CN116135874A - 靶向hdac5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向HDAC5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用。其中的多肽特异性结合HDAC5，且多肽选自SEQ ID NOs：1‑5及SEQ ID NOs：11‑15中任意一条或多条。通过以HDAC5作为抗癌药物的靶点蛋白，结合AI辅助设计以及筛选的手段，寻找到了多个具有抗癌活性的全新多肽化合物，这些多肽作为药物具有靶标专一、低毒及低副作用的优势，因而具有开发为抗癌药物的潜在应用价值。尤其是SEQ ID NO：1或11所示的多肽，将其以带有穿膜肽的SEQ ID NO：6或16的形式进行细胞实验时，发现其抗肝癌活性最高。

Description

靶向HDAC5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗癌药物开发领域，具体而言，涉及一种靶向HDAC5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。组蛋白去乙酰化是表观遗传抑制的标记，在转录调控、细胞周期进程和发育事件中起着重要作用。HDAC5蛋白主要负责核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)的N端赖氨酸残基的去乙酰化，其中去乙酰化酶通过形成大的多蛋白复合物发挥作用。近年来，越来越多的研究发现，HDAC5与肿瘤的发生发展有着密切的关系。
HDAC5作为一个新颖的抗癌靶点，尤其是作为抗肝癌的靶点分子，可以有效的抑制癌症的发生。肝癌是一种发生于肝脏恶性肿瘤，已成为全球高发的且危害性极大的疾病之一。据统计，中国每年死于肝癌的约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。目前肝癌的普遍临床治疗方法为手术治疗(包括肝移植)、消融、靶向治疗、放疗以及化疗。其中手术治疗方法只适用于在早期发现的肝癌，并且病人足够健康时展现出显著的效果，但由于很多肝癌患者确诊时已经是中晚期，错失了最佳治愈的机会。其他的一些治疗方法旨在杀伤肿瘤细胞，但同时对正常细胞也存在较大的副作用，这些副作用会使得癌症复发率增高且影响健康的组织或器官，因此开发安全、有效及靶标专一的抗肝癌药物迫在眉睫。
多肽是由肽键连接的三个或三个以上氨基酸分子化合物。作为重要的生命物质之一，肽类物质广泛存在于生命体中调节体内各个系统器官和细胞的功能活动。近年来多肽类药物凭借其高靶向性、低免疫原性、高组织渗透性，及安全性等优点在抗肿瘤药物的研制中备受关注。2019年，全世界抗肿瘤多肽治疗的市场估值为86亿美元，并预期会在未来近十年保持稳定增长的趋势。
因此，如何开发一批以HDAC5为抗癌靶点的具有潜在药用价值的多肽药物分子，也成为抗肿瘤药物研制的一大热点问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种靶向HDAC5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用，以便为抗癌药物研制提供更多具有潜在药用价值的多肽药物分子。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种靶向HDAC5的多肽，该多肽特异性结合HDAC5，且多肽选自如下任意一条或多条：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14及SEQ ID NO：15。
进一步地，多肽为修饰后的肽段；优选地，修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰；优选地，化学基团修饰为PEG修饰、乙酰化修饰或酰胺化修饰中的任意一种或多种；优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰；优选地，PEG修饰位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；优选地，多肽的N端和C端分别具有乙酰化修饰和酰胺化修饰；优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在多肽的N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；进一步优选地，1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser；优选地，半胱氨酸修饰为在多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端、C端、NC两端或肽链中间；更优选地，在肽链中间添加半胱氨酸包括在肽链中间插入一个或多个半胱氨酸，或者一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于肽链的中间；优选地，多肽以带穿膜肽的线性多肽或无穿膜肽的环状多肽形式存在；优选地，穿膜肽的氨基酸序列为SEQ IDNO：21：RKKRRQRRR；更优选地，带穿膜肽的线性多肽选自如下任意一条或多条：SEQ ID NO：:6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：1:6、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种多肽药物，多肽药物包括上述多肽以及药学上可选的辅料。
进一步地，多肽药物为抗癌药物，优选为抗肝癌药物；优选地，多肽药物中多肽的浓度为0.1μM～100μM。
根据本发明的第三个方面，提供了上述多肽在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
进一步地，癌症包括如下任意一种或多种：肝癌、肺癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、血管瘤、骨癌、宫颈癌、子官癌、卵巢癌、脂肪癌、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、胸腺癌以及中枢神经系统癌症；优选地，中枢神经系统癌症为脑癌。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测HDAC5的试剂盒，该试剂盒包括上述的多肽。
进一步地，多肽以多肽-蛋白偶联物的形式存在；优选地，多肽-蛋白偶联物中的蛋白选自如下任意一种：牛血清蛋白、卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或酪蛋白；更优选，多肽通过连接序列与蛋白偶联形成多肽-蛋白偶联物，进一步优选地，连接序列为CGSG。
进一步地，多肽被包被于固相载体上；优选地，固相载体包括酶标板、膜载体或微球；优选地，膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；优选地，膜载体上还包被有阳性对照物，多肽和阳性对照物按检测顺序在膜载体上依次设置；优选地，试剂盒还包括如下至少之一：(1)酶标二抗，更优选酶标二抗为HRP标记的二抗；(2)胶体金结合垫，胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗原和阳性对照物的特异性结合物；(3)标记垫，标记垫上包被有荧光标记的微球，微球上负载有阳性对照物的特异性结合物；优选地，阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。
进一步地，试剂盒包括芯片，芯片上预置有多肽组成的多肽阵列。
应用本发明的技术方案，通过以HDAC5作为抗癌药物的靶点蛋白，结合AI辅助设计以及筛选的手段，寻找到了多个具有抗癌活性的全新多肽化合物，这些多肽作为药物具有靶标专一、低毒及低副作用的优势，因而具有开发为抗癌药物的潜在应用价值。尤其是SEQID NO：1及11所示的多肽，将其以带有穿膜肽的SEQ ID NO：6及16的形式进行细胞实验时，发现其抗癌活性最高，比如，对抗肝癌的活性较其他多肽活性高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请的实施例1中筛选出的第二候选多肽与HDAC5的结合力箱线图；
图2示和图3分别出了本申请的实施例2中SEQ ID NO：6和16所示的多肽的合成的HPLC图谱；
图4和图5分别示出了本申请的实施例3中SEQ ID NOs：6-10和16-20所示的候选抗癌多肽对HepG2细胞增殖效果MTT结果图；
图6和图7分别示出了本申请的实施例4中SEQ ID NO：6和16所示的多肽对HepG2细胞增殖抑制作用效果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
多肽：本申请中指预测的或者筛选的能够与靶点HDAC5特异性结合的任意一条肽段。
多肽-载体蛋白偶联物：本申请中指一条多肽与载体蛋白偶联形成的偶联物，其中，一个载体蛋白可以偶联一条或多条多肽，多条多肽偶联时，多条多肽具有相同的氨基酸序列。根据具体偶联的多肽序列的理化性质的差异、具体载体蛋白的种类的不同以及偶联方法的不同，每个载体蛋白上所偶联的多肽的条数有所差异，本申请中优选2～50条，更优选为3～45条、5～40条、5～35条、5～30条、8～30条、10～30条、12～30条、15～30条；或者，更优选为6～36条、8～32条、10～28条、10～26条、10～24条、10～22条、10～20条、10～18条、10～16条及10～15条中的任意一种情况。
多肽芯片技术是基于多肽芯片的检测技术，其利用多肽芯片上的种类繁多的多肽与样本的接触，然后利用图像采集技术采集多肽芯片上各个特征信号(具体可表现为携带各个特征信号的荧光图像)，进而输出芯片中每个特征的信号强度，即多肽芯片检测结果数据。基于多肽芯片检测结果数据输出的样本检测信号，可实现对与多肽芯片上的多肽结合的样本中的待测物的分析，样本的分析等。
Motif：基序，在生物学中是一个基于数据的数学统计模型，典型的是一段序列(Sequence)，也可以是一个结构，是特定的组(group)的序列预测，例如，一个DNA序列可以定义为转录因子结合位点，也就是序列倾向于被转录因子结合。对蛋白质来说，序列基序(Sequence motif)可以被定义为蛋白质序列属于一个给定的蛋白质家族。一个简单的motif可以是，比如一个模式(pattern)，而这个模式被这个组(group)中的所有成员共享。
ROC曲线：反映敏感性与特异性之间关系的曲线。横坐标X轴为1-特异性，也称为假阳性率，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率，Y轴越大代表敏感度越好。根据曲线位置，把整个图划分为两部分，曲线下方部分的面积被称为AUC(AreaUnder Curve)，用来表示预测准确性，AUC值越高，表明预测准确率越高。曲线越接近左上角(X越小，Y越大)，预测准确率越高。
如背景技术所提到的，现有技术中急需开发针对不同靶点的抗癌多肽药物的问题，本发明通过以HDAC5作为抗癌药物的靶点蛋白，结合AI辅助设计以及筛选的手段，寻找到了具有抗癌活性的全新多肽化合物。并通过实验验证，筛选出的多肽药物具有抗癌活性。基于多肽类药物靶标专一、低毒及低副作用的优势，本发明所筛选的多肽一定程度上弥补了当前药物研制和治疗手段的不足。
基于上述研究结果，申请人提出了本申请的一系列技术方案。在一种典型的实施例中，提供了一种靶向HDAC5的多肽，该多肽特异性结合HDAC5，且多肽选自如下任意一条或多条：RPWLFPYHAFS(SEQ ID NO：1)、PYWRHRHPRYRVF(SEQ ID NO：2)、QFWRHPWLQD(SEQ IDNO：3)、WPHRHLFWKE(SEQ ID NO：4)、PLYHRHPWFG(SEQ ID NO：5)、YRFFFPYHLD(SEQ ID NO：11)、PQRFPYHYDNRLD(SEQ ID NO：12)、FWNHRHPHSD(SEQ ID NO：13)WLHRHRFSG(SEQ ID NO：14)及QFPFPYQYRG(SEQ ID NO：15)。
如上述，本申请通过以HDAC5作为抗癌药物的靶点蛋白，结合AI辅助设计以及筛选的手段，寻找到了上述具有抗癌活性的全新多肽化合物，这些多肽作为药物具有靶标专一、低毒及低副作用的优势，因而具有开发为抗癌药物的潜在应用价值。上述多肽中，优选SEQID NO：1或11所示的多肽，将其以带有穿膜肽的SEQ ID NO：6或16的形式进行细胞实验时，发现该多肽的抗癌活性最高，比如，对抗肝癌的活性较其他多肽活性高。
根据药物开发所需，上述多肽在研制时还可以根据需要进行各种修饰。在一种优选的实施例中，该多肽为修饰后的肽段；优选地，修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰。
比如，为进一步提高某些肽段的亲和性，在一种优选的实施例中，上述化学基团修饰为PEG修饰；优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰；优选地，PEG修饰的位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在多肽的N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；进一步优选地，1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser。
由于化学合成的多肽往往携带游离的氨基和游离的羧基，而多肽的序列往往代表的是其所在的母本蛋白的序列，因而，为了使合成的蛋白与母本蛋白在序列和活性方面更接近，通常要对多肽的末端进行封闭，一般是对N端进行乙酰化和对C端进行酰胺化，这样修饰会减少多肽的总电荷，降低多肽的溶解度，进而也能够使多肽模拟其在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。因此，在另一些实施例中，上述化学基团修饰为对多肽进行双端修饰，更优选地，对多肽的N端和C端分别进行乙酰化修饰及酰胺化修饰。
在某些实施例中，为了更好地实现对肽段的定向偶联，优选可以对多肽进行半胱氨酸修饰。具体地，包括但不限于在肽段的N端、C端或者NC两端添加，亦或在多肽的肽链中间添加半胱氨酸。当在肽段的肽链中间添加半胱氨酸时，一个或多个半胱氨酸可以插入肽链中间(即插入两个氨基酸残基之间)，也可以将一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于肽链的中间(即作为肽链中间的某个氨基酸的侧链)。
在某些实施例中，为了更有效地发挥上述多肽分子作为药物能够穿过细胞膜，进入体内与HDAC5靶点结合，优选地，多肽以带穿膜肽的线性多肽或无穿膜肽的环状多肽形式存在。穿膜肽通常设置在多肽的C端或药物分子的一端，可用将多肽分子或药物分子带入特定类型的细胞内，随后分子在细胞内发生生物化学反应。穿膜肽通常为富含精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)这样的碱性氨基酸。比较常用的穿膜肽示例如下：(1)H7R8：HHHHHHHRRRRRRRR(SEQ ID NO：23)；(2)YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：24)；或(3)GRRRRRRRRRPPQ(SEQ ID NO：25)。
在一种优选的实施例中，穿膜肽的氨基酸序列为RKKRRQRRR(SEQ ID NO：21)。具体地，带穿膜肽的线性多肽的氨基酸序列为RKKRRQRRR-RPWLFPYHAFS(SEQ ID NO：6)、RKKRRQRRR-PYWRHRHPRYRVF(SEQ ID NO：7)、RKKRRQRRRQFWRHPWLQD(SEQ ID NO：8)、RKKRRQRRR-WPHRHLFWKE(SEQ ID NO：9)、RKKRRQRRR-PLYHRHPWFG(SEQ ID NO：10)、RKKRRQRRRYRFFFPYHLD(SEQ ID NO：16)、RKKRRQRRRPQRFPYHYDNRLD(SEQ ID NO：17)、RKKRRQRRRFWNHRHPHSD(SEQ ID NO：18)、RKKRRQRRRWLHRHRFSG(SEQ ID NO：19)或RKKRRQRRRQFPFPYQYRG(SEQ ID NO：20)。
SEQ ID NO：21所示的穿膜肽为TAT修饰后的，是一种已知的非常成熟的穿膜肽的修饰方法。此穿膜肽的修饰可以增强多肽的穿膜性能。
在本申请第二种典型的实施例中，提供了一种多肽药物，多肽药物包括上述任一种多肽以及药学上可选的辅料。含有上述多肽分子的药物具有与HDAC5靶向结合能力高、抗癌活性高、低毒及低副作用的优势。
上述药学上可选的辅料，可以根据所欲制备的药物的剂型和/或给药方式、给药途径的不同，而有所不同，可以从现有药用辅料中合理选择。包括但不仅限于药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂等辅料。而且，该多肽药物可以制成不同的剂型以适应多样化的给药途径，给药途径包括口服给药、注射给药或经皮给药等。而药物的剂型包括胶囊、片剂、口服液、注射剂或透皮吸收剂等。
具体地，可以按照制药工业中已知的方法将本申请的药物制成胶囊剂、片剂、口服液、注射剂或透皮吸收剂等。优选地，注射剂为静脉注射剂。在制备适于口服给药的胶囊剂、片剂、口服液时，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。另外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本申请的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。若制备适于胃肠道外途经给药的溶液剂和悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mm)磷酸缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型的制剂中还可以含有其他的增溶剂、崩解剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。
上述多肽药物由于具有抗癌活性，因而可以作为抗癌药物，优选为抗肝癌药物。在某些实施例中，多肽以带穿膜肽的线性多肽形式存在，以进一步提高该多肽药物的穿膜性能。在另一些实施例中，多肽以无穿膜肽的环状或线性多肽形式存在，具有一定的抗癌活性效果，尤其是抗肝癌的活性。进一步优选地，穿膜肽选自上述SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。具有穿膜肽的多肽如上述SEQ ID NOs：6-10或SEQ ID NOs：16-20所示，更优选为SEQ IDNO:6或16所示的序列。
上述多肽药物中，多肽的浓度根据剂型或给药方式的不同而有所不同。在一种优选的实施例中，多肽药物中多肽的浓度为0.1μM～100μM，在该浓度范围内均具有抗癌活性。更优选地，浓度为1μM～100μM，进一步优选为10μM～100μM。具体地，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μM。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了上述任一种多肽在制备用于治疗癌症的药物中的应用。由于HDAC5是对核小体中的核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)的N端赖氨酸残基的去乙酰化，与各种肿瘤的发生发展有着密切的关系。因而，本申请筛选到的能够特异性与HDAC5结合的多肽在一定程度上都是具有潜在的治疗癌症的药用开发价值的。尤其是抗肝癌的药用价值。
上述癌症包括但不仅限于如下任意一种或多种：肝癌、肺癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、血管瘤、骨癌、宫颈癌、子官癌、卵巢癌、脂肪癌、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、胸腺癌以及中枢神经系统癌症；优选地，中枢神经系统癌症为脑癌。优选上述癌症为肝癌。
需要说明的是，上述治疗包括不同程度的抑制癌细胞增殖等效果，具体的抑制程度包括一种5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、甚至100％的癌细胞的增殖。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种检测HDAC5的试剂盒，该试剂盒包括上述任一种多肽。由于上述多肽通过多肽芯片结合AI辅助筛选及实验验证了上述多肽具有特异性靶向结合HDAC5的能力，进而通过结合HDAC5而具有抗癌活性，尤其是SEQ ID NO：1、11或SEQ ID NO：6或16所示的多肽抗肝癌细胞的活性。因此，利用包含上述多肽的试剂盒能够特异地准确地检测HDAC5的存在与否以及表达量高低。
由于多肽分子相对较小，为提高检测能力，可以将上述多肽制备成多肽-载体蛋白偶联物的形式进行检测。根据多肽-载体蛋白偶联物制备的需求，可以选择具体合适的载体蛋白来形成多肽-载体蛋白偶联物。在一些优选的实施例中，多肽以多肽-蛋白偶联物的形式存在。本申请中的载体蛋白包括但不仅限于BSA(牛血清蛋白)、OVA(卵清白蛋白)、KLH(钥孔血蓝蛋白)或CS(酪蛋白)。根据不同多肽的氨基酸序列组成，为了便于与载体蛋白偶联，通过需要通过连接序列(又叫连接子或linker)与载体蛋白偶联。本申请中，连接序列优选CGSG。
需要说明的是，上述多肽-载体蛋白偶联物是重组合成表达的蛋白。上述重组表达的多肽-载体蛋白偶联物，除可以检测HDAC5外，基于蛋白的同源性，在较大程度上也可以用于检测与HDAC5蛋白同源的其他蛋白，或者HDAC蛋白家族里的其他重组蛋白。
根据多肽氨基酸的理化性质、所用的载体蛋白的不同及偶联方式的不同，每个载体蛋白所能偶联上的多肽的条数也有所不同。从偶联的效率及对抗体识别结合能力综合考虑，优选每个载体蛋白偶联2～50条多肽，更优选为3～45条、5～40条、5～35条、5～30条、8～30条、10～30条、12～30条、15～30条；或者，更优选为6～36条、8～32条、10～28条、10～26条、10～24条、10～22条、10～20条、10～18条、10～16条及10～15条中的任意一种情况。
上述试剂盒，根据具体需要可以制备成多种不同类型的检测试剂盒。但从方便检测，便于判断检测结果的角度考虑，试剂盒中的多肽可以设置为预包被于固相载体上的形式。具体的预包被的固相载体根据需要合理设计。更优选，固相载体包括酶标板(多为聚苯乙烯材料的)、膜载体或微球；进一步优选地，膜载体包括硝酸纤维素膜(使用最广泛)、玻璃纤维素膜或尼龙膜，更进一步优选地，膜载体上还包被有阳性对照物，多肽-载体蛋白偶联物和阳性对照物按检测顺序在硝酸纤维素膜上依次设置。
根据试剂盒的具体检测方法的不同，试剂盒中具体的配套试剂也相应有所不同，但均可以根据已知试剂盒的配制方式进行组合配套试剂。优选地，上述试剂盒中还包括以下至少之一：(1)酶标二抗，更优选酶标二抗为HRP标记的二抗(对应于ELISA检测试剂盒)；(2)胶体金结合垫，胶体金结合垫上包被有胶体金标记的多肽-载体蛋白偶联物和阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫胶体金检测试剂盒)；(3)标记垫，标记垫上包被有荧光标记的微球，微球上负载有阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫荧光检测试剂盒)。
上述免疫胶体金检测试剂盒和免疫荧光检测试剂盒检测相对更方便，只需要建立阳性对照的C线和检测样本的T线即可。阳性对照的C线处预包被的阳性对照物，只要是能够随着待测样本的血清层析过程携带过来的带有检测标记的特异性结合物结合即可，对具体的阳性对照物的具体抗原或抗体并无特殊限定。优选地，上述阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。
上述抗鼠免疫球蛋白根据免疫的对象的不同，可以是羊抗鼠的免疫球蛋白或兔抗鼠的免疫球蛋白，或者是其他可免疫的动物抗鼠的免疫球蛋白。同样地，抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白也可以根据免疫动物的不同，是不同物种来源的免疫球蛋白。上述免疫球蛋白可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE中的任意一种。这些抗免疫球蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
上述试剂盒中，根据所需要检测的样本数量的多少，所使用的酶标板的规格也有所不同，可以在12～384孔酶标板中合理选择。预包被的酶标板中，根据不同多肽-载体蛋白偶联物中的检测对象的不同，每个孔中对多肽-载体蛋白偶联物的包被量也有所差异。类似地，多肽-载体蛋白偶联物在膜载体上(比如，硝酸纤维素膜)的包被量也不同。比如，可以为0.8～8μg/cm，更优选为0.8～7μg/cm，0.8～6μg/cm、0.8～5μg/cm、0.8～4μg/cm、0.8～3μg/cm、0.8～2μg/cm、0.8～1.8μg/cm、0.8～1.7μg/cm、0.8～1.6μg/cm、0.8～1.5μg/cm、0.8～1.4μg/cm或0.8～1.2μg/cm。
在一些优选的实施例中，该试剂盒包括芯片，芯片上预置有多肽，其中多肽由上述多肽组成多肽阵列。将上述多肽设置在多肽芯片上进行检测，不仅能利用该多肽对HDAC5的靶向结合能力提高检测的特异性，而且能利用阵列形式提高检测的通量，因而适用于癌症的大规模筛查。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，本申请的实施例主要包括以下几部分：
A.数据分析：根据已有的多肽芯片中含有的肽库，筛选在目标靶点蛋白和阴性血清样本两组中存在显著差异的结合肽段；
B.AI计算：特异多肽特征随机剪切，计算与HDAC5蛋白的结合力，筛选结合力排名靠前的多肽并与现有知识库比对；
C.实验验证：合成有潜力的多肽进行多肽抗癌的细胞实验，验证以筛选有活性的多肽。
实施例1：多肽库筛选以及AI分析
1.利用多肽芯片，通过利用市售的重组的纯化蛋白HDAC5蛋白(厂家：BPSBioscience；货号：Q9UQL6)，与阴性血清对照，初步筛选出两组中存在显著差异的结合肽段，作为第一候选多肽集合。针对第一候选多肽集合，利用AutoDock CrankPep软件基于Docking的策略计算各候选多肽与HDAC5蛋白之间的结合力，再次筛选出第二候选多肽集合。
1)HDAC5蛋白的三维结构的查找
从PDB数据库下载HDAC5蛋白的三维构象文件。[RCSB PDB-5UWI:CrystalStructure of HDAC5 NES Peptide in complex with CRM1-Ran-RanBP1](具体网址为https://www.rcsb.org/structure/5UWI)。
2)准备受体蛋白
提取受体蛋白坐标：5UWI PDB文件中包含了蛋白、配体和水分子；首先提取出蛋白的坐标。
加氢：晶体结构中通常缺少氢原子的坐标(因为氢原子电子少，且质子核对电子吸引能力弱，因此很难定位)。但是在docking过程中，氢原子尤其是极性氢原子对计算静电作用是必须的。因此需要给蛋白加上氢原子。
定义配体结合的3D搜索空间：如果结合位点未知，理论上可以定义一个长方体盒子包含整个蛋白或者随便一个特定区域。
3)准备参考配体
从5UWI PDB结构中提取参考配体的原子位置。
与蛋白结构类似，配体的结构也缺少氢原子，因而需要添加氢原子并且定义哪些键是可以旋转的以用于柔性docking。
4)准备docking配置文件
Docking配置文件包含了输入的受体(蛋白)、配体(化合物)和默认搜索参数的信息。
DockingD及使用PyMol可视化Docking结果。
结果见图1。图1示出的是筛选得到的第二候选多肽与靶点蛋白HDAC5结合力的箱线图(横坐标表示的是结合能，绝对值越大，表示结合能力越强)。
2.根据图1中结合力的强弱，并结合已知的靶点蛋白HDAC5的相关知识挑选潜在的功能肽段进行合成，本申请选取了其中的10条多肽(见表1)进一步验证肽段的活性。且根据目前公开的多肽库数据(NCBI多肽组)进行比对，本申请的所有多肽为全新的序列。
表1：
多肽序列 结合能kcal/mol
RPWLFPYHAFS(SEQ ID NO：1) -115.7246
PYWRHRHPRYRVF(SEQ ID NO：2) -119.1618
QFWRHPWLQD(SEQ ID NO：3) -116.8866
WPHRHLFWKE(SEQ ID NO：4) -113.7353
PLYHRHPWFG(SEQ ID NO：5) -113.0858
YRFFFPYHLD(SEQ ID NO：11) -113.0858
PQRFPYHYDNRLD(SEQ ID NO：12) -111.5115
FWNHRHPHSD(SEQ ID NO：13) -110.8541
WLHRHRFSG(SEQ ID NO：14) -110.2346
QFPFPYQYRG(SEQ ID NO：15) -110.0055
注：表中结合能的绝对值越大，说明多肽结合力可能越高。
实施例2：多肽合成
1)委托吉尔生物合成如下候选肽段和阳性对照多肽：
表2：
Figure BDA0003362750820000101
其中，合成SEQ ID NO：6和16所示的多肽的HPLC图谱分别如图2和图3所示。
实施例3：肽段生物学功能验证试验
一、化学品和试剂：
表3：
试剂 来源
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) Invitrogen(CA，USA)
胎牛血清(FBS) HyClone Laboratories，Inc(USA)
二甲基亚砜(DMSO) Sigma
MTT试剂盒 生工生物(E606334-0500)
二、MTT实验步骤：
1.所有的管子在打开之前需要先离心。
2.MTT溶液的配制：用MTT Solvent(组分B)溶解MTT Reagent(组分A)，配制成5mg/ml的MTT溶液。配制后即可使用，或置于-20℃避光保存，也可以根据需要适当分装后置于-20℃避光保存。
3.每孔加入10μL MTT溶液，使每个孔中的MTT的终浓度为0.5mg/ml。
4.轻轻混匀后，置于5％CO2、37℃培养箱中孵育4小时。
5.小心吸取每个孔中的培养基以防止细胞单层破裂。
6.每孔加入100μL Formazan Solubilization Solution(组分C)
7.将96孔板放在振荡器上轻轻震荡10分钟，直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜全部溶解。
8.在酶标免疫检测仪570nm测定吸光度。
三、对HepG2细胞活性的抑制情况
(1)细胞培养：将HepG2细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)和含有1％青霉素和链霉素的Dulbecco's改良伊格尔培养基(DMEM)中，置于37℃、潮湿的、含5％二氧化碳的环境中。
(2)在体外检测多肽的生物活性：釆用MTT(USE)检测法检测细胞增殖情况，先将HepG2(ATCC)细胞种植于96孔板中，每孔中含5×103个细胞，每孔含有10％FBS的l00μLDMEM，留空8个孔作为空白对照。孵育(37℃，5％CO2)过夜，使细胞附着到井上。加入不同浓度(0.1μM，1μM，10μM，100μM)精确溶于DMSO的设计多肽(iCXOncH1a、iCXOncH2a、iCXOncH3a、iCXOncH4a、iCXOncH5a、iCXOncH6a、iCXOncH7a、iCXOncH8a、iCXOncH9a、iCXOncH10a)，以及阳性对照，每孔加入含2％FBS的DMEM。孵育(37℃，5％CO2)48小时，使多肽生效。
每孔加入0.05％MTT溶液。孵育(37℃，5％CO2)3小时，使MTT代谢。弃去培养基，在100μL DMSO中重悬甲臜(MTT代谢产物)，将甲臜混入溶剂中。读取570nm处的光密度，记录结果。以浓度为横坐标，细胞活存率为纵坐标绘制生长曲线，结果如图4和图5所示。
图4结果显示：多肽iCXOncH3a具有显著的抗癌活性，在浓度为10μM～100μM可有效抑制癌细胞生长，且在100μM时，抑制活性更高，明显优于同浓度下的阳性对照肽。由实验数据推算iCXOncH3a的IC50＝121.3μM，阳性对照的IC50＝218.1μM。由此可见，本申请的多肽活性优于阳性对照肽，可作为后续开发的活性化合物。
图5结果显示：多肽iCXOncH6a具有显著的抗癌活性，在浓度为10μM～100μM可有效抑制癌细胞生长，且在100μM时，抑制活性更高，抑制率显著优于同浓度下的阳性对照多肽。由实验数据推算iCXOncH6a的IC50＝39.5μM，阳性对照的IC50＝218.1μM。
IC50值计算方法：根据不同浓度下，多肽对肿瘤细胞的抑制率，绘制以多肽浓度为横坐标，肿瘤细胞的抑制率为纵坐标的回归曲线，得出回归方程式与R值，计算50％抑制率时的多肽浓度，即为IC50值。
实施例4：细胞增殖显微观察
通过对iCXOncH3a和iCXOncH6a采用不同浓度(1μM，10μM，100μM)的多肽对细胞进行处理，结果如图6和图7所示，多肽处理后的癌细胞生长缓慢，且在100μM的处理下，癌细胞无存活。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过多肽芯片结合AI辅助筛选及实验验证了上述多肽具有特异性靶向结合HDAC5的能力，进而通过结合HDAC5而具有抗癌活性，尤其是SEQ ID NO：1或11所示的多肽及其带穿膜肽的多肽SEQID NO：6或16，具有显著的抗肝癌细胞活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海碳云智能科技有限公司
<120> 靶向HDAC5的多肽及其在制备用于治疗癌症的药物中的应用
<130> PN161915SZTY
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<223> HDAC5结合肽
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<212> PRT
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<223> HDAC5结合肽
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<223> HDAC5结合肽
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Tyr Asp Asn Arg Leu Asp
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<212> PRT
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His Ser Asp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Trp Leu His Arg His Arg Phe
1 5 10 15
Ser Gly
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(19)
<223> iCXOncH10a
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Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Phe Pro Phe Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Tyr Arg Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> PEPTIDE
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<223> 首尾相连的环状5肽
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 穿膜肽H7R8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> 穿膜肽
<400> 24
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(13)
<223> 穿膜肽
<400> 25
Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10

Claims (10)

1.一种靶向HDAC5的多肽，其特征在于，所述多肽特异性结合HDAC5，且所述多肽选自如下任意一条或多条：
SEQ ID NO：1：RPWLFPYHAFS；
SEQ ID NO：2：PYWRHRHPRYRVF；
SEQ ID NO：3：QFWRHPWLQD；
SEQ ID NO：4：WPHRHLFWKE；
SEQ ID NO：5：PLYHRHPWFG；
SEQ ID NO：11：YRFFFPYHLD；
SEQ ID NO：12：PQRFPYHYDNRLD；
SEQ ID NO：13：FWNHRHPHSD；
SEQ ID NO：14：WLHRHRFSG及
SEQ ID NO：15：QFPFPYQYRG。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为修饰后的肽段；
优选地，所述修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰；
优选地，所述化学基团修饰为PEG修饰、乙酰化修饰或酰胺化修饰中的任意一种或多种；
优选地，所述PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰；
优选地，所述PEG修饰位点选自所述多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；
优选地，所述PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；
优选地，所述多肽的N端和C端分别具有所述乙酰化修饰和所述酰胺化修饰；
优选地，所述氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；
优选地，所述亲水性氨基酸修饰为在所述多肽的N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，所述亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；进一步优选地，所述1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser；
优选地，所述半胱氨酸修饰为在所述多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端、C端、NC两端或肽链中间；
更优选地，在所述肽链中间添加半胱氨酸包括在所述肽链中间插入一个或多个半胱氨酸，或者一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于所述肽链的中间；
优选地，所述多肽以带穿膜肽的线性多肽或无穿膜肽的环状多肽形式存在；
优选地，所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：21：RKKRRQRRR；
更优选地，所述带穿膜肽的线性多肽选自如下任意一条或多条：
SEQ ID NO：6：RKKRRQRRRRPWLFPYHAFS；
SEQ ID NO：7：RKKRRQRRRPYWRHRHPRYRVF；
SEQ ID NO：8：RKKRRQRRRQFWRHPWLQD；
SEQ ID NO：9：RKKRRQRRRWPHRHLFWKE；
SEQ ID NO：10：RKKRRQRRRPLYHRHPWFG；
SEQ ID NO：16：RKKRRQRRRYRFFFPYHLD；
SEQ ID NO：17：RKKRRQRRRPQRFPYHYDNRLD；
SEQ ID NO：18：RKKRRQRRRFWNHRHPHSD；
SEQ ID NO：19：RKKRRQRRRWLHRHRFSG；
SEQ ID NO：20：RKKRRQRRRQFPFPYQYRG。
3.一种多肽药物，其特征在于，所述多肽药物包括权利要求1或2所述的多肽以及药学上可选的辅料。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述多肽药物为抗癌药物，优选为抗肝癌药物；
优选地，所述多肽药物中所述多肽的浓度为0.1μM～100μM。
5.权利要求1或2所的靶向HDAC5的多肽在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述癌症包括如下任意一种或多种：肝癌、肺癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、血管瘤、骨癌、宫颈癌、子官癌、卵巢癌、脂肪癌、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、胸腺癌以及中枢神经系统癌症；
优选地，所述中枢神经系统癌症为脑癌。
7.一种检测HDAC5的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的多肽。
8.根据权利要求7的试剂盒，其特征在于，所述多肽以多肽-蛋白偶联物的形式存在；
优选地，所述多肽-蛋白偶联物中的蛋白选自如下任意一种：牛血清蛋白、卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或酪蛋白；
更优选，所述多肽通过连接序列与所述蛋白偶联形成所述多肽-蛋白偶联物，进一步优选地，所述连接序列为CGSG。
9.根据权利要求7或8的试剂盒，其特征在于，所述多肽被包被于固相载体上；
优选地，所述固相载体包括酶标板、膜载体或微球；
优选地，所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；
优选地，所述膜载体上还包被有阳性对照物，所述多肽和所述阳性对照物按检测顺序在所述膜载体上依次设置；
优选地，所述试剂盒还包括如下至少之一：
(1)酶标二抗，更优选所述酶标二抗为HRP标记的二抗；
(2)胶体金结合垫，所述胶体金结合垫上包被有胶体金标记的抗原和所述阳性对照物的特异性结合物；
(3)标记垫，所述标记垫上包被有荧光标记的微球，所述微球上负载有所述阳性对照物的特异性结合物；
优选地，所述阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，所述阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。
10.根据权利要求7的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括芯片，所述芯片上预置有所述多肽组成的多肽阵列。
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