CN111574596B

CN111574596B - 组成型分泌表达o型fmdv重组抗原表位基因工程cho细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN111574596B
Application number: CN202010451052.6A
Authority: CN
Inventors: 常惠芸; 孙振文; 邵军军; 常艳燕
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111574596A

Abstract

本发明涉及组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法，属于基因工程领域，以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的OME2为元件，以HBcAg为骨架，设计信号肽‑HBcAg‑OME2融合基因，构建包含所述融合基因的供体质粒，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带信号肽‑HBcAg‑OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区，构建的基因工程CHO细胞能组成型分泌表达FMD重组抗原，为将来实现大量组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原提供了技术平台和基因工程CHO细胞系，具有重要的经济价值。

Description

组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种基因工程CHO细胞系的构建方法。

背景技术

HBcAg作为抗原表位展示载体，重组蛋白可自组装成天然病毒样颗粒(VLP)。因此，利用该HBcAg作为载体展示外源抗原表位，不仅可以使抗原表位展示在病毒样颗粒的表面，诱导体液免疫反应，而且可以通过激活模式识别受体(PRRS)激发固有免疫和细胞免疫反应。但原核(E.coli)系统表达的HBcAg外源蛋白常常是包涵体，不能折叠组装成天然病毒样颗粒，需要对包涵体变性溶解，复性等一系列的处理过程，实现重组蛋白的重新折叠组装。这种组装不仅过程复杂，而且组装过程受到缓冲系统，孵育时间，蛋白浓度、溶液离子强度、环境温度等条件的影响，VLP产量低，成本高，不适合大规模生产。因此，开发能可溶性表达，细胞内组装VLP的重组表达系统显得尤为重要。

CHO细胞作为目前生产各种医用治疗性生物制剂的最广泛的真核细胞表达系统(Renner et al.,1995)，不仅可以实现重组蛋白的可溶性表达，保证其天然结构，而且可以对表达蛋白进行修饰，最大化保证重组蛋白的生物学与免疫学功能。但是CHO细胞常常以瞬时形式表达重组蛋白，而且表达量低，导致生产成本非常高，用于生产医用生物制剂尚可，但不适宜生产兽用疫苗用重组抗原或生物试剂。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种O型FMDV抗原表位基因OME2，目的二在于提供一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2基因，目的三在于提供包含所述信号肽-HBcAg-OME2基因的重组载体，目的四在于提供分泌表达所述信号肽-HBcAg-OME2重组蛋白的基因工程CHO细胞系，目的五在于提供所述基因工程CHO细胞系的构建方法。利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因或8号染色体端粒区，构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的基因工程CHO细胞，为实现组成型可持续表达重组蛋白奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种O型FMDV重组抗原表位OME2，其特征在于：将PADRE T细胞淋巴表位命名为E4、将GenBank:AAK62010.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命令为E5、将GenBank:AF506822.2中O型口蹄疫VP1第200-213位氨基酸命名为E6、将GenBank:JN998085.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命名为E7；所述抗原表位基因OME2是将E4、E5、E6、E7和E6依次串联所得。

一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2，是将SCGB1D1 isoform信号肽、HBcAg 1-78氨基酸段、所述的抗原表位基因OME2和HBcAg81-149氨基酸段依次串联所得。进一步地，在HBcAg 1-78氨基酸段N末端和HBcAg81-149氨基酸段C末端分别添加6×His标签。

一种重组载体，包含上述信号肽-HBcAg-OME2基因的核苷酸序列。

一种组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系，在CHO细胞HPRT基因2号外显子，或在CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间的内含子区域，定点插入所述信号肽-HBcAg-OME2基因。

所述CHO细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建打靶质粒：根据HPRT 2号外显子的基因序列和8号染色体端粒区内含子序列分别设计sgRNA，将所述sgRNA与pSpCas9(BB)-2A-Puro载体连接分别构建打靶质粒，得到HPRT打靶质粒和8号染色体端粒区打靶质粒；

所述HPRT的sgRNA为H-2、H-6或H-7，其中：

H-2：GTGGCCCTCTGTGTGCTGAA，

H-6：AGCCCCCCTTCAGCACACAG，

H-7：CTGATAAAATCTACAGTCAT；

所述8号染色体端粒区的sgRNA为8-6、8-7或8-10，其中：

8-6：TGAATGGCACCATGTCACAC，

8-7：TCAGAGATGAAATTAATAAG，

8-10：CGTTGATTTAAGTTCCTTAA；

步骤二、构建供体质粒：根据打靶位点确定同源臂序列；将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因序列相连，通过添加载体元件并插入PMD19-T载体构建供体质粒，由此分别得到HPRT供体质粒H-19T和8号染色体端粒区供体质粒8-19T；

步骤三、瞬时转染供体质粒验证表达：将HPRT供体质粒和8号染色体端粒区供体质粒分别转染CHO细胞，验证是否转染成功并表达目的蛋白；若转染成功并表达目的蛋白，继续进行下一步骤；

步骤四、共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆：将供体质粒H-19T和8-19T分别酶切线性化，得到线性化供体质粒H-19T和线性化供体质粒8-19T；将步骤一所得HPRT打靶质粒与所述线性化供体质粒H-19T混合后得到混合物Ⅰ，将步骤一所得8号染色体端粒区打靶质粒与所述线性化供体质粒8-19T混合后得到混合物Ⅱ；将所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ分别转染CHO细胞，利用CSRISP/Cas9同源重组技术，使信号肽-HBcAg-OME2融合基因与CHO细胞基因组发生同源重组，经筛选获取阳性克隆，得到组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系。

作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述添加载体元件是以PEF1α启动子启动信号肽-HBcAg-OME2基因、在信号肽-HBcAg-OME2后添加SV40 PolyA、以PCMV启动子启动筛选基因EGFP和PURO并在所述筛选基因后添加SV40 PolyA。

作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述HPRT供体质粒，是以CHO细胞HPRT基因2号外显子为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。

作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述8号染色体端粒区供体质粒，是以CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间内含子区域为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。

有益效果：

本发明以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的O型FMDV抗原表位(OME2)为元件，能自组装病毒样颗粒(VLP)的HBcAg为骨架，设计SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因，构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的供体质粒，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区，构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的基因工程CHO细胞。所述基因工程CHO细胞系能以组成型分泌表达FMD重组抗原，为将来实现大量组成型分泌表达HBcAg的VLP展示口蹄疫病毒重组抗原提供了技术平台和基因工程CHO细胞系，具有重要的经济价值。

附图说明

图1是HPRT基因组成图；其中，1：1号外显子；2：2号外显子；3：3号外显子；4：4号外显子；5：5号外显子；6：6号外显子；7：7号外显子；8：8号外显子；9：9号外显子；

图2是8号染色体端粒区基因组成图；其中，1：LOC100761280外显子；2：Etfbkmt基因；3：内含子区域插入位点；

图3是表位串联顺序图；其中，E4：PADRE T细胞淋巴表位；E5：O型口蹄疫(GenBank:AAK62010.1)VP1 135-160氨基酸；E6：O型口蹄疫(GenBank:AF506822.2)VP1 200-213氨基酸；E7：O型口蹄疫(GenBank:JN998085.1)VP1 135-160；RE：多表位基因序列；

图4是融合基因串联顺序图；其中，E1：信号肽SCGB1D1 isoform；E2：HBcAg(GenBank：AAL31838.1)1-78氨基酸；E3：HBcAg(GenBank：AAL31838.1)81-149氨基酸；RE：多表位基因序列；

图5是8-19T供体质粒图谱；

图6是H-19T供体质粒图谱；

图7是右同源臂Junction PCR鉴定原理图；

图8是左同源臂Junction PCR鉴定原理图；

图9是8号染色体端粒区扩增结果图；其中，M：DNA标尺(DL5000)；1：63℃；2：62.5℃；3：61.6℃；4：60.3℃；5：58.7℃；

图10是HPRT扩增结果图；其中，1：68c℃；2：66℃；3：64.1℃；4：61.8℃；5：60℃；6：58℃；7：56℃；8：54.2℃；9：51.9℃；10：49.9℃；M：DNA标尺(DL5000)；

图11是8号染色体端粒区效率检测结果图；其中，1：8-1；2：8-2；3：8-3；4：8-4；5：8-5；6：8-6；7：8-7；8：8-8；9：8-9；10：8-10；11：8-11；12：8-12；13：8-13；14：阴性对照；15：阳性对照；M:DNA标尺(DL1000)；

图12是HPRT效率检测结果图；其中，1：阴性对照；2：H-1；3：H-2；4：H-3；5：H-4；6：H-5；7：H-6；8：H-7；9：H-8；10：H-9；11：H-10；12：H-11；13：H-12；14：H-13；15：阳性对照；M:DNA标尺(DL1000)；

图13是细胞荧光图；其中，a为同源重组8号染色体端粒区的细胞荧光；b为同源重组HPRT区的细胞荧光；

图14是兔抗his-tag抗体反应结果图；其中，1：8号染色体端粒区；2：8号染色体端粒区；3：HPRT；4：HPRT；5：阴性对照；

图15是猪O型口蹄疫病毒阳性血清反应结果图；其中，1：8号染色体端粒区；2：8号染色体端粒区；3：HPRT；4：HPRT；5：阴性对照；

图16是同源重组HPRT区域荧光细胞系；其中，a：H-2-4；b：H-2-3；c：H-2-2；d：H-6-27；e：H-6-24；f：H-6-5；g：H-6-7；h：H-6-23；i：H-7-20；j：H-7-43；k：H-7-4；l：H-7-14；m：H-7-13；n：H-7-26；o：H-7-16；p：H-7-42；

图17是同源重组8号染色体端粒区荧光细胞系；其中，a：8-10-48；b：8-6-41；c：8-6-27；d：8-6-11；e：8-6-10；f：8-6-6；g：8-6-15；h：8-6-46；i：8-6-42；j：8-7-7；k：8-7-6；l：8-7-21；m：8-7-20；n：8-7-14；o：8-7-26；p：8-7-24；q：8-7-25；

图18是8号染色体端粒区Junction PCR结果图；其中，M：DNA标尺(DL5000)；1:8-10-48；2：8-6-41；3：8-6-27；4：8-6-11；5：8-6-10；6：8-6-6；7：8-6-15；8：8-6-46；9：8-6-42；10：8-7-7；11：8-7-6；12：8-7-21；13：8-7-20；14：8-7-14；15：8-7-26；16：8-7-24；17：8-7-25；

图19是HPRT Junction PCR结果图；其中，1：H-2-4；2：H-2-3；3：H-2-2；4：H-6-27；5：H-6-24；7：H-6-5；7：H-6-7；8：H-6-23；9：H-7-20；10：H-7-43；11：H-7-4；12：H-7-14；13：H-7-13；14：H-7-26；15：H-7-16；16：H-7-42；M：DNA标尺(DL5000)；

图20HPRT二轮PCR结果图；其中，M：DNA标尺(DL5000)；1：H-2-4；2：H-2-3；3:H-2-2；

图21是HPRT Junction PCR图；其中，1：H-2-3；2：H-2-4；M：DNA标尺(DL5000)；

图22是兔抗his-tag抗体反应结果图；其中，1：H-2-3；2：H-2-4；3：阴性对照；

图23是猪O型口蹄疫病毒阳性血清反应结果图；其中，1：H-2-3；2：H-2-4；3：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

1、主要试剂

pSpCas9(BB)-2A-Puro载体由实验室保存。

Enzyme(GP0105)购自江苏吉锐生物技术有限公司。100rxns嘌呤霉素(P8230)购自索莱宝(Solarbio)公司。FastAPThemosenitive Alkline(EF651)购自Thermo Scientific公司。限制性核酸内切酶Bbs1(R3539S)、T4 DNA Ligase Reaction Buffer(B0202S)、T4 Polynucleotide Kinase(M0201S)、T7 DNA Ligase(M0318S)等购自NEB公司。TaKaRa MiniBEST Universal GenomicDNA Extraction Kit(9765)、

HS DNA Polymerase(R010A)购自Takara公司。供体质粒送通用生物系统(安徽)有限公司合成。Rabbit Anti-6X His

antibody(ab9108)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(ab205718)、Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)(ab6915)购自Abcam公司。猪O型口蹄疫病毒血清由实验室保存。

2、方法

2.1 CRISPR/Cas9基因打靶位置确定

CHO细胞HPRT基因有9个外显子，选择2号外显子(基因位点如图1)为插入位点；另外选择CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间内含子区域为插入位点(基因位点如图2)。

2.2设计引物扩增打靶区域序列及测序

根据NCBI查询序列设计引物，提取CHO细胞基因组，扩增细胞打靶位置附近3000bp大小基因，并将其测序。

8号染色体端粒区：

上游引物序列：GTCCATGGGTCATTTTAGAAAG

下游引物序列：AGTATGGAAGGTAACAGAGTGGA

PCR反应体系，上游引物(10uM)2μL，下游引物(10μM)2μL，基因组(100ng/μL)2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂ O 29.5μL，总体积50μL

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度(设温度梯度63℃，62.5℃，61.6℃，60.3℃，58.7℃)30s，72℃4min,循环35次,72℃10min。

HPRT：

上游引物序列：CTCCTCCCCTGTTATACACAT

下游引物序列：TTTGCCACCAGCATATACAGT

PCR反应体系，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，基因组(100ng/μL)2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂ O 29.5μL，总体积50μL

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度(设温度梯度68℃，66℃，61.8℃，60℃，58℃,56℃,54.2℃,51.9℃,49.9℃)30s,72℃4min,循环35次,72℃10min。

2.3设计sgRNA

根据基因组测序结果设计sgRNA，将测序结果输入在线设计网站(http://crispor.tefor.net)，因HPRT打靶位置确定为2号外显子，输入序列为2号外显子基因序列，而8号染色体端粒区内含子序列过长，未确定具体打靶区域，将测序结果整体输入，选择高分sgRNA集中区域，且该区域大小为300bp左右为打靶区域，以便确定同源臂序列，当sgRNA打靶位置差距不大时，同源臂序列可相同的。

2.4构建打靶质粒

根据所选sgRNA合成引物，将sgRNA分为上游引物sgRNAF和下游引物sgRNAR，通过上下游引物互补生成sgRNA,然后将其连接pSpCas9(BB)-2A-Puro载体，具体步骤如下。

(1)引物互补及磷酸化：

反应体系，sgRNAF(100μM)1μL，sgRNAR(100μM)1μL，10×T4 ligation buffer 1μL，T4 PNK 1μL，ddH₂O 6μL，总体积10μL。

反应条件，37℃30min，95℃5min，5℃/min降至25℃。

(2)向199μLH₂O中加入1μL(1)步骤中磷酸化sgRNA。

(3)酶切pSpCas9(BB)-2A-Puro载体：

反应体系，pSpCas9(BB)-2A-Puro载体65μL(20μg)，Bbs1 10μL，10×buffer 20μL，ddH₂O 105μL，总体积200μL。

反应条件，37℃1h。

(4)胶回收酶切后载体，参照OMEGA胶回收试剂盒说明书。

(5)去磷酸化。

反应体系，线性pSpCas9(BB)-2A-Puro载体60μL(10ng)，10×T4 buffer 10μL，Fast AP 5μL，ddH₂O 25μL，总体积100μL。

反应条件，25℃30min。

(6)胶回收去磷酸化产物，步骤同(4)。

(7)连接线性载体和(2)步骤中稀释后sgRNA构建打靶质粒：

反应体系，稀释后sgRNA 1μL，线性pSpCas9(BB)-2A-Puro载体0.5μL(50ng)，T7DNA Ligase 0.5μL，10×Buffer 1μL，ddH₂O 7μL，总体积10μL。

反应条件，25℃30min。

连接后的打靶质粒转化感受态DH5α，提取质粒。因插入sgRNA序列过短，无法通过酶切和PCR验证，只能通过测序验证质粒是否构建成功。

3.2.5验证打靶质粒效率

转染打靶质粒，转染后48h提基因组，因打靶后存在脱靶率，所以同一细胞池提取基因组中既有打靶细胞基因组，也有未经打靶的野生型细胞基因组，以其为模板进行PCR，产物既有未经突变的野生型序列，也有打靶后经过错配缺失修复的突变型序列，将野生型和突变型PCR产物杂交后将会出现碱基错配，

Enzyme可以识别错配碱基对其进行切割，切割后与未经转染的阴性对照细胞相比，核酸胶将会出现多条带，多出条带亮度代表打靶效率的高低，条带越亮，效率越高。具体步骤如下：

(1)将HPRT的13个sgRNA构建质粒分别命名为H-1，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-7，H-8，H-9，H-10，H-11，H-12，H-13；8号染色体端粒区13个sgRNA构建质粒分别命名为8-1，8-2，8-3，8-4，8-5，8-6，8-7，8-8，8-9，8-10，8-11，8-12，8-13。分别将上述26个质粒转染CHO细胞，48h后收细胞参照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit说明书提取基因组，设计引物做PCR分别对转染质粒的细胞基因组和未转染的阴性对照细胞基因组打靶位点附近序列扩增。

8号染色体端粒区：

上游引物序列：ATCCACTAAGCTGGCCTTTCCTG

下游引物序列：TGCCAAGCACCAGTAGAAGTCTG

PCR反应体系，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，基因组(100ng/μL)2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 29.5μL，总体积50μL。

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度66℃30s，72℃1min，循环35次，72℃10min。

HPRT：

上游引物序列：CCCAACCCCCAAAATCTTCCCTT

下游引物序列：ACAGCAGAGAGTTCCAAGACAGG

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度68℃30s，72℃1min，循环35次，72℃10min。

(2)对PCR产物进行胶回收。

(3)异源双链DNA杂交。

反应体系，胶回收PCR产物2.8μL(300ng)，5×buffer 2.2μL，ddH₂O 6μL。

反应条件，将反应管置于PCR仪中，98℃孵育3min，保持仪器盖子闭合，将PCR反应管留在PCR仪中自然冷却，放置20min以上，待管中液体温度下降至40℃以下取出。

(4)

Enzyme酶切验证，将(3)中反应管再加入

Enzyme和3μL 5×Cruiser Buffer。

反应条件，置于PCR仪器中，45℃孵育20min后，立刻降至4℃。

(5)反应降至4℃后立即加入3μL 6×stop Buffer，然后进行核酸胶验证打靶效率，根据打靶率各选择3个打靶质粒用于下一步。

2.6确定同源臂，构建供体质粒

根据打靶位点确定同源臂序列，并将其与信号肽-HBcAg-O型FMDV多表位基因序列相连，通过添加各种载体元件并将其插入PMD19-T载体构建供体质粒。具体步骤如下：

(1)表位串联：

将PADRE T细胞淋巴表位，O型口蹄疫(GenBank:AAK62010.1)VP1 135-160氨基酸，O型口蹄疫(GenBank:AF506822.2)VP1 200-213氨基酸和O型口蹄疫(GenBank:JN998085.1)VP1 135-160氨基酸表位串联，中间添加GGSSGG间隔子序列(表位串联顺序见图3)，O型FMDV抗原表位基因命名为OME2，核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。

(2)信号肽-HBcAg-OME2设计及基因优化：

将串联表位基因插入截短的HBcAg 1-149氨基酸的第79-81氨基酸区间，替换该区间，分别在HBcAg 1-78氨基酸段N末端和HBcAg81-149氨基酸段C末端添加6×His标签，然后参考第二部分实验，综合表达量和切割位点准确性选择SCGB1D1 isoform信号肽，将其连接于HBcAg1-78氨基酸段His标签的N末端构建信号肽-HBcAg-O型口蹄疫抗原重组蛋白(基因串联顺序见图4)，并对整体基因序列以CHO细胞为表达宿主进行密码子偏好性优化，最终核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示。

(3)HPRT同源臂确定：

根据HPRT基因打靶位点位置，分别选择其打靶位点两侧各750bp序列为同源臂序列，打靶位点左侧基因序列为左同源臂(同源臂序列如SEQ ID NO：03所示)，打靶位点右侧基因序列为右同源臂(同源臂序列如SEQ ID NO：04所示)，序列方向均为5’-3’方向。

(4)8号染色体端粒区同源臂确定：

方法同(3)，其中左同源臂序列如SEQ ID NO：05所示，右同源臂序列如SEQ ID NO：06所示。

(5)添加载体原件将各部分相串联，插入PMD19-T载体：

以PEF1α启动子启动信号肽-HBcAg-OME2基因，在信号肽-HBcAg-OME2后添加SV40PolyA，以PCMV启动子启动筛选基因EGFP和PURO(嘌呤霉素抗性基因)在其后添加SV40PolyA，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成基因并连入PMD19-T载体构建供体质粒，由公司验证成功后交付，分别命名为8-19T(8号染色体端粒区供体质粒)质粒图谱见图5和H-19T(HPRT供体质粒)质粒图谱见图6。

2.7瞬时转染供体质粒验证表达

使用Lipofectamine 3000将供体质粒转染CHO细胞，转染后第8h，更换含有10％血清的高糖DMEM培养基，继续培养，转染后第48h收集CHO细胞培养基，与PMSF混合,使其终浓度为0.001mol/L，以800rpm离心5min以除去细胞碎片，取上清液进行BCA蛋白质定量，以总蛋白质量为60μg上样，分别跑两个SDS-PAGE胶，将两个凝胶分别转印于两张NC膜，通过Western Blot验证。具体步骤如下：

(1)供体质粒转染CHO细胞。

(2)Western Blot验证。所用一抗和二抗不同，一张NC膜用含5％脱脂奶粉的PBST1：200稀释的猪O型口蹄疫病毒阳性血清作为一抗，用含5％脱脂奶粉的PBST 1：10000稀释的HRP标记的山羊抗猪IgG抗体作为二抗；另一张NC膜用含5％脱脂奶粉的PBST 1：1000稀释的兔抗his-tag抗体作为一抗，用含5％脱脂奶粉的PBST 1：10000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体作为二抗。

2.8共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆

用Not I分别酶切8-19T和H-19T将质粒线性化，以提高其同源重组成功率，对酶切产物进行胶回收，按照1:1将打靶质粒分别与其对应的供体质粒混合，转染6孔板中CHO细胞，转染后36h按照1:1将六孔板中细胞传于100mmdish，加入含23μg/mL嘌呤霉素的培养基10mL，每2d更换一次培养基，筛选细胞，筛选周期18d。18d后将剩余存活细胞冻存一部分，另一部分按每个100mmdish铺200个细胞，每个打靶质粒对应细胞铺6个100mmdish，6个质粒共铺36个100mmdish，同时继续添加含23μg/mL嘌呤霉素的培养基10mL。每日观察细胞，待细胞形成克隆岛后用克隆环将其圈出，消化分散，接种48孔细胞培养板，为了尽可能获得阳性重组细胞，每个质粒转染细胞挑选50个克隆岛(命名按照打靶质粒名称加克隆岛编号如，8-7-10代表8-7打靶质粒的第10号克隆岛)，共挑选300个克隆岛，继续添加含23μg/mL嘌呤霉素的培养基，待细胞长成单层后，消化分散，接种24孔细胞培养板，同样方法接种于12孔板后培养基中不在添加嘌呤霉素。

2.9挑选荧光细胞系

根据荧光显微镜结果显示，对12孔板中的细胞根据荧光基因表达情况完成同源重组细胞系的初步筛选。

2.10右同源臂Junction PCR鉴定细胞

上游引物在右同源臂5’端以外供体质粒基因上，因上游引物均在供体质粒上且不在同源臂中，所以HPRT和8号染色体端粒区Junction PCR上游引物相同，下游引物在右同源臂3’端以外CHO细胞基因组中设计引物，提取荧光细胞基因组，对其进行Junction PCR只有右同源臂整合到CHO细胞基因组中才能扩出目的条带，并对目的条带进行测序，测序结果同时含有供体质粒序列，右同源臂序列和CHO基因组序列，则说明右同源臂整合成功。

(原理见图7)

8号染色体端粒区Junction PCR：

上游引物序列：CGTCTATATCATGGCCGACAAGC

下游引物序列：TGGAAGGTAACAGAGTGGAGAGC

反应体系，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，基因组(50ng/μl)5μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O 26.5μL，总体积50μL。

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度62℃30s，72℃4min，循环35次，72℃10min。

HPRT右同源臂Junction PCR：

上游引物序列：CGTCTATATCATGGCCGACAAGC

下游引物序列：GTGCCTTTGACTACTGAGTCCAC

PCR反应条件，98℃5min，98℃30s，退火温度68℃30s，72℃4min，循环35次，72℃10min。

2.11左同源臂Junction PCR鉴定细胞

挑选右同源臂整合成功的H-2-3和H-2-4细胞系进行左同源臂Junction PCR鉴定，只有左，右同源臂区域Junction PCR均验证成功，才能证明目的基因成功重组，上游引物在左同源臂5’端以外CHO细胞基因组中设计引物，下游引物在左同源臂3’端以外供体质粒基因上，提取H-2-3和H-2-4细胞系基因组，对其进行Junction PCR只有左同源臂整合到CHO细胞基因组中才能扩出目的条带，并对目的条带进行测序，测序结果同时含有CHO细胞基因组序列，左同源臂序列和供体质粒序列，则说明整合成功。(原理见图8)

HPRT左同源臂Junction PCR：

上游引物序列：TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

下游引物序列：TATCCAGCAGATCCCTCACGGAA

2.12细胞系目的蛋白表达验证

将12孔板中Junction PCR验证目的基因同源重组成功的细胞系逐步扩大培养至T75细胞瓶中，取其培养基做Western Blot验证。抗体孵育同3.2.7。

3结果

3.1扩增打靶区域序列及测序结果

NCBI查询序列基因序列可能与实际所养细胞基因组序列存在碱基误差，根据NCBI查询序列设计引物，扩增8号染色体端粒区目的区域2982bp(结果如图9)，扩增HPRT目的区域2835bp(结果如图10)，8号染色体端粒区选2号，HPRT选4号送测序，实际sgRNA设计和同源臂序列选择应以测序结果为准，测序结果8号染色体端粒区基因序列如SEQ ID NO：07和HPRT基因序列如SEQ ID NO：08。

3.2设计sgRNA结果

将HPRT 2号外显子(基因序列如SEQ ID NO：09)和8号染色体端粒区内含子整体测序基因序列输入，HPRT按分数选择13个sgRNA，8号染色体端粒区选择高分sgRNA集中且大小279bp区域(基因序列如SEQ ID NO：10)，选择该区域所含分数较高的13个sgRNA。HPRT的sgRNA及其对应合成所需上游引物sgRNAF和下游引物sgRNAR结果见表1，8号染色体端粒区的sgRNA及其对应合成所需上游引物sgRNAF和下游引物sgRNAR结果见表2。

表1：HPRT的sgRNA及其对应合成所需上游引物sgRNAF和下游引物sgRNAR

表2：8号染色体端粒区的sgRNA及其对应合成所需上游引物sgRNAF和下游引物sgRNAR

3.3打靶质粒鉴定

因插入sgRNA序列过短，无法通过酶切和PCR验证，只能通过测序验证质粒是否构建成功，设计测序引物TTTATGGCGAGGCGGCGG，送公司测序，结果26种打靶质粒均成功构建。

3.4打靶质粒效率结果

打靶质粒转染细胞，48h后提取细胞基因组做PCR，异源双链DNA杂交后以

Enzyme酶切，酶切后琼脂糖电泳分析，8号染色体端粒区效率检测结果见图11，HPRT效率检测结果见图12，根据结果按照酶切条带亮度挑选打靶质粒8-6，8-7，8-10；H-2，H-6，H-7，该6种质粒为打靶效率高的质粒。

3.5瞬时转染供体质粒验证表达结果

将供体质粒转染CHO细胞，荧光显微镜结果显示，同源重组8号染色体端粒区的转染细胞内出现了明显的亮色荧光(图13a)，同样同源重组HPRT区的转染细胞内也观察到了亮色荧光(结果见图13b)，提示转染成功并表达目的蛋白。对荧光阳性的细胞继续培养，收集48h细胞培养上清进行Western blot，结果显示，上清液中含有分别能与兔抗his-tag抗体发生免疫反应的蛋白(图14)，也能与O型口蹄疫病毒阳性血清发生免疫反应的蛋白(图15)，提示转染细胞能分泌表达目的蛋白。

3.6同源重组荧光细胞挑选结果

同源重组HPRT区域荧光细胞系编号为，H-2-4，H-2-3，H-2-2，H-6-27，H-6-24，H-6-5，H-6-7，H-6-23，H-7-20，H-7-43，H-7-4，H-7-14，H-7-13，H-7-26，H-7-16，H-7-42(细胞荧光图见图16)。同源重组8号染色体端粒区荧光细胞系编号为，8-10-48，8-6-41，8-6-27，8-6-11，8-6-10，8-6-6，8-6-15，8-6-46，8-6-42，8-7-7，8-7-6，8-7-21，8-7-20，8-7-14，8-7-26，8-7-24，8-7-25(细胞荧光图见图17)。

3.7右同源臂Junction PCR鉴定细胞结果

将同源重组HPRT区域荧光细胞系和同源重组8号染色体端粒区荧光细胞系提基因组进行右同源臂Junction PCR验证右同源臂整合情况，8号染色体端粒区右同源臂Junction PCR，未扩增出特异性目的条带(结果如图18)；HPRT右同源臂Junction PCR(结果如图19)，HPRT目的条带大小2174bp，选择H-2-2，H-2-3，H-2-4以其产物为模板做PCR，HPRT二轮PCR(结果见图20)以提高测序物浓度，H-2-4和H-2-3目的带大小存在差异推测是PCR扩增后H-2-4产物片段发生二级结构，导致电泳图结果比目的位置偏大，将其送测序。测序结果H-2-2浓度太低测序无反应；H-2-3和H-2-4测序结果含有供体质粒序列，右同源臂序列和CHO基因组序列相串联，证明右同源臂整合成功，成功整合到CHO细胞基因组HPRT 2号外显子中。

3.8左同源臂Junction PCR鉴定细胞结果

选择H-2-3，H-2-4细胞系提基因组做左同源臂Junction PCR，验证左同源臂整合情况目的条带大小2923bp(结果见图21)，将其送测序。H-2-3和H-2-4测序结果含有CHO基因组序列，左同源臂序列和供体质粒序列相串联，证明左同源臂整合成功。左，右同源臂均成功整合于HPRT 2号外显子中，目的序列同源重组成功，成功整合到CHO细胞基因组HPRT 2号外显子中。

3.9细胞系目的蛋白表达验证结果

同源重组成功的H-2-3和H-2-4细胞系逐步扩大培养至T75细胞瓶，取其细胞培养上清进行Western blot，结果显示，上清液中含有分别能与兔抗his-tag抗体发生免疫反应的蛋白(图22)，也能与O型口蹄疫病毒阳性血清发生免疫反应的蛋白(图23)，提示同源重组细胞系能分泌表达目的蛋白。

本发明以CHO细胞为表达系统表达HBcAg可直接分泌到CHO细胞培养基中，省略了蛋白的变性和复性过程，有利于蛋白的分离纯化，其分泌产物结构接近天然蛋白分子，能更好的发挥其分子内佐剂的效果。

本发明以HBcAg为载体，将设计的O型FMDV多表位基因(OME2)插入该载体，即为HBcAg-OME2融合基因，此外，为了实现该重组蛋白在CHO细胞中的分泌性表达，在HBcAg-OME2融合基因的N端引入了信号肽分子，构建包含信号肽-HBcAg-OME2融合基因序列的供体质粒，WB结果显示该供体质粒能够在CHO细胞系分泌表达外源重组蛋白。利用CSRISP/Cas9同源重组技术，将信号肽-HBcAg-OME2融合基因整合进CHO细胞的基因组，构建了整合信号肽-HBcAg-OME2基因的CHO细胞系，Junction PCR结果显示成功将融合基因插入了CHO细胞的HPRT基因2号外显子，WB结果显示该基因工程CHO细胞细胞系能够分泌表达外源重组蛋白。这些结果提示本研究成功构建了组成型高水平分泌表达重组蛋白的基因工程CHO细胞细胞系，为将来实现大量组成型分泌表达HBcAg的VLP展示口蹄疫病毒重组抗原提供了技术平台和基因工程CHO细胞系，具有重要的经济价值。

本发明利用CRISP/Cas9技术成功构建了组成型高水平分泌表达重组蛋白的基因工程CHO细胞细胞系，并实现了HBcAg-O型FMDV抗原表位融合蛋白的分泌表达；将信号肽引入融合蛋白的N端，将有助于CHO细胞将表达的重组蛋白向细胞外分泌。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp

20 25 30

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser

35 40 45

Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu

50 55 60

Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn

65 70 75 80

Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu

85 90 95

Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

100 105 110

Val Lys Gln Leu Leu

115

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly His His His His His His Met

20 25 30

Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser

35 40 45

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr

50 55 60

Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser

65 70 75 80

Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu

85 90 95

Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

115 120 125

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val

165 170 175

Lys Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ala Gly Gly Ser

180 185 190

Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala

195 200 205

Arg Pro Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile

210 215 220

Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Arg

225 230 235 240

Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg

245 250 255

Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr

260 265 270

Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro

275 280 285

Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr

290 295 300

Thr Val Val Gly Gly Ser Ser Gly Gly His His His His His His

305 310 315

<210> 3

<211> 750

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 3

tttattgaat attatcatac tgccaaatta acctctaaaa aatttcataa ttttatacta 60

ccagtggtat gtgagttcat ttttcctcac aatctcttct aatattttac attagagaaa 120

tgcaatttaa ccaaaattca ccagtcttgt tagctttgaa cattgtatct ttttatttgt 180

atttttaaat ttcatgatgt tatagtatac ctgttctttt atttgagaca gaatcttatt 240

atgtagccct aagtgaccta gtacttactc tgctgttgta cagtatgtcc ctcaacccat 300

acccttcctc ctgcctcagc ctccagagtg ctagaattat aggcatgtac catggtgcct 360

agcatgtacc tggtttttaa aggtagctgg aattataggc atgtaccatg atgcctagca 420

tgtacctggt ttttaaagtt agtaagtttt aattttggtt gagctgtgtg ttggtgtgta 480

agtataatct cagcacacag agttcgagac atgggttatg agttactatg cagcctgggc 540

tacatagagg gatcctgtgt caccttcccc aacccccaaa atcttccctt tgccatatgg 600

aaaacatccc ccactttatt taatagtttg atttatgaag caagattacc aattatgggg 660

acaaagaatg tgtcctgtgg aagtttaaga agtgtttgtt ataaaaatat aactatttgg 720

aatcttctat tcctgatttt atttttgtag 750

<210> 4

<211> 750

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 4

gtaagtataa ttcattcata atttaaaaaa tatggcaatc ctagttttgt atgtattttt 60

gtttgtttgt ttttactttg aaacagtgtt tttctgggta gctttggagc ctgtcttgga 120

actctctgct gtagaccaga ctgacctaca gagatctacc tgcctctgac tcctgagtgc 180

tgagattaaa cgagtgcacc accacctgag cctcatcaac tgaggcttat cccagttttt 240

tttagaattt tagtttgaga ccctctctaa cttgctcaga ctatccttga actcattaca 300

taggctgatc tagaaatttt agtcatcttg actcagtttc tcaagtagct gggattacag 360

gcaggtgcta ccacttctgg ccataattgt tgctgttatt attcactggt actttacatc 420

acaacactgt agttcaagac caacatcaaa gtgaatattg tttgttagtc acccaagatg 480

gatttgtact tactttgcat ggtttttctt ttgtcttatt ttgacctgga ttttgacttg 540

ttttatgata ctgctcaggc tagtatcaaa ctctgtggtt caaataatcc ttctgtctta 600

gcctcccaaa ttctgggagt acaagcgtgt atcaccatac ctgactgtgt tttgatattt 660

tccaaaacaa cttttaagaa ttactgcaga gtacagtgac agagagagat ggttcatcag 720

tcacaagcac ttgtagagaa gactggggtt 750

<210> 5

<211> 744

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 5

tggaatctta ttaatgatat ccttaccaat tcccctggct ctgcccacct tacttctgca 60

attaaaaact ttcttgagcc cctctcctgt gctcattctc ccacttctga ctgccccata 120

gacaaacctc catcctctcc ctgtccttca gtttccatct gtatgccccc tgatgagacc 180

cagacccccc acatcttaca gacaaacctc ccttaaaagc ccccgtaatc tctatccctc 240

tttacagggc ctcgagcctc attcccctaa aaaccttaaa agttaccctg tctttcgttc 300

aaaccccaaa ccataaactg atcacctaag tccatcagac gaggaggacc tagaagaagc 360

ggcggctgct tttcacaacc ccaactggcc tactttcgag ggctttacgg cccctacagg 420

gcttccgact tatccttccg ccccccttct cccatcttcc acaaacgcct taattcaagc 480

taaaaaacat ctcacccaac aaatatcaga acttaaagag gtcttacaat tacaacagga 540

gttttcacag ctgtctctat acctcacatc cctccagacc actgttggcc aatcgatctt 600

cggactcccc actcagccca ttacagcccc taaaccctcc cttccaccag gcaacaggcc 660

aaaaatctcc aaatccacta agctggcctt tcctgactta acccgccagg gctccaagca 720

tacaccatcc tcctctaacc aaga 744

<210> 6

<211> 750

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 6

tccttagctg cgggaaatac ttaacttgga aatctgaatt ctatgaccgt tgacaaaacc 60

ttgctaccaa gaatcaacaa aggccctcca ctcaaaaatg gacccttgat aaactcactg 120

gtcaaggaaa atttgtctct gaaattctcc agattaagct tcgcataggt ctcttaggac 180

aaacctctca gacttctact ggtgcttggc aagctctctc aggccgaggg tccatgctta 240

caccccttac taagatcatt cagggagcca atgaacctta tacagaattt gtagggagac 300

ttacagaggc cacagaatgg gttttgggca cacaagaaac tgacaataaa ctccttaaac 360

aactagcttt tgagaacgcc aagagtgttt gccgaaatgt cctcagaggc acctttagaa 420

acaagtccct tgaggaaatt attcgggcct gcaatgatgt tgactctttt tctcaaaaac 480

tctcacagag catttcccag ggggtcacta tggctattgg tgcagctcta caaacaacag 540

gtaacaacag agcttgcttt aaatgccacc aacctggaca ttttgctaaa caatgtcccc 600

aaaatattac acccagacct tcagagggca tcctgacatc tcgatcccaa aatggcatat 660

tgacctttgc cccttcaccc ttgcagaaaa ctctctgtcc caggtgcaaa aagggtaaac 720

attggctcag ggactgtaga tccaaaactg 750

<210> 7

<211> 2982

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 7

gtccatgggt cattttagaa agcccagaca ttcatcccct aacttggaaa aaggtcggag 60

aggatcttaa tagattactc aaagaaaagg gacctgaggc agttccctta cagactttta 120

gttattggaa tcttattaat gatatcctta ccaattcccc tggctctgcc caccttactt 180

ctgcaattaa aaactttctt gagcccctct cctgtgctca ttctcccact tctgactgcc 240

ccatagacaa acctccatcc tctccctgtc cttcagtttc catctgtatg ccccctgatg 300

agacccagac cccccacatc ttacagacaa acctccctta aaagcccccg taatctctat 360

ccctctttac agggcctcga gcctcattcc cctaaaaacc ttaaaagtta ccctgtcttt 420

cgttcaaacc ccaaaccata aactgatcac ctaagtccat cagacgagga ggacctagaa 480

gaagcggcgg ctgcttttca caaccccaac tggcctactt tcgagggctt tacggcccct 540

acagggcttc cgacttatcc ttccgccccc cttctcccat cttccacaaa cgccttaatt 600

caagctaaaa aacatctcac ccaacaaata tcagaactta aagaggtctt acaattacaa 660

caggagtttt cacagctgtc tctatacctc acatccctcc agaccactgt tggccaatcg 720

atcttcggac tccccactca gcccattaca gcccctaaac cctcccttcc accaggcaac 780

aggccaaaaa tctccaaatc cactaagctg gcctttcctg acttaacccg ccagggctcc 840

aagcatacac catcctcctc taaccaagac ccctcctcta ctcatacaat taggcaggag 900

gatgaggagg aaaactcaga gatgaaatta ataagaggga taaaaatgac tctgagtcag 960

ataatgaggt ccaagataaa cagacagaaa caaccgaaaa catctttaaa aaattaaaat 1020

ttaaagccct taaggaactt aaatcaacgg tcgaaaatta cggtcccatt gcatctttca 1080

cccttggctt actggaggcc ctctcaggag agggatgcct caccccagct gaatggcacc 1140

atgtcacaca ggcagtcctt agctgcggga aatacttaac ttggaaatct gaattctatg 1200

accgttgaca aaaccttgct accaagaatc aacaaaggcc ctccactcaa aaatggaccc 1260

ttgataaact cactggtcaa ggaaaatttg tctctgaaat tctccagatt aagcttcgca 1320

taggtctctt aggacaaacc tctcagactt ctactggtgc ttggcaagct ctctcaggcc 1380

gagggtccat gcttacaccc cttactaaga tcattcaggg agccaatgaa ccttatacag 1440

aatttgtagg gagacttaca gaggccacag aatgggtttt gggcacacaa gaaactgaca 1500

ataaactcct taaacaacta gcttttgaga acgccaagag tgtttgccga aatgtcctca 1560

gaggcacctt tagaaacaag tcccttgagg aaattattcg ggcctgcaat gatgttgact 1620

ctttttctca aaaactctca cagagcattt cccagggggt cactatggct attggtgcag 1680

ctctacaaac aacaggtaac aacagagctt gctttaaatg ccaccaacct ggacattttg 1740

ctaaacaatg tccccaaaat attacaccca gaccttcaga gggcatcctg acatctcgat 1800

cccaaaatgg catattgacc tttgcccctt cacccttgca gaaaactctc tgtcccaggt 1860

gcaaaaaggg taaacattgg ctcagggact gtagatccaa aactgatgtt caagggaatc 1920

ccctgcctcc tcctcaggga aacagcttga ggggccagcc ttgggcccca cagccaatcc 1980

ccttcttgcc agcatccggg ccaagcctgc aggcacaatc cttccaacct gcgcctccaa 2040

gctctacaga gccacccccg gaagcacagg actggacctg tgtgccaaca ccgactcaat 2100

attaaaccct aaggatggtg tacagattct ctccactgga atttctgccc caccgccccc 2160

agatacttgt tttctcattc ttggtcgagc ctcctctacc accagggcca ggggatcgtt 2220

gagagatctc accaaacact aaaaacatgc tatttaaact atattcagga ggaggaattc 2280

tataccccac taaaggcaat cacaagaacc tactcaatca tgcattgttt gtgctaaatt 2340

tcctcacata tgatgccaca ggaaaatcag cctcggatcg cctctggcat ccatcaacgg 2400

ctcaaaacta tgctcaggcc ttatggaagg atcccctaac tcataaatgg aatagaccag 2460

acccagtctt catttgggga aaaggacatt catgtatttt tgatactcag gccaataatg 2520

ccagatggtt gcctgaatgc cctttaaaac tatataatcc acccagggaa gcccctgaga 2580

agtcttctaa ttctgcttaa ttccagataa agaatgatgt ctttctggct acttgtgtgt 2640

ttctcactct caattatcgt tgccgctgca atctcctatc agatctacaa ctacaccagg 2700

atgatcatca accaagctgg tgatgttgcc aatgcctcta catacattgg acctcagccc 2760

tcttattccc ccctgatagt agctctttgt gccttggcta tgggagccca ccctctctga 2820

ggaacttgct tttatgcaaa accgggcctc gttgaagaaa gcctaaaaaa ggttcaggat 2880

agcctagaga accgtaaaaa aacaaagaga acaagcagaa tcatggtaca aaaattggtt 2940

ttccacctct ccatggctct ccactctgtt accttccata ct 2982

<210> 8

<211> 2835

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 8

ctcctcccct gttatacaca tttctttact gtatcactgt atgtaaagta tatatacaca 60

tacgagttat gtactatcat ataatactaa atttttggac tttttaatat tagtacatct 120

atagctatca catgttttta tctttaaaaa tttttataat tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 180

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg gagagatatg tgtatgtgtg taaactgttt 240

tctctttgag ataggttctt actgtttagt tcagtctggc ttggaacttt ctgtatagcc 300

cagactgacc ttaactcagt attcctcccc catctggaga ttacaggtat gagccaccat 360

gcccagtcct gtttttatat tgattttgaa aaagggtctc aaatagttta gactggcttc 420

caactcacag tgtagctgag gatgacctga agttctgatg ctattgcttc tactggtgtg 480

ccattatgcc cagtttgcac agttatgagg ataaaaccta ggaccttgtt cctgtgcata 540

ctaggcatag actctaccaa ttaagctaca ttcccagctc ccccaggttt actttaaagg 600

tgataatgct attctgttca tggatatacc ataactgatt taactctgta ctgttggtag 660

acacttaaga tctccattat tttgcactta gcaggagttt attagaggaa atatgatata 720

tattggcact tgctcagctt taggcaagta gaaattctgg gtcaagtaaa agatgtttat 780

tgaatattat catactgcca aattaacctc taaaaaattt cataatttta tactaccagt 840

ggtatgtgag ttcatttttc ctcacaatct cttctaatat tttacattag agaaatgcaa 900

tttaaccaaa attcaccagt cttgttagct ttgaacattg tatcttttta tttgtatttt 960

taaatttcat gatgttatag tatacctgtt cttttatttg agacagaatc ttattatgta 1020

gccctaagtg acctagtact tactctgctg ttgtacagta tgtccctcaa cccataccct 1080

tcctcctgcc tcagcctcca gagtgctaga attataggca tgtaccatgg tgcctagcat 1140

gtacctggtt tttaaaggta gctggaatta taggcatgta ccatgatgcc tagcatgtac 1200

ctggttttta aagttagtaa gttttaattt tggttgagct gtgtgttggt gtgtaagtat 1260

aatctcagca cacagagttc gagacatggg ttatgagtta ctatgcagcc tgggctacat 1320

agagggatcc tgtgtcacct tccccaaccc ccaaaatctt ccctttgcca tatggaaaac 1380

atcccccact ttatttaata gtttgattta tgaagcaaga ttaccaatta tggggacaaa 1440

gaatgtgtcc tgtggaagtt taagaagtgt ttgttataaa aatataacta tttggaatct 1500

tctattcctg attttatttt tgtaggactg aaagacttgc ccgagatgtc atgaaagaga 1560

tgggaggcca tcacattgtg gccctctgtg tgctgaaggg gggctataaa ttctttgctg 1620

acctgctgga ttacattaaa gcactgaata gaaatagtga tagatccatt cccatgactg 1680

tagattttat cagactgaag agctactgtg taagtataat tcattcataa tttaaaaaat 1740

atggcaatcc tagttttgta tgtatttttg tttgtttgtt tttactttga aacagtgttt 1800

ttctgggtag ctttggagcc tgtcttggaa ctctctgctg tagaccagac tgacctacag 1860

agatctacct gcctctgact cctgagtgct gagattaaac gagtgcacca ccacctgagc 1920

ctcatcaact gaggcttatc ccagtttttt ttagaatttt agtttgagac cctctctaac 1980

ttgctcagac tatccttgaa ctcattacat aggctgatct agaaatttta gtcatcttga 2040

ctcagtttct caagtagctg ggattacagg caggtgctac cacttctggc cataattgtt 2100

gctgttatta ttcactggta ctttacatca caacactgta gttcaagacc aacatcaaag 2160

tgaatattgt ttgttagtca cccaagatgg atttgtactt actttgcatg gtttttcttt 2220

tgtcttattt tgacctggat tttgacttgt tttatgatac tgctcaggct agtatcaaac 2280

tctgtggttc aaataatcct tctgtcttag cctcccaaat tctgggagta caagcgtgta 2340

tcaccatacc tgactgtgtt ttgatatttt ccaaaacaac ttttaagaat tactgcagag 2400

tacagtgaca gagagagatg gttcatcagt cacaagcact tgtagagaag actggggttt 2460

agttactggc acccaaaaga tggctcacag ctatgtagct ccagttccag gggacctgat 2520

gtcctagcct ccagataaaa taaaaataag taagttttac aagaattatg ggactggtga 2580

ggtggactca gtagtcaaag gcactggctg ctctttcaga ggacctggtt caattcctag 2640

cacccacgtg gtagttcaca gttgtcttta actccagtcc cagggatctg atgccatctt 2700

ctggcctcca agggcaccag acactaacat ggtacacaaa caaatatgca acttgaacac 2760

ccatacacat attttaaaaa taaacaattt ctgttgagac ttggtgtttt cctgactgta 2820

tatgctggtg gcaaa 2835

<210> 9

<211> 184

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 9

gactgaaaga cttgcccgag atgtcatgaa agagatggga ggccatcaca ttgtggccct 60

ctgtgtgctg aaggggggct ataaattctt tgctgacctg ctggattaca ttaaagcact 120

gaatagaaat agtgatagat ccattcccat gactgtagat tttatcagac tgaagagcta 180

ctgt 184

<210> 10

<211> 280

<212> DNA

<213> CHO细胞

<400> 10

ctctactcat acaattaggc aggaggatga ggaggaaaac tcagagatga aattaataag 60

agggataaaa atgactctga gtcagataat gaggtccaag ataaacagac agaaacaacc 120

gaaaacatct ttaaaaaatt aaaatttaaa gcccttaagg aacttaaatc aacggtcgaa 180

aattacggtc ccattgcatc tttcaccctt ggcttactgg aggccctctc aggagaggga 240

tgcctcaccc cagctgaatg gcaccatgtc acacaggcag 280

Claims

1.一种组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系的构建方法，其特征在于：在CHO细胞HPRT基因2号外显子，定点插入信号肽-HBcAg-OME2的基因；

所述信号肽-HBcAg-OME2的氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示；

所述OME2的氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示；

所述CHO细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建打靶质粒：根据HPRT 2号外显子的基因序列设计sgRNA，将所述sgRNA与pSpCas9（BB）-2A-Puro载体连接构建打靶质粒，得到HPRT打靶质粒；

所述HPRT的sgRNA为H-2，其中：H-2：GTGGCCCTCTGTGTGCTGAA；

步骤二、构建供体质粒：根据打靶位点确定同源臂序列；将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因序列相连，通过添加载体元件并插入PMD19-T载体构建供体质粒，由此得到HPRT供体质粒H-19T；

步骤三、瞬时转染供体质粒验证表达：将HPRT供体质粒转染CHO细胞，验证是否转染成功并表达目的蛋白；若转染成功并表达目的蛋白，继续进行下一步骤；

步骤四、共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆：将供体质粒H-19T酶切线性化，得到线性化供体质粒H-19T；将步骤一所得HPRT打靶质粒与所述线性化供体质粒H-19T混合后得到混合物Ⅰ；将所述混合物Ⅰ转染CHO细胞，利用CSRISP/Cas9同源重组技术，使信号肽-HBcAg-OME2融合基因与CHO细胞基因组发生同源重组，经筛选获取阳性克隆，得到组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系；

步骤二所述HPRT供体质粒，是以CHO细胞HPRT基因2号外显子为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750 bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。

2.如权利要求1所述的CHO细胞系的构建方法，其特征在于：步骤二所述添加载体元件是以PEF1α启动子启动信号肽-HBcAg-OME2基因、在信号肽-HBcAg-OME2后添加SV40 PolyA、以PCMV启动子启动筛选基因EGFP和PURO并在所述筛选基因后添加SV40 PolyA。