CN112521479B - 一种与cd3特异性结合的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与CD3特异性结合的多肽及其应用。所述多肽为多肽Limphotin，所述多肽Limphotin的氨基酸序列如序列1所示。Limphotin可以抑制CD3阳性T淋巴细胞和Jurkat肿瘤细胞的增殖,腹腔注射Limphotin可显著减少银屑病小鼠皮肤T淋巴细胞浸润，减轻银屑病小鼠的皮肤损害。因此，Limphotin可用于CD3阳性T淋巴细胞相关疾病和CD3阳性肿瘤的诊断和靶向治疗。

Description

一种与CD3特异性结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及能与CD3分子特异性结合的非抗体结合多肽及其应用。

背景技术

CD3(cluster of differentiation 3)主要表达在T淋巴细胞(简称T细胞)膜，通常与T细胞表面抗原受体(T-cell receptor,TCR)形成TCR-CD3复合物，是T细胞分化和成熟的重要调节分子，也是免疫相关疾病治疗的靶向分子。TCR识别抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合物(MHC)及其递呈的抗原多肽，通过CD3分子将信号传递到T细胞内，引起T细胞生长和功能方面的一系列变化，包括T细胞选择、分化、增殖，以及细胞因子的产生。

T细胞是机体适应性免疫的重要组成部分，可以根据遇到的多种不同的感染源产生恰当反应。T细胞来源于骨髓的多能干细胞，在胸腺内分化成熟，通过淋巴和血液循环分布到全身的免疫器官和组织，发挥免疫功能。CD3⁺T细胞依据细胞表面的CD分子可以分为CD3⁺CD4⁺T细胞和CD3⁺CD8⁺T细胞。CD3⁺CD4⁺T细胞识别MHCⅡ类分子递呈的抗原肽，主要辅助B细胞产生抗体，增强巨噬细胞的杀菌活性，招募中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞到感染、炎症部位，通过分泌细胞因子和趋化因子形成免疫反应的正反馈调节。CD3⁺CD4⁺T细胞根据分泌细胞因子和功能的不同又可以分为4类，包括Th1细胞，Th2细胞，Th17细胞和iTreg细胞。CD3⁺CD8⁺T细胞识别MHCⅠ类分子递呈的抗原肽，通过释放穿孔素和颗粒酶对靶细胞产生溶细胞效应，分泌INF-γ和TNF-α抑制胞内的病原体，以及分泌CCL4招募其他免疫细胞到感染部位。

自身免疫疾病是机体对自身的抗原产生免疫反应而引起自身组织损伤的疾病，是由于体内的自我免疫调节通路和病原体免疫反应之间的平衡被打破。据报道，有超过80种疾病的病因都和自身免疫相关，因此，自身免疫相关的发病率在发展中国家位列第三位(前两位分别是心血管疾病和癌症)，并且在过去三十年一直呈上升的发病趋势。目前治疗自身免疫疾病的一种重要方式就是用生物试剂促进免疫耐受，比如用单克隆抗体或配体直接阻断免疫细胞的相关受体，抑制免疫细胞的功能。这种方法在治疗过敏反应，类风湿关节炎，1型糖尿病等自身免疫疾病中有广泛的应用。1型糖尿病和器官移植排斥反应的治疗采用CD3抗体取得良好的治疗效果，CD3抗体与T细胞表面的CD3分子结合后阻断了TCR-CD3复合物识别抗原的能力，并且促进了激活的T细胞发生凋亡或者功能丧失，导致IL-2分泌减少和辅助性T细胞的失活。

银屑病是一种慢性炎症反应疾病，发病与炎症细胞的浸润和炎症因子的参与相关，是由免疫介导的炎症性疾病。通常用咪喹莫特乳膏(IMQ)涂抹小鼠皮肤建立银屑病动物模型，该模型的皮肤损伤非常类似于人的斑块状银屑病损伤，包括红斑、皮肤厚度、表皮细胞变化、血管生成，以及T细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润等。通过使用CD3抗体清除T细胞的治疗，或者使用免疫缺陷小鼠，都证明了T细胞在该模型发病中的重要作用，尤其是Th17细胞的促炎症作用。

在过去的三十年里，OKT3抗体-第一个鼠抗人CD3单克隆抗体被广泛用于临床试验，由于其具有清除T细胞的作用，被用于治疗器官移植后的排斥反应和自身免疫疾病。相比于常规的免疫抑制剂，OKT3治疗移植后排斥反应并不引起广泛的免疫抑制，降低了病人的感染风险，因此在临床上得到了广泛的应用。除了免疫抑制作用外，人们还发现抗CD3单克隆抗体具有诱导特异性免疫耐受的作用。有文献报道将CD3单克隆抗体应用于糖尿病的治疗、银屑病性关节炎病人的治疗都取得了显著的疗效，因此在将CD3单克隆抗体用于各种自身免疫性疾病的治疗得到了广泛的研究。但是这种抗人CD3单克隆抗体是鼠源性的，因此限制了它的应用。

OKT3主要识别位点为CD3分子的ε肽链，通过静脉注射到体内后可以显著减少外周血中的CD3⁺T细胞数量，作用机制尚不十分清楚，可能是补体介导的作用，或是抗体依赖的细胞毒性作用直接杀伤T细胞，也可能是诱导T细胞发生凋亡了。OKT3抗体的免疫抑制效应取得了良好的疗效和广泛的认可，但是其鼠源性在人体内引发的免疫反应限制了它的推广和长期用药。而且这种CD3单克隆抗体还有一个缺陷是具有丝裂原性，这种特性与OKT3抗体的Fc段有关，OKT3抗体的Fc段通过与淋巴细胞表面的Fc受体结合而激活淋巴细胞，释放大量细胞因子。因此，研究者一直致力于开发人源化和非Fc受体结合型的CD3抗体。

另外，在过去的几十年里，过继性T细胞转移疗法成为抗肿瘤治疗的一个重要方法。从病人身上获取T淋巴细胞，在体外修饰培养扩增后重新输回到病人体内，提高病人的抗肿瘤免疫能力。在体内肿瘤微环境中，肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞处于缓慢激活的状态，杀伤肿瘤细胞的活性被多种免疫抑制分子抑制，如TIM3，LAG3，PD1，CTLA4等。将肿瘤浸润淋巴细胞或血液中的淋巴细胞从体内分离出来，在体外进行扩增培养，或者基因修饰表达肿瘤特异性TCR或嵌合抗原受体，再回输到经过淋巴清扫的肿瘤病人体内，可以显著缓解肿瘤，甚至治愈肿瘤。然而T细胞在混杂的肿瘤组织或血液中只占一小部分，需要寻求一种简单、可重复、高通量和经济上可行的细胞分选方法。

发明内容

本发明提供一种与CD3特异性结合的多肽及其应用。

本发明一方面提供一种与CD3特异性结合的多肽，所述多肽为多肽Limphotin，所述多肽Limphotin的氨基酸序列如序列1所示。

本发明一方面还提供一种多核苷酸，其包含编码如上文所述的多肽或多肽片段的核苷酸序列。

本发明一方面还提供一种载体，其包含上文所述的多核苷酸。

本发明一方面还提供一种宿主细胞，其包括上文所述的载体或上文所述的多核苷酸。

本发明一方面还提供一种制剂，所述制剂包括如下组分：

上文所述的多肽与药物分子和/或可被检测的标记连接而成的化合物；所述多肽可以与药物分子或可被检测的标记采用本领域所常见的连接方式连接，例如形成缀合物，例如通过共价键或非共价键方式连接。

优选的，所述可被检测的标记包括荧光试剂、核素或放射试剂中的一种或两种以上的组合；这些标记均可以具体采用本领域所熟知的相应标记物，例如荧光试剂罗丹明B、FITC(5-异硫氰酸荧光素)等等。

优选的，所述药物分子具有预防或治疗具有CD3阳性表达特征的疾病的活性，所述疾病例如包括肿瘤、自身免疫疾病，所述肿瘤优选包括T淋巴细胞性白血病，所述自身免疫疾病优选包括银屑病。

本发明一方面还提供一种治疗或预防自身免疫疾病的药物，其活性成分包括多肽Limphotin或其衍生物，所述多肽Limphotin的氨基酸序列如序列1所示。所述药物还可以含有其他活性成分和/或本领域所允许使用的辅料或载体等，可以根据需要而制备成本领域所允许的剂型，如经胃肠道给药剂型，注射给药剂型，皮肤给药剂型，呼吸道给药剂型等。优选的，所述自身免疫疾病包括银屑病。

本发明一方面还提供多肽Limphotin在制备用于缓解自身免疫反应的制剂中的应用，优选的，所述自身免疫反应包括银屑病中所出现的自身免疫反应。

本发明一方面还提供如上文所述的多肽的应用，包括在标记、鉴定、富集、分选或纯化CD3阳性细胞中的应用，或在制备用于标记、鉴定、富集、分选或纯化CD3阳性细胞的制剂中的应用；

所述CD3阳性细胞的具体种类并无特别限制，例如白血病细胞、T细胞等。

本发明另一方面还提供如上文所述的多肽或上文所述的制剂在制备用于靶向CD3阳性细胞的试剂中应用。

本申请发明人利用人肝癌cDNA文库构建的噬菌体，筛选得到CD3的新型非抗体结合蛋白命名为Limphotin。Limphotin一方面具有CD3阳性T细胞和淋巴细胞性白血病Jurkat细胞的特异性结合能力，另一方面能够阻滞细胞周期、抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，显著缓解小鼠银屑病的症状。这些结果表明Limphotin具有CD3分子靶向的T细胞免疫抑制作用和淋巴细胞性白血病Jurkat细胞凋亡的诱导作用。

附图说明

图1为Limphotin和CD3抗体与细胞结合的共聚焦观察：Jurket细胞和T细胞的细胞膜呈现Limphotin和anti-CD3抗体荧光共聚集定位，而CAL27舌癌细胞膜无荧光聚集，标尺分别为10μm，50μm。

图2(A)流式细胞术分析不同浓度Limphotin与Jurkat细胞的结合率。(B)三次实验统计结果(***p<0.001)。

图3为用(A)CPZ，(B)DI，(C)EIPA分别处理Jurkat细胞后，Limphotin与Jurkat细胞结合的平均荧光强度。(三次重复实验，*p<0.05,**p<0.01)

图4Limphotin对Jurkat细胞和CAL27细胞增殖的影响(***p<0.001)

图5(A)流式细胞术分析Limphotin对T细胞周期的影响；(B)三次实验统计数据(*p<0.05)。

图6为Limphotin引导T细胞和Jurkat细胞凋亡的TUNEL染色,标尺50μm。

图7为Limphotin与小鼠淋巴细胞结合的共聚焦图片，标尺10μm。

图8为Limphotin治疗银屑病小鼠背部皮肤变化。

图9为小鼠背部皮肤(A)红斑(0-4分)、(B)鳞屑(0-4分)、(C)厚度(0-4分)分别评分，以及(D)总分(红斑+鳞屑+厚度，0-12分)。

图10为小鼠背部皮肤的HE染色和免疫组化结果，标尺100μm。

图11为小鼠皮肤中浸润的CD3⁺T淋巴细胞数目，方差分析(*p<0.05，***p<0.001)

图12为Limphotin治疗银屑病小鼠的淋巴结荧光成像。

图13为Limphotin治疗银屑病小鼠的脾脏荧光成像。

图14为Limphotin治疗银屑病小鼠的脾脏重量。

图15为Limphotin治疗银屑病小鼠的血常规检测。各组小鼠取血液进行血常规检测，包括白细胞数，红细胞数和血红蛋白含量。

图16-1和图16-2为Limphotin治疗银屑病小鼠的白细胞五分类检测，(A)中性粒细胞(NEUT)数目和百分比，(B)淋巴细胞(LYMPH)数目和百分比，(C)单核细胞(MONO)数目和百分比，(D)嗜酸性粒细胞(EO)数目和百分比，(E)嗜碱性粒细胞(BASO)数目和百分比。(*p<0.05)

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于以下实施例。

以下实施例中，所用到的试剂均为本领域常规试剂，若未特别说明均可从市售渠道获得。文中涉及的实验方法均为本领域的常规实验方法，为本领域技术人员根据其掌握的公知技术所能理解和知晓。

实验中所用部分试剂说明如下：

人肝癌T7噬菌体cDNA文库：Novagen；人CD3ε肽链重组蛋白(下文或简称CD3ε重组蛋白)：ACRO Biosystems；Anti-CD3抗体：Abcam。

实施例一：CD3新型配体的筛选和理化性质分析

1、材料和方法

1.1、人肝癌T7噬菌体cDNA文库筛选CD3新型配体

按照常规多肽筛选方法，包被CD3ε重组蛋白于96孔板，次日加入T7噬菌体室温孵育30min，TBST冲洗后用T7噬菌体洗脱液室温孵育10-20min以洗脱CD3ε重组蛋白结合的噬菌体，将其加入到6ml摇好的BLT5403宿主菌(Novagen公司)，37℃摇菌直到裂解。重复四次噬菌体筛选过程，ELISA法检测噬菌体单克隆与CD3ε重组蛋白的结合力。

1.2、PCR及测序鉴定噬菌体插入序列

经过上述4轮噬菌体筛选后，随机挑取46个噬菌斑分别进行扩增，采用表1-1引物进行PCR扩增及测序分析，并翻译成氨基酸序列。

表1-1 T7噬菌体克隆位点引物序列

1.3、多肽的合成及纯化

根据噬菌体中插入的cDNA序列翻译为多肽的氨基酸序列，采用固相合成法人工合成筛选得到的Limphotin多肽(委托杭州丹港生物科技有限公司合成)，在N末端添加异硫氰酸荧光素(FITC)标签蛋白，合成纯度＞95％，并进行高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)分析，然后将纯化好的液体放入冻干机进行浓缩，冻干成粉末，用于后续实验。

1.4、Limphotin与CD3重组蛋白亲和力的检测

按照常规试验方法配置CD3ε胞外段重组蛋白(即CD3ε重组蛋白)至浓度为10μg/ml，预富集到CM5芯片，设置流速10μl/min，进样时间120s，用50mM NaOH作为清洗溶液，再生30s。根据CD3重组蛋白(分子量15000)和Limphotin多肽(分子量11829.7)以及Anti-CD3抗体(分子量150000)的分子量，按照公式计算偶联蛋白(配体蛋白)到芯片上的目标响应值RU＝150*配体蛋白响应值/分析物蛋白响应值。将偶联试剂EDC(浓度0.4M)和NHS(浓度0.1M)按体积比1:1混合，活化CM5芯片表面。CD3重组蛋白在10000rpm下离心8min去除气泡，进样偶联，再用乙醇胺封闭多余的活化位点。Anti-CD3抗体用HEPES缓冲液溶解，并稀释成梯度浓度，离心后去除气泡，进样检测。用Biacore Evaluation Software软件进行数据分析，拟合曲线，计算蛋白相互作用的亲和力大小KD值。同样的，Limphotin多肽用含1％DMSO的HBS缓冲液溶解，偶联在CM5芯片上，用CD3重组蛋白进样检测。

2、结果

2.1、T7噬菌体单克隆挑选以及测序

在第四轮CD3ε肽链特异性结合噬菌体筛选生长的琼脂平板上随机挑选46个单克隆，经克隆PCR及DNA序列检测得到cDNA序列和氨基酸序列，其中被命名为Limphotin的氨基酸序列和cDNA序列如表1-2所示。

表1-2 CD3新型配体Limphotin的cDNA和氨基酸序列

2.2、Limphotin的理化性质分析

Limphotin的氨基酸序列分析显示：该多肽由96个氨基酸组成，其中疏水性氨基酸有35个，占比达36％。带负电荷的氨基酸有3个，带正电荷的氨基酸有17个，Limphotin整体带电荷+14，等电点为11.87。Limphotin的分子结构式为C₅₀₆H₇₉₀N₁₅₈O₁₃₂S₄，分子量11327.082，蛋白结合电位(Boman index)为2.51kcal/mol。

2.3、Limphotin的合成以及质量检测

参照本实施例前文1.3所述，采用固相合成法体外合成Limphotin，高效液相色谱提纯，冻干机浓缩成粉末，所得多肽纯度为96.78％。

2.4、Limphotin与CD3重组蛋白亲和力的检测

将Limphotin偶联在CM5芯片上，让CD3重组蛋白流经芯片表面，发现表面等离子共振(SPR)的响应值(RU)随着CD3蛋白的浓度(CD3蛋白浓度梯度包括250nM、500nM、1000nM、2000nM、4000nM)增加而增加，测得结合速率常数Ka＝703.5(1/Ms)，解离速率常数Kd＝2.60e-06(1/s)。根据动力学常数计算亲和力KD＝Kd/Ka，得出KD＝3.69e-09M。同样的，将CD3重组蛋白固定在CM5芯片上，让OKT3抗体流经芯片表面，发现表面等离子共振(SPR)的响应值(RU)随着Anti-CD3抗体的浓度(Anti-CD3抗体浓度梯度包括0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2nM)增加而增加，测得结合速率常数Ka＝3.81e+06(1/Ms)，解离速率常数Kd＝3.92e-05(1/s)，亲和力KD＝1.03e-11M。像OKT3抗体一样，Limphotin与CD3蛋白的结合是慢结合慢解离的方式。

从实施例一的结果可见，我们以人CD3分子的ε肽链重组蛋白为靶标，利用T7噬菌体展示技术，筛选得到与CD3分子有高亲和力的多肽，SPR检测显示Limphotin与CD3分子具有很强的亲和力(KD＝3.69nM)。

实施例二 Limphotin的细胞结合特异性研究

1、材料和方法

Jurkat细胞：人急性T淋巴细胞性白血病细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；

Cal27细胞(或称为CAL27细胞)：人舌鳞癌细胞系(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；

CTSC-2细胞：人舌鳞癌细胞系(本实验室构建)

PBMC细胞：人外周血单个核细胞；

1.2、Limphotin与Jurkat细胞、PBMC细胞、CAL27细胞结合的免疫荧光分析研究

将Jurkat细胞，PBMC细胞，CAL27细胞分别培养在6孔板，细胞密度生长到70％左右时，分别加入5μM的Limphotin多肽，阴性对照组为等量的多肽溶解试剂，孵育30min后，4％PFA室温固定20min兔抗人CD3抗体(Abcam，1：200稀释)，4℃避光孵育过夜。用二抗rabbitanti-mouse IgG 568(Life technologies，1：1000稀释)室温避光孵育1h。用于荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察。

另外应用上述细胞，分别孵育不同时间或不同浓度的Limphotin，观察分析Limphotin多肽与不同细胞结合的荧光强度。

1.3、Limphotin多肽与Jurkat细胞结合的流式分析

收集对数生长期的Jurkat细胞，每组5×10⁵个细胞数，加入不同浓度的Limphotin多肽，37℃孵育30min。用PBS洗1次和重悬后，加入CD3-APC流式抗体(Miltenyi)，4℃孵育10min，用于流式细胞仪检测。

1.4、CPZ、DI、EIPA对Limphotin多肽结合CD3⁺Jurkat细胞的影响

每组取2×10⁵个Jurkat细胞，分别加入梯度浓度的CPZ、DI(MedChemExpress)和EIPA(Selleck)试剂培养1h，PBS漂洗后加入20μg/ml的Limphotin多肽培养液孵育30min，4％PFA固定细胞20min后用于荧光显微镜观察。

1.5、小鼠脾脏CD3+淋巴细胞Limphotin多肽分选

取BALB/C小鼠脾脏放入70μm细胞筛中，活塞碾压分散脾脏组织，细胞筛过滤单细胞悬液，红细胞裂解液裂解红细胞后离心弃上清，培养液重悬细胞备用，免疫荧光实验步骤参照实施例二的1.2中所述。

2、结果

经以上实验方法进行实验，实验结果如下：

2.1、Limphotin结合CD3⁺细胞，不结合CD3^-细胞

细胞的免疫荧光结果如图1，显示Limphotin能够与CD3单克隆抗体共定位于Jurkat和T细胞(对应前文所述的PBMC细胞)的细胞膜表面，不结合CD3阴性的CAL27细胞。

2.2、Limphotin浓度依赖性地结合CD3+Jurkat细胞

流式细胞术结果显示，随着Limphotin多肽浓度的增加，Jurkat细胞的荧光结合率逐步增加，0.08μM浓度的Limphotin，Jurkat细胞的荧光结合率仅为0.92％，8.45μM浓度时，细胞结合率达到90％以上。说明加入多肽的浓度与细胞结合率成正相关。图2(A)中各曲线由上至下依次对应8.45、4.23、2.11、0.85、0.42、0.08、0μM的Limphotin多肽实验结果。

2.3、CPZ、DI、EIPA对Limphotin结合Jurkat细胞的影响

CPZ是一种钙调蛋白抑制剂，DI是一种GTPase抑制剂，两者均可以阻断TCR-CD3复合物在细胞膜的形成；EIPA是Na⁺/H⁺离子交换通道抑制剂，可以抑制发动蛋白介导的细胞内吞作用，不影响TCR-CD3复合物在细胞膜的形成。在Jurkat细胞培养基中分别加入梯度浓度的CPZ、DI、EIPA处理细胞1h，然后加入Limphotin在37℃孵育30min，细胞平均荧光强度分析显示(图3)，CPZ和DI阻断Limphotin与Jurkat细胞的结合具有浓度依存性，而EIPA则没有阻断效果。

实施例二的结果显示Limphotin与CD3抗体共定位于CD3阳性表达的Jurkat细胞和T细胞膜表面，不结合CD3阴性表达的CAL27细胞膜。Limphotin与Jurkat细胞的结合随着Limphotin浓度的增加而递增，证明Limphotin与CD3⁺Jurkat细胞和T细胞的结合具有选择性。

实施例三 Limphotin的细胞调节功能研究

1、实验试剂

2、实验方法

2.1、细胞活性检测

在96孔培养板中分别加入10⁴个细胞Jurkat、PBMC和CAL27细胞，处理组加入梯度浓度的Limphotin，培养24h，48h，72h后，Jurkat和CAL27细胞每孔加入10μl的CCK-8溶液，多功能酶标仪测定450nm处的吸光度，计算相对细胞活性：细胞相对活性＝(实验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(阴性对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。

PBMC细胞加入100μl cell titer glo试剂，将液体转移到不透光的黑色96孔板中，多功能酶标仪测定荧光值CPS，计算相对细胞活性：细胞相对活性＝(实验组细胞CPS值-空白组细胞CPS值)/(阴性对照组细胞CPS值-空白组细胞CPS值)×100％。

2.2、细胞周期的流式检测

取PBMC细胞培养于6孔板，实验组加入10μM的Limphotin多肽，多肽溶解试剂作为对照，分别在培养24h，48h和72h后收集细胞，75％无水乙醇4℃固定过夜，PBS漂洗后加入500μl含RNA酶(1:100稀释)的PBS溶液37℃水浴30min，加入10μmol的PI试剂和0.2％的Triton-X100试剂，4℃孵育30min，用于流式细胞仪检测。

2.3、TUNEL染色

Jurkat细胞和PBMC细胞分别培养在24孔板，实验组加入10μM的Limphotin，对照组为多肽溶解试剂，在培养24h，48h和72h时收集细胞，室温下4％多聚甲醛固定细胞30min，0.3％Triton-X100的PBS溶液重悬细胞，用PBS漂洗后加入TUNEL检测液，在37℃避光孵育60min。PBS漂洗后滴加到载玻片上，防荧光淬灭剂(DAKO)封片用于荧光显微镜下观察。

3、实验结果

3.1、Limphotin抑制细胞增殖

细胞增殖实验显示Limphotin在4.23μM和8.45μM浓度时，作用于Jurkat细胞72h后显著抑制Jurkat细胞增殖(p<0.05)，但是对CAL27细胞没有增殖抑制作用。另外发明人发现，当加入CD3抗体后，可缓解Limphotin对细胞增殖的抑制作用，论证了Limphotin与CD3抗体能竞争性结合CD3分子(图4)。

3.2、Limphotin对T细胞周期的影响

如图5所示，10μM的Limphotin处理T细胞24h后，G0/G1期细胞比例从82.7％下降至59.55％，S期细胞比例从10.42％增加至21.75％，而G2/M期细胞比例从4.06％提高到10.72％(*p<0.05)。Limphotin处理T细胞48h和72h后得到相同的变化趋势(*p<0.05)，这些结果表明Limphotin使T细胞阻滞在S期和G2/M期。

3.3、Limphotin对Jurkat细胞和T细胞具有促凋亡作用

如图6所示，Limphotin处理后48小时，Jurkat细胞和T细胞呈现TUNEL染色，表明Limphotin可引导CD3阳性细胞凋亡，协同于Limphotin对T细胞的增殖抑制实验结果。

从实施例三的实验结果可见，Limphotin不仅能够特异性的结合到CD3⁺Jurkat细胞和T细胞表面，而且能够抑制Jurkat细胞和T细胞的增殖，对不结合的CD3^-CAL27细胞没有明显的毒性作用。Limphotin与Jurkat细胞的结合随着浓度的增加而升高，对细胞的毒性作用也随之增加，表明Limphotin的增殖抑制作用具有较好的细胞选择性。Limphotin结合到CD3⁺Jurkat细胞后，使细胞周期阻滞在S期和G2/M期，TUNEL染色也证实Limphotin促进了CD3⁺Jurkat细胞和T细胞的凋亡。

实施例四、Limphotin抑制自身免疫反应的研究

1、材料和方法

1.1实验试剂

1.2、实验方法

1.2.1、小鼠银屑病模型的建立和多肽治疗

1)20只BALB/C雄性小鼠，周龄6-8周，随机分为4组，每组5只小鼠，4组小鼠的实验处理如表4-1所示：

表4-1小鼠实验分组

2)小鼠饲养在SPF级屏障环境中，剃除小鼠背部毛发，处理组涂抹咪喹莫特(IMQ)乳膏，空白对照组不涂抹，药物对照组隔天腹腔注射100ul生理盐水，低剂量治疗组隔天腹腔注射100μl Limphotin多肽(0.2mg/ml)，高剂量治疗组隔天腹腔注射100μl Limphotin多肽(2mg/ml)。电子游标卡尺测量背部皮肤厚度，取血检测血常规，解剖淋巴结、脾脏和背部皮肤，用于组织学切片、H&E染色分析和免疫组化检查。3)H&E染色和免疫组化分析。

常规组织包埋、石蜡切片、脱蜡后分别用于H&E染色和免疫组织学分析。后者用anti-CD3抗体4℃孵育过夜，次日PBS漂洗，HRP-antibody-mouse IgG二抗室温下孵育1h，DAB混合液显色，苏木素复染，中性树脂封片，用于显微镜观察。

2、实验结果

2.1、Limphotin结合小鼠淋巴细胞

分离小鼠脾脏淋巴细胞，加入5μM的Limphotin培养30min，共聚焦显微镜观察显示Limphotin也能结合到小鼠淋巴细胞膜表面(图7)。

2.2、Limphotin对银屑病的治疗作用

如图8所示，涂IMQ药后第4天，小鼠背部皮肤显著增厚、变硬，并有大量鳞屑形成，对照组皮肤光滑，成功构建了银屑病小鼠模型。第5天高剂量Limphotin处理小鼠，皮肤鳞屑脱落，较为光滑平整，新毛发生长；低剂量Limphotin处理组较生理盐水对照组皮肤鳞屑逐渐减少。第8天，高剂量Limphotin处理组接近正常对照组的皮肤状态，表面光滑且无鳞屑，较多新生毛发，但是低剂量处理组仍有少量鳞屑，皮肤较软，生理盐水组则有大量鳞屑，皮肤厚而硬。

Limphotin治疗组和生理盐水对照组小鼠体重无明显差异，根据小鼠背部皮肤红斑、鳞屑和厚度的严重程度分别打分(0-4分)，以及各项指标的总和分数(0-12分)，如图9所示，Limphotin治疗有效缓解小鼠皮肤鳞屑病改变，治疗过程中未见明显不良反应，小鼠精神状态良好。

小鼠皮肤HE染色组织切片如图10，与正常对照组比较，IMQ及生理盐水组的小鼠皮肤显著增厚，表皮层细胞增多，毛囊结构破坏严重，出现大量角化不全的细胞，且有较多炎症细胞浸润。低剂量多肽处理组和高剂量多肽处理组的小鼠皮肤与生理盐水组相比，可见皮肤厚度明显降低，角化不全的细胞减少。CD3阳性的浸润T淋巴细胞数目显著减少(图11)。

此外，通过对小鼠体重进行监测，发现用IMQ处理小鼠后可以显著减轻小鼠体重。但是Limphotin治疗组和生理盐水对照组小鼠体重无明显差异，说明用多肽治疗没有使小鼠体重进一步减轻，多肽治疗不影响小鼠体重的变化，不对小鼠饮食造成副作用。

在小动物活体成像仪下拍照观察发现，在高剂量多肽Limphotin处理组的小鼠淋巴结和脾脏内都有多肽荧光聚集，低剂量多肽处理的淋巴结有少量多肽荧光聚集(图12)，在正常对照组、生理盐水组和低剂量处理组的脾脏都未见多肽荧光(图13)，说明Limphotin进入小鼠体内后可以富集到淋巴结和脾脏，减轻小鼠的炎症和免疫反应。对小鼠脾脏称重发现，用IMQ处理后的小鼠脾脏重量显著增加，但是用Limphotin治疗组和生理盐水对照组的脾脏重量没有显著性差异(图14)。

对小鼠血液进行血常规检测和白细胞分类分析，血常规结果如图15所示，白细胞分类分析结果如图16-1和图16-2所示。用IMQ药物处理小鼠白细胞显著增多，Limphotin处理组白细胞低于生理盐水处理组，与正常对照组小白细胞数目无显著差异，说明Limphotin可以抑制由IMQ引起的白细胞增多。Limphotin处理组淋巴细胞数和比例显著降低(p<0.05)，单核细胞数目减少，嗜酸性粒细胞增多。说明Limphotin在体内主要作用于淋巴细胞，减少外周血中淋巴细胞数目。

本实施例发现，Limphotin治疗可以明显减轻银屑病皮损，减少T淋巴细胞浸润，降低外周血淋巴细胞。Limphotin主要富集在淋巴结和脾脏。

从以上实验可见，本发明利用T7噬菌体展示技术，从人肝癌cDNA文库筛选得到由96个氨基酸组成的CD3非抗体结合蛋白Limphotin。在体外人工合成了Limphotin，证实其与CD3蛋白具有很强的亲和力，表面等离子共振技术(SPR)检测显示KD值为3.69nM。

其次对Limphotin调节T细胞的功能进行了探索。Limphotin可以特异性结合人体和小鼠T细胞表面CD3分子。Limphotin可以通过CD3分子显著抑制CD3⁺Jurkat细胞和T细胞的增殖，并使T细胞停滞在S期和G2/M期。Limphotin还可以诱导T细胞和Jurkat细胞凋亡。

最后探究了Limphotin在治疗自身免疫疾病和细胞分选中的应用。利用Limphotin对T细胞的增殖抑制作用，治疗银屑病动物模型。Limphotin可以显著减少银屑病小鼠的皮肤损害，减少外周血淋巴细胞和皮肤的T淋巴细胞组织浸润，缓解银屑病的损伤。

本领域技术人员可以理解，在本说明书的教导之下，可对本发明做出一些修改或调整。这些修改或调整也应当在本发明权利要求所限定的范围之内。

序列表

<110> 中山大学附属口腔医院

广州一代医药科技有限公司

<120> 一种与CD3特异性结合的多肽及其应用

<130> DP1F182301GZ

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ser Glu Ala Arg Met Asn Gly Asn Lys Trp Ala Pro Gly Thr Arg

1 5 10 15

Leu Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Leu Phe Arg Leu Gln Ser Pro Ala

20 25 30

Phe Leu Val Asp Thr Ser Gly Leu Trp Phe Thr Ser Arg Val Gln Lys

35 40 45

Asn Leu Pro Leu Cys Ser His Phe Ser Arg Cys Ser Trp Ile Ser Ser

50 55 60

Gln Thr Arg Tyr Ala Gln Ser Arg Met His Trp Arg Ala Trp Trp Gln

65 70 75 80

Glu Asn Leu Ser Lys Val Ile Pro Gln Lys Pro Asn Lys Arg Leu Arg

85 90 95

Claims (15)

1.一种与CD3特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽为多肽Limphotin，所述多肽Limphotin的氨基酸序列如序列1所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，其包含编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其包括权利要求3所述的载体或权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种制剂，其特征在于，所述制剂包括如下组分：

权利要求1所述的多肽与药物分子和/或可被检测的标记连接而成的化合物。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述可被检测的标记包括荧光试剂、核素或放射试剂中的一种或两种以上的组合。

7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述药物分子选自能够预防或治疗CD3阳性表达的肿瘤、自身免疫疾病的药物分子。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述自身免疫疾病包括银屑病。

9.一种治疗或预防自身免疫疾病的药物，其特征在于，其活性成分包括多肽Limphotin，所述多肽Limphotin的氨基酸序列如序列1所示。

10.根据权利要求9所述的治疗或预防自身免疫疾病的药物，其特征在于，所述自身免疫疾病包括银屑病。

11.权利要求1所述的多肽Limphotin在制备用于缓解自身免疫反应的制剂中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述自身免疫反应包括银屑病中所出现的自身免疫反应。

13.如权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于，所述应用为在制备用于标记、鉴定、富集、分选或纯化CD3阳性细胞的制剂中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述CD3阳性细胞包括白血病细胞、外周血中T淋巴细胞。

15.如权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的制剂在制备用于靶向CD3阳性细胞的试剂中应用。

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