> 17

<211> 561

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

tgttctattt taaagtacag gtaatcatgc atgagaagtc aaaaccttta aaactgtcaa 60

acagtgggct gctgtgtgtg gcatttgctg ccaaccatga caacctaagt tcaacttaag 120

agcccaacaa tggaaaaaga ccccttcaag ttgtcctctg ccatctacac atacaccaaa 180

gcaggacaca ggtatgtaca gaattcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 240

ggtaccgaat tcagtttctg gaccttgttg ttttgtctta agtatcaaag tagaacagtg 300

accgatatat tccttttatt tttttttttc ttccctgaga ctgggtttct ctgtgtagcc 360

cttgctgttc tgtaactcac tctgtgagtg gcctcaaact cagagatccg cctgccttgg 420

gcaaggaagg tgctataaaa agagtctcgt gtggtatatg aagtatagtt tgtgaaagct 480

gcttcagtgt gagcacacac gcattatatg caagaccaat tgcagcccga agaatactct 540

aaaaaatgac tcactgccca g 561

<210> 18

<211> 1204

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 18

tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag 60

aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt 120

taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg 180

atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt 240

cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagctcg gtacccgggt 300

cgaggtaggc gtgtacggtg ggaggcctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 360

atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc 420

agcctccgcg gccccgaatt cgagctcggt acccgggatg agaactccgc tgctaccgct 480

ggcgcgctca gtgctgttgc tgctggtctt aggctcaggc cattatgcag ctgctttgga 540

gctcaatgac cccagctcag ggaaaggcga atcgctttct ggggaccaca gtgccggtgg 600

acttgagctt tctgtgggaa gagaggtttc caccataagc gaaatgcctt ctggcagtga 660

actctccaca ggggactacg actactcaga ggagtatgat aatgaaccac aaatatccgg 720

ctatattata gatgattcag tcagagttga acaggtgatt aagcccaaga aaaacaagac 780

agaaggagaa aagtctacag aaaaacccaa aaggaagaaa aagggaggca aaaatggaaa 840

aggcagaagg aataagaaga aaaagaatcc atgcactgcc aagtttcaga acttttgcat 900

tcatggcgaa tgcagataca tcgagaacct ggaggtggtg acatgcaatt gtcatcaaga 960

ttactttggt gaacggtgtg gagaaaaatc catgaagact cacagcgagg atgacaagga 1020

cctatccaag attgcagtag tagctgtcac tatctttgtc tctgccatca tcctcgcagc 1080

tattggcatc ggcatcgtta tcacagtgca cctttggaaa cgatacttca gggaatatga 1140

aggagaaaca gaagaaagaa ggaggcttcg acaagaaaac gggactgtgc atgccattgc 1200

ctag 1204

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

gtacccggga tgagaactcc g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

gccggatatt tgtggttcat t 21

<210> 21

<211> 987

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 21

ctctatgtca tgcgaggtcc agtacatcta actacaggca tacctaggta aaagaattca 60

agtggcatgc aacagaggtt actgtgcact gcccgataga ggacacggat ccataacttc 120

gtataatgta tgctatacga agttatcgag tcgctattct gtgcagcttt atcatgtgtg 180

tgttgcttta attaatgagg ccaaagtagc tctcagtgct gtgatttctg ggtctcacgt 240

aacccaaatc attttgaaga cgaaaagaga acgtgggcag tcgtaaatct aatcttactt 300

tgtcaaactt cctttctctc cagttgaaca ggtgattaag cccaagaaaa acaagacaga 360

aggagaaaag tctacagaaa aacccaaaag gaagaaaaag ggaggcaaaa atggaaaagg 420

cagaaggaat aagaagaaaa agaatccatg cactgccaag tttcagaact tttgcattca 480

tggcgaatgc agatacatcg agaacctgga ggtggtgaca tgcaagtagg tttgtttcct 540

acacaacacc tgaaatcccc atcaatagaa actattcact tttccagtgt gtaaaccaag 600

gatttcatga gccaacatta tgtttgtaca ggcaattaaa atataagcat gtaaatcccg 660

cggataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatact agtccaacgg aaaaaagatt 720

cttagcttaa aggctgtaac aaatagcttt atggctactg gtgcacagta tcattttatt 780

ataaatatta tatgtatgca atgtatatat atatgtgcct gtacatatat tttaagcctt 840

aaaaaaaact taaagtattt atcacacaac ttttcatgtt gttctaatgt ccccaaaccc 900

tctcaacgca ctaaaactaa actaaatgat agaggaatgt attagctgtg acaccaggag 960

tcaaagtcat cgcttggtcc taaaaga 987

<210> 22

<211> 430

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 22

ctctatgtca tgcgaggtcc agtacatcta actacaggca tacctaggta aaagaattca 60

agtggcatgc aacagaggtt actgtgcact gcccgataga ggacacggat ccataacttc 120

gtataatgta tgctatacga agttatcgag tcgaaaaaag attcttagct taaaggctgt 180

aacaaatagc tttatggcta ctggtgcaca gtatcatttt attataaata ttatatgtat 240

gcaatgtata tatatatgtg cctgtacata tattttaagc cttaaaaaaa acttaaagta 300

tttatcacac aacttttcat gttgttctaa tgtccccaaa ccctctcaac gcactaaaac 360

taaactaaat gatagaggaa tgtattagct gtgacaccag gagtcaaagt catcgcttgg 420

tcctaaaaga 430

Claims

1.一种用于特发性肺纤维化的药物靶点，其是动物或人类的肺的AT2细胞中的AREG信号传导。

2.根据权利要求1所述的药物靶点，其中AREG在患有特发性肺纤维化(IPF)的动物和人类的肺的AT2细胞中被检测到，而在动物或人类的正常肺的AT2细胞中不表达。

3.根据权利要求1所述的药物靶点，其中AREG在Cdc42 AT2基因无效的肺的AT2细胞中被检测到，并且在PNX后，AREG的表达水平在Cdc42 AT2基因无效的肺的AT2细胞中升高。

4.根据权利要求1所述的药物靶点，其中AREG的表达水平在患有进行性纤维化的动物或人类的肺的AT2细胞中被上调。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物靶点，其中所述动物或人类的肺的AT2细胞中的AREG信号传导是AREG靶点。

6.根据权利要求5所述的药物靶点，其中所述AREG靶点是来自动物或人类的肺的AT2细胞中的AREG。

7.根据权利要求5所述的药物靶点，其中所述AREG靶点是动物或人类的肺的AT2细胞中的AREG的受体。

8.根据权利要求5所述的药物靶点，其中所述AREG靶点是动物或人类的肺的成纤维细胞中的EGFR。

9.根据权利要求8所述的药物靶点，其中α-SMA阳性成纤维细胞中EGFR信号传导的强度取决于AT2细胞中的AREG的表达。

10.根据权利要求1所述的药物靶点，其中所述药物靶点降低动物或人类的肺的AT2细胞中的AREG的表达水平。

11.一种产生Areg在AT2细胞中过表达的转基因小鼠的方法，其中在小鼠的肺的AT2细胞中特异性过表达AREG。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括，在强力霉素处理后，在AT2细胞中特异性诱导Areg表达的步骤。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所产生的转基因小鼠是Spc-rtTA；teto-Areg小鼠。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠具有SEQ ID NO：18所示的特征序列。

15.用于鉴定在权利要求14中产生的Spc-rtTA；teto-Areg小鼠的引物序列对，其中所述引物序列对具有下述序列：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

16.一种转基因小鼠，其中AREG在肺的AT2细胞中特异性过表达。

17.根据权利要求16所述的转基因小鼠，其中所述转基因小鼠是Areg AT2过表达的转基因小鼠。

18.根据权利要求16或17所述的转基因小鼠，其中所述转基因小鼠是Spc-rtTA；teto-Areg小鼠。

19.根据权利要求18所述的转基因小鼠，其中所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠具有由SEQID NO：18所示的特征序列。

20.根据权利要求19所述的转基因小鼠，其中所述Spc-rtTA；teto-Areg小鼠能够使用下述引物序列来鉴定：

正向：GTACCCGGGATGAGAACTCCG(SEQ ID NO：19)；

反向：GCCGGATATTTGTGGTTCATT(SEQ ID NO：20)。

21.肺的AT2细胞中的AREG和/或其在成纤维细胞中的受体EGFR，在作为药物靶点用于治疗动物和人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)中的用途。

22.前述权利要求中所述的AREG靶点或转基因小鼠，在用于筛选治疗动物或人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。

23.AREG的检测剂和/或其受体EGFR的检测剂，在用于制造诊断动物或人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的诊断试剂盒中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述试剂盒用于疑似患肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的动物或人类的样品。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述样品是活检组织，例如来自于动物或人类的肺组织，优选为来自于所述动物或人类的肺叶的下部、中部或上部。

26.根据权利要求25所述的用途，其中在来自于动物或人类的肺叶的上部中检测到AREG，则将所述动物或人类诊断为患有严重的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)。

27.靶向肺的AT2细胞中的AREG和/或其受体，例如成纤维细胞中的EGFR的物质，在制造用于治疗动物或人类的肺纤维化、特别是特发性肺纤维化(IPF)的药物中的用途。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述物质是肺的AT2细胞中的AREG的抑制剂或肺的成纤维细胞中的EGFR的抑制剂。

29.权利要求1至10中的任一项所述的药物靶点，和权利要求22至28中的任一项所述的用途，其中所述动物是小鼠、兔、大鼠、犬、猪、马、奶牛、绵羊、猴或黑猩猩。