CN113430166A - 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，包括基础培养基80‑100份、自体血浆5‑15份、诱导剂0.2‑1.5份、活化剂0.2‑1.5份、细胞因子0.08‑0.4份、补充氨基酸2‑8份、葡萄糖3‑5份和去离子水20‑40份。按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种外周血单个核细胞，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；细胞接种培养2‑3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10‑14天后收集NK细胞。

Description

一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。
在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D,AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。
目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。目前体外大规模扩增NK细胞的两种常用方法：
1、滋养细胞(K562细胞)刺激法
以基因工程手段构建滋养细胞，如CD8α-CD137-K562、4-1BBL-K562等，利用这种方法得到NK细胞纯度较高、倍数也较大，但是由于(1)涉及基因转染，成本和步骤较为复杂；(2)需要用到K562细胞(一种肿瘤细胞)，使用者对其安全有一定的顾虑；(3)在NK细胞或者CAR-NK细胞进行药品注册的时候，需要对其进行安全性评价，滋养细胞为一个完整的细胞，涉及到的评价内容会非常复杂，极大的增加了安评的难度和支出。
2、因子刺激方法
传统的NK细胞体外扩增方法，利用一些细胞因子或者因子组合在体外刺激PBMC或者纯化的NK细胞，利用该方法得到的NK细胞一般纯度不高(NK细胞纯度不高意味着，其它杂细胞的含量高，比如T细胞，而T细胞为特异性细胞，如果回输进入人体，容易产生GVHD反应)，倍数也不大(倍数不高意味着终产品中NK细胞的数量少，而数量少就不能达到治疗或者杀伤靶细胞的目的)，也有极端一些的可以得到极高纯度的效应细胞，但是扩增倍数极低，即便延长培养时间也无法达到临床所需的数量。
本发明提供了一种利用因子方法在体外大量扩增NK细胞的方法，该方法可以在12天内达到以下技术效果(1)效应细胞纯度89.88％以上，平均91％；(2)扩增5000倍以上(平均6500倍，最高可达8000倍以上)；(3)杀伤活性不降低；(4)细胞存活率87.21％以上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基80-100份、自体血浆5-15份、诱导剂0.2-1.5份、活化剂0.2-1.5份、细胞因子0.08-0.4份、补充氨基酸2-8份、葡萄糖3-5份和去离子水20-40份。
优选的一种实施案例，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基85份、自体血浆12份、诱导剂0.5份、活化剂0.5份、细胞因子0.1份、补充氨基酸3份、葡萄糖3份和去离子水25份。
优选的一种实施案例，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基90份、自体血浆10份、诱导剂0.8份、活化剂0.9份、细胞因子0.2份、补充氨基酸5份、葡萄糖4份和去离子水30份。
优选的一种实施案例，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基80-100份、自体血浆5-15份、诱导剂0.2-1.5份、活化剂0.2-1.5份、细胞因子0.08-0.4份、补充氨基酸2-8份、葡萄糖3-5份和去离子水20-40份。
优选的一种实施案例，所述基础培养基为免疫细胞无血清培养基，所述自体血浆为人脐血血浆或外周血血浆，所述细胞因子包括白细胞介素21 5-60ng/mL、白细胞介素151-20ng/ml、白细胞介素12 5-50ng/mL、白细胞介素5 2-15ng/ml和白细胞介素2 50-300ng/mL。
优选的一种实施案例，所述诱导剂包括抗CD3单克隆抗体50-150μg/L、抗CD28单抗20-180μg/L、抗CD127单抗12-160μg/L、白细胞介素2 10-200μg/L、白细胞介素12 10-100μg/L和白细胞介素15 10-150μg/L、TNFSF9 12-98μg/L。
优选的一种实施案例，所述活化剂包括IL-2 10-100μg/L、IL-18 10-100μg/L、INF-β10-100μg/L、TNF-α10-200μg/L和白细胞调节素10-100μg/L。
优选的一种实施案例，所述补充氨基酸包括精氨酸200-300mg/L、谷氨酸15-25mg/L、甘氨酸8-12mg/L、亮氨酸40-60mg/L、脯氨酸18-22mg/L和门冬氨酸12-25mg/L。
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、制备自体血浆
S101、将装有人脐血的采血管用酒精擦拭消毒后放入超净工作台内，打开采血管，将脐血倒入消毒的离心管内，在室温下，2000rpm离心10min；
S102、离心完毕后，从离心机中拿出离心管，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血浆至50ml离心管中，灭活，剩余下层血细胞备用；
S103、将灭活好的血浆2500rpm离心8min，离心完毕后，通过移液枪吸取上清液与离心管中，-20℃冰箱保存；
S2、单个核细胞提取
S201、用生理盐水对S102剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水：血细胞＝1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用；
S202、根据稀释后的血细胞体积，在另一个离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中，淋巴细胞分离液：稀释的血细胞悬液＝1:1，室温，2500rpm，离心20min；
S203、离心完毕后，取出离心管，用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min，离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min，重复两次；
S204、第二次离心完毕后，取出离心管，取足量上清液至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样，剩余上清弃去，取离心管底部剩余细胞为单个核细胞；
S3、细胞接种
按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂份和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种单个核细胞，接种密度为1-50×106个/mL，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
S4、NK细胞扩增培养
细胞接种培养2-3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10-14天后收集NK细胞。
优选的一种实施案例，步骤S102中，所述灭活条件为56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min；步骤S202中，所述血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中的方法为将淋巴细胞细胞离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管，避免打乱液面界面。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过在无血清培养基基础上添加诱导剂、活化培养基，针对NK细胞诱导、活化时期的不同影响需求而设计，培养得到的NK细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和活性等方面都优于现有技术，通过脐血血浆的全面性直接分离得到自体血浆和单核细胞，使得培养中的血浆与自体生长环境相似，避免动物血浆中不确定的成分对细胞培养的结果造成的不确定影响；
2、效应细胞纯度89.88％以上，平均91％；扩增5000倍以上(平均6500倍，最高可达8000倍以上)；杀伤活性不降低；细胞存活率87.21％以上，对比常规普通培养方法，大大提高了NK细胞得率，增加了NK细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本，且材料易得、方法简单，具有推广价值。
附图说明
图1为本发明NK细胞扩增倍数图；
图2为本发明NK细胞扩增纯度图；
图3为本发明NK细胞存活率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基85份、自体血浆12份、诱导剂0.5份、活化剂0.5份、细胞因子0.1份、补充氨基酸3份、葡萄糖3份和去离子水25份。
进一步的，基础培养基为免疫细胞无血清培养基，自体血浆为人脐血血浆或外周血血浆，细胞因子包括白细胞介素21 20ng/mL、白细胞介素15 9ng/ml、白细胞介素1215ng/mL、白细胞介素5 6ng/ml和白细胞介素2 100ng/mL。
进一步的，诱导剂包括抗CD3单克隆抗体70μg/L、抗CD28单抗60μg/L、抗CD127单抗70μg/L、白细胞介素2 90μg/L、白细胞介素12 40μg/L和白细胞介素15 50μg/L、TNFSF9 30μg/L。
进一步的，活化剂包括IL-2 40μg/L、IL-18 30μg/L、INF-β35μg/L、TNF-α80μg/L和白细胞调节素30μg/L。
进一步的，补充氨基酸包括精氨酸230mg/L、谷氨酸17mg/L、甘氨酸9mg/L、亮氨酸43mg/L、脯氨酸19mg/L和门冬氨酸15mg/L。
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、制备自体血浆
S101、将装有人脐血的采血管用酒精擦拭消毒后放入超净工作台内，打开采血管，将脐血倒入消毒的离心管内，在室温下，2000rpm离心10min；
S102、离心完毕后，从离心机中拿出离心管，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血浆至50ml离心管中，灭活，剩余下层血细胞备用；
S103、将灭活好的血浆2500rpm离心8min，离心完毕后，通过移液枪吸取上清液与离心管中，-20℃冰箱保存；
S2、单个核细胞提取
S201、用生理盐水对S102剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水：血细胞＝1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用；
S202、根据稀释后的血细胞体积，在另一个离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中，淋巴细胞分离液：稀释的血细胞悬液＝1:1，室温，2500rpm，离心20min；
S203、离心完毕后，取出离心管，用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min，离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min，重复两次；
S204、第二次离心完毕后，取出离心管，取足量上清液至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样，剩余上清弃去，取离心管底部剩余细胞为单个核细胞；
S3、细胞接种
按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂份和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种单个核细胞，接种密度为10000000个/mL，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
S4、NK细胞扩增培养
细胞接种培养2-3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10-14天后收集NK细胞。
进一步的，步骤S102中，灭活条件为56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min；步骤S202中，血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中的方法为将淋巴细胞细胞离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管，避免打乱液面界面。
实施例2
本发明提供一种技术方案：一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基90份、自体血浆10份、诱导剂0.8份、活化剂0.9份、细胞因子0.2份、补充氨基酸5份、葡萄糖4份和去离子水30份。
进一步的，基础培养基为免疫细胞无血清培养基，自体血浆为人脐血血浆或外周血血浆，细胞因子包括白细胞介素21 40ng/mL、白细胞介素15 10ng/ml、白细胞介素1230ng/mL、白细胞介素5 11ng/ml和白细胞介素2 200ng/mL。
进一步的，诱导剂包括抗CD3单克隆抗体110μg/L、抗CD28单抗120μg/L、抗CD127单抗110μg/L、白细胞介素2 130μg/L、白细胞介素12 60μg/L和白细胞介素15 120μg/L、TNFSF9 60μg/L。
进一步的，活化剂包括IL-2 60μg/L、IL-18 50μg/L、INF-β55μg/L、TNF-α150μg/L和白细胞调节素45μg/L。
进一步的，补充氨基酸包括精氨酸260mg/L、谷氨酸20mg/L、甘氨酸10mg/L、亮氨酸50mg/L、脯氨酸20mg/L和门冬氨酸20mg/L。
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、制备自体血浆
S101、将装有人脐血的采血管用酒精擦拭消毒后放入超净工作台内，打开采血管，将脐血倒入消毒的离心管内，在室温下，2000rpm离心10min；
S102、离心完毕后，从离心机中拿出离心管，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血浆至50ml离心管中，灭活，剩余下层血细胞备用；
S103、将灭活好的血浆2500rpm离心8min，离心完毕后，通过移液枪吸取上清液与离心管中，-20℃冰箱保存；
S2、单个核细胞提取
S201、用生理盐水对S102剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水：血细胞＝1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用；
S202、根据稀释后的血细胞体积，在另一个离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中，淋巴细胞分离液：稀释的血细胞悬液＝1:1，室温，2500rpm，离心20min；
S203、离心完毕后，取出离心管，用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min，离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min，重复两次；
S204、第二次离心完毕后，取出离心管，取足量上清液至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样，剩余上清弃去，取离心管底部剩余细胞为单个核细胞；
S3、细胞接种
按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂份和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种单个核细胞，接种密度为30000000个/mL，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
S4、NK细胞扩增培养
细胞接种培养2-3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10-14天后收集NK细胞。
进一步的，步骤S102中，灭活条件为56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min；步骤S202中，血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中的方法为将淋巴细胞细胞离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管，避免打乱液面界面。
实施例3
本发明提供一种技术方案：一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基80-100份、自体血浆5-15份、诱导剂0.2-1.5份、活化剂0.2-1.5份、细胞因子0.08-0.4份、补充氨基酸2-8份、葡萄糖3-5份和去离子水20-40份。
进一步的，基础培养基为免疫细胞无血清培养基，自体血浆为人脐血血浆或外周血血浆，细胞因子包括白细胞介素21 50ng/mL、白细胞介素15 18ng/ml、白细胞介素1240ng/mL、白细胞介素5 13ng/ml和白细胞介素2 260ng/mL。
进一步的，诱导剂包括抗CD3单克隆抗体140μg/L、抗CD28单抗170μg/L、抗CD127单抗150μg/L、白细胞介素2 170μg/L、白细胞介素12 80μg/L和白细胞介素15 130μg/L、TNFSF9 80μg/L。
进一步的，活化剂包括IL-2 90μg/L、IL-18 80μg/L、INF-β88μg/L、TNF-α180μg/L和白细胞调节素90μg/L。
进一步的，补充氨基酸包括精氨酸260mg/L、谷氨酸23mg/L、甘氨酸11mg/L、亮氨酸55mg/L、脯氨酸21mg/L和门冬氨酸23mg/L。
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、制备自体血浆
S101、将装有人脐血的采血管用酒精擦拭消毒后放入超净工作台内，打开采血管，将脐血倒入消毒的离心管内，在室温下，2000rpm离心10min；
S102、离心完毕后，从离心机中拿出离心管，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血浆至50ml离心管中，灭活，剩余下层血细胞备用；
S103、将灭活好的血浆2500rpm离心8min，离心完毕后，通过移液枪吸取上清液与离心管中，-20℃冰箱保存；
S2、单个核细胞提取
S201、用生理盐水对S102剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水：血细胞＝1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用；
S202、根据稀释后的血细胞体积，在另一个离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中，淋巴细胞分离液：稀释的血细胞悬液＝1:1，室温，2500rpm，离心20min；
S203、离心完毕后，取出离心管，用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min，离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min，重复两次；
S204、第二次离心完毕后，取出离心管，取足量上清液至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样，剩余上清弃去，取离心管底部剩余细胞为单个核细胞；
S3、细胞接种
按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂份和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种单个核细胞，接种密度为40000000个/mL，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
S4、NK细胞扩增培养
细胞接种培养2-3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10-14天后收集NK细胞。
进一步的，步骤S102中，灭活条件为56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min；步骤S202中，血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中的方法为将淋巴细胞细胞离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管，避免打乱液面界面。
现将本发明的实施例1-3作为实验组1-3，将常规方法培养NK细胞作为对照组，对照组培养基采用优质细胞因子培养方法，接种密度20000000个/mL，其细胞扩增倍数如图1所示，通过对比发现：对照组在培养12天后扩增倍数仅为2483倍，而实验组1-3的扩增倍数分别为5021倍、6801倍和6328倍，对比结果可以看出，本方法达到的扩增倍数在5000倍以上，平均6500倍，实验显示最终最高倍数可达8000倍以上；
并且选取上述实验组扩增倍数最多的实验组2进行细胞纯度和细胞存活率实验，结果分别如图2和图3所示，结果如下：(1)第12天时，CD3-CD56+占比为90.54％，效应细胞纯度89.88％以上，平均91％；(2)细胞存活率87.21％以上；(3)细胞纯度和存活率高，保证NK细胞的杀伤活性不降低。
对比常规普通培养方法，大大提高了NK细胞得率，增加了NK细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
综上所述，本发明通过在无血清培养基基础上添加诱导剂、活化培养基，针对NK细胞诱导、活化时期的不同影响需求而设计，培养得到的NK细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和活性等方面都优于现有技术，本技术不仅可以采用外周血单个核细胞为原材料进行培养，也可采用脐血作为原材料进行培养，通过脐血血浆的全面性直接分离得到自体血浆和单核细胞，使得培养中的血浆与自体生长环境相似，避免动物血浆中不确定的成分对细胞培养的结果造成的不确定影响，从而稳定培养NK细胞，大大提高了NK细胞得率，增加了NK细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基80-100份、自体血浆5-15份、诱导剂0.2-1.5份、活化剂0.2-1.5份、细胞因子0.08-0.4份、补充氨基酸2-8份、葡萄糖3-5份和去离子水20-40份。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基85份、自体血浆12份、诱导剂0.5份、活化剂0.5份、细胞因子0.1份、补充氨基酸3份、葡萄糖3份和去离子水25份。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基90份、自体血浆10份、诱导剂0.8份、活化剂0.9份、细胞因子0.2份、补充氨基酸5份、葡萄糖4份和去离子水30份。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，以体积份计，其原料组成包括：基础培养基80-100份、自体血浆5-15份、诱导剂0.2-1.5份、活化剂0.2-1.5份、细胞因子0.08-0.4份、补充氨基酸2-8份、葡萄糖3-5份和去离子水20-40份。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述基础培养基为免疫细胞无血清培养基，所述自体血浆为人脐血血浆或外周血血浆，所述细胞因子包括白细胞介素21 5-60ng/mL、白细胞介素15 1-20ng/ml、白细胞介素12 5-50ng/mL、白细胞介素5 2-15ng/ml和白细胞介素2 50-300ng/mL。
6.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述诱导剂包括抗CD3单克隆抗体50-150μg/L、抗CD28单抗20-180μg/L、抗CD127单抗12-160μg/L、白细胞介素2 10-200μg/L、白细胞介素12 10-100μg/L和白细胞介素15 10-150μg/L、TNFSF9 12-98μg/L。
7.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述活化剂包括IL-2 10-100μg/L、IL-18 10-100μg/L、INF-β10-100μg/L、TNF-α10-200μg/L和白细胞调节素10-100μg/L。
8.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述补充氨基酸包括精氨酸200-300mg/L、谷氨酸15-25mg/L、甘氨酸8-12mg/L、亮氨酸40-60mg/L、脯氨酸18-22mg/L和门冬氨酸12-25mg/L。
9.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备自体血浆
S101、将装有人脐血的采血管用酒精擦拭消毒后放入超净工作台内，打开采血管，将脐血倒入消毒的离心管内，在室温下，2000rpm离心10min；
S102、离心完毕后，从离心机中拿出离心管，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血浆至50ml离心管中，灭活，剩余下层血细胞备用；
S103、将灭活好的血浆2500rpm离心8min，离心完毕后，通过移液枪吸取上清液与离心管中，-20℃冰箱保存；
S2、单个核细胞提取
S201、用生理盐水对S102剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水：血细胞＝1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用；
S202、根据稀释后的血细胞体积，在另一个离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中，淋巴细胞分离液：稀释的血细胞悬液＝1:1，室温，2500rpm，离心20min；
S203、离心完毕后，取出离心管，用巴斯德滴管或1ml移液枪缓慢插入离心管中，沿管壁提取淋巴细胞分离液与血浆层交界处的白膜层，将提取的白膜层细胞加入50ml离心管中，补充生理盐水至45ml，混匀，1500rpm，离心5min，离心完毕后，取出离心管，用酒精纱布擦拭离心管外表面后放入超净工作台内，倒掉上清，补充生理盐水至45ml重悬，1000rpm，离心10min，重复两次；
S204、第二次离心完毕后，取出离心管，取足量上清液至15m离心管中，做上标记，送微生物检测并留样，剩余上清弃去，取离心管底部剩余细胞为单个核细胞；
S3、细胞接种
按配比将基础培养基、自体血浆、诱导剂、活化剂份和去离子水进行混和，并置于培养瓶中，向培养瓶中接种单个核细胞，接种密度为1-50×106个/mL，拧紧培养瓶盖，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
S4、NK细胞扩增培养
细胞接种培养2-3天后，取出培养瓶，使用移液枪吸取细胞因子、补充氨基酸和葡萄糖的混合液加入培养基内，充分混合后竖直放入37℃、5％CO2培养箱中扩增培养，扩增10-14天后收集NK细胞。
10.根据权利要求9所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：步骤S102中，所述灭活条件为56℃水浴锅中水浴30min，4℃放置30min；步骤S202中，所述血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的离心管中的方法为将淋巴细胞细胞离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞悬液，沿离心管壁缓慢滴加在淋巴细胞细胞分离液表面，滴加完毕后，缓慢竖立离心管，避免打乱液面界面。
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