CN111116713B - Sirpa蛋白亲和环肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Sirpɑ胞外段亲和环肽及其应用。亲和环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明还提供了含所述环肽的药物组合物或试剂盒。本发明的亲和环肽能够亲和Sirpɑ胞外段，阻断Sirpɑ与CD47之间的相互作用，进而起到抗肿瘤效果。

Description

Sirpa蛋白亲和环肽及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及Sirpɑ蛋白亲和环肽及其应用。

背景技术：

一直以来，肿瘤以其不断增高的致死率和发病率成为不断威胁人类生命健康的重大严重疾病之一，人们不断探寻治疗肿瘤的方法。传统医治肿瘤的措施包括化学治疗、放射治疗和外科治疗，虽然这些方法在临床上已经运用数年，但是它们局限性而且对人体的副作用比较大。目前肿瘤治疗领域最受关注的是免疫治疗，肿瘤免疫治疗是激发机体自身的免疫机制，通过改善自身免疫能力对肿瘤细胞进行杀伤，达到抗肿瘤的目的。2013年《科学》杂志把肿瘤的免疫治疗列为十大科学突破之首，肿瘤免疫治疗法逐步成为继三大传统治疗方法之后的第四种重要疗法。肿瘤的免疫治疗是科学界的一大热点，2018年诺贝尔生理学或医学奖也授予这一领域的两位免疫学家，以表彰他们“发现负性免疫调节治疗癌症的疗法方面的贡献”。

肿瘤细胞通过上调免疫检查点，使其与相应配体结合，产生负性调控信号从而抑制吞噬细胞、T细胞等免疫细胞对肿瘤细胞的威胁而发生免疫逃逸。在肿瘤免疫逃逸的机制中，高表达免疫抑制信号这一机制近年来受到越来越多的关注。随着先天免疫检查点PD-1和CTLA-4的抗体在临床上的使用，CD47正在成为免疫检查点治疗的下一个主要目标，受到科研人员广泛的关注。

CD47是一种广泛表达在体内多种细胞表面的跨膜糖蛋白，尤其表达在T细胞、红细胞等造血细胞上，是免疫球蛋白超家族的成员之一。CD47不仅可以参与中性粒细胞的增殖、粘附、迁移、凋亡和吞噬作用，而且也可以在免疫调节、体内平衡和神经系统中发挥重要调节功能。此外，CD47还可以介导血管平滑肌细胞的增殖和迁移、血小板的活化和扩散以及粒细胞和T细胞向感染部位的募集。最重要的是，CD47可以在生物体内的宿主细胞上起到“自身”标记的作用，当被激活时，CD47启动信号转导级联反应，与循环免疫细胞如巨噬细胞表面上的SIRP-α结合，发出“不要吃我”的免疫负性调控信号,抑制巨噬细胞对自身细胞的识别和吞噬，减少自身免疫疾病的发生。例如，表达在红细胞膜上的CD47可以使年幼的红细胞避免被吞噬细胞发现，从而继续行使运输氧气的作用，然而随着红细胞的不断成熟，其表面上的CD47表达量逐渐降低，衰老的红细胞就可以及时有效地得到清除。

目前的研究发现，几乎所有的肿瘤细胞表面都会高表达CD47，通过CD47与SIRP-α结合后产生的抑制性信号通路来逃避免疫细胞对它们的吞噬作用，并且肿瘤细胞上CD47的高表达也与不良预后有关。病理学上的研究结果表面，CD47在多种造血系统肿瘤中包括B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、急性淋巴细胞白血病干细胞、慢性粒细胞白血病细胞、急性髓细胞白血病干细胞等多种肿瘤细胞表面的表达量都显著高于正常细胞表面的表达量，通过它和SIRP-α结合后发出“不要吃我”的负性调控信号，导致肿瘤细胞逃避免疫系统的监视和攻击，从而抑制吞噬作用和T细胞活化作用，这也表明了肿瘤细胞会通过高表达免疫检查点相关的蛋白量来进行免疫逃逸。因此在CD47/SIRP-α通路的基础上，寻找合理有效的治疗策略也是科学家们正在面临和亟待解决的问题。

目前针对CD47/SIRP-α通路的单克隆抗体已经上市，应用于肿瘤的免疫治疗，但抗体类药物生产成本高、组织渗透性差、半衰期长，不能很快终止免疫不良事件，而多肽等小分子药物合成方便、组织渗透性好、免疫原性也较低。

发明内容：

本发明独辟蹊径，提供了一种Sirpɑ蛋白胞外段亲和环肽，并经过实验证明了该亲和环肽对Sirpɑ蛋白胞外段的体外亲和力强，可阻断Sirpɑ/CD47蛋白结合，故而具有抗肿瘤活性。

第一方面，本发明提供了一种环肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所示。所述环肽的各氨基酸的构型可独立地选自D型或L型，比如各氨基酸的构型均为D型或L型。

任选地，所述氨基酸序列中的首尾两个氨基酸(即两个半胱氨酸)，通过形成酰胺键或二硫键彼此相连，优选通过各自的巯基形成二硫键彼此相连而成环。

第二方面，本发明提供了含前述第一方面所述环肽的药物组合物或试剂盒。

第三方面，本发明提供了前述第一方面所述环肽在制备药物组合物或试剂盒中的应用。

第二方面或第三方面所述的试剂盒可用于检测待测物对Sirpɑ蛋白的亲合和或阻断(如阻断CD47与Sirpɑ的结合)能力，或，用于定性、定位或定量检测生物样品中Sirpɑ蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

第二方面或第三方面所述的药物组合物可用于下述至少一种用途：

1)抗肿瘤，如结肠癌或黑色素瘤。

2)阻断CD47与Sirpɑ蛋白的结合。

3)增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。

所述Sirpɑ蛋白指本领域哺乳动物的Sirpɑ蛋白，如人或小鼠的Sirpɑ蛋白。

本发明的多肽可通过固相合成制得，如采用标准Fmoc方案制备。

本发明的有益效果：

本发明独辟蹊径，通过反复筛选获得了Sirpɑ蛋白胞外段的亲和环肽。该类环肽对Sirpɑ蛋白胞外段的体外亲和力强，阻断Sirpɑ/CD47蛋白结合的效果好，进一步的体外刺激人源巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，在一定程度上抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长，这些实验表明，亲和环肽作用目标明确，对高表达CD47蛋白的肿瘤抑制效果明显，且无明显毒副作用，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。

附图说明：

图1为噬菌体展示肽库的筛选结果、序列及其与Sirpɑ蛋白亲和结果；

图2a为亲和环肽SP1-SP6在200μM时的阻断率结果；

图2b为亲和环肽SP4在多个μM浓度时的阻断率结果；

图2c为亲和环肽SP5在多个μM浓度时的阻断率结果；

图3a为亲和环肽SP5促进人外周血诱导的巨噬细胞对细胞HT29的吞噬的结果，对照为磷酸盐缓冲液(pH 7.2)；

图3b为SP5促进人外周血诱导的巨噬细胞对细胞的吞噬的结果，对照为磷酸盐缓冲液(pH7.2)；

图4为亲和环肽SP5对接种MC38的小鼠移植瘤体积变化的影响；

图5为亲和环肽SP5对接种MC38的小鼠体重变化的影响；

图6为亲和环肽SP5对接种B16-OVA的小鼠移植瘤体积变化的影响；

图7为亲和环肽SP5对接种B16-OVA的小鼠体重变化的影响；

各图中涉及显著性分析标识*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式:

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品，部分示例如下：

试剂：

牛血清白蛋白(BSA)；

胎牛血清(FBS)；

培养基和溶液：

LB培养基、上层琼脂、LB/IPTG/X-gal平板、Protein A/G Mix Magnetic Beads、TBS缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，含有150mM NaCl)、Tris-HCl(pH 9.1)中和液、PEG-8000/NaCl沉淀液、Tris-T缓冲液、洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH 2.2]，1mg/mL BSA)、中和液(1M Tris-HCl[pH 9.1])、蛋白标记试剂盒Monolith NT^TM His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA、PBS7.2、PBST、BSA、Tween-20、TBST洗涤液缓冲液均按照现有技术制备即可，不再详细描述。

生物材料：

ER2738菌，New England Biolabs,Inc.公司；

MC38细胞、B16-OVA细胞来源于ATCC细胞库；

CHO-K1-hSirpɑ细胞(过表达hSirpɑ的细胞)实验室构建。

实施例1

(1)测定噬菌体滴度

接种ER2738单菌落于10mL LB培养基中，摇床培养至对数期(OD_600nm值约为0.5)。用LB培养基将噬菌体进行10倍系列稀释。稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸～10¹²；未扩增的淘选洗脱物：10¹～10⁵。将已达到对数期的菌体每200μL装入一微量离心管中，然后每管加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育5min。将感染菌体加入45℃预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上，使其均匀铺开。待平板冷却15min后，倒置于37℃培养过夜。第二天检查平板，计数有～10²个噬菌体的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

(2)淘选过程

①第1轮淘选：

磁珠预处理：涡旋混匀Protein A/G Mix Magnetic Beads悬液，吸取5μL置于无菌1.5mL低吸附EP管中，加入1mL无菌TBS颠倒数次进行洗涤，洗涤后将EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附在靠近磁力架一侧的EP管管壁上后将液体吸弃，再加入1mL无菌TBS重复洗涤1次。

磁珠封闭：洗涤后的磁珠加入1mL封闭液(TBS+1％BSA)，4℃封闭1h，封闭期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

噬菌体和蛋白结合：在磁珠封闭期间，取另一只无菌1.5mL EP管，加入hSirpɑ-Fc蛋白4μg(10μL TBS溶解)+180μL TBS+10μL环七肽库(2×10¹¹个噬菌体)，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

封闭后的磁珠洗涤：含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL 0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)颠倒数次进行洗涤，共洗涤4次。

蛋白和磁珠结合：将结合噬菌体后的蛋白及噬菌体混合液转移至洗去封闭液的磁珠中，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

洗涤：将含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃液体，加入1mL 0.1％TBST颠倒数次进行洗涤，共洗涤5次。

洗脱：洗涤后的磁珠加入1mL洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH2.2]，1mg/mL BSA)，室温洗脱10min，期间将EP管置于旋转摇床快速颠倒混匀。

中和：将EP管置于磁力架上，收集洗脱液，加入150μL中和液(1M Tris-HCl[pH9.1])进行中和。

扩增：将洗脱中和后的噬菌体取出10μL用于滴度测定，剩余噬菌体扩增用于下一轮淘选。

②第2轮淘选：

磁珠预处理：涡旋混匀Protein A/G Mix Magnetic Beads悬液，吸取5μL置于无菌1.5mL低吸附EP管中，加入1mL无菌TBS颠倒数次进行洗涤，洗涤后将EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附在靠近磁力架一侧的EP管管壁上后将液体吸弃，再加入1mL无菌TBS重复洗涤1次；第2轮到第5轮淘选该步骤制备两支。

磁珠封闭：洗涤后的磁珠加入1mL封闭液(TBS+1％BSA)，4℃封闭1h，封闭期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

噬菌体结合Fc蛋白：在封闭50min时，取另一只无菌1.5mL EP管，加入2.5μghIgG1-Fc蛋白和全部第1轮淘选扩增后的洗脱物(约200μL)，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

封闭后的磁珠洗涤：取一只封闭过的含磁珠EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤4次。

差向Fc蛋白：将“噬菌体结合Fc蛋白”步的混合液加入磁珠中，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀；此步骤后，结合Fc蛋白的噬菌体被固定在磁珠上除去，经磁珠分离以后获得上清液备用。

蛋白和噬菌体结合：取另一只无菌1.5mL EP管，加入上步获得的上清液，再加入hSirpɑ-Fc蛋白2.4μg(10μL TBS溶解)，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

洗涤：取另一只封闭过的含磁珠EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL 0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤4次。

蛋白和磁珠结合：将结合后的蛋白和噬菌体混合液转移至磁珠中，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀。

洗涤：含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃液体，加入1mL 0.2％TBST洗涤10次；

洗脱：洗涤后的磁珠加入1mL洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH2.2]，1mg/mL BSA)，室温洗脱10min，期间将EP管置于旋转摇床快速颠倒混匀。

中和：将EP管置于磁力架上，收集洗脱液，加入150μL中和液(1M Tris-HCl[pH9.1])进行中和。

扩增：将洗脱中和后的噬菌体取出10μL用于滴度测定，剩余噬菌体扩增用于下一轮淘选。

③第3-5轮淘选：

与第2轮淘选步骤类似，在淘选过程中，第3-5轮hSirpɑ-Fc蛋白使用量分别为2.4μg、2.4μg和1.6μg；最后一次TBST洗涤磁珠时所用Tween-20浓度分别为0.3％、0.5％和0.5％。

(3)噬菌体扩增

扩增：将过夜培养后进入对数生长期的E.coli ER2738宿主菌按照1:100的体积比接种至20mL LB液体培养基中(250mL无菌三角瓶盛装)，加入终浓度为0.1％的四环素Tet及待扩增的噬菌体，置于37℃水平摇床，270rpm/min培养4.5～5h(剧烈震荡，以提供足够的氧气)。

沉淀：将扩增后的培养物转移至50mL无菌离心管中，12000g，4℃离心10min，将上清液(包含扩增后的噬菌体)转移至新的无菌50mL离心管中，弃去沉淀(E.coli ER2738菌体)，重复一次离心，尽可能除去菌体。将约80％的上清液转移至新的无菌50mL离心管中，加入其体积1/6的PEG-8000/NaCl，混合均匀后冰上沉淀1h以上，最好4℃沉淀过夜；

重悬：噬菌体经沉淀后可形成少量絮状物，12000g，4℃离心10min，弃去上清，再短暂离心，吸弃残留的上清液，将沉淀用1mL无菌TBS重悬。

再沉淀：将TBS重悬液转入1.5mL无菌EP管中，加入其体积1/6的PEG-8000/NaCl，再次冰上沉淀1h，12000g，4℃离心10min，弃上清。

重悬：沉淀用200μL无菌TBS重悬，12000g，4℃短暂离心，除去残余的不溶物，上清液即为扩增后的次级肽库，用于下一轮淘选或滴度测定。

(4)噬菌体DNA序列测定及多肽序列同源性分析

取上步噬菌体储存液进行噬菌体克隆DNA测序；根据DNA序列推导其所编码的氨基酸序列，并利用DNAMAN软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明，在阳性克隆中共得到多个插入环七肽序列，即特异性结合人Sirpɑ蛋白的环七肽序列，其中6个亲和环肽命名为SP1-SP6，其序列分别如SEQ ID NO.1-6所示，这6个环肽肽的各氨基酸的构型均为L型，其中氨基酸序列中首尾两端的两个半胱氨酸之间形成一个二硫键S-S，将肽首尾链接成为环状。

实施例2

(1)人Sirpɑ蛋白标记：用PBST调整蛋白浓度至200nM，取100μL备用；向固体荧光染料中加入50μLPBST，涡旋混合染料；使用PBST将染料的浓度调节至100nM；以体积比为1:1的比例混合蛋白质和染料，室温避光孵育30min。

(2)将样品在4℃和15 000g条件下离心10分钟。保留上清，弃沉淀，蛋白标记完成。

(3)MST检测：准备16个200μL EP管，标记为1-16，向第1个EP管中加入20μL 400μM的亲和环肽溶液，然后将管1中的亲和环肽溶液用PBST倍比稀释至2-16管中；向1-16管中加入10μL标记的人Sirpɑ蛋白，混匀；室温孵育5min后，用毛细管吸取1-16管中的混合溶液，按照从高浓度到低浓度从上至下依次排列于毛细管板条上，并开始MST仪器检测。

MST检测亲和环肽SP1-SP6与人Sirpɑ蛋白亲和力，图1结果显示，亲和环肽SP1-SP6都对Sirpɑ蛋白具有亲和力。

实施例3

(1)将CHO-K1-hSirpɑ细胞用1640培养基(含10％FBS)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养至状态良好。收集细胞，调整细胞密度，按3×10⁵/管分装到1.5mL EP管中。4℃，3000rpm/min离心5min，弃去上清获取细胞沉淀备用。

(2)50μL PBS(pH7.2)缓冲液的反应体系中梯度稀释得不同浓度(0，31.25μM，62.5μM，125μM，250μM，500μM，1000μM)的SP4、SP5环肽溶液，另配备SP1-SP6环肽200μM浓度的溶液。

(3)分别将上步配好的环肽溶液加入(1)的细胞沉淀中，轻柔涡旋混匀，冰上孵育30min，同时取一管细胞沉淀用50μL PBS(pH7.2)缓冲液重悬作为阴性对照。

(4)孵育结束后，每管加入15ng hCD47蛋白(阴性对照管除外)，轻柔涡旋混匀，冰上孵育30min；

(5)孵育结束后，所有样品管、阴性和阳性对照(反应体系中肽浓度为0μM)中加入荧光标记抗体anti-human IgG1-Fc PE，4℃避光孵育30min，期间轻微震动避免细胞沉降到EP管底部。

(6)孵育结束后，加入1mL PBS(pH7.2)洗涤一次，4℃，3000rpm/min离心5min，弃去上清获得细胞沉淀。

(7)200μL PBS(pH7.2)重悬细胞沉淀，经筛网过滤后转移至流式管，流式上机检测，并用FlowJo软件分析数据。

(8)阻断率计算公式：(阳性对照mean值-实验组mean值)/阳性对照mean值×100％。

图2a结果显示，亲和环肽SP1-SP6均对Sirpɑ/CD47的结合具有阻断效果，而改用31.25μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM的环肽浓度进行阻断实验时发现，环肽SP1、SP2、SP3、SP6的阻断率没有浓度依赖性，环肽SP4、SP5的阻断率具有浓度依赖性(如图2b、2c所示)。

实施例4

(1)取人外周血20mL与等体积PBS 7.2混合，取两个50mL的离心管分别加入10mL的TBD,在其上层分别加入20mL血和PBS 7.2的混合液，注意不要打破界面。2000rpm,升降速为1,25℃，离心30min。

(2)离心结束后，抽出白膜层细胞到15mL离心管中，补加10mL PBS 7.2,3000rpm,4℃，离心5min,离心结束后弃上清，用10mL PBS 7.2重悬细胞沉淀，同样条件离心，离心结束后弃上清，用DMEM培养基(含10％FBS)调细胞密度，每皿1×10⁷个细胞，10mL培养基DMEM(含10％FBS)，rGM-CSF(20ng/ml)诱导7d(隔天半量补加含20ng/mL GM-CSF的DMEM(10％FBS))。

(3)诱导7天后，将诱导的巨噬细胞从培养箱中取出，除去旧的培养基，加入新鲜无血清DMEM,饥饿处理1个小时。

(4)1个小时后，收巨噬细胞,计数，用含10％FBS的DMEM调密度2.5×10⁶/mL,加入到低吸附的96孔板中，40μL/孔，最终1×10⁵/孔。设置实验组，阴性对照，阳性对照组，将肽SP5稀释到1000μM，分别将肽、PBS7.2、anti mouseCD47(20μg/ml)加到实验组孔、阴性对照组孔、阳性对照孔中，各20μL/孔，培养箱孵育一个小时。

(5)收HT29-eGFP(含10％FBS的1640)、Raji-eGFP(含10％FBS的1640),细胞计数，调密度1×10⁷/mL,加到对应的上述96孔板中，40μL/孔，37℃共孵育4h。

(6)收细胞，Rat血清封闭10min，anti F4/80标记巨噬细胞，流式检测双阳性细胞数。

(7)吞噬率＝双阳细胞比例/巨噬细胞总比例(F4/80阳性)。

实验结果表明，图3a、3b所示，环肽SP5在200μM的浓度下能有效促进人外周血诱导的巨噬细胞对人结直肠癌细胞(HT29)和人淋巴瘤细胞(Raji)的吞噬。

实施例5

MC38结肠癌移植瘤模型实验、B16-OVA黑色素瘤移植瘤模型实验过程均如下：

(1)于每只C57BL/6小鼠的右侧背部接种1×10⁶个MC38细胞或2×10⁵个B16-OVA细胞,待小鼠的瘤体积达到40～60mm³时按瘤体积大小S型分组，分为3组，分别为亲和环肽SP5高剂量组、亲和环肽SP5低剂量组和生理盐水组(阴性对照组)。

(2)瘤旁皮下给药的方式注射，亲和环肽SP5低剂量组按照0.5mg/kg/d，亲和环肽SP5高剂量组按照2mg/kg/d，共给药14天，生理盐水组(阴性对照组)同样采用瘤旁皮下注射的给药方式，注射量为0.2mL。实验期间小鼠自由进食和饮水。

(3)隔日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，结果如图2、图5所示；隔日测量肿瘤的长(a)短(b)径及高(c)，并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，结果如图3、图6所示，计算公示为：V＝1/2×a×b×c。

实验结果表明，图4和图6所示瘤体积曲线表明SP5在0.5mg/kg和2mg/kg剂量下能够很好的抑制MC38结直肠癌移植瘤和B16-OVA黑色素移植瘤的生长，且图5和图7结果表明SP5在0.5mg/kg和2mg/kg的给药剂量下小鼠的体重无明显减轻现象。两种移植瘤模型给药期间小鼠精神状态都较为良好。

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> Sirpa蛋白亲和环肽及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Asn Trp Trp Arg Pro Ser His Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Asn Ser Leu Gly Gln Lys Ser Cys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Ser Asn Ser His Asn Ala Thr Cys

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Asp Thr Gly Gln Trp Gln Gln Cys

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Thr Gln Asp Ala Trp His Ile Cys

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys Trp Lys His Gly Asn Phe Glu Cys

1 5

Claims (4)

1.环肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.5，其特征是，所述环肽的各氨基酸的构型均为L型，所述氨基酸序列中的首尾两个氨基酸，通过形成二硫键彼此相连。

2.含权利要求1所述环肽的药物组合物或试剂盒。

3.权利要求1所述环肽在制备药物组合物或试剂盒中的应用，其特征是，所述试剂盒用于检测待测物对Sirpɑ蛋白的亲和或阻断能力，或者用于检测样品中Sirpɑ蛋白表达与否、表达位置或表达含量，所述药物组合物用于下述至少一种用途：

1）抗结肠癌或黑色素瘤；

2）增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述Sirpɑ蛋白为人或小鼠的Sirpɑ蛋白。

Images