CN112063584A - 肿瘤特异性til和dnt细胞的递进式分离和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,包括步骤一肿瘤组织单细胞悬液的制备；步骤二制备肿瘤浸润性淋巴细胞；步骤三配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；步骤四将肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；步骤五对肿瘤特异性DNT细胞进行分离；步骤六将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。本发明增加了TIL细胞和DNT细胞分离的针对性，使培养细胞的肿瘤杀伤活性更强，且操作流程简单，且便于推广使用。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法。
背景技术
CD3+CD4-CD8-(double negative T cell, DNT)细胞是近年来新发现的一群免疫调节性T细胞，DNT细胞的功能更像是固有免疫细胞，在肿瘤的免疫监视、免疫防御和抵抗过程中起着重要的作用。
过去,DNT细胞被认为是一种调节性T细胞，过继转移DNT细胞可以防止同种异体移植物排斥反应、移植物抗宿主病和自身免疫性糖尿病。近期的临床前实验表明DNT细胞能够以肿瘤抗原非特异性方式杀伤急性髓性白血病细胞(acute myeloid leukemia, AML)，并且具有抑制移植物抗宿主病的双重作用。DNT细胞的抗肿瘤免疫作用在黑色素瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌和乳腺癌等固体肿瘤中得到证实。肿瘤浸润性DNT细胞是存在于肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中的DNT细胞，它是肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratinglymphocyte,TIL) 中一类独特的细胞群，相比于外周血DNT细胞，肿瘤浸润性DNT细胞中含有较高比例的活化的肿瘤特异性DNT细胞，这一类DNT细胞经过体外分离、扩增、活化后，对肿瘤细胞的杀伤活性明显提高，可用于肿瘤的过继细胞免疫治疗。
DNT细胞的实验和临床研究已经取得了良好的效果。2003年，有人（Young KJ等）研究在体内和体外实验中DNT细胞可以杀伤Ld+ A20 淋巴瘤细胞，表明DNT细胞可能具有抗肿瘤功能。还有人（Voelkl S）从淋巴瘤患者外周血中分离出一组DNT细胞，它们可以特异性的识别淋巴瘤相关的gp100抗原肽，并且对表达gp100的靶细胞和gp100+ 淋巴瘤细胞具有杀伤作用。道口（Dokouhaki）体外实验表明γδ+ DNT细胞对肺癌细胞具有杀伤作用。徐宏（XuHong）体内实验发现DNT细胞可以显著抑制胰腺癌细胞的生长。
肿瘤浸润性DNT细胞是TIL细胞中一类独特的细胞群。TIL细胞是一种异质性的细胞群，其中包含DNT细胞、CD4+和CD8+T细胞、B细胞、NK细胞等。目前尚未出现肿瘤浸润性DNT细胞的分离和培养方法，因此如何从TIL中筛选出肿瘤特异性DNT细胞并进行扩增培养和活化，以应用于临床成为急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法，该方法将具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性DNT细胞从肿瘤特异性TIL细胞群中分离出来并进行大量扩增培养和活化，操作流程简单，分离得到的肿瘤特异性DNT细胞可异体使用，肿瘤杀伤活性更强，便于制备成细胞类药物使用和临床推广。
技术方案：肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,包括：
步骤一、肿瘤组织单细胞悬液的制备；
步骤二、对步骤一制备的肿瘤组织单细胞悬液进行分离，得到肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)；
步骤三、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；
步骤四、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；
步骤五：对肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞(double-negative T cell，DNT细胞)进行分离；
步骤六：将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
进一步地，步骤一包括如下步骤：
（11）、取肿瘤组织块，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，用剪刀剪成小块组织，将小块组织浸入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清基础培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，其中：
胶原酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1～20mg/ml；
透明质酸酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1～10mg/ml；
DNA酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.01～10mg/ml；
（12）、再向其中加入1～10℃磷酸盐缓冲液，充分混匀，通过200目金属筛网过滤，即得到肿瘤组织单细胞悬液。
进一步地，步骤一包括如下步骤：
对于发生癌性胸腹水的患者，通过胸穿或者腹穿的方式，用注射器或者负压引流袋来抽取癌性胸腹水，经滤网过滤即得到肿瘤组织单细胞悬液。
进一步地，步骤二中包括如下步骤：
（21）、将肿瘤组织单细胞悬液加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500～2000rpm ，离心时间4～10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重新悬浮，充分混匀后用无菌移液器轻轻加入到装有人淋巴细胞分离液的离心管中，铺在人淋巴细胞分离液上，其中：
细胞沉淀、无菌PBS缓冲液、人淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1；
（22）、将步骤（21）中装有肿瘤组织单细胞悬液和人淋巴细胞分离液的离心管置于水平转子的差速离心机上进行离心，速度升降指数为升6降4，转速450～550g, 离心时间15～25分钟，收集上清层和淋巴细胞分离液之间呈白色云雾状的淋巴细胞层；
（23）、将步骤（22）所得淋巴细胞层移入另一离心管中，加入适量PBS缓冲液，用吸管反复吹吸清洗细胞后，置于离心机上进行离心，转速1800～2000rpm，离心时间4～10分钟，弃去上清，得到肿瘤浸润性淋巴细胞，取样进行细胞计数。
进一步地，步骤三包括如下步骤:
（31）、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液：
往每（0.5～5）× 105～8个步骤二所得肿瘤浸润淋巴细胞中加入0.4ml无菌磷酸盐缓冲液、5～500ul Fc受体阻断剂、10～1000ul抗人IgG磁珠、2～200ul PD-1抗体溶液和/或2～200ul TIM-3的抗体溶液，充分混和均匀，制得肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液；
（32）、将步骤（31）得到的肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液加入到细胞磁性分选柱中，利用磁性分离器吸附表达PD-1和/或TIM-3的活化TIL细胞，弃掉上清液后移除磁性分离器，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液洗脱细胞磁性分选柱，收集洗脱的细胞液，即获得肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤四包括如下步骤:
（41）、将抗CD3抗体、无菌磷酸盐缓冲液加入细胞培养瓶中，液面高出瓶底1～3mm，包被细胞培养瓶，封口膜封口，孵箱过夜；次日在超净工作台无菌环境下打开封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次，其中：
抗CD3抗体的用量以无菌磷酸盐缓冲液的体积计算，其为0.05～10mg/ml；
（42）、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞置于步骤（41）处理后的细胞培养瓶，并向细胞培养瓶中加入混合培养基，用混合培养基将肿瘤特异性TIL细胞的浓度调整为0.5～1.5×106个/ml，然后向该混合培养基中分别加入适量的IL-2、抗CD3抗体、抗CD28抗体、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、链霉素、青霉素、人a型血血清和/或人b型血血清，然后将培养瓶放入培养箱中在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，过夜，其中：
混合培养基是由体积比为（1～5）：(1～5)的人体外周血淋巴细胞培养基和AIM-V培养基混合而成；
IL-2的用量以混合培养基的体积计，为10～500ng/ml；
抗CD3抗体用量以混合培养基的体积计，为100～500ng/ml；
抗CD28抗体用量以混合培养基的体积计，为100～500ng/ml；
L-谷氨酰胺用量以混合培养基的体积计，为0.2～10mmol/ml；
β-巯基乙醇用量以混合培养基的体积计，为0.5～20mmol/ml；
链霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
青霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
人a型血血清和/或人b型血血清的用量与混合培养基的质量比为（1～2）:（8～9）；
（43）、第2天向细胞培养瓶中以100～10000IU/ml 的比例加入IL-2，以后每3天换液1次，即轻轻吸去上清，加入混合培养基液至原来的体积继续培养，同时补充细胞因子：以100～10000IU/ml的比例加入IL-2、以100-500ng/ml的比例加入抗CD3抗体及以100～500ng/ml的比例加入抗CD28抗体；每当细胞数达到1.5～2.5×106个/ml时，均分为两瓶连续扩增培养，到第7～14天，得到大量的肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤五中，包括如下步骤：
（51）、将步骤四得到的肿瘤特异性TIL细胞加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500～2000rpm，离心时间4～10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液按体积比1:（10～100）重新悬浮得到细胞悬液，加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗人CD4、CD8抗体试剂，避光、4℃条件下振荡孵育15分钟得到细胞抗体孵育液，其中：
PE标记的抗人CD4、CD8抗体试剂的用量以所述细胞悬液的体积计， 0.5ml/1×108细胞，加入每种抗体的终浓度至10～20μg/ml；
（52）、将步骤（51）得到的细胞抗体孵育液置于离心管中，置离心机上进行离心分离，转速1500～2000rpm ，离心时间4～10分钟，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入20倍体积的无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入2倍体积的抗PE抗体包被磁性颗粒（Anti- R-Phycoerythrin Magnetic Particles）试剂，混匀后室温孵育15分钟，震荡混匀30s，加入1倍体积的磁珠，室温孵育10分钟。
（53）、再向其中加入80倍体积无菌磷酸盐缓冲液，抽吸混匀后注入流式管中，将流式管安置在磁性分离器中，室温孵育10分钟；拿起磁性分离器，快速倒置磁性分离器和其中放置的流式管，将流式管中的细胞孵育液倒入阴选管中，将最后一滴液体弃去；
（54）、将阴选管中的细胞取50ul，上流式细胞仪进行检测，若PE磁珠和/或杂细胞过多，用流式分选方法进一步除去PE磁珠和杂细胞，收集肿瘤特异性DNT细胞，并进行细胞计数。
进一步地，步骤六包括如下步骤：
（61）、用5ug/mL纯化抗人CD3抗体的无菌磷酸盐缓冲液包被细胞培养瓶，封口膜封口，37℃孵箱过夜；次日，在超净工作台无菌环境下开启封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次；
（62）、将步骤五得到的肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞置于步骤（61）处理后的细胞培养瓶中，加入纯化抗人CD28抗体含量为3ug/mL和人重组IL-2含量为20 ng/mL的x-vivo 15培养液，使其中肿瘤特异性DNT细胞浓度为（0.5～1）×106 个/ml，然后将培养瓶放入培养箱中，在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养；
（63）在细胞培养的第3天、第7天观察细胞增殖情况，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液A充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到另一个已包被的新培养瓶中，即将细胞均分成两瓶进行培养，其中：
所述新培养液A为含3ug/mL纯化抗人CD28抗体和20 ng/mL 人重组IL-2的x-vivo 15培养基；
（64）在细胞培养的10～21天，每三天换液一次，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液B充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到新的不需包被处理的细胞培养瓶中继续培养；所述新培养液B为含0.1 ug/mL 纯化抗人CD3抗体和20 ng/mL人重组IL-2的x-vivo 15培养基，即制得大量具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
与现有技术相比，本发明公开的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法具有如下的有益效果：
1.本发明利用活化的T细胞表达的抑制性受体将肿瘤特异性T细胞从复杂的细胞群中分离出来，增加了分离的针对性，使培养得到的肿瘤特异性TIL细胞的肿瘤杀伤活性更强；
2.本发明利用免疫磁珠分离技术从肿瘤特异性TIL细胞中递进式分离出肿瘤特异性DNT细胞，并进行了体外扩增，操作流程简单，且便于推广使用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
实施例1
肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,包括：
步骤一、肿瘤组织单细胞悬液的制备；
步骤二、对步骤一制备的肿瘤组织单细胞悬液进行分离，得到肿瘤浸润性淋巴细胞；
步骤三、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；
步骤四、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；
步骤五：对肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞进行分离；
步骤六：将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
进一步地，步骤一包括如下步骤：
（11）、取肿瘤组织块，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，用剪刀剪成小块组织，将小块组织浸入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清基础培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，其中：
胶原酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1mg/ml；
透明质酸酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1mg/ml；
DNA酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.01mg/ml；
（12）、再向其中加入1℃磷酸盐缓冲液，充分混匀，通过200目金属筛网过滤，即得到肿瘤组织单细胞悬液。
进一步地，步骤二中包括如下步骤：
（21）、将肿瘤组织单细胞悬液加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500rpm ，离心时间10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重新悬浮，充分混匀后用无菌移液器轻轻加入到装有人淋巴细胞分离液的离心管中，铺在人淋巴细胞分离液上，其中：
细胞沉淀、无菌PBS缓冲液、人淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1；
（22）、将步骤（21）中装有肿瘤组织单细胞悬液和人淋巴细胞分离液的离心管置于水平转子的差速离心机上进行离心，速度升降指数为升6降4，转速500g, 离心时间20分钟，收集上清层和淋巴细胞分离液之间呈白色云雾状的淋巴细胞层；
（23）、将步骤（22）所得淋巴细胞层移入另一离心管中，加入适量PBS缓冲液，用吸管反复吹吸清洗细胞后，置于离心机上进行离心，转速1800rpm，离心时间10分钟，弃去上清，得到肿瘤浸润性淋巴细胞，取样进行细胞计数。
进一步地，步骤三包括如下步骤:
（31）、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液：
往每0.5×105个步骤二所得肿瘤浸润淋巴细胞中加入0.4ml无菌磷酸盐缓冲液、5ulFc受体阻断剂、10ul抗人IgG磁珠、2ul PD-1抗体溶液，充分混和均匀，制得肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液；
（32）、将步骤（31）得到的肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液加入到细胞磁性分选柱中，利用磁性分离器吸附表达PD-1和/或TIM-3的活化TIL细胞，弃掉上清液后移除磁性分离器，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液洗脱细胞磁性分选柱，收集洗脱的细胞液，即获得肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤四包括如下步骤:
（41）、将抗CD3抗体、无菌磷酸盐缓冲液加入细胞培养瓶中，液面高出瓶底1mm，包被细胞培养瓶，封口膜封口，孵箱过夜；次日在超净工作台无菌环境下打开封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次，其中：
抗CD3抗体的用量以无菌磷酸盐缓冲液的体积计算，其为0.05mg/ml；
（42）、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞置于步骤（41）处理后的细胞培养瓶，并向细胞培养瓶中加入混合培养基，用混合培养基将肿瘤特异性TIL细胞的浓度调整为0.5×106个/ml，然后向该混合培养基中分别加入适量的IL-2、抗CD3抗体、抗CD28抗体、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、链霉素、青霉素、人a型血血清，然后将培养瓶放入培养箱中在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，过夜，其中：
混合培养基是由体积比为1：5的人体外周血淋巴细胞培养基和AIM-V培养基混合而成；
IL-2的用量以混合培养基的体积计，为10ng/ml；
抗CD3抗体用量以混合培养基的体积计，为100ng/ml；
抗CD28抗体用量以混合培养基的体积计，为100ng/ml；
L-谷氨酰胺用量以混合培养基的体积计，为0.2mmol/ml；
β-巯基乙醇用量以混合培养基的体积计，为0.5mmol/ml；
链霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
青霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
人a型血血清的用量与混合培养基的质量比为1:9；
（43）、第2天向细胞培养瓶中以100IU/ml 的比例加入IL-2，以后每3天换液1次，即轻轻吸去上清，加入混合培养基液至原来的体积继续培养，同时补充细胞因子：以100IU/ml的比例加入IL-2、以100ng/ml的比例加入抗CD3抗体及以100ng/ml的比例加入抗CD28抗体；每当细胞数达到1.5×106个/ml时，均分为两瓶连续扩增培养，到第7天，得到大量的肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤五中，包括如下步骤：
（51）、将步骤四得到的肿瘤特异性TIL细胞加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500rpm，离心时间10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液按体积比1:10重新悬浮得到细胞悬液，加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗人CD4、CD8抗体试剂，避光、4℃条件下振荡孵育15分钟得到细胞抗体孵育液，其中：
PE标记的抗人CD4、CD8抗体试剂的用量以所述细胞悬液的体积计， 0.5ml/1×108细胞，加入每种抗体的终浓度至10μg/ml；
（52）、将步骤（51）得到的细胞抗体孵育液置于离心管中，置离心机上进行离心分离，转速1500rpm ，离心时间10分钟，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入20倍体积的无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入2倍体积的抗PE抗体包被磁性颗粒（Anti- R-Phycoerythrin Magnetic Particles）试剂，混匀后室温孵育15分钟，震荡混匀30s，加入1倍体积的磁珠，室温孵育10分钟。
（53）、再向其中加入80倍体积无菌磷酸盐缓冲液，抽吸混匀后注入流式管中，将流式管安置在磁性分离器中，室温孵育10分钟；拿起磁性分离器，快速倒置磁性分离器和其中放置的流式管，将流式管中的细胞孵育液倒入阴选管中，将最后一滴液体弃去；
（54）、将阴选管中的细胞取50ul，上流式细胞仪进行检测，若PE磁珠和/或杂细胞过多，用流式分选方法进一步除去PE磁珠和杂细胞，收集肿瘤特异性DNT细胞，并进行细胞计数。
进一步地，步骤六包括如下步骤：
（61）、用5ug/mL纯化抗人CD3抗体的无菌磷酸盐缓冲液包被细胞培养瓶，封口膜封口，37℃孵箱过夜；次日，在超净工作台无菌环境下开启封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次；
（62）、将步骤五得到的肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞置于步骤（61）处理后的细胞培养瓶中，加入纯化抗人CD28抗体含量为3ug/mL和人重组IL-2含量为20 ng/mL的x-vivo 15培养液，使其中肿瘤特异性DNT细胞浓度为0.5×106 个/ml，然后将培养瓶放入培养箱中，在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养；
（63）在细胞培养的第3天、第7天观察细胞增殖情况，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液A充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到另一个已包被的新培养瓶中，即将细胞均分成两瓶进行培养，其中：
所述新培养液A为含3ug/mL纯化抗人CD28抗体和20 ng/mL 人重组IL-2的x-vivo 15培养基；
（64）在细胞培养的10天，每三天换液一次，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液B充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到新的不需包被处理的细胞培养瓶中继续培养；新培养液B为含0.1 ug/mL 纯化抗人CD3抗体和20 ng/mL人重组IL-2的x-vivo 15培养基，即制得大量具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
实施例2
肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,包括：
步骤一、肿瘤组织单细胞悬液的制备；
步骤二、对步骤一制备的肿瘤组织单细胞悬液进行分离，得到肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)；
步骤三、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；
步骤四、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；
步骤五：对肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞进行分离；
步骤六：将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
进一步地，步骤一包括如下步骤：
（11）、取肿瘤组织块，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，用剪刀剪成小块组织，将小块组织浸入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清基础培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，其中：
胶原酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为20mg/ml；
透明质酸酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为10mg/ml；
DNA酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为10mg/ml；
（12）、再向其中加入10℃磷酸盐缓冲液，充分混匀，通过200目金属滤网过滤，即得到肿瘤组织单细胞悬液。
进一步地，步骤二中包括如下步骤：
（21）、将肿瘤组织单细胞悬液加入离心管中，置离心机上进行离心，转速2000rpm ，离心时间4分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重新悬浮，充分混匀后用无菌移液器轻轻加入到装有人淋巴细胞分离液的离心管中，铺在人淋巴细胞分离液上，其中：
细胞沉淀、无菌PBS缓冲液、人淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1；
（22）、将步骤（21）中装有肿瘤组织单细胞悬液和人淋巴细胞分离液的离心管置于水平转子的差速离心机上进行离心，速度升降指数为升6降4，转速450g, 离心时间15分钟，收集上清层和淋巴细胞分离液之间呈白色云雾状的淋巴细胞层；
（23）、将步骤（22）所得淋巴细胞层移入另一离心管中，加入适量PBS缓冲液，用吸管反复吹吸清洗细胞后，置于离心机上进行离心，转速2000rpm，离心时间4分钟，弃去上清，得到肿瘤浸润性淋巴细胞，取样进行细胞计数。
进一步地，步骤三包括如下步骤:
（31）、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液：
往每5×108个步骤二所得肿瘤浸润淋巴细胞中加入0.4ml无菌磷酸盐缓冲液、500ulFc受体阻断剂、1000ul抗人IgG磁珠、200ul PD-1抗体溶液，充分混和均匀，制得肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液；
（32）、将步骤（31）得到的肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液加入到细胞磁性分选柱中，利用磁性分离器吸附表达PD-1和/或TIM-3的活化TIL细胞，弃掉上清液后移除磁性分离器，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液洗脱细胞磁性分选柱，收集洗脱的细胞液，即获得肿瘤特异性TIL细胞。
步骤（31）所述Fc受体阻断剂是一种人工合成的多肽，可以阻断位于不同细胞上的Fc受体，如血液中的造血细胞、淋巴细胞和组织以及肿瘤细胞和细胞株，用来排除抗体的Fc部分与位于白细胞或者肿瘤细胞表面的Fc受体之间形成非特异性结合，而这种非特异性结合会导致背景信号的产生以及非特异性染色的出现。
进一步地，步骤四包括如下步骤:
（41）、将抗CD3抗体、无菌磷酸盐缓冲液加入细胞培养瓶中，液面高出瓶底3mm，包被细胞培养瓶，封口膜封口，孵箱过夜；次日在超净工作台无菌环境下打开封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次，其中：
抗CD3抗体的用量以无菌磷酸盐缓冲液的体积计算，其为10mg/ml；
（42）、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞置于步骤（41）处理后的细胞培养瓶，并向细胞培养瓶中加入混合培养基，用混合培养基将肿瘤特异性TIL细胞的浓度调整为1.5×106个/ml，然后向该混合培养基中分别加入适量的IL-2、抗CD3抗体、抗CD28抗体、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、链霉素、青霉素、人b型血血清，然后将培养瓶放入培养箱中在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，过夜，其中：
混合培养基是由体积比为5：1的人体外周血淋巴细胞培养基和AIM-V培养基混合而成；
IL-2的用量以混合培养基的体积计，为500ng/ml；
抗CD3抗体用量以混合培养基的体积计，为500ng/ml；
抗CD28抗体用量以混合培养基的体积计，为500ng/ml；
L-谷氨酰胺用量以混合培养基的体积计，为10mmol/ml；
β-巯基乙醇用量以混合培养基的体积计，为20mmol/ml；
链霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
青霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
人b型血血清的用量与混合培养基的质量比为2:8；
（43）、第2天向细胞培养瓶中以10000IU/ml 的比例加入IL-2，以后每3天换液1次，即轻轻吸去上清，加入混合培养基液至原来的体积继续培养，同时补充细胞因子：以10000IU/ml的比例加入IL-2、以500ng/ml的比例加入抗CD3抗体及以500ng/ml的比例加入抗CD28抗体；每当细胞数达到2.5×106个/ml时，均分为两瓶连续扩增培养，到第14天，得到大量的肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤五中，包括如下步骤：
（51）、将步骤四得到的肿瘤特异性TIL细胞加入离心管中，置离心机上进行离心，转速2000rpm，离心时间4分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液按体积比1:100重新悬浮得到细胞悬液，加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗人CD4、CD8抗体试剂，避光、4℃条件下振荡孵育15分钟得到细胞抗体孵育液，其中：
PE标记的抗人CD4、CD8抗体试剂的用量以所述细胞悬液的体积计， 0.5ml/1×108细胞，加入每种抗体的终浓度至20μg/ml；
（52）、将步骤（51）得到的细胞抗体孵育液置于离心管中，置离心机上进行离心分离，转速2000rpm ，离心时间4分钟，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入20倍体积的无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入2倍体积的抗PE抗体包被磁性颗粒（Anti- R-Phycoerythrin Magnetic Particles）试剂，混匀后室温孵育15分钟，震荡混匀30s，加入1倍体积的磁珠，室温孵育10分钟；
（53）、再向其中加入80倍体积无菌磷酸盐缓冲液，抽吸混匀后注入流式管中，将流式管安置在磁性分离器中，室温孵育10分钟；拿起磁性分离器，快速倒置磁性分离器和其中放置的流式管，将流式管中的细胞孵育液倒入阴选管中，将最后一滴液体弃去；
（54）、将阴选管中的细胞取50ul，上流式细胞仪进行检测，若PE磁珠和/或杂细胞过多，用流式分选方法进一步除去PE磁珠和杂细胞，收集肿瘤特异性DNT细胞，并进行细胞计数。
进一步地，步骤六包括如下步骤：
（61）、用5ug/mL纯化抗人CD3抗体的无菌磷酸盐缓冲液包被细胞培养瓶，封口膜封口，37℃孵箱过夜；次日，在超净工作台无菌环境下开启封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次；
（62）、将步骤五得到的肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞置于步骤（61）处理后的细胞培养瓶中，加入纯化抗人CD28抗体含量为3ug/mL和人重组IL-2含量为20 ng/mL的x-vivo 15培养液，使其中肿瘤特异性DNT细胞浓度为1×106 个/ml，然后将培养瓶放入培养箱中，在5v/v％CO2、37℃条件下进行培养；
（63）在细胞培养的第3天、第7天观察细胞增殖情况，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液A充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到另一个已包被的新培养瓶中，即将细胞均分成两瓶进行培养，其中：
所述新培养液A为含3ug/mL纯化抗人CD28抗体和20 ng/mL 人重组IL-2的x-vivo 15培养基；
（64）在细胞培养的10天，每三天换液一次，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液B充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到新的不需包被处理的细胞培养瓶中继续培养；所述新培养液B为含0.1 ug/mL 纯化抗人CD3抗体和20ng/mL人重组IL-2的x-vivo 15培养基，即制得大量具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
实施例3
肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,包括：
步骤一、肿瘤组织单细胞悬液的制备；
步骤二、对步骤一制备的肿瘤组织单细胞悬液进行分离，得到肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)；
步骤三、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；
步骤四、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；
步骤五：对肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞进行分离；
步骤六：将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
进一步地，步骤一包括如下步骤：
（11）、取肿瘤组织块，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，用剪刀剪成小块组织，将小块组织浸入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清基础培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，其中：
胶原酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为10mg/ml；
透明质酸酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为5mg/ml；
DNA酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为5mg/ml；
（12）、再向其中加入4℃磷酸盐缓冲液，充分混匀，通过200目金属滤网过滤，即得到肿瘤组织单细胞悬液。
进一步地，步骤二中包括如下步骤：
（21）、将肿瘤组织单细胞悬液加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1800rpm ，离心时间6分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重新悬浮，充分混匀后用无菌移液器轻轻加入到装有人淋巴细胞分离液的离心管中，铺在人淋巴细胞分离液上，其中：
细胞沉淀、无菌PBS缓冲液、人淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1；
（22）、将步骤（21）中装有肿瘤组织单细胞悬液和人淋巴细胞分离液的离心管置于水平转子的差速离心机上进行离心，速度升降指数为升6降4，转速550g, 离心时间25分钟，收集上清层和淋巴细胞分离液之间呈白色云雾状的淋巴细胞层；
（23）、将步骤（22）所得淋巴细胞层移入另一离心管中，加入适量PBS缓冲液，用吸管反复吹吸清洗细胞后，置于离心机上进行离心，转速1900rpm，离心时间7分钟，弃去上清，得到肿瘤浸润性淋巴细胞，取样进行细胞计数。
进一步地，步骤三包括如下步骤:
（31）、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液：
往每3×107个步骤二所得肿瘤浸润淋巴细胞中加入0.4ml无菌磷酸盐缓冲液、200ulFc受体阻断剂、300ul抗人IgG磁珠、100ul PD-1抗体溶液，充分混和均匀，制得肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液；
（32）、将步骤（31）得到的肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液加入到细胞磁性分选柱中，利用磁性分离器吸附表达PD-1和/或TIM-3的活化TIL细胞，弃掉上清液后移除磁性分离器，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液洗脱细胞磁性分选柱，收集洗脱的细胞液，即获得肿瘤特异性TIL细胞。
步骤（31）所述Fc受体阻断剂是一种人工合成的多肽，可以阻断位于不同细胞上的Fc受体，如血液中的造血细胞、淋巴细胞和组织以及肿瘤细胞和细胞株，用来排除抗体的Fc部分与位于白细胞或者肿瘤细胞表面的Fc受体之间形成非特异性结合，而这种非特异性结合会导致背景信号的产生以及非特异性染色的出现。
进一步地，步骤四包括如下步骤:
（41）、将抗CD3抗体、无菌磷酸盐缓冲液加入细胞培养瓶中，液面高出瓶底2mm，包被细胞培养瓶，封口膜封口，孵箱过夜；次日在超净工作台无菌环境下打开封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次，其中：
抗CD3抗体的用量以无菌磷酸盐缓冲液的体积计算，其为5mg/ml；
（42）、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞置于步骤（41）处理后的细胞培养瓶，并向细胞培养瓶中加入混合培养基，用混合培养基将肿瘤特异性TIL细胞的浓度调整为1×106个/ml，然后向该混合培养基中分别加入适量的IL-2、抗CD3抗体、抗CD28抗体、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、链霉素、青霉素、人a型血血清和人b型血血清，然后将培养瓶放入培养箱中在5v/v％CO2、37℃条件下进行培养，过夜，其中：
混合培养基是由体积比为3：2的人体外周血淋巴细胞培养基和AIM-V培养基混合而成；
IL-2的用量以混合培养基的体积计，为200ng/ml；
抗CD3抗体用量以混合培养基的体积计，为300ng/ml；
抗CD28抗体用量以混合培养基的体积计，为200ng/ml；
L-谷氨酰胺用量以混合培养基的体积计，为5mmol；
β-巯基乙醇用量以混合培养基的体积计，为10mmol；
链霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
青霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
人a型血血清和b型血血清的用量之和与混合培养基的质量比为1.5:8.5；
（43）、第2天向细胞培养瓶中以5000IU/ml 的比例加入IL-2，以后每3天换液1次，即轻轻吸去上清，加入混合培养基液至原来的体积继续培养，同时补充细胞因子：以5000IU/ml的比例加入IL-2、以300ng/ml的比例加入抗CD3抗体及以300ng/ml的比例加入抗CD28抗体；每当细胞数达到2 ×106个/ml时，均分为两瓶连续扩增培养，到第10天，得到大量的肿瘤特异性TIL细胞。
进一步地，步骤五中，包括如下步骤：
（51）、将步骤四得到的肿瘤特异性TIL细胞加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1800rpm，离心时间7分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液按体积比1:100重新悬浮得到细胞悬液，加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗人CD4、CD8抗体试剂，避光、4℃条件下振荡孵育15分钟得到细胞抗体孵育液，其中：
PE标记的抗人CD4、CD8抗体试剂的用量以所述细胞悬液的体积计， 0.5ml/1×108细胞，加入每种抗体的终浓度至15μg/ml；
（52）、将步骤（51）得到的细胞抗体孵育液置于离心管中，置离心机上进行离心分离，转速1800rpm ，离心时间6分钟，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入20倍体积的无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入2倍体积的抗PE抗体包被磁性颗粒（Anti- R-Phycoerythrin Magnetic Particles）试剂，混匀后室温孵育15分钟，震荡混匀30s，加入1倍体积的磁珠，室温孵育10分钟；
（53）、再向其中加入80倍体积无菌磷酸盐缓冲液，抽吸混匀后注入流式管中，将流式管安置在磁性分离器中，室温孵育10分钟；拿起磁性分离器，快速倒置磁性分离器和其中放置的流式管，将流式管中的细胞孵育液倒入阴选管中，将最后一滴液体弃去；
（54）、将阴选管中的细胞取50ul，上流式细胞仪进行检测，若PE磁珠和/或杂细胞过多，用流式分选方法进一步除去PE磁珠和杂细胞，收集肿瘤特异性DNT细胞，并进行细胞计数。
进一步地，步骤六包括如下步骤：
（61）、用5ug/mL纯化抗人CD3抗体的无菌磷酸盐缓冲液包被细胞培养瓶，封口膜封口，37℃孵箱过夜；次日，在超净工作台无菌环境下开启封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次；
（62）、将步骤五得到的肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞置于步骤（61）处理后的细胞培养瓶中，加入新培养液A使其中肿瘤特异性DNT细胞浓度为0.8×106 个/ml，然后将培养瓶放入培养箱中，在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，其中：
所述新培养液A为含3ug/mL纯化抗人CD28抗体和20 ng/mL 人重组IL-2的x-vivo 15培养基；
（63）、在细胞培养的第3天、第7天观察细胞增殖情况，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液A充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到另一个已包被的新培养瓶中，即将细胞均分成两瓶进行培养；
（64）、在细胞培养的14天，每三天换液一次，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液BB至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液B充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到新的不需包被处理的细胞培养瓶中继续培养；所述新培养液B为含0.1 ug/mL 纯化抗人CD3抗体和20ng/mL人重组IL-2的x-vivo 15培养基，即制得大量具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
实施例4
与实施例1大致相同，区别仅仅在于步骤（31）中还加入了200ul TIM-3的抗体溶液。
实施例5
与实施例2大致相同，区别仅仅在于步骤（31）中还加入了2ul TIM-3的抗体溶液。
实施例6
与实施例3大致相同，区别仅仅在于步骤（31）中还加入了100ul TIM-3的抗体溶液。
实施例7
与实施例1大致相同，区别仅仅在于步骤一的肿瘤组织单细胞悬液的制备步骤不同：
步骤一包括如下步骤：
对于发生癌性胸腹水的患者，通过胸穿的方式，用注射器来抽取癌性胸腹水，经滤网过滤即得到肿瘤组织单细胞悬液。
实施例8
与实施例1大致相同，区别仅仅在于步骤一的肿瘤组织单细胞悬液的制备步骤不同：
步骤一包括如下步骤：
对于发生癌性胸腹水的患者，通过腹穿的方式，用负压引流袋来抽取癌性胸腹水，经滤网过滤即得到肿瘤组织单细胞悬液。
实施例9
与实施例1大致相同，区别仅仅在于步骤一的肿瘤组织单细胞悬液的制备步骤不同：
步骤一包括如下步骤：
对于发生癌性胸腹水的患者，通过胸穿的方式，用负压引流袋来抽取癌性胸腹水，经滤网过滤即得到肿瘤组织单细胞悬液。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (8)
1.肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，包括：
步骤一、肿瘤组织单细胞悬液的制备；
步骤二、对步骤一制备的肿瘤组织单细胞悬液进行分离，得到肿瘤浸润性淋巴细胞；
步骤三、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液，然后将肿瘤特异性TIL细胞从肿瘤浸润性淋巴细胞磁珠混合悬液中分离出；
步骤四、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行体外扩增培养得到大量的肿瘤特异性TIL细胞；
步骤五：对肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞进行分离；
步骤六：将肿瘤特异性DNT细胞在高效扩增培养体系中进行扩增培养，得到具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
2.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤一包括如下步骤：
（11）、取肿瘤组织块，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗干净后，用剪刀剪成小块组织，将小块组织浸入胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清基础培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，其中：
胶原酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1～20mg/ml；
透明质酸酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.1～10mg/ml；
DNA酶的浓度以无血清基础培养基的体积计，为0.01～10mg/ml；
（12）、再向其中加入1～10℃磷酸盐缓冲液，充分混匀，通过200目金属筛网过滤，即得到肿瘤组织单细胞悬液。
3.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤一包括如下步骤：
对于发生癌性胸腹水的患者，通过胸穿或者腹穿的方式，用注射器或者负压引流袋来抽取癌性胸腹水，经滤网过滤即得到肿瘤组织单细胞悬液。
4.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤二中包括如下步骤：
（21）、将肿瘤组织单细胞悬液加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500～2000rpm ，离心时间4～10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液重新悬浮，充分混匀后用无菌移液器轻轻加入到装有人淋巴细胞分离液的离心管中，铺在人淋巴细胞分离液上，其中：
细胞沉淀、无菌PBS缓冲液、人淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1；
（22）、将步骤（21）中装有肿瘤组织单细胞悬液和人淋巴细胞分离液的离心管置于水平转子的差速离心机上进行离心，速度升降指数为升6降4，转速450～550g, 离心时间15～25分钟，收集上清层和淋巴细胞分离液之间呈白色云雾状的淋巴细胞层；
（23）、将步骤（22）所得淋巴细胞层移入另一离心管中，加入适量PBS缓冲液，用吸管反复吹吸清洗细胞后，置于离心机上进行离心，转速1800～2000rpm，离心时间4～10分钟，弃去上清，得到肿瘤浸润性淋巴细胞，取样进行细胞计数。
5.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤三包括如下步骤:
（31）、配制肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液：
往每（0.5～5）×105～8个步骤二所得肿瘤浸润淋巴细胞中加入0.4ml无菌磷酸盐缓冲液、5～500ul Fc受体阻断剂、10～1000ul抗人IgG磁珠、2～200ul PD-1抗体溶液和/或2～200ul TIM-3的抗体溶液，充分混和均匀，制得肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液；
（32）、将步骤（31）得到的肿瘤浸润淋巴细胞磁珠混合悬液加入到细胞磁性分选柱中，利用磁性分离器吸附表达PD-1和/或TIM-3的活化TIL细胞，弃掉上清液后移除磁性分离器，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液洗脱细胞磁性分选柱，收集洗脱的细胞液，即获得肿瘤特异性TIL细胞。
6.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤四包括如下步骤:
（41）、将抗CD3抗体、无菌磷酸盐缓冲液加入细胞培养瓶中，液面高出瓶底1～3mm，包被细胞培养瓶，封口膜封口，孵箱过夜；次日在超净工作台无菌环境下打开封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次，其中：
抗CD3抗体的用量以无菌磷酸盐缓冲液的体积计算，其为0.05～10mg/ml；
（42）、将步骤三所得肿瘤特异性TIL细胞置于步骤（41）处理后的细胞培养瓶，并向细胞培养瓶中加入混合培养基，用混合培养基将肿瘤特异性TIL细胞的浓度调整为0.5～1.5×106个/ml，然后向该混合培养基中分别加入适量的IL-2、抗CD3抗体、抗CD28抗体、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、链霉素、青霉素、人a型血血清和/或人b型血血清，然后将培养瓶放入培养箱中在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，过夜，其中：
混合培养基是由体积比为（1～5）：(1～5)的人体外周血淋巴细胞培养基和AIM-V培养基混合而成；
IL-2的用量以混合培养基的体积计，为10～500ng/ml；
抗CD3抗体用量以混合培养基的体积计，为100～500ng/ml；
抗CD28抗体用量以混合培养基的体积计，为100～500ng/ml；
L-谷氨酰胺用量以混合培养基的体积计，为0.2～10mmol/ml；
β-巯基乙醇用量以混合培养基的体积计，为0.5～20mmol/ml；
链霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
青霉素用量以混合培养基的体积计，为100ug/ml；
人a型血血清和/或人b型血血清的用量与混合培养基的质量比为（1～2）:（8～9）；
（43）、第2天向细胞培养瓶中以100～10000IU/ml 的比例加入IL-2，以后每3天换液1次，即轻轻吸去上清，加入混合培养基液至原来的体积继续培养，同时补充细胞因子：以100～10000IU/ml的比例加入IL-2、以100-500ng/ml的比例加入抗CD3抗体及以100～500ng/ml的比例加入抗CD28抗体；每当细胞数达到1.5～2.5×106个/ml时，均分为两瓶连续扩增培养，到第7～14天，得到大量的肿瘤特异性TIL细胞。
7.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤五中，包括如下步骤：
（51）、将步骤四得到的肿瘤特异性TIL细胞加入离心管中，置离心机上进行离心，转速1500～2000rpm，离心时间4～10分钟；离心后弃去上清，将所得细胞沉淀用无菌PBS缓冲液按体积比1:（10～100）重新悬浮得到细胞悬液，加入藻红蛋白标记的抗人CD4、CD8抗体试剂，避光、4℃条件下振荡孵育15分钟得到细胞抗体孵育液，其中：
PE标记的抗人CD4、CD8抗体试剂的用量以所述细胞悬液的体积计， 0.5ml/1×108细胞，加入每种抗体的终浓度至10～20μg/ml；
（52）、将步骤（51）得到的细胞抗体孵育液置于离心管中，置离心机上进行离心分离，转速1500～2000rpm ，离心时间4～10分钟，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入20倍体积的无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞，离心后弃去上清，所得细胞沉淀加入2倍体积的抗PE抗体包被磁性颗粒试剂，混匀后室温孵育15分钟，震荡混匀30s，加入1倍体积的磁珠，室温孵育10分钟；
（53）、再向其中加入80倍体积无菌磷酸盐缓冲液，抽吸混匀后注入流式管中，将流式管安置在磁性分离器中，室温孵育10分钟；拿起磁性分离器，快速倒置磁性分离器和其中放置的流式管，将流式管中的细胞孵育液倒入阴选管中，将最后一滴液体弃去；
（54）、将阴选管中的细胞取50ul，上流式细胞仪进行检测，若PE磁珠和/或杂细胞过多，用流式分选方法进一步除去PE磁珠和杂细胞，收集肿瘤特异性DNT细胞，并进行细胞计数。
8.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL和DNT细胞的递进式分离和培养方法,其特征在于，步骤六包括如下步骤：
（61）、用5ug/mL纯化抗人CD3抗体的无菌磷酸盐缓冲液包被细胞培养瓶，封口膜封口，37℃孵箱过夜；次日，在超净工作台无菌环境下开启封口膜，以适量无菌磷酸盐缓冲液加2%m/V胎牛血清淋洗培养瓶内壁3次；
（62）、将步骤五得到的肿瘤特异性CD4CD8双阴性T细胞置于步骤（61）处理后的细胞培养瓶中，加入新培养液A使其中肿瘤特异性DNT细胞浓度为（0.5～1）×106 个/ml，然后将培养瓶放入培养箱中，在5 v/v％CO2、37℃条件下进行培养，其中：
所述新培养液A为含3ug/mL纯化抗人CD28抗体和20 ng/mL 人重组IL-2的x-vivo 15培养基
（63）、在细胞培养的第3天、第7天观察细胞增殖情况，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液A至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液A充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到另一个已包被的新培养瓶中，即将细胞均分成两瓶进行培养；
（64）、在细胞培养的10～21天，每三天换液一次，若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不足90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来的体积继续培养；若细胞的数量平铺细胞培养瓶的底面面积不小于90%，轻轻吸去上清，加入新培养液B至原来体积的二倍，用移液器轻轻吹打，使细胞和新培养液B充分混匀成悬液后，将其中一半的细胞悬液转移到新的不需包被处理的细胞培养瓶中继续培养；所述新培养液B为含0.1 ug/mL 纯化抗人CD3抗体和20 ng/mL人重组IL-2的x-vivo 15培养基，即制得大量具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性DNT细胞。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN112961828A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-06-15 | 傅松涛 | 一种促进dnt细胞扩增与活化的方法 |
| CN114672457A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-06-28 | 优赛医疗科技(天津)有限公司 | 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 |
| CN114672458A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-06-28 | 优赛医疗科技(天津)有限公司 | 来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020039576A1 (en) * | 2000-08-21 | 2002-04-04 | Li Zhang | Method of modulating tumor immunity |
| CN101313061A (zh) * | 2005-11-18 | 2008-11-26 | 大学健康网络 | 扩增双阴性t细胞的方法 |
| CN105087485A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-25 | 上海鑫宸医疗科技有限公司 | 一种肿瘤特异性til细胞的培养方法 |
| CN107400658A (zh) * | 2017-08-14 | 2017-11-28 | 福建医科大学孟超肝胆医院 | 一种从肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法 |
-
2020
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020039576A1 (en) * | 2000-08-21 | 2002-04-04 | Li Zhang | Method of modulating tumor immunity |
| CN101313061A (zh) * | 2005-11-18 | 2008-11-26 | 大学健康网络 | 扩增双阴性t细胞的方法 |
| CN105087485A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-25 | 上海鑫宸医疗科技有限公司 | 一种肿瘤特异性til细胞的培养方法 |
| CN107400658A (zh) * | 2017-08-14 | 2017-11-28 | 福建医科大学孟超肝胆医院 | 一种从肝癌组织中分离纯化出cd8+t细胞的方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112961828A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-06-15 | 傅松涛 | 一种促进dnt细胞扩增与活化的方法 |
| CN114672457A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-06-28 | 优赛医疗科技(天津)有限公司 | 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 |
| CN114672458A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-06-28 | 优赛医疗科技(天津)有限公司 | 来源于肿瘤患者胸腹水的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 |
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