CN104761633A - 阻断猪pd-1/pd-l1通路的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于阻断猪PD-1/PD-L1复合物结合位点的多肽，对其阻断猪PD-1/PD-L1通路后的免疫效应进行初步研究，为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。该多肽：CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT，分子量：4012.42Da。

Description

阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及动物分子免疫学，具体涉及阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用。

背景技术

免疫系统存在着活化和抑制调节两种信号通路，免疫活化和抑制调节相互协调共同维持免疫系统动态平衡。TCR或BCR与MHC分子-抗原肽和共刺激信号通路B7/CD28共同调节T细胞或B细胞活化；另外，T细胞表面存在一系列的免疫抑制性表面分子，如PD-1、CTLA-4、Tim-3、ICOS、LFA1、SLAM、LAG-3等，与其相应配体结合激活免疫负调节通路，导致T细胞功能衰竭。其中PD-1/PD-Ls通路是目前研究的热点，研究表明，多种急性或慢性病毒性疾病过程中，PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达量升高，PD-1与其配体相互结合后，激活PD-1下游通路，抑制了T细胞抗病毒细胞因子分泌、增殖和CTL等功能，导致机体免疫抑制。有趣的是用抗PD-1或PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-Ls通路后，可以逆转已衰竭T细胞的功能，为提高免疫水平和治疗病毒性免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。

PD-L1比PD-L2的分布更加广泛，如表达PD-L1的细胞种类较多，如B细胞、DC、巨噬细胞、骨髓源肥大细胞、T细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、胰岛细胞星形胶质细胞等，而PD-L2仅表达于DC、巨噬细胞、记忆性B细胞等，所以在阻断PD-1/PD-Ls通路逆转T细胞功能方面，PD-1/PD-L1通路比PD-1/PD-L2通路显得更加重要。相关研究表明，可溶性PD-1重组蛋白免疫小鼠后，可以显著提高T细胞抗病毒或抗肿瘤免疫反应，达到清除病原或杀死肿瘤细胞的目的，为开发可溶性蛋白PD-1和PD-Ls的药物或疫苗奠定基础。目前，PD-1和PD-Ls的晶体结构已被解析，在PD-1与PD-L1复合物结合区域中，PD-1的N末端结合区域与PD-L1的C端结合区域位于复合物的同一侧面，PD-1的两个β折叠链分别位于ABED和A′GFCC′C″区域，PD-L1的两个β折叠链分别位于AGFCC′C″和BED区域，为筛选和鉴定阻断PD-1/PD-Ls通路的多肽表位提供有利信息。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽及其应用。

本发明的技术方案是：阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT。

本发明的另一目的在于，提供了阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高体液免疫中的应用。

阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应用。

阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。

阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽的用途，用于结合PBMC上的PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路，提高PBMC增殖。

本发明设计合成了基于PD-1/PD-L1复合物结合位点的系列多肽，对其阻断PD-1/PD-L1通路后的免疫效应进行研究，为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。

附图说明

图1a是PBMC与FITC结合的结合流式散点图。

图1b是PBMC与FITC结合的流式荧光曲线图。

图1c是PBMC与本发明多肽结合散点图。

图1d是PBMC与本发明多肽结合曲线图。

图2a是阴性对照组刺激PBMC增殖的流式图。

图2b是本发明多肽刺激PBMC增殖的流式图。

图3a是本发明多肽高效液相图。

图3b是本发明多肽的质谱图。

图4是本发明多肽作为佐剂免疫小鼠的抗体效价变化。

图5a是FITC对照组。

图5b是PD-15与重组蛋白PD-L1的结合。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明。

多肽标记FITC

用FITC Antibody Labeling Kit试剂盒将FITC标记于多肽上，FITC Antibody Labeling Kit可以将FITC连接于氨基酸残基中的巯基、咪唑基、羰基和酪氨酰等基团，步骤如下：

(1)多肽准备，向0.5mL 2mg/mL多肽溶液中加入40μL 0.67mol/L的硼酸钠溶液，并将多肽浓度调制1mg/mL；

(2)0.5mL多肽加入装有约30μL FITC试剂管中，混匀使试剂充分溶解，室温避光孵育60min；

(3)往反应管中加入400μL纯化树脂，将反应管放入微型收集管中，1000r/min室温离心30～45sec，弃掉收集管；

(4)把反应管放入新的收集管中，加入250～270μL的标记反应液(0.05mol/L硼酸钠溶液)，混匀，1000r/min室温离心30～45sec，收集液即为标记并纯化多肽，分装－20℃避光保存。

FITC标记多肽与PBMC结合

PBMC分离

(1)颈静脉采集正常猪抗凝血5mL，抗凝剂为10％柠檬酸钠，全血与抗凝剂比例为10:1，抗凝血与等量PBS轻轻混匀；

(2)取4mL淋巴细胞分离液于15mL玻璃离心管中，将上述混匀血10mL沿管壁慢慢加入离心管中(注：动作要轻，不能混匀)，水平转子2000r/min，室温离心20min；

(3)用毛细管吸取血浆层与分离液之间的白色细胞薄层(单个核细胞)，移入新的15mL玻璃离心管中，加入2～5倍体积PBS，轻轻悬浮细胞，1000r/min，室温离心10min，弃上清，加入10mL PBS，轻轻悬浮细胞，重复离心一次，弃上清；

(4)观察白细胞中红细胞量，适当加入1～2mL红细胞裂解液，冰上裂解红细胞5min，加入10mL PBS，1000r/min，室温离心10min，弃上清，加入0.5mL PBS，悬浮细胞，即为PBMC细胞悬液。

PD-15与PBMC结合

PBMC来自于临床感染PCV2的断奶仔猪，用PBS调整PBMC浓度至10⁶个/mL，取10⁶个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL的FTIC-多肽(总体积200μL)，同时设FITC为阴性对照组，混合均匀后冰上避光结合2h，期间多次悬浮细胞，PBS洗涤6次，加入0.5mL PBS悬浮细胞，200目尼龙网过滤后，流式细胞仪和荧光显微镜检测多肽与PBMC结合情况，流式细胞仪计数20000个细胞。

多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合

(1)包板，10μg/mL的PD-L1包板，50μL/孔，4℃过夜孵育，PBST洗涤3次；

(2)封闭，5％脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃孵育4h，PBST洗涤3次；

(3)加多肽，加入0.1mg/mL FITC标记多肽PD-15，设FITC为阴性对照，浓度为0.1mg/mL，稀释液为5％脱脂奶粉，50μL/孔，37℃孵育2h，PBS洗涤5次，

(4)荧光显微镜观察多肽PD-15与PD-L1的结合情况，记录结果。

为检测合成的系列多肽能否阻断PD-1/PD-L1通路，首先检测多肽与PD-1或PD-L1结合，本研究用标记FITC的多肽与PBMC结合，流式细胞仪检测结果显示，多肽PD-15与PBMC结合后，与FITC对照组相比荧光信号显著增强，说明多肽PD-15与PBMC结合(如图1a，图1b，图1c，图1d所示)。多肽PD-15与重组蛋白PD-L1结合试验表明，PD-15可以与PD-L1结合，因此得出结论，PD-15位于猪PD-1蛋白上，PD-15与PBMC的结合是与PBMC上的PD-L1结合。

多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后对PBMC增殖影响

(1)PBMC来临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程，用RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至10⁶个/mL；

(2)分别取10⁶个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200μL)，冰上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；

(3)加入10μmol/L CFSE，37℃孵育10min，1000r/min室温离心10min，弃上清，洗涤3次，将多余的SFSE洗去；

(4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加入100μL 10％RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10μL猪血浆(过滤除菌)100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO2培养箱中培养3d，收集细胞，PBS洗涤3次，加入0.5mL PBS悬浮细胞，200目尼龙网过滤，流式细胞仪计数20000个细胞，检测细胞中CFSE荧光信号强弱，判定PBMC增殖能力。

多肽PD-15阻断后对PBMC增殖影响

体外检测PBMC的增殖变化，以期证实多肽PD-15结合PBMC后能否阻断PD-1/PD-L1通路。本研究用感染PCV2断奶仔猪的PBMC，与多肽PD-15作用后，培养3d，检测CFSE标记的PBMC增殖变化，流式结合显示PD-15阻断PD-1/PD-L1通路后，PBMC的增殖显著提高，出现大量增殖细胞，而空白对照组的PBMC几乎未增殖(图2)。说明PD-15不但能够结合PBMC上的PD-L1，而且还能阻断PD-1/PD-L1通路，提高免疫细胞免疫效应。为深入研究PD-15的免疫功能奠定基础。

(1)PBMC来自临床感染PCV2的断奶仔猪和健康猪，PBMC的分离纯化同上述过程，用RPMI-1640基础培养基调整PBMC浓度至10⁶个/mL；

(2)分别取10⁶个PBMC加入终浓度为0.1mg/mL未标记多肽(总体积200μL)，冰上避光孵育2h，PBS洗涤3次，洗去未结合多肽；

(3)加入10μmol/L CFSE，37℃孵育10min，1000r/min室温离心10min，弃上清，洗涤3次，将多余的SFSE洗去；

(4)将PBMC转至96孔细胞培养板中，50000个/孔，每个样品做6个重复，然后加入100μL 10％RPMI-1640培养基，10mg/mL conA，4mmol/L L-谷氨酰胺，10μL猪血浆(过滤除菌)100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO₂培养箱中培养18～24h；

(5)流式检测结果，计数20000个PBMC。

免疫小鼠

(1)准备病毒，石门株CSFV为本实验室在PK-15细胞上传代获得，用终浓度为2‰的甲醛溶液37℃灭活24h；

(2)免疫昆明鼠，50μg灭活CSFV+50μg PD-15多肽/只，皮下多点注射，同时设CSFV和PBS两组对照，每组试验3只昆明鼠，一免后14d进行二免，二免后14d，检测CSFV抗体的水平。

多肽PD-15作为佐剂与灭活CSFV共同免疫昆明鼠，CSFV和PBS分别为无多肽对照和阴性对照，二免后14d用ELISA检测CSFV抗体水平。结果显示，多肽PD-15和CSFV抗原组的抗体效价达1:3200以上，无多肽的CSFV组的抗体效价为1:400～1:1600(见表1和图4)，说明多肽PD-15能够刺激B细胞活化，提高B细胞产生抗体的能力，为PD-15作为免疫佐剂提高体液免疫反应奠定基础。

表1 CSFV抗体效价

ELISA检测抗体水平

用本实验室已建立检测CSFV的ELISA方法，具有步骤如下：

(1)包被包被液稀释灭活CSFV至10μg/mL，50μL/孔，4℃过夜，PBST洗3次；

(2)封闭5％脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃封闭4h，PBST洗3次；

(3)加一抗免疫鼠血清依次1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400倍稀释，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗3次；

(4)加二抗HRP标记羊抗鼠IgG 1:5000倍稀释，稀释液为5％脱脂奶粉，50μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗3次；

(5)显色底物缓冲液A和B液混合后，50μL/孔，显色5min左右，加入2mol/L的H₂SO₄终止液50μL/孔。

(6)结果判定，酶标仪读取各孔OD_450nm吸光值，以P/N≥2.1判为阳性。

测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列

HPLC检测多肽PD-15的纯度，HPLC结果显示在洗脱时间约为11min左右呈现单一狭窄峰，表明多肽纯度高(图3a)，质谱分析结果表明氨基酸数量和顺序正确，分子量为4012.42Da(图3b)。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：CTRRNDSGTYFCGAIYLPPKTQINESHQAKLT。

2.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高体液免疫中的应用。

3.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应用。

4.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。

5.如权利要求1所述阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽的用途，用于结合PBMC上的PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路，提高PBMC增殖。