CN114672458A - 来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。本申请通过分离筛选肿瘤患者胸腹水内的肿瘤特异性T淋巴细胞，并对符合要求的种子细胞进行扩增培养，经CD3和CD28、IFN‑γ等因子直接刺激，在短时间内即可获得具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。本申请将肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的培养周期从传统方式的25天左右缩短至11‑16天，而且所得的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞在快速达到临床治疗数量级的同时也保证所需T淋巴细胞的纯度和杀伤活性。

Description

来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴 细胞及其制备方法和细胞制剂
技术领域
本发明涉及T淋巴细胞制剂领域，特别涉及一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康的疾病之一。根据国际癌症研究机构(IARC)发布的全球癌症统计数据，2020年全球新发恶性肿瘤1930万例(不计非黑色素瘤皮肤癌为1810万例),全球恶性肿瘤死亡病例约为1000万例(不计非黑色素瘤皮肤癌为990万例)，是世界范围内主要死亡原因。恶性肿瘤己经成为我国主要公共卫生问题，自2010年来，恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病，成为中国人群第一大死因。恶性胸腹水又称恶性胸腔积液，是晚期恶性肿瘤常见的并发症，威胁着患者的生命安全，影响患者的生活质量。
正常人体内，胸腹腔和心包腔内仅有少量液体发挥润滑功能，一般情况下胸腔内的液体量＜200mL，腹腔内的液体量＜50mL即可维持正常的心肺功能。当胸腹腔出现恶性肿瘤细胞浸润或炎症时，腔内积液就会增多，并且逐渐积聚，积液的性质也随之发生变化。近年来，我国恶性肿瘤的发病率逐年攀升，恶性胸腹腔积液病例也日渐增多。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，即具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(T cell receptor,TCR)。TIL细胞治疗肿瘤是当前肿瘤生物学治疗研究的热点之一。TIL 细胞的优点是：1.具有较强的抗肿瘤作用；2.可特异识别自体肿瘤, 具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性；3.除对肿瘤细胞有直接杀伤作用外，回输后TIL细胞还能增强患者的抗肿瘤免疫功能从而提高疗效。
临床所见的大量胸腔积液大约40%是由恶性肿瘤引起，最常见的为肺癌、乳腺癌和淋巴瘤，此时患者已不具备手术治疗的条件，而全身的化疗、放疗使耐受性较差的患者难以承受。自体TIL细胞过继免疫疗法是近年发展起来治疗恶性胸腔积液的较为成熟、有效且低毒的方法。恶性胸腔积液中的淋巴细胞是一种特殊形式的TIL细胞，其特点是可对自体内生长的实体瘤进行特异性杀伤，而对其他种类肿瘤和正常组织细胞则无杀伤作用。
肿瘤进展与肿瘤中CD8+T淋巴细胞浸润之间存在相关性，CD8+T细胞被认为直接参与抗肿瘤细胞毒性反应。Ahrends等认为CD4+T细胞帮助细胞毒性T细（CTL）表达细胞毒性效应分子，抑制受体下调和增加迁移能力。有报道显示，癌症组织内浸润的CD8+细胞的数量与患者预后呈正相关，其数量越多，预后就越好。
综上，申请人认为分离筛选肿瘤患者胸腹水内的肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞并对符合要求的种子细胞进行扩增培养，快速获得临床治疗数量的特异性T淋巴细胞具有重要的意义。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。
第一方面，本发明提供一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，是通过以下技术方案得以实现的。
一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将胸腹水样本离心、洗涤，用培养基重悬细胞并计数；
S2.取2.0-3.0×107个步骤S1获得的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，加入完全培养基至细胞终浓度0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，进行细胞培养；细胞培养瓶预先包被的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0% CO2条件下0.5-1 h；
S3.培养24h-48h后，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至预先包被的细胞培养瓶中，细胞培养瓶包被方法同步骤S2；根据计数结果，补加完全培养基将细胞浓度调整为0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，进行细胞培养；
S4.每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，进行连续培养；
S5.当培养体系总体积为180-200mL时，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至细胞培养袋中，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，按照20-50ng/mL向培养袋中补加CD3和CD28单抗，继续进行细胞培养；
S6.每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，进行连续培养；
S7.当培养体系终体积达到1.6-2.0 L时，每日进行细胞计数，直到细胞浓度增至2.0-2.5×109/L时，回收全部细胞。
通过采用上述技术方案，肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞通过患者的胸腹水获得种子细胞，较其他方式更易获得病灶样本，且分离筛选细胞过程操作更加简便。使用CD3和CD28单抗、IFN-γ对细胞进行多次直接刺激，使其在相对较短的培养时间内即可达到临床治疗的数量级。由于肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞来源于患者肿瘤周围的浸润液体中，其本身就可特异识别自体肿瘤细胞。经培养后对细胞进行表面标志物检测，结果显示以CD3+CD8+和CD3+CD4+细胞为主，其中以CD8+细胞更甚，并且调节性T细胞的比例很低。
进一步的，所述完全培养基为含有10-20 v%胎牛血清、4000-6000 IU/mL白细胞介素2和2 v% 50X必需氨基酸的X-VIVO 15培养基。
进一步的，步骤S2、S3中，CD3和CD28两种单抗的含量为20-50ng/cm2。
第二方面，本申请提供了一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞，是通过以下技术方案得以实现的。
一种上述制备方法制备得到的来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。
第三方面，本申请提供了一种治疗恶性胸腹腔积液的细胞制剂，是通过以下技术方案得以实现的。
一种治疗恶性胸腹腔积液的细胞制剂，包括上述来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。
本申请具有以下有益效果。
本发明使用CD3和CD28单抗、IFN-γ等因子对细胞进行直接刺激，使其在相对较短的培养时间内即可达到临床治疗的数量级，可以快速收获，节省时间成本。本申请可通过患者胸腹水获得肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞，降低最终制剂中调节性T淋巴细胞比例，较其他方式更易获得病灶样本，且分离筛选细胞过程操作更加简便。
附图说明
图1是本发明实施例1 D0天细胞表面标志物检测结果图；
图2是本发明实施例1培养D5天细胞表面标志物检测结果图；
图3是本发明实施例1培养D11天细胞表面标志物检测结果图；
图4是本发明实施例1细胞浓度扩增曲线图；
图5是本发明实施例1细胞总数扩增曲线图；
图6是本发明实施例2 D0天细胞表面标志物检测结果图；
图7是本发明实施例2培养D5天细胞表面标志物检测结果图；
图8是本发明实施例2培养D12天细胞表面标志物检测结果图；
图9是本发明实施例2细胞浓度扩增曲线图；
图10是本发明实施例2细胞总数扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本专利申请进行进一步的说明。
一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）分离种子细胞：将100-300mL胸腹水样本以300-500g的离心力离心8-10min，弃掉上清，以150-250mL1640培养基重悬，再次以300g-500g的离心力离心8-10min。弃掉上清后以10-30mL1640培养基重悬并计数，用于后续培养。
（2）配置完全培养基：X-VIVO 15培养基（LONZA/04-418Q）中含有体积比浓度10-20%的胎牛血清和4000-6000 IU/mL的白细胞介素2、体积比浓度2% 50X必需氨基酸（BI/01-325-1B）。
（3）提前使用3.5mL含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被T-175培养瓶置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5-1 h备用，两种单抗的含量为20-50ng/cm2。取2.0-3.0×107个细胞加入到包被的细胞培养瓶中，加入完全培养基至细胞终浓度0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，置于37℃，5.0% CO2培养箱培养。
（4）培养24h-48h后，提前使用3.5mL含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被T-175培养瓶置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5-1h备用，两种单抗的含量为20-50ng/cm2。取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至包被好的细胞培养瓶中，根据计数结果，补加完全培养基将细胞浓度调整为0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，置于37℃，5.0% CO2培养箱培养。
（5）每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱进行连续培养。
（6）当培养体系总体积为180-200mL时，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至细胞培养袋中，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，按照20-50ng/mL向培养袋中补加CD3和CD28单抗，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（7）每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱进行连续培养。
（8）当培养体系终体积达到1.6-2.0 L时，每日进行细胞计数，直到细胞浓度增至2.0-2.5×109/L时，回收全部细胞。
实施例1
罗某，男性，28岁。乙肝阳性，肝癌。采集于解放军总医院第五医学中心。
具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备：
（1）分离种子细胞：取235mL的胸腹水样本以500g的离心力离心10min，弃掉上清，补加1640培养基至200 mL重悬，再次以500g的离心力离心10min清洗1次。以20 mL1640培养基重悬细胞，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:8.2×109/L，表面标志物检测结果见图1。
（2）配置完全培养基：X-VIVO 15培养基中含有体积比浓度10%的胎牛血清，4000IU/mL的白细胞介素2，体积比浓度2% 50X必需氨基酸（BI/01-325-1B）。
（3）提前使用3.5 mL CD3和CD28单抗（包被液成分：含浓度为1μg/mL的CD3和CD28单抗的完全培养基）包被1个T-175培养瓶，置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5h，两种单抗的含量为20 ng/cm2。根据计数结果，取3.7 mL细胞接种于包被好的T-175培养瓶，补加IFN-γ至终浓度1000IU/mL，补加38 mL完全培养基至总体积为50 mL，调整细胞悬液浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱培养。
（4）培养24h后，提前使用3.5 mL CD3和CD28单抗（包被液成分：含浓度为1μg/mL的CD3和CD28单抗的完全培养基）包被1个T-175培养瓶置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5h，两种单抗的含量为20 ng/cm2。取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.0×109/L，将其余细胞悬液全部转移至包被好的T-175培养瓶中，根据计数结果，补加IFN-γ至终浓度1000IU/mL，加入25mL完全培养基至总体积为83 mL，调整细胞悬液浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（5）每日观察细胞状态，培养至第3天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:0.7×109/L。根据细胞计数补加13 mL完全培养基，调整细胞浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0%CO2培养箱继续培养。
（6）培养至第5天，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:1.1×109/L，表面标志物检测结果见图2。根据细胞计数补加80 mL完全培养基，调整细胞悬液浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（7）培养至第6天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.7×109/L。将其余细胞悬液全部转移至1个细胞培养袋中，根据细胞计数补加313.02 mL完全培养基，并按照20 ng/mL浓度补加9.98mL CD3和CD28单抗，调整细胞悬液浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（8）培养至第7天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:2.0×109/L。根据细胞计数补加1165 mL完全培养基，调整细胞悬液浓度至0.6×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（9）培养至第8天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.5×109/L，根据细胞计数补加136 mL完全培养基，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（10）培养至第9天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.7×109/L。置于37℃，5.0%CO2培养箱继续培养。
（11）培养至第10天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.9×109/L。置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（12）培养至第11天，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:2.1×109/L，表面标志物检测结果见图3。其余细胞悬液转移至4个500mL离心杯中配平，以500g离心力离心10min后弃上清，使用两瓶洗液（每瓶洗液为500mL氯化钠注射液加1mL人血白蛋白，人血白蛋白浓度为0.2%）将细胞重悬至2个500mL离心杯中。配平后以500g离心力离心10min清洗细胞3次，使用200mL保存液（保存液为194mL氯化钠注射液加6mL人血白蛋白，人血白蛋白浓度为3%）重悬细胞，制成肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂。回收细胞总数：3.5210×109，细胞活率：97.5%，根据生长情况绘制扩增曲线图，参见图4和图5。
实施例2
朱某，女性，57岁。乙肝阳性，肝炎，肝癌。采集于解放军总医院第五医学中心。
（1）分离种子细胞：取236 mL的胸腹水样本以500g的离心力离心10min，弃掉上清，补加1640培养基至200 mL重悬，再次以500g的离心力离心10min清洗1次。以20 mL1640培养基重悬细胞，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:4.2×109/L，表面标志物检测结果见图6。
（2）配置完全培养基：X-VIVO 15培养基中含有体积比浓度10%的胎牛血清，4000IU/mL的白细胞介素2，体积比浓度2% 50X必需氨基酸（BI/01-325-1B）。
（3）提前使用3.5 mL CD3和CD28单抗（包被液成分：含浓度为2μg/mL的CD3和CD28单抗的完全培养基）包被1个T-175培养瓶置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5h，两种单抗的含量为40 ng/cm2。根据计数结果，取4.8mL细胞接种于包被好的T-175培养瓶，补加IFN-γ至终浓度500IU/mL，补加37mL完全培养基至总体积为50 mL，调整细胞悬液浓度至0.4×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱培养。
（4）培养24h后，提前使用3.5 mL CD3和CD28单抗（包被液成分：含浓度为2μg/mL的CD3和CD28单抗的完全培养基）包被1个T-175培养瓶置于37℃，5.0% CO2培养箱0.5h，两种单抗的含量为40 ng/cm2。取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.0×109/L，将其余细胞悬液全部转移至包被好的T-175培养瓶中，根据计数结果，补加IFN-γ至终浓度500IU/mL，加入67mL完全培养基至总体积为125 mL，调整细胞悬液浓度至0.4×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（5）每日观察细胞状态，培养至第3天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:0.6×109/L。根据细胞计数补加62 mL完全培养基，调整细胞悬液浓度至0.4×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（6）培养至第5天，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:0.8×109/L，表面标志物检测结果见图7。将其余细胞悬液全部转移至1个细胞培养袋中，根据细胞计数补加179.52 mL完全培养基，并按照40 ng/mL浓度补加7.48 mL CD3和CD28单抗，调整细胞悬液浓度至0.4×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（7）培养至第6天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.0×109/L。根据细胞计数补加561 mL完全培养基，调整细胞悬液浓度至0.4×109/L，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（8）培养至第7天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.5×109/L。根据细胞计数补加865 mL完全培养基，置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（9）培养至第8天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.4×109/L。置于37℃，5.0%CO2培养箱继续培养。
（10）培养至第9天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.6×109/L。置于37℃，5.0%CO2培养箱继续培养。
（11）培养至第10天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.8×109/L。置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（12）培养至第11天，取细胞悬液计数，计数结果为WBC:1.9×109/L。置于37℃，5.0% CO2培养箱继续培养。
（13）培养至第12天，取细胞悬液计数、送检表面标志物，计数结果为WBC:2.0×109/L，表面标志物检测结果见图8。其余细胞悬液转移至4个500mL离心杯中配平，以500g离心力离心10min后弃上清，使用两瓶洗液（每瓶洗液为500mL氯化钠注射液加1mL人血白蛋白，人血白蛋白浓度为0.2%）将细胞重悬至2个500mL离心杯中。配平后以500g离心力离心10min清洗细胞3次，使用200mL保存液（保存液为194mL氯化钠注射液加6mL人血白蛋白，人血白蛋白浓度为3%）重悬细胞，制成肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂。最终回收细胞总数：3.3831×109，细胞活率：96.8%，根据生长情况绘制扩增曲线图，参见图9和图10。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将胸腹水样本离心、洗涤，用培养基重悬细胞并计数；
S2.取2.0-3.0×107个步骤S1获得的细胞加入到预先包被的细胞培养瓶中，加入完全培养基至细胞终浓度0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，进行细胞培养；细胞培养瓶预先包被的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0% CO2条件下0.5-1 h；
S3.培养24h-48h后，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至预先包被的细胞培养瓶中，细胞培养瓶包被方法同步骤S2；根据计数结果，补加完全培养基将细胞浓度调整为0.4-0.6×109/L，补加IFN-γ至终浓度500-2000IU/mL，进行细胞培养；
S4.每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，进行连续培养；
S5.当培养体系总体积为180-200mL时，取细胞悬液计数，将其余细胞悬液全部转移至细胞培养袋中，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，按照20-50ng/mL向培养袋中补加CD3和CD28单抗，继续进行细胞培养；
S6.每日观察细胞状态，每间隔24h取细胞悬液计数，根据细胞计数补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109/L，进行连续培养；
S7.当培养体系终体积达到1.6-2.0 L时，每日进行细胞计数，直到细胞浓度增至2.0-2.5×109/L时，回收全部细胞。
2.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：所述完全培养基为含有10-20 v%胎牛血清、4000-6000IU/mL白细胞介素2和2 v% 50X必需氨基酸的X-VIVO 15培养基。
3.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：步骤S2、S3中，CD3和CD28两种单抗的含量为20-50ng/cm2。
4.一种权利要求1-3任一所述制备方法制备得到的来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。
5.一种治疗恶性胸腹腔积液的细胞制剂，其特征在于：包括权利要求4所述的来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。
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