CN1281740C - 一种细胞分化诱导剂、其制备方法及其在对干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在对干细胞向心肌组织细胞分化诱导中应用的细胞分化诱导剂，其为含有心肌细胞生长因子的营养液，特别公开了心肌细胞裂解液或含心肌裂解液中提纯成分的营养液，所述心肌细胞裂解液由心肌细胞或心脏组织反复冻融裂解而成。本发明利用CMs裂解液可以模拟心肌微环境，在诱导干细胞分化为心肌样细胞的同时，还诱导部分干细胞向内皮细胞方向分化，能很好地建立细胞间的联接，进行信号传导，且对细胞没有毒副作用，具有更好的应用和治疗前景。

Description

一种细胞分化诱导剂、其制备方法 及其在对干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及将干细胞定向诱导为心肌组织细胞技术中用到的细胞分化诱导剂、其制备方法及其应用。

现有技术

心肌梗死是导致心源性死亡的主要原因。心肌缺血发生后大量心肌细胞(cardiomyocytes，CMs)坏死，坏死的心肌主要由瘢痕组织取代，导致心脏收缩功能下降，进一步发展为心力衰竭。近期的研究虽然发现CMs具有一定再生能力，但其再生能力极为缓慢，不能满足心肌修复的需要。目前心梗后的主要治疗方法包括以ACEI和β受体阻滞剂为主的药物治疗和以改善缺血心肌局部血液供应为目的的冠脉介入治疗及心脏搭桥手术。由于以上这些治疗方法不能从根本上解决CMs的减少，因此只能起到延缓心功能恶化的作用。

近年来发展的细胞心肌移植技术为治疗缺血性心脏病提供了新的方向。这种方法主要通过将外源性的细胞移植到受损心肌中，增加心肌中具有收缩功能的细胞数量和质量并改善梗死区局部血循环，从而改善心功能。目前可供选择的移植细胞主要有：成骨骼肌细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞等。成骨骼肌细胞形态和功能上都不同于CMs，进入心肌微环境后也不能分化为心肌样细胞，特别是它移植入心肌后不能与宿主细胞建立电-机械偶联，只能在相邻的宿主CMs收缩时被动收缩，因此难以有效改善心功能，并有可能导致严重心律失常的发生；胚胎干细胞移植由于存在异体排斥和伦理方面问题，且细胞来源困难，细胞分化方向不确定，有潜在的致瘤性，因此限制了它的应用；自体骨髓干细胞由于来源丰富，相对容易获得，且不存在免疫排斥等问题，具有较好的应用前景。

由于骨髓干细胞具有多向分化能力，在不同的条件下可以分化为不同类型的细胞，如果将新鲜的骨髓细胞直接注入心梗动物模型体内，能够存活并分化为心肌样细胞的比例非常低。因此，在移植前对骨髓细胞进行分离纯化及定向诱导是细胞心肌移植技术研究中的重要内容。骨髓中存在有多向分化能力的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，它来源于中胚层，具有自我更新和修复损伤组织的功能，在一定条件下可以分化为肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，是目前细胞心肌移植技术中研究的较多的一类细胞。

5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)是甲基化酶抑制剂，有研究表明MSCs可被化学物质5-aza在体外诱导分化成为心肌样细胞。1999年加拿大的Tomita将5-aza诱导的骨髓单个核细胞注射到冷冻法制作的大鼠心梗模型中，发现在心肌的瘢痕组织中有骨髓来源的心肌样细胞，且心梗动物模型的心功能有所改善。日本的Fukuta在2001年发表文章详细介绍了5-aza诱导MSCs分化的具体过程，并从形态学、蛋白质水平、RNA水平以及电生理各个方面证明分化后的细胞具有CMs的特性，适宜的诱导条件是在细胞接种后三天内用浓度为5-10umol/l的5-aza持续作用24小时。然而，本发明在研究中发现细胞经过5-aza处理后部分细胞脱壁、降解或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-aza作为一种化学物质，在诱导MSCs分化的同时对细胞也具有一定毒性作用，另一方面，没有证据证明5-aza可以在体外诱导分化得到内皮细胞，因而从生物安全性上和实际生物环境上考虑5-氮杂胞苷的临床应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以对干细胞向心肌组织细胞定向分化诱导的细胞分化诱导剂。

本发明提供的细胞分化诱导剂，其为含有心肌细胞生长因子的营养液。具体的，所述细胞分化诱导剂为心肌细胞裂解液或含心肌裂解液中提纯成分的营养液，所述心肌细胞裂解液由心肌细胞或心脏组织经以下方法反复冻融裂解而成。

本发明的另一目的在于提供一种该细胞分化诱导剂的制备方法。

该方法是将心肌细胞或心脏组织反复冻融裂解制成心肌细胞裂解液。

该方法具体包括以下操作：1)将心肌细胞或心脏组织制成细胞悬液，迅速置于低于-70℃环境中冷冻；2)冷冻约4-5个小时后取出，在4℃左右融化并充分粉碎；3)分离细胞裂解物溶液，去除细胞碎片后上清液经过滤取到的滤液即为心肌细胞裂解液。

更为具体的，所述心肌细胞裂解液通过以下方法制备：将生长较好的第一、二代心肌细胞制成1×10⁶/ml的细胞悬液，迅速置于-70℃以下冰箱中，约4-5个小时后取出融化，并用吸管反复吹打细胞悬液，如此反复3次后将细胞裂解液在2000转/分的条件下离心10分钟，将上清用0.45um的滤器过滤后取滤液即为心肌细胞裂解液。

本发明目的还在于提出上述细胞分化诱导剂在扩增干细胞和对干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用。

具体的，所述应用为细胞分化诱导剂在对骨髓间充质干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用。

更具体的，所述应用为心肌细胞裂解液在对骨髓间充质干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用。

本发明通过细胞体外培养实验证明：本发明提供的细胞分化诱导剂，特别是含有CMs裂解液的培养基可以在体外模拟心肌微环境，并诱导MSCs分化为心肌样细胞；并且在诱导MSCs分化为心肌样细胞的同时，还诱导部分MSCs向内皮细胞方向分化，同时能很好地建立细胞间的联接，能进行信号传导，且对细胞没有明显毒副作用，优于目前广泛研究的肌细胞诱导分化剂5-aza；并且CMs裂解液促进细胞增殖的作用非常明显，且实验操作简单，具有更好的应用和治疗前景。

附图说明

图1为本发明实施例中四组MSCs贴片体外培养后细胞形态；其中，

A.未经诱导的MSCs体外培养1周；

B.经5-aza诱导的MSCs体外培养1周；

C.MSCs经含有4倍CMs裂解液的培养基培养1周；

D.MSCs经5-aza诱导后用含有4倍CMs裂解液的培养基培养1周，部分细胞内可见大量细胞空泡(↑所示)。

图1实验结果表明：在相同的时间内，经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组明显增殖快于5-aza诱导组，且没有毒副作用。

图2为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经α-actin单克隆抗体免疫染色照片(25×)；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组。图2实验结果表明：在相同条件下，经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组与5-aza诱导组均有α-actin抗原表达，证明诱导后细胞有横纹肌细胞类型存在。

图3为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经cTnT单克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组。图3实验结果表明：在相同条件下，经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组与5-aza诱导组均有cTnT心肌特异抗原表达，证明诱导后细胞有大量心肌细胞类型。

图4为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经CD31单克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组。图4实验结果表明：在相同条件下，经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组有表达CD31阳性的内皮细胞存在，它有可能在移植心肌组织中建立新的血液CD31阳性的内皮细胞存在循环是必需的。而5-aza诱导组没有明显的CD31阳性的内皮细胞存在，实验结果支持心肌细胞裂解液诱导优于5-aza诱导。

图5为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经Connexin43多克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组。图5实验结果表明：在相同条件下，经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组和5-aza诱导组均能表达细胞联接蛋白Connexin43，说明经诱导后细胞能建立细胞信号传导所需蛋白，为细胞形成电机械偶联打下结构基础。

图6为MTS法分析5-aza和CMs裂解液对MSCs增殖的影响，经酶标仪测定的细胞吸光度平均值。图6实验结果表明：经心肌细胞裂解液诱导的干细胞组较5-aza诱导组增殖明显。

具体实施方式

以下结合附图与具体实验详述本发明。

心肌细胞微环境可以诱导MSCs向心肌组织细胞分化，本发明通过向MSC培养体系中加入细胞分化诱导剂，特别是心肌细胞裂解液的方法体外模拟心肌细胞微环境，从而提供一种对干细胞向心肌组织细胞分化起作用的心肌细胞微环境。

心肌微环境所提供的诱导因素应该是多方面的，但总的来说可以归为两类：化学性因素和物理性因素。化学性因素包括细胞因子、激素、离子梯度以及周围细胞产生的其他可溶性因子；物理性因素较为复杂，包括直接接触的细胞和细胞基质所提供的信号刺激，细胞之间的牵拉力，细胞之间的电生理环境等等。以往的研究认为诱导MSCs向心肌细胞分化的关键因素是MSCs与心肌细胞之间的直接接触，而心肌细胞所分泌的各种细胞因子或其他未知的可溶性物质不足以起到诱导作用。本发明却通过实验得出，细胞分化诱导剂，特别是反复冻融裂解所得到的包括心肌细胞所分泌释放的各种细胞因子和未知的可溶性物质的心肌细胞裂解液可以诱导MSCs向心肌组织细胞的分化。

因此，本发明首先提出一种细胞分化诱导剂，其为含有心肌细胞生长因子的心肌微循环营养液。作为一个具体的实例，较好的此种细胞分化诱导剂为心肌细胞裂解液。该心肌细胞裂解液通过以下方法制备：将生长较好的第一，二代心肌细胞制成1×10⁶/ml的细胞悬液，迅速置于-70℃冰箱中，约4-5个小时后取出融化，并用吸管反复吹打细胞悬液，如此反复3次后将细胞裂解液在2000转/分的条件下离心10分钟，将上清用0.45um的滤器过滤后取滤液备用。

所述心肌细胞裂解液也可以直接使用心脏组织经反复冻融裂解得到。

下面实验以心肌细胞裂解液在骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中所起的作用为例证明本发明的效果。

实验中采用的心肌细胞裂解液取自新生乳鼠，这主要是考虑新生鼠的心肌细胞活力好，对骨髓细胞具有诱导作用的有效成分含量较高。且相同重量的乳鼠心肌与成年鼠的心肌相比，含心肌细胞数量多、纤维组织少，利于提取。本实验方法也适于选取其他不同年龄及种属动物的心肌细胞裂解液，同时包括直接制作的心肌组织细胞裂解液，并通过实验条件(如心肌细胞裂解液的浓度)的选取最终应用到人体。

实验材料和方法：

1.实验材料与动物：IMDM培养基(美国Gibco公司)，优质胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，II型胶原酶(美国Gibco公司)，5-aza，α-actin，cTnT，CD31(美国Sigma公司)。成熟SD大鼠，200-250g(北京协和医院动物房提供)；新生SD大鼠，1天龄(北京协和医院动物房提供)。

2.成熟大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养：成熟SD大鼠予乌拉坦(12％，1ml/100g)腹腔麻醉后于股骨及胫骨处吸取适量骨髓，加入装有IMDM培养基(成分：15％胎牛血清，青霉素G 100u/ml，链霉素80u/ml)的25cm²的培养瓶中，吹打均匀后置于37℃、95％的CO₂孵箱内，培养2天后，换液弃去悬浮细胞，认为此时贴壁的部分细胞为MSCs，细胞隔天换液，细胞80％融合时进行传代。

3.新生大鼠心肌细胞的分离和培养：将新生SD大鼠断颈处死，迅速取出其心脏并于冰上剪碎，PBS缓冲液洗涤3次，用II型胶原酶(1.25mg/mL)37℃消化30分钟，收集心肌细胞悬液及未消化完全之心肌组织，800转/分离心5分钟，弃上清，无血清IMDM培养基反复洗涤细胞2次，IMDM培养基(成分：15％胎牛血清，青霉素G 100u/ml，链霉素80u/ml)将细胞吹打均匀后转移至25cm²培养皿中，置于37℃、95％的CO₂孵箱内，约2天细胞贴壁后换液，此后隔天换液，1周后1∶2传代。

4.体外诱导骨髓间充质干细胞：取生长较好的第二代MSCs制成4×10⁵/ml的细胞悬液，滴加25ul于25mm²的盖玻片上。约4小时后细胞贴于玻片上，再加入含15％胎牛血清的IMDM培养基培养。将上述MSCs贴片分为四组做如下处理：

A组(对照组)：MSCs仅在含15％胎牛血清的IMDM培养基中培养，不加入5-aza或心肌细胞裂解液。

B组(5-aza诱导组)：加入10umol/l的5-aza，37℃避光孵育24小时后，换新鲜的含15％胎牛血清的IMDM培养基继续培养，隔天换液；

C组(心肌细胞裂解液培养组)：根据MSCs贴片上的细胞数量，将4倍于MSCs数量的心肌细胞裂解液加入MSC培养体系；隔天换液，每次换液均加入相同量的心肌细胞裂解液；

D组(5-aza诱导+心肌细胞裂解液培养组)：MSCs经10umol/l的5-aza诱导24小时后在其培养体系中加入4倍于MSCs数量的的心肌细胞裂解液；隔天换液，每次换液均加入相同量的心肌细胞裂解液；

5.免疫细胞化学染色：培养1周后取出上述四组MSCs贴片进行如下操作：PBS洗涤细胞贴片3次，95％的乙醇室温固定15分钟，PBS洗涤细胞贴片3次，分别加入α-actin，cTnT，CD31的单克隆抗体及Connexin43的多克隆抗体(α-actin，cTnT，CD31和Connexin43抗体购自武汉博士德生物工程有限公司进口分装的Santa Cruz的商品)，4℃孵育过夜，二抗选用辣根过氧化物酶结合的相应的IgG抗体，经DAB试剂盒显色。

其中，α-actin是横纹肌的特异性标记，通过检测α-actin判断MSCs经诱导后表达横纹肌特异性抗原的情况；cTnT为一种心肌特异的抗原，Cx43是一种心肌细胞缝隙连接蛋白，CD31为内皮细胞特异性抗原。

实验结果

1.心肌细胞的体外培养及形态学特征：消化法分离的心肌细胞在培养瓶中生长3天后大部分已经贴壁，可见许多心肌细胞有节律的自发收缩，收缩频率不尽相同，快者120次/分左右，慢者60次/分左右，传代后的心肌细胞仍保有自主收缩的特性。随着培养时间的延长和传代次数的增加，聚集生长的心肌细胞集落逐渐减少，分散生长为许多单个心肌细胞，单个生长的心肌细胞仍可以自主收缩，但收缩幅度较小，完全贴壁的心肌细胞仅见胞内容物有节律的抽动。

2.MSCs的体外培养及形态学特征：参见图1，骨髓细胞分离培养后1-2天后换液，未贴壁的血细胞随换液被洗去，这时可见贴壁生长的MSCs，形态以圆形为主，带有小的突起。随培养时间延长，细胞形态变得不规则，1周后它们多数呈梭形或多角形，个别细胞还可见细丝状的突触(见图1-A)。MSCs经5-aza诱导24小时后已形成的突起明显回缩，变成带有毛刺的小圆形细胞，部分细胞脱壁或胀大降解。换为完全培养基培养，MSCs逐渐变长，1周后可见肌丝样结构形成(见图1-B)。MSCs在心肌细胞裂解液的作用下有聚集生长的趋势，大量细胞子代形成，1周后可见大量成片的肌丝样结构(见图1-C)。5-aza诱导的MSCs经心肌细胞裂解液处理后脱壁或降解的细胞数量少于仅用5-aza诱导的MSCs，细胞生长趋势也优于仅用5-aza诱导的MSC，1周后也形成大量的肌丝样结构，但部分细胞内有脂肪空泡形成(见图1-D)。

实验中还发现，细胞经过5-aza处理后部分细胞脱壁、降解，残存的细胞胞浆成分较空，这样的细胞即使再加入CMs裂解液继续培养，一段时间后仍可看见细胞内有大量的脂肪空泡形成，当细胞受到有害物质的作用后最直接的表现就是细胞脱壁、胞浆成分空化，进而形成许多脂肪空泡，这在细胞超微结构上表现为细胞器的空化、降解脂肪，因而空泡的存在说明细胞曾经受到毒性作用；而在CMs裂解液的环境中培养的MSCs却不出现上述情况。

3.免疫细胞化学染色：培养1周后C组α-actin，cTnT，CD31，Connexin43染色呈阳性；B组α-actin，cTnT，Connexin43染色呈阳性，CD31染色呈阴性；D组α-actin，cTnT，CD31，Connexin43染色呈阳性；对照组A组α-actin染色呈阳性，cTnT，CD31，Connexin43染色呈阴性。结果见表1及图2～图5，其中图2为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经α-actin单克隆抗体免疫染色照片(25×)；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组；图3为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经cTnT单克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组；图4为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经CD31单克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组；图5为CMs裂解液组和5-aza诱导组培养细胞经Connexin43多克隆抗体免疫染色照片(25×)，圈内部分为阳性结果；其中，B.5-aza诱导组；C.CMs裂解液组。

表1分组培养细胞经α-actin、cTnT、CD31、Connexin43抗体免疫细胞化学染色结果。+：部分细胞表达此种蛋白；-：没有细胞表达此种蛋白。

分组	1α-actin	2cTnT	3CD31	4Connexin43
					A.心肌细胞裂解液培养B.5-aza诱导组C.5-aza诱导+心肌细胞裂解液培养组D.对照组	++++	++++	+-+-	+++-

实验结果说明：体外采用心肌细胞裂解液模拟的心肌微环境可以诱导骨髓间充质干细胞分化为肌样细胞，并表达心肌特异性蛋白。实验中对照组MSCs经过一周的体外培养也表达α-actin，但通过密度梯度离心法从骨髓中刚刚分离的MSCs却不表达α-actin(未在结果中显示)，这提示体外培养过程中的细胞贴壁、传代等步骤有可能刺激MSC向肌细胞方向的分化，但从形态上看这种方法培养的MSC与真正的肌细胞相去甚远，更不具备心肌细胞特异的抗原。

本实验还证实了部分MSCs在心肌细胞裂解液的诱导下可以表达CD31，说明心肌微环境可以使一部分MSCs分化为血管内皮细胞，这对于移植细胞的存活及受损心肌血供的改善会起到十分重要的作用。同时还说明心肌细胞裂解液可以将具有多能分化潜能的MSCs诱导为包括心肌细胞、血管内皮细胞在内的一个细胞群体，与5-aza单一的肌细胞诱导作用相比，它更能提供一个心肌再生所需的全面的自然条件，如果将这种诱导方法应用于心肌细胞移植技术，对于提高移植效率可能很有价值。

4、细胞增殖分析实验：

MSCs的分化方向与其所处的微环境有关。对于反复心梗发作的患者其心脏内往往已有瘢痕组织形成的，而干细胞在心肌瘢痕组织中的分化方向是不确定的，且这部分患病人群多为中老年人，其体内MSCs数量有限，要想获得足够量的移植细胞，必定要经历一个细胞体外扩增的过程，在扩增阶段对骨髓细胞给予适当的诱导，就可以在一定程度上消除细胞分化的不确定性。本实验心肌细胞裂解液所模拟的心肌微环境提供这样一个完全的生理条件，在促进细胞增殖的同时诱导其分化，可能能更好地应用于临床诱导及治疗。

细胞增殖的测定(MTS法)：

将MSCs悬液接种于96孔板中(5000个细胞/孔)，在4种不同的条件下培养，1周后加入IMDM培养基100ul和CellTiter 96 AQueous One Solution试剂20ul，混合均匀后37℃避光孵育90分钟，酶标仪测定各孔细胞的吸光度值。结果参见表2和图6，发现：5-aza组MSCs的吸光度值低于对照组；CMs裂解液组MSCs的吸光度值高于对照组；5-aza+CMs裂解液组MSCs的吸光度值高于对照组，但不及CMs裂解液组MSCs。()

表2.MTS法分析5-aza和CMs裂解液对MSCs增殖的影响，经酶标仪测定的细胞吸光度结果。(单因素方差分析，各组均值有显著差异，P＜0.05)

分组(n＝3)	对照组	5-aza组	CMs裂解液组	5-aza+CMs裂解液组
					吸光度平均值±SD	0.485±0.013	0.420±0.009	0.562±0.016	0.517±0.012

实验发现，CMs裂解液的环境中培养的MSCs细胞生长旺盛、有大量子代形成，提示CMs裂解液所模拟的心肌微环境更符合细胞生长分化的天然环境，可为移植前的MSCs提供一个良好的增殖分化条件。

实验定量分析结果显示，相同数量的MSCs分别经四种条件培养一周，CMs裂解液促进细胞增殖的作用最为明显，5-aza对细胞生长具有抑制作用，但加入CMs裂解液后仍能恢复细胞的生长。因此，本发明CMs裂解液不仅具有诱导MSCs向CMs分化的作用，还具有促进MSCs增殖的作用。

以上实验证明了心肌细胞裂解液在骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中所起的作用。本发明不限于单纯使用实施例中制备的心肌细胞裂解液，事实上，本发明的细胞分化诱导剂可以根据所处的生物环境人工模拟，如根据心肌微环境所特有的化学性因素和物理性因素人工配制细胞分化诱导剂，或利用心肌细胞裂解液提纯物再重新组配营养液；本发明也不限于对骨髓间充质干细胞进行分化诱导，事实上，对于其它的干细胞，本发明的细胞分化诱导剂同样有效，该部分内容属于本领域的常识，在此不一一赘述。

Claims (5)

1、一种细胞分化诱导剂，其特征在于，其为心肌细胞裂解液，所述心肌细胞裂解液由心肌细胞或心脏组织经以下步骤获得：

1)将心肌细胞或心脏组织制成细胞悬液，迅速置于低于-70℃环境中冷冻；所述心肌细胞为生长较好的第一、第二代心肌细胞；

2)冷冻4-5个小时后取出，在4℃融化，用吸管反复吹打细胞悬液，如此反复3次；

3)将细胞裂解液在2000转/分的条件下离心10分钟，将上清用0.45μm的滤器过滤后取滤液即为心肌细胞裂解液。

2、一种细胞分化诱导剂的制备方法，由心肌细胞或心脏组织反复冻融裂解制成心肌细胞裂解液；所述心肌细胞裂解液由以下步骤获得：

1)将心肌细胞或心脏组织制成1×10⁶/ml的细胞悬液，迅速置于低于-70℃环境中冷冻；所述心肌细胞为生长较好的第一、二代心肌细胞；

2)冷冻4-5个小时后取出，在4℃融化，用吸管反复吹打细胞悬液，如此反复3次；

3)将细胞裂解液在2000转/分的条件下离心10分钟，将上清用0.45μm的滤器过滤后取滤液即为心肌细胞裂解液。

3、权利要求1所述细胞分化诱导剂在对骨髓间充质干细胞向心肌组织细胞分化诱导中的应用。

4、根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述心肌组织细胞为心肌细胞和血管内皮细胞。

5、权利要求1所述细胞分化诱导剂在扩增骨髓间充质干细胞中的应用。

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