CN114917370B - 一种以lag-3为靶点的pet分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高分子杂环化合物与核医学显像技术领域，具体涉及一种以LAG‑3为靶点的PET分子探针及其制备方法与应用，该PET分子探针包括放射性同位素、靶向分子和连接体，连接体连接靶向分子和放射性同位素。该PET分子探针能够很好的对多种肿瘤微环境(B16,PANC‑02和MC38等)中的LAG‑3表达水平进行活体显像，不仅可以用于多种肿瘤微环境中的LAG‑3表达水平进行检测，还能辅助免疫抑制剂进行免疫治疗时的治疗选择和疗效评价，与现有技术相比该分子探针还具有高特异性、高灵敏度、非入侵、无创检测以及活体全身实时显像的特点；同时，该PET分子探针制备方法简便稳定，具备良好的市场推广应用前景。

Description

一种以LAG-3为靶点的PET分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及高分子杂环化合物与核医学显像技术领域，具体涉及一种以LAG-3为靶点的PET分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的早期诊断是分子影像学重要研究内容，可以为肿瘤的有效治疗提供有效手段。基于PET显影的肿瘤诊断技术，因其高分辨率、高组织穿透力、低剂量、实时活体显影等特点，已成为肿瘤早期诊断的重要工具。目前根据肿瘤营养需求，基于糖代谢、核酸代谢的PET显影剂均已上市。
淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)，又称为CD233，是一个属于免疫球蛋白(Ig)超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达在活化T细胞和NK细胞表面。LAG-3是T细胞的一个抑制性免疫检查点，能通过与MHCII反式激活因子(CIITA)结合诱导MHCII和MHCII辅助分子(括CD74和H2-DM等)的表达，从而发挥负向调控T细胞的增殖、激活和稳态。研究表明人CD4+细胞中封闭LAG-3能促进细胞增殖，并提高IL-2、IL-4、IFN-γ和TNFα的表达水平。此外，LAG-3还能参与调节性T细胞(Treg)的抑制性作用。当处于肿瘤环境或慢性感染时，长期的抗原刺激会导致LAG-3持续高表达，引起T细胞耗竭(exhaustion)。
因此，肿瘤微环境中LAG-3的表达水平检测不仅可以间接反映肿瘤免疫逃逸的程度，还能为以LAG-3为靶点的抑制药物的治疗选择提供参考，开发设计一种能够对多种肿瘤微环境中的LAG-3表达水平进行活体显像的分子探针具有重要临床应用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种以LAG-3为靶点的PET分子探针及其制备方法与应用，其目的是提供一种能够高特异性靶向LAG-3的分子探针，对LAG-3的表达水平进行活体显像，从而实现对于与LAG-3的表达水平相关肿瘤进行活体实时显像，用于肿瘤的的显像诊断和免疫治疗药物的效果评价。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种以LAG-3为靶点的PET分子探针，包括放射性同位素、靶向分子和连接体，所述连接体连接所述靶向分子和放射性同位素，所述靶向分子结构如式I所示：
作为优选，所述连接体结构如下式II、式III或式IV任一项所示：
其中，式II中n为2～6的整数；式III中n为3～7的整数；式IV中n为4～8的整数。
作为优选，所述放射性同位素为68Ga，18F，177Lu，89Zr,64Cu，99mTc中的任意一种。
作为优选，所述以LAG-3为靶点的PET分子探针由所述放射性同位素标记前体化合物制得，所述前体化合物结构式如下式V所示：
其中，n为2～6的整数。
作为优选，所述PET分子探针的结构式如下式VI所示：
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种以LAG-3为靶点的PET分子探针的制备方法：将式I所示的靶向分子和连接体结合形成前体化合物，然后将前体化合物和放射性同位素混合，在酸性条件下反应得到以LAG-3为靶点的PET分子探针。
作为优选，所述前体化合物和放射性同位素混合反应pH为4～4.5。
作为优选，所述前体化合物和放射性同位素混合反应温度为90～110℃，反应时间为10min。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种以LAG-3为靶点的PET分子探针在制备PET显像剂中的应用。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种以LAG-3为靶点的PET分子探针在评价免疫药物治疗LAG-3相关疾病的效果中的应用，所述LAG-3相关疾病包括黑色素瘤、肝癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤以及其他能影响LAG-3表达变化的肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的PET分子探针能够很好的对多种肿瘤微环境(B16,PANC-02和MC38等)中的LAG-3表达水平进行活体显像，不仅可以用于多种肿瘤微环境中的LAG-3表达水平进行检测，从而能够实现与LAG-3表达相关肿瘤的PET实时显像诊断，还能协助免疫抑制剂进行免疫治疗时的治疗选择和疗效评价；
2、本发明提供的分子探针还具有高特异性、高灵敏度、非入侵、无创检测以及活体全身实时显像的特点，该分子探针制备方法简便稳定，条件温和，制得的分子探针纯度大于95％，体外稳定性较好，利于临床推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中前体化合物NOTA-CC09质谱图；
图2为实验例1中68Ga-NOTA-CC09放射化学纯度HPLC图；
图3为实验例1中68Ga-NOTA-CC09放置4h后的稳定性HPLC图；
图4为实验例2中68Ga-NOTA-CC09动态PET成像图。
图5为实验例2中68Ga-NOTA-CC09在多种不同肿瘤模型中的PET成像图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1
制备以LAG-3为靶点的PET分子探针(68Ga-NOTA-CC09)
分子探针68Ga-NOTA-CC09包括放射性同位素、靶向分子和连接体，连接体连接所述靶向分子和放射性同位素，其中靶向分子结构如式I所示：
连接体结构如下式II所示：
其中，式II中n＝3；
放射性同位素为68Ga。
在本实施例中，将螯合基团NOTA、靶向分子和连接体组合成为前体化合物(NOTA-CC09)，如下式VII所示：
该前体化合物NOTA-CC09的质谱图如图1所示。
前体化合物NOTA-CC09的放射性标记方法：
1、向含有前体化合物NOTA-CC09(20-30μg)的EP管中加入1mL 0.25M NaOAc水溶液，混匀；
2、NOTA-CC09溶液转移至20mL反应管中；
3、用4mL 0.05M HCl将68Ga淋洗至反应管中，pH为4.0～4.5，放射性活度约为30-35mCi；
4、90℃，反应10min；
5、加入10mL去离子水淬灭反应；
6、反应体系过C18 Plus柱进行富集，并用10mL去离子水清洗C18 Plus柱；
7、依次用1mL乙醇和10mL生理盐水将产物淋洗至装有滤膜产品瓶中，形成68Ga-NOTA-CC09产品注射液,放射性活度约为20-25mCi；
反应式如下所示：
实验例1
68Ga-NOTA-CC09产品注射液进行HPLC纯度和稳定性分析
HPLC纯度分析：流动相A为含0.1％TFA的蒸馏水，流动相B为含0.1％TFA的乙腈，色谱柱为ZORBAX SB-C18。洗脱方式为梯度洗脱(0-2mim：5％乙腈；2-14min：90％乙腈)，实施例1制得的68Ga-NOTA-CC09的放射化学纯度HPLC结果如图2所示，由图2可知，产品68Ga-NOTA-CC09出峰时间为7.48min左右，纯度大于95％。
体外稳定性分析：取适量68Ga-NOTA-CC09产品注射液，4h后测定其放化纯度用于稳定性研究，结果如图3所示，放置4h后68Ga-NOTA-CC09产品注射液放化纯度(图3)与该产品本身的放化纯度(图2所示)基本一致，这说明制得的68Ga-NOTA-CC09产品注射液体外稳定性良好。
实验例2
小鼠PET活体成像实验
1、购买30只C57小鼠，分三组分别构建皮下黑色素瘤B16模型，胰腺癌PANC02模型和结直肠癌MC38模型，肿瘤大小为0.5cm左右时作为模型鼠备用。
2、按实施例1方法放射性标记制备68Ga-NOTA-CC09，并进行质量控制。
3、B16肿瘤模型鼠尾静脉注射68Ga-NOTA-CC09(0.1-0.2mCi)，并进行60min动态扫描，结果如图4所示。图4结果表明该PET分子探针不仅能较好的肿瘤部位进行浓聚，具有较好的肿瘤微环境显像前景，同时该PET分子探针能快速经过肾脏代谢得到清除，具有较高的生物安全性。
4、分别对黑色素瘤B16模型，胰腺癌PANC02模型和结直肠癌MC38模型注射68Ga-NOTA-CC09(0.1-0.2mCi)，注射30min后进行小动物PET/CT显像，结果如图5所示，该分子探针能特异性的靶向黑色素瘤B16模型、胰腺癌PANC02模型和结直肠癌MC38模型中的LAG-3，从而实现了对于与LAG-3表达相关的肿瘤的活体显像。
5、分析获取肿瘤部位的SUV值，其中68Ga-NOTA-CC09探针在黑色素瘤B16模型、胰腺癌PANC02模型和结直肠癌MC38模型中肿瘤摄取SUV值分别为4.6±2.2、3.1±0.3和3.6±1.1，由此可见该探针能够特异性的被肿瘤高特异性和高灵敏度大量摄取，从而实现了对于与LAG-3表达相关肿瘤的PET实时显像诊断，还能协助免疫抑制剂进行免疫治疗时的治疗选择和疗效评价。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种以LAG-3为靶点的PET分子探针，其特征在于，所述PET分子探针的结构式如下式VI所示：
2.一种如权利要求1所述的以LAG-3为靶点的PET分子探针的制备方法，其特征在于，将式I所示的靶向分子和连接体结合形成如式V所示的前体化合物，然后将前体化合物和放射性同位素混合，在酸性条件下反应得到以LAG-3为靶点的PET分子探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述前体化合物和放射性同位素混合反应pH为4～4.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述前体化合物和放射性同位素混合反应温度为90～110℃，反应时间为10min。
5.一种如权利要求1所述的以LAG-3为靶点的PET分子探针或如权利要求2～4任一项制备方法制得的以LAG-3为靶点的PET分子探针在制备PET显像剂中的应用。
6.一种如权利要求1所述的以LAG-3为靶点的PET分子探针或如权利要求2～4任一项制备方法制得的以LAG-3为靶点的PET分子探针以非疾病诊断目的在评价免疫药物治疗LAG-3相关疾病的效果中的应用，所述LAG-3相关疾病包括黑色素瘤、肝癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤以及其他能影响LAG-3表达变化的肿瘤。
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