CN102373177A

CN102373177A - 猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建

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Publication number: CN102373177A
Application number: CN2010102591686A
Authority: CN
Inventors: 杨跃进; 钱海燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2012-03-14

Abstract

本发明公开了猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系的构建。

Description

猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建

技术领域

本发明涉及骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建。

背景技术

近年来，干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty)，即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。移植干细胞实施细胞心肌成形术是改善心肌梗死造成的血液动力学和神经体液紊乱的一种可行的方法。各种前期动物实验表明干细胞具有修复心肌细胞的能力，能改善梗死区的灌注和心功能[Schuster MD，Kocher AA，Seki T，Martens TP，Xiang G，Homma S，et al.Myocardial neovascularization bybone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration.Am JPhysiol Heart CircPhysiol 2004；287：H525-532.(Schuster MD，KocherAA，Seki T，Martens TP，Xiang G，Homma S等，骨髓成血管细胞引起的血管新生导致心肌细胞再生.美国生理杂志心脏和循环分册2004；287：H525-532.)]。

在用于移植的的多种细胞类型中，尤以骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs)成为关注的焦点，因为其有着获取方便、自体移植从而免除免疫排斥反应、强大的体外增殖潜能和向三胚层组织类型的细胞分化能力等显著的优点，体外和在体移植实验均证实MSCs可以向心肌细胞分化[Tomita S，Li RK，Weisel RD，et al.Autologous transplantation of bone marrow cellsimproves damaged heart function.Circulation.1999；100：II247-56.(Tomita S，Li RK，Weisel RD等，自体骨髓干细胞移植改善受损的心功能.循环，1999；100：II247-56.)]。然而也有一些资料显示MSCs在体移植后不能横向分化为心肌，即使是经过5-氮胞苷的诱导后也不能分化为心肌细胞[Liu Y，Song J，Liu W，et al.Growth anddifferentiation of rat bone marrow stromal cells：does 5-azacytidinetrigger their cardiomyogenic differentiation？Cardiovasc.Res.2003；58：460-8.(Liu Y，Song J，Liu W，等.大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和分化：5-氮胞苷能启动其向心肌细胞分化吗？心血管研究.2003；58：460-8.)]。

导致上述结果争议的原因很多，其中最主要的是现有的诱导方法不足以提供确切的实验证据。

而本课题组前期研究在国际上首次发现，猪骨髓MSCs在体外培养到一定代数，即自发出现向心肌细胞分化的现象。基于此，本研究在前期实验的基础上，创新实验方法及干预手段，选择特定培养代数的猪骨髓MSCs，并给予特定浓度的5-氮胞苷进行诱导，以探索构建骨髓MSCs向心肌细胞横向分化的新体系。

发明内容

1.本发明表明特定浓度的5-氮胞苷可以诱导P10代MSCs成心肌分化，且分化的心肌细胞结构成熟，形态更典型，分化效率更高。

2.本发明结果提示MSCs培养状态下增殖潜能呈不均一性。

3.本发明首次发现猪骨髓来源的MSCs(10.3±1.8％)在P10代时能自发分化为心肌样细胞，即使在传代到30代时仍保持这种自发分化能力。免疫组化、电镜和RT-PCR均表明分化而成的是心肌样细胞，而非骨骼肌细胞。这些自发分化的MSCs可能就是MSCs培养过程中的定型的亚群。本发明发现猪骨髓MSCs在P1，P4和P8代时增殖较快，从P10代开始减缓，并出现自发分化现象，也支持上述观点。

4.本发明发现5-氮胞苷(10μM)能够诱导P1，P4，P8和P10代MSCs成心肌分化，重要的是电镜发现P10代分化细胞有相对比较成熟的心肌样结构，如排列整齐的肌丝、肌节、横纹和闰盘，而在其他早期代数的分化细胞中只发现一些肌丝。这些超微结构上的差异可能是由于P10代MSCs包含有定型的细胞前体，这些定型前体已经开始表达心肌表型，这样在为期4周的诱导观察期内更加成熟，而早期代数的MSCs大多处于未定型的“干细胞”阶段，5-氮胞苷只是启动了这些细胞的分化方向，因此在相同的观察期内并未达到相对成熟的阶段。这些在超微结构上的差异也被定量RT-PCR结果所证实。

综上所述，本发明首次发现猪骨髓来源的MSCs在体外培养状态下增殖到P10代时有部分组分出现增速减缓、形态改变、自发成心肌分化现象；并且在5-氮胞苷诱导下P10代MSCs分化比率显著高于早期各代细胞，超微结构更趋成熟。

具体实施方式

材料与方法

实验动物

10月龄的中华小型猪，体重(30kg±5kg)，由中国农业大学实验动物中心提供。所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。并且，所有实验方案均得到了中国医学科学院实验动物管理委员会和中国协和医科大学阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的认可。

猪骨髓单个核细胞(MNCs)的分离、培养和鉴定

肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉，两种药物剂量分别为25mg/kg和1mg/kg。在无菌操作下对猪的左髂嵴处备皮、铺单，用含12,500单位肝素的注射器抽取约50ml骨髓。所有实验动物在送回饲养间之前均肌肉注射丁丙诺啡0.3mg止痛。

MNCs的分离按以前报道方法略作修改。即抽取的骨髓用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍，加入硅石胶态悬浮液(Percoll分离液，1.077g/ml，Sigma公司)，在4℃条件下，800g离心30分钟分离出MNCs。以5×10⁵/cm²密度接种于75cm²培养瓶中，置入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。正常生长培养基为低糖Dulbecco’s Modified Eagle’ s Medium(LG-DMEM，Gibco)、13％胎牛血清(FBS，Gibco)。

形态学观察和增殖能力测定

取第1，4，8，10代MSCs(passage 1，4，8，10，P1，P4，P8，P10)按照300个细胞/孔密度接种于96孔培养板上，每代细胞取4孔样品消化后以2ml PBS稀释，在相差显微镜下以细胞计数板进行计数，每24h进行一次计数直至细胞停止增殖为止。计算平均活细胞数并绘制增殖曲线。细胞倍增时间(population doubling time，TD)按照下列公式计算：TD＝t(log 2)/(logNt-logNo)，t为培养时间，No和Nt分别为接种前后的细胞数。

体外成心肌分化的诱导

为检测5-氮胞苷是否能诱导MSCs成心肌分化，选取P1，P4，P8，P10代MSCs，按照2×10⁵/ml密度接种，接种后第二天向培养瓶中加入5-氮胞苷(10μM)，作用24h后洗去5-氮胞苷，继续传代4周，观察细胞形态变化并作进一步检测。

RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR

从待检细胞中以Trizol(Gibco)提取总RNA，合成cDNA。扩增以下基因：GATA4，α-MHC，MLC，phospholamban，connexin 43，心肌troponin I，α-sarcomeric actin，desmin，骨骼肌α-skeletal actin。选取GAPDH基因作为内参。来源于同一头猪的心肌细胞的总RNA同时进行RT-PCR扩增以作为阳性对照，以水代替cDNA作为阴性对照。

实时荧光定量RT-PCR：每个循环结束荧光光谱测量SYBR Green强度，循环完成后在75℃-95℃温度范围和连续荧光监测基础上分析溶解曲线，所有反应独立重复3次以确保结果的可重复性。

透射电镜观察超微结构

贴壁培养的细胞以37℃预热的PBS洗2次，加0.2％戊二醛固定30min后以PBS洗2次，以细胞刮轻轻刮下细胞转入离心管进行离心，800rpm×6min，弃上清，PBS洗1次，转至EP管中，加入等体积的10％琼脂糖混匀，离心弃上清，以5％戊二醛固定，环氧树脂包埋，60-nm超薄切片(Sorvall MTB2 ultramicrotome)，切片以醋酸铀柠檬酸铅双染，75KV透射电镜下观察超微结构(Nihon Denshi)。

免疫组化

MSCs达到80％融合时弃培养基，检测以下抗体：CD34(1∶50，Santa Cruz)，CD 45(1∶50，Santa Cruz)，CD 90(1∶50，Santa Cruz)，SH2(1∶50，Santa Cruz)，α-sarcomeric actin(α-横纹肌肌动蛋白，1∶100，DAKO)，α-MHC(α-肌球蛋白重链，1∶100，DAKO)，cardiac troponin T(心肌肌钙蛋白T，cTn-T，1∶50，Sigma)，connexin 43(连接蛋白43，Cx43，1∶50，Sigma)。为确定成心肌细胞分化比率，以cTn-T阳性作为成心肌分化细胞，每份样品取2张玻片，每张玻片随机取5个视野(400×)，计数细胞总数和cTn-T阳性细胞数。

统计分析

连续变量以means±SD表示，各组样品分化比率差别以X²检验进行统计分析，以P＜0.05作为统计学差异显著性标志。

结果

1.猪骨髓来源的MSCs体外培养的特性

形态学观察

猪骨髓单个核细胞接种后3天开始有部分细胞呈现成纤维细胞样贴壁、变长，逐渐形成小克隆，7-10天后，贴壁细胞达到80％融合时呈现为相对均一的成纤维细胞样形态，免疫组化表型鉴定可见＞95％贴壁细胞为CD90、SH2阳性，而CD34、CD45阴性。

MSCs增殖模式

原代培养后3-7天，大多贴壁细胞形成克隆，开始进入对数生长期直至平台期。P1、P4和P8代MSCs增殖速率相似，15天观察期内未见显著性差异(P＝0.908)，倍增时间(PD)约为48h。自接种后第3天起，P10代MSCs增殖速率则相对变慢(P＜0.05)，PD约为72h，P10以上代数的MSCs增殖速率和P10相似。

2.不同代数MSCs在正常生长和诱导条件下成心肌分化潜能

形态学和增殖能力变化

在正常培养状态下，P1、P4和P8代MSCs形态相似，但是自P10 代开始有部分细胞出现形态学变化，表现为多核、胞浆延长、和邻近细胞形成连接，转变为克隆样、球样或者肌管样形态。5-氮胞苷诱导后1周，P1、P4和P8代MSCs均表现为较长的胞浆形态和多核化，4周后更多细胞相互连接形成不规则的管样结构，而P10代MSCs则形成相对规则的肌管样结构。

RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR

RT-PCR结果表明P1、P4和P8代MSCs在正常培养状态下没有心肌特异性转录因子和功能基因的表达，而P10代MSCs则有心肌特异性转录因子GATA4和功能基因connexin 43、desmin、phospholabman、α-MHC和MLC的表达，未观察到骨骼肌actin基因的表达。5-氮胞苷诱导后4周，所有代数的MSCs均有上述基因的表达。实时定量PCR结果表明，GATA4和MLC在P10代诱导MSCs的表达丰度显著高于P4代诱导细胞(P＝0.018，P＜0.0001，n＝3)，骨骼肌actin基因在所有检测样品中均未见表达。

免疫组化分析

在正常培养状态下，P1、P4和P8代MSCs未检测到心肌特异性结构蛋白的表达，而在P10代MSCs则有10.3±1.8％的细胞表达以下心肌特异蛋白：α-sarcomeric actin、α-cardiac MHC、cardiac troponin T和connexin 43。

5-氮胞苷诱导后4周，P1、P4、P8和P10代MSCs均表达上述心肌特异性结构蛋白，P1、P4和P8代MSCs分化比率相似(18.31±8.2％ vs17.62±11.9％ vs 16.52±5.0％，respectively，P＞0.05)，但均显著低于P10代MSCs分化比率(44.52±4.2％，P＝0.0001)。

透射电镜超微结构观察

电镜显示在正常生长状态下，P1、P4和P8代MSCs未见任何肌细胞样结构，而P10代MSCs有部分细胞出现不规则肌丝，但是未见心肌特异性的横纹、肌节和闰盘等结构。5-氮胞苷诱导后4周P1、P4和P8代MSCs显示有较多不规则肌丝、散乱肌节和横纹，而P10代MSCs则见丰富的肌丝、规则的肌节和横纹，并可见闰盘样结构。

结论

本研究结果表明特定浓度的5-氮胞苷可以诱导P10代MSCs成心肌分化，且分化的心肌细胞结构成熟，形态更典型，分化效率更高。

在光镜下观察，MSCs似乎是相当均一的成纤维样细胞，然而我们发现MSCs在P10代时有一小部分开始呈现特化的细胞形态，不再表现为成纤维样细胞的形态，提示MSCs培养状态下增殖潜能的不均一性。我们结果也显示MSCs体外培养时具有不同层级的增殖潜能。

我们首次发现猪骨髓来源的MSCs(10.3±1.8％)在P10代时能自发分化为心肌样细胞，即使在传代到30代时仍保持这种自发分化能力。免疫组化、电镜和RT-PCR均表明分化而成的是心肌样细胞，而非骨骼肌细胞。这些自发分化的MSCs可能就是MSCs培养过程中的定型的亚群。我们发现猪骨髓MSCs在P1，P4和P8代时增殖较快，从P10代开始减缓，并出现自发分化现象，也支持上述观点。

我们研究发现5-氮胞苷(10μM)能够诱导P1，P4，P8和P10代MSCs成心肌分化，重要的是电镜发现P10代分化细胞有相对比较成熟的心肌样结构，如排列整齐的肌丝、肌节、横纹和闰盘，而在其他早期代数的分化细胞中只发现一些肌丝。这些超微结构上的差异可能是由于P10代MSCs包含有定型的细胞前体，这些定型前体已经开始表达心肌表型，这样在为期4周的诱导观察期内更加成熟，而早期代数的MSCs大多处于未定型的“干细胞”阶段，5-氮胞苷只是启动了这些细胞的分化方向，因此在相同的观察期内并未达到相对成熟的阶段。这些在超微结构上的差异也被定量RT-PCR结果所证实。

综上所述，本研究首次发现猪骨髓来源的MSCs在体外培养状态下增殖到P10代时有部分组分出现增速减缓、形态改变、自发成心肌分化现象；并且在5-氮胞苷诱导下P10代MSCs分化比率显著高于早期各代细胞，超微结构更趋成熟。

Claims

1.猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述细胞类型为骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于所述种属为猪。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分化方向为心肌细胞。