TW202207954A - 可促進骨質新生之瓦頓氏凝膠製品 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種臍帶瓦頓氏凝膠製品，具有促進骨質新生的功效。其中該製品係由以下兩種方法製得：(1) 取臍帶之瓦頓氏凝膠，以抗凍劑處理後冷凍保存，使用前解凍；或(2)取臍帶之瓦頓氏凝膠，直接冷凍乾燥，使用前，可保存於常溫、乾燥條件中。

Description

可促進骨質新生之瓦頓氏凝膠製品

本發明涉及臍帶瓦頓氏凝膠製品，其具有促進骨質新生的功效。

骨骼因外傷、骨折、感染、與腫瘤轉移等因素，導致大量的骨骼被破壞、或移除。當缺損範圍超過長骨骨幹直徑的2倍以上，儘管採用植骨等修復骨質的方法，缺損處仍不會自然癒合時，此現象即稱為臨界骨缺損（critical-sized bone defect），骨折部位過大，導致後續骨折的風險也會大增。並且，緻密骨骨缺損的再生難度相對高。因此，如何修復緻密骨的骨缺損是現今臨床骨科相當棘手的難題與困境。

目前臨床常見醫材治療的方向分為三種，第一種是自體骨質，自體骨質，需手術取出身體其他部位的骨組織去補缺損處之骨質。缺點是，再次手術的恢復期長、無法取出面積相符的骨組織等缺點。第二種則是異體骨質，即是使用他人因手術取下多餘骨組織，經後加工處理之異體骨移植。異體骨移植除了有免疫感染風險外，也存有道德爭議。因此，本領域之研究人員們希望研發合適的醫材，試圖克服臨床治療的困境。

本發明提供一種可用於促進骨質新生之臍帶瓦頓氏凝膠製品。

因此，本發明提供了一種臍帶瓦頓氏凝膠製品，具有促進骨質新生的功效，其中該製品係由以下兩種方法製得：(1)取臍帶之瓦頓氏凝膠，以抗凍劑處理後冷凍保存，使用前解凍；或(2)取臍帶之瓦頓氏凝膠，直接冷凍乾燥，可保存於常溫、乾燥條件中。

根據本發明，以第(1)種方法製得之瓦頓氏凝膠製品，經抗凍劑處理後冷凍保存，以WJF (Wharton’s Jelly Frozen)表示，仍然保有細胞體。

根據本發明實施例，其中抗凍劑為10%DMSO溶液。

根據本發明實施例，其中冷凍保存係於液態氮中保存。

在本發明之一具體實施例，該瓦頓氏凝膠製品是先以抗凍劑(例如，10%DMSO溶液)保護，再冷凍保存製成，使用前解凍。

根據本發明，以第(2)種方法製得之瓦頓氏凝膠製品，取臍帶之瓦頓氏凝膠直接冷凍乾燥製成，可保存於常溫、乾燥條件中。以WJD (Wharton’s Jelly Dried)表示，不含有細胞形體。

根據本發明實施例，其中冷凍保存係保存於-80°C下。

在本發明之另一具體實施例，該瓦頓氏凝膠製品是取下新鮮之瓦頓氏凝膠，直接於-80°C冷凍保存，再施以冷凍乾燥，抽乾組織間的水分製成。

根據本發明，該兩種瓦頓氏凝膠製品能使骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現增加、增加骨母細胞內骨分化基因的表現量、促進骨母細胞分化、加強鈣沉積的表現、有效提升骨質的產量、能使骨缺損處的骨質新生、提升骨缺損處骨母細胞的活性表現、或促使新生骨質的發育。

另一方面，本發明提供該兩種瓦頓氏凝膠製品用於製備促進骨質新生藥劑或醫材之用途。

在下面的描述中闡述了本發明的一個或多個實施例的細節。 從以下幾個實施例的詳細描述以及從所附的權利要求中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同的含義。

如本文所使用的，冠詞「一」和「一個」是指冠詞的一個或多於一個（即，至少一個）語法對象。 舉例來說，「一個元素」是指一個元素或多於一個元素。

術語「包括」或「包含」通常以包括/包括允許存在一個或多個特徵，成分或組分的意義來使用。 術語「包括」或「包含」涵蓋術語「由...組成」或「由......組成」。

在此使用的術語「個體」或「主體」包括人類和非人類哺乳動物，例如狗、貓、牛、羊、豬、馬、大鼠、小鼠、豚鼠等。

如本文所用之臍帶，是指哺乳動物（包括人類）的母體內，胎兒與懷孕的母親的胎盤的一種聯繫結構。本發明所使用之臍帶，可來自人類和非人類哺乳動物，例如狗、貓、牛、羊、豬、馬、大鼠、小鼠、豚鼠等。

如本文所用瓦頓氏凝膠(Wharton's jelly)一詞，是指哺乳動物臍帶中的瓦頓氏凝膠，其也被稱為層間凍(inter-laminar jelly)，即臍帶中發現的粘液結締組織物質，由大量的細胞外基質（extracellular matrix）構成三維架構的膠體，其中富含細胞外基質、膠原蛋白、醣蛋白、與玻尿酸等。在臍帶內含兩條臍動脈、與一條臍靜脈；而包裹血管之結締組織，即為瓦頓氏凝膠（Wharton’s jelly）。

適用於製備本發明的製品的來源，是來自臍帶之「瓦頓氏凝膠(Wharton's jelly) 」，可以例如通過解剖，切碎，洗滌，酶促消化，抗凍、冷凍、乾燥、烘烤、或其任何組合進行處理。

本文所用的術語「臨界骨缺損」是指骨骼因外傷、骨折、細菌感染、與腫瘤轉移侵蝕等因素，導致的骨骼被破壞、或移除。當缺損範圍超過長骨骨幹直徑的2倍以上，儘管採用植骨等修復骨質的方法，缺損處仍不會自然癒合時，此現象即稱為臨界骨缺損（critical-sized bone defect）。

通過以下實施例進一步說明本發明，這些實施例僅用於說明而不是限制。 根據本公開內容，本領域技術人員應該理解，可以在所公開的具體實施方式中做出許多改變，並且仍然獲得相似或相似的結果，而不偏離本發明的精神和範圍。

實施例

1. 材料與方法

1.1 瓦頓氏凝 膠製品之取得

本實驗採分娩後的臍帶，以無菌方式收集並保存於4°C之漢克平衡鹽溶液(Hanker’s balanced salt solution（簡稱HBSS，Gibco 14185-052）緩衝溶液中，24小時內取下瓦頓氏凝膠，實驗器械皆經由高溫高壓滅菌處理後，於實驗中以75%酒精消毒，並於使用前過火。於無菌操作台內將臍帶取出，以75%酒精浸泡消毒，置於HBSS緩衝溶液。接著，用已滅菌之器械將臍帶縱切開，挑離血管後，其乳白色間質組織即為瓦頓氏凝膠（Wharton’s Jelly）。

取下的瓦頓氏凝膠分成兩種處理方式； (1) 第一組為新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品，以WJF稱之。將新鮮的瓦頓氏凝膠，先以抗凍劑(10% DMSO)保護，再冷凍保存，解凍即可使用。 (2) 第二組為冷凍乾燥後的瓦頓氏凝膠製品，以WJD稱之。將新鮮的瓦頓氏凝膠，直接存放-80°C冰箱冷凍後，再使用冷凍乾燥機，以抽乾組織間水分，密封存放於乾燥箱，隨時可直接取用。

兩組的瓦頓氏凝膠製品，皆進行體外細胞實驗、與動物實驗。另外，將新鮮、或冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品進行石蠟包埋，以組織化學染色觀察瓦頓氏凝膠製品的組織型態。

1.2 組織纖維染色

將新鮮冷凍、或冷凍乾燥後的瓦頓氏凝膠製品進行石蠟包埋，組織切片脫蠟復水後，置於0.1% 天狼星紅染色（Sirius Red Stain）（Sigma 2610-10-8）染色，隨即，將組織片浸泡於二次水清洗。接著，將組織片浸泡至濃度遞增的酒精內進行脫水、再浸泡至二甲苯（xylene），最後封片，進行光學顯微鏡觀察、拍照。

1.3 組織醣蛋白染色

瓦頓氏凝膠組織片脫蠟復水後，以高碘酸-希夫染色套組（Periodic acid-Schiff Stain kit）（Sigma 395B-1KT）進行染色高碘酸-希夫染色（Periodic acid-Schiff Stain，簡稱PAS Stain）。組織片於高碘酸溶液(periodic acid solution)染5分鐘，以二次水清洗三次，每次兩分鐘。接著，將組織片於希夫試劑(Schiff’s regent)染15分鐘，以流動的水清洗5分鐘。完成染色後，組織間的醣蛋白呈現粉紫色。接著，將組織片浸泡至濃度遞增的酒精內進行脫水、再浸泡至二甲苯(xylene)，最後封片進行光學顯微鏡觀察、拍照。

1.4 大白鼠骨母細胞（ osteoblast ）之體外培養

本實驗採用出生一天大之出生大白鼠，以過量麻醉致死後，於無菌操作台內，使用滅菌之器械將大白鼠之顱骨取下，切成約1mm大小，並以無菌HBSS緩衝溶液清洗，除去紅血球。再與0.1% 胰蛋白酶(trypsin)、0.1% 膠原酶(collagenase)作用，於37°C烘箱搖晃反應2小時。之後，加入適量10% FBS DMEM以終止胰蛋白酶(trypsin)的效用，再以1500 rpm轉速，離心5分鐘。取下層細胞，加入10% FBS DMEM打散細胞，種在10 cm培養皿中，每四天更換一次培養液，約10-14天即可長滿，接著，進行細胞繼代培養。本實驗係以使用第2代的骨母細胞進行實驗。

1.5 體外培養骨母細胞的分組

體外培養中的骨母細胞(osteoblast)分成五組，第一組，osteoblast組，即2*10⁴ 骨母細胞單獨培養在24 孔皿中。第二組，osteoblast/WJD組，即2*10⁴ 骨母細胞培養在24孔皿下層，冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品培養在上層的遷移皿孔(transwell)內。第三組，osteoblast+WJD組，即2*10⁴ 骨母細胞培養在24孔皿裡，同時置入冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品(WJD)共同培養。第四組，osteoblast/WJF組，即2*10⁴ 骨母細胞培養在24孔皿(24 well plate)下層，新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品(WJF)培養在上層的遷移皿孔內。第五組，Osteoblast+WJF組，即2*10⁴ 骨母細胞培養在24 孔皿裡，同時置入新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品(WJF)共同培養。每三天更換含10% FBS之 DMEM培養液，培養14天後，進行鹼性磷酸酶細胞染色實驗。

1.6 轉錄 - 聚合酶連鎖反應（ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，簡稱 RT-PCR ）

經0.05% 胰蛋白酶(Trypsin)處理後取得的細胞，與新鮮的顱骨組織，以苯酚 (Trizol)（Sigma T9424）反應萃取總RNA，於4°C下離心12000g 15分鐘。取上清液與異丙醇等體積混和後，於4°C下離心12000g 10分鐘。再以酒精清洗RNA後，以55°C DEPC水回溶。使用前測量RNA濃度。純化後RNA，經進行逆轉錄反應轉錄合成互補核糖核酸（complementary DNA，簡稱cDNA）。將cDNA，與Primer、Master Mix進行聚合酶連鎖反應。使用下述引子： Rat-RUNX2                                                                               212 bp Forward：5’-GCTTCTCCAACCCACGAATG -3’， Reverse：5’-GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’。 Rat-GAPDH                                                                               160 bp Forward：5’- CTCTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’， Reverse：5’- GGTGAAGACGCCAGTAGACTCCA -3’。

完成後PCR產物，以2% 瓊脂糖凝膠(Agarose gel)進行DNA電泳( Electrophoresis)，完成後放到UV燈顯像與照相。

1.7 鹼性磷酸酶細胞染色實驗

以生理實驗水清洗細胞，用2.5% 戊二醛(glutardialdehyde)固定細胞15分鐘；再以5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑氮藍(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium，簡稱BCIP/NBT，Sigma B5655)錠劑溶解在10 mL的二次水中，加入24 孔皿。在37°C烘箱，避光反應1小時；接著加入10% SDS於鹽酸(HCl)中 (Ocarino et al., 2008)，在37°C烘箱，避光反應12小時。以吸光值595nm測量數值，定量每組鹼性磷酸酶的表現量。鹼性磷酸酶的表現越高，代表分化為骨母細胞的數量越多。

1.8 茜 素紅Ｓ（ alizarin red S ）染色

將osteoblast組、osteoblast/WJD組、與osteoblast/WJF組以骨分化培養液（osteogenic medium，R&D CCM007），培養21天後，每三天更換一次培養液，最後進行茜素紅S（alizarin red S）染色實驗。以生理實驗水清洗細胞，用2.5% 戊二醛(glutardialdehyde)固定細胞15分鐘；再以2% 茜素紅S（alizarin red S，簡稱ARS，Sigma A5533 )，加入6 孔皿。在37°C烘箱，避光反應1小時；接著加入10% 西吡氯銨（cetylpyridinium chloride，簡稱CPC，Sigma C-0732）(Qiao et al., 2016)，在37°C烘箱，避光反應1小時。以吸光值540nm測量數值，定量每組紅色面積，即代表鈣的表現量。

1.9 實驗動物

本實驗所使用的實驗動物來源是陽明大學實驗動物中心提供八周齡大的雄性 Sprague Dawley （S.D.）品系大白鼠，體重約為250~280g。飼養方式為45x24x20cm的透明PC籠子飼養，每日照光12小時（上午七點半至下午七點半），環境溫度恆溫空調（22±2°C）並且充分供應飼料（Laboratory Animal Diets MF18）與飲用水，每星期更換墊料一次。

1.10 臨界顱骨缺損（ critical-sized cranial bone defect ）之大白鼠模式建立

將大白鼠以舒泰50 (Zoletil 50)、及鹽酸甲苯噻嗪(xylazine hydrochloride, Sigma 23076359)腹腔注射麻醉後，以立體定位儀固定頭部。使用剃毛刀將毛剃除乾淨，並以棉花沾取碘酒溶液消毒大白鼠皮膚後，以手術刀將皮膚劃開，再以手術剪撐開皮下組織，且分離外骨膜。接著，使用直徑8mm的環型鑽，在大白鼠頂骨上鑽孔，將顱骨與下層腦膜剝離，作為臨界骨缺損(critical-sized bone defect)的動物模式。最後縫合皮下組織與皮膚。

1.11 動物實驗分組

大白鼠共分成三組： 第一組為Injury+Saline組，即顱骨缺損後，不給予任何治療，僅給予生理食鹽水(Saline)。 第二組為Injury+WJD組，即顱骨缺損後，立即在缺損處給予冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品(WJD)的治療組。 第三組為Injury+WJF組，即顱骨缺損後，立即在缺損處給予新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品(WJF)的治療組。

1.12 微電腦斷層掃描（ micro-Computerized Tomography Scan ，簡稱 micro-CT ）

電腦斷層掃描影像，經由Amide軟體（SOURCEFORGE）利用數位幾何處理後，重建三維放射線醫學影像。本實驗使用小動物光學暨電腦斷層儀（U-CT^UHR ，MILabs），進行活體顱骨掃描，於術後第一天，之後的第一、二、三、四、第五個月，每個月一次，追蹤缺損顱骨的癒合程度。

1.13 實驗動物犧牲、灌流固定、脫鈣與石蠟切片

大白鼠以腹腔注射舒泰50 (Zoletil 50)、及鹽酸甲苯噻嗪(xylazine hydrochloride)麻醉大白鼠，再以4% 多聚甲醛(paraformaldehyde)、7.5% 苦味酸( picric acid ) 於 0.01M PB灌流固定。將顱骨取出放入固定液24小時候，換入20% EDTA進行脫鈣；20% EDTA in 9% NaOH水溶液，脫鈣時間的9天內，共更換兩次脫鈣液。脫鈣完成的組織，以流動的水沖洗8小時。接著，以濃度遞增的酒精溶液脫水，再以二甲苯(xylene)和純石蠟(pure paraffin)進行石蠟包埋，使用石蠟切片機進行切片，將顱骨以水平切面切成7 μm的組織片。

1.14 蘇木紫 - 伊紅染色 （ Hematoxylin & Eosin Stain ，簡稱 H&E Stain ）

將組織片脫蠟復水後，置於蘇木紫(hematoxylin)（武藤化學 No.3008-1）中染5分鐘，以流動的水清洗30分鐘。接著，置入70% 酒精3分鐘後，於通風環境等待殘留酒精揮發。將組織片浸泡伊紅(eosin)（武藤化學 No.3200-2）1分鐘，以流動的水清洗15分鐘後，組織片浸泡至濃度遞增的酒精內進行脫水、再浸泡至二甲苯(xylene)兩次。最後以封片膠封片，進行光學顯微鏡觀察、拍照。取完整且最大面之顱骨切片，以原生骨與新生骨之間的交界，作為顱骨缺損的邊界，標定出顱骨缺損面積。接著，定量缺損面積內新生骨質的百分比。

1.15 鹼性磷酸酶染色 (Alkaline Phosphatase Stain ，簡稱 ALP Stain)

將組織片脫蠟復水後，將組織片以鹼性磷酸酶套組 ( Alkaline Phosphatase kit)（Sigma 85L2-1KT）於37°C烘箱反應1小時，接著，浸泡ddH₂ O 2分鐘。最後以封片膠封片，進行光學顯微鏡觀察、拍照並定量。染色完成的切片可以觀察到染上藍紫色為含有鹼性磷酸酶之細胞，即代表成熟骨母細胞。取完整且最大面之顱骨切片，以原生骨與新生骨之間的交界，作為顱骨缺損的邊界，標定出顱骨缺損面積。接著，定量缺損面積內的藍紫色面積百分比，作為存在的骨母細胞之區域面積比例。

1.16 抗骨鈣 素抗體 （anti-osteocalcin antibody ）組織免疫染色

將組織片脫蠟後，加入初級抗體-小鼠抗骨鈣素抗體（mouse anti-osteocalcin antibody）（Abcam ab13740；1:200），於4°C下反應16～18小時。接著，與次級抗體-山羊抗小鼠IgG-共軛生物素 （goat anti-mouse-IgG-conjugated biotin）（Millipore AP124B，1:250），於室溫下反應1小時。再以 VECTASTAIN® ABC-conjugated HRP Kit （Vector Laboratoris PK-4000），於室溫下反應1小時。以0.01M PBS清洗5分鐘，共三次；最後以DAB（5mg DAB，35% H₂ O₂ 3.5 μL in 10mL Tris-HCl，pH 7.4）進行呈色。染色完成後，將組織片於室溫風乾，並進行脫水。將組織片浸泡至濃度遞增的酒精內進行脫水、再浸泡至二甲苯(xylene)。最後以封片膠封片，進行光學顯微鏡觀察、拍照。 取所有顱骨切片，定量缺損面積內以深褐色標識之骨鈣蛋白（Osteocalcin）的百分比，標識骨化作用的活性表現。

1.17 統計分析

所有實驗數據以平均SEM（Standard error of the mean）表示。各平均值間的比較以單因子變異係數分析（One-Way ANOVA）、或雙因子變異係數分析（Two-Way ANOVA），再以費雪最小顯著差異性測驗(Fisher’s Least Significant Difference（LSD）test)進行多重比較。實驗數據皆以p＜0.05作為具有顯著差異的最低起始標準。

2. 結果

2.1 新鮮與冷凍乾燥之瓦頓氏凝膠製品的組織分析

將臍帶取下之新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品（圖1A），與經過冷凍乾燥處理後的瓦頓氏凝膠製品（圖1B）石蠟包埋進行組織連續切片。經H&E染色，觀察瓦頓氏凝膠製品的細胞與組織結構。結果顯示，新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品內存在大量的細胞核，結構也呈現緻密且排列整齊（圖1A1）。經過冷凍乾燥處理後的瓦頓氏凝膠製品，已經觀察不到任何細胞核的存在，結構從緻密轉變成疏鬆、並且出現大大小小的孔洞（圖1B1）。瓦頓氏凝膠製品主要成分是膠原蛋白與醣蛋白構成。分別以天狼星紅(Sirius red)與PAS染色，觀察膠原蛋白與醣蛋白的分布情形。結果顯示，存在於瓦頓氏凝膠的膠原蛋白與醣蛋白，不會因冷凍乾燥而被破壞，仍作為支撐瓦頓氏凝膠的結構骨架（圖1A2~A3，B2~B3）。將冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品以掃描式電子顯微鏡觀察型態（圖1C）。掃描影像顯示冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品剖面呈現高密度的孔洞（圖1D）。隨機取多處視野，框選孔洞進行大小定量，計算出孔洞平均直徑的分布。分析顯示，冷凍乾燥處理的瓦頓氏凝膠，不論是經石蠟包埋切片，再以HE染色定量、或經掃描式電子顯微鏡影像分析，均呈現大小不一的多孔洞結構；而且，孔洞直徑分布大多落在10~ 70微米範圍內（圖1E）。

2.2 與瓦頓氏凝膠製品進行共同培養之骨母細胞，增加細胞內骨分化基因的表現量上升

體外單獨培養的大白鼠骨母細胞、或與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品、新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品進行共同培養14天後，經trypsin處理後，取下層細胞，進行RNA的萃取。利用大白鼠Runt相關轉譯因子2（Runt -related transcription factor 2, 簡稱RUNX2），進行RT-PCR，探討大白鼠骨母細胞骨分化的情形。結果顯示，ROB組、ROB/WJD組、或ROB /WJF組有偵測到大白鼠GAPDH的表現；並且，也都有大白鼠RUNX2表現（圖2A）。進一步，利用即時定量聚合酶連鎖反應儀分析各組別之間基因表現量的差異。定量結果顯示， ROB/WJD組、或ROB/WJF組內的骨母細胞表現rat RUNX2的含量與ROB組相比，都有顯著的增加（圖2B）。

2.3 與瓦頓氏凝膠製品進行共同培養之大白鼠骨母細胞，其鹼性磷酸酶的表現增加

大白鼠骨母細胞進行單獨體外培養、或分別與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品、新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品進行非直接、或直接的體外共同培養，以10% FBS之 DMEM培養液，處理14天，再以BICP/NBT進行細胞染色，以OD595測量吸光值，觀察大白鼠骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現量（圖3A、圖3B）。結果顯示，大白鼠骨母細胞與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品、或新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品進行非直接、或直接的共同培養下，其細胞內鹼性磷酸酶的表現量均較單獨培養之骨母細胞，有顯著增加的情形（p＜0.05，圖3C）。

2.4 與瓦頓氏凝膠製品進行共同培養之大白鼠骨母細胞，其鈣沉積提高

大白鼠骨母細胞進行單獨體外培養、或與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品、新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品進行非直接的體外共同培養，以骨分化培養液，處理21天，再以茜素紅S(alizarin red S)進行染色，以深紅色標識大白鼠骨母細胞鈣沉積的表現。從低倍影像逐漸放大顯示，ROB組有群聚的骨母細胞較為疏散，並且視野下僅有極少量的鈣沉積現象。ROB/WJD組除了有群聚的骨母細胞外，亦能發現正以同心圓方式生長的骨母細胞，同時，周邊也有大量鈣沉積表現。ROB/WJF組則可以發現成熟、具有小管的骨細胞，並且，群聚的骨母細胞圍繞在旁。視野下也有大量鈣結晶的分布（圖4A）。接著，回溶深紅色標識的鈣結晶，以OD 540測量吸光值，分析鈣離子的濃度。結果顯示，ROB/WJD組、或ROB /WJF組內鈣離子的濃度相較於ROB組，有顯著的升高（p＜0.05，圖4B）。由茜素紅S (alizarin red S)染色結果推測，與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品、或新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品非直接的共同培養下，能夠促進骨母細胞的分化，加強鈣沉積的表現。

2.5 以微電腦斷層掃描定量顱骨缺損處新生骨質，顯示給予瓦頓氏凝膠製品，有效提升骨質的產量

使用微電腦斷層掃描（micro-CT）觀察大白鼠經顱骨缺損手術後的第一、二、三、四、五個月，觀察顱骨癒合情形。Injury+Saline組的新生骨質僅沿著骨缺損周邊小幅度的向內生長。Injury+WJD組、或Injury+WJF治療組，除了有向內生長的新生骨外，也可以在缺損範圍中發現有零星新生骨組織(圖5A)。定量骨缺損範圍內新生骨質的面積百分比。結果顯示，Injury +Saline組在術後第一個月就有12.5±3.4 %的骨質新生，隨著術後時間增長，顱骨癒合攀升極為緩慢，於術後第五個月僅有18.4±1.4 %的顱骨回復情形。而Injury+WJD、與Injury +WJF治療組，於術後第一個月，新生骨質百分比分別為21.2±3.9 %、和23.0±4.1 %，相較於Injury+ Saline組，有顯著增加（p＜0.05），此顯著增加的現象，一直維持到第五個月，骨缺損範圍內的新生骨質百分比分別達到30.6±3.6 %、和 35.6±3.7 %（p＜0.05，圖5B）。由微電腦斷層掃描巨觀觀察，發現大白鼠經顱骨缺損手術，不給予任何治療，五個月時間，顱骨癒合能力僅能維持在12%～18%範圍內。給予冷凍乾燥、或新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品能促進顱骨缺損大白鼠的新骨生成。

2.6 以 H&E 染色顯示，給予瓦頓氏凝膠製品，促進大白鼠顱骨缺損處的骨質新生

以H&E染色結果之低倍全景圖（圖6A），從低倍逐漸放大骨缺損處周邊（圖6B）、與骨缺損範圍內（圖6C）的骨質表現。結果顯示，Injury+Saline組缺損周邊有少量新生骨質、與緻密的結締組織；骨缺損範圍內僅有結締組織呈現。Injury+WJD、與Injury+WJF治療組除了在骨缺損邊緣處有骨質增加的趨勢，骨缺損範圍內還能觀察到游離且趨於成熟之新生骨質。以H&E染色結果定量手術後第五個月，骨缺損範圍內新生骨質的面積百分比。Injury+Saline組缺損範圍內新生骨質含量僅含有18.8±1.9 %。而Injury+WJD、與Injury+WJF治療組，骨缺損範圍內新生骨質含量分別達到27.1±4.0 %、和32.7±5.0 %，與Injury+Saline組相比，有顯著增加（p＜0.05，圖6D）。由H&E染色微觀觀察，給予冷凍乾燥、或新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品能促進顱骨缺損大白鼠的骨質新生。

2.7 以 alkaline phasphatase 染色標識骨母細胞 (osteoblast) ，顯示給予瓦頓氏凝膠製品，提升大白鼠顱骨缺損處骨母細胞的活性表現

以ALP染色結果之低倍全景圖（圖7A），從低倍逐漸放大骨缺損周邊（圖7B）、與骨缺損範圍內（圖7C）的成熟骨母細胞表現區域。結果顯示，Injury+Saline組骨缺損周邊與範圍內，有少量成熟骨母細胞表現ALP。Injury+WJD、與Injury +WJF治療組皆有成熟骨母細胞貼附骨缺損周邊向內生長之新生骨質，同時，也能在骨缺損範圍內，觀察游離新生骨質皆被骨母細胞包圍著。以ALP染色結果定量缺損範圍內ALP⁺ 的面積百分比。Injury+ Saline組ALP⁺ 面積僅約為3.7±2.1 %。Injury+WJD、與Injury+WJF治療組，ALP⁺ 面積分別達到10.0±5.9 %、和8.8±2.3 %，與Injury+Saline組相比，有增加的趨勢（p＜0.05，圖7D）。以ALP染色微觀觀察，給予冷凍乾燥、或新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品能增加顱骨缺損大白鼠骨母細胞之活性。

2.8 以抗骨鈣蛋白 (anti-osteocalcin) 抗體免疫組織染色標識新生的骨質，顯示給予瓦頓氏凝膠製品，促進大白鼠顱骨缺損處骨質新生的表現

骨鈣蛋白（Osteocalcin）是在骨生成過程中，由骨母細胞分泌並釋放於骨組織中，形成未鈣化的骨質。以抗骨鈣蛋白(anti-osteocalcin)免疫組織染色結果之低倍全景圖（圖8A），從低倍逐漸放大骨缺損周邊（圖8B）、與骨缺損範圍內（圖8C）含有osteocalcin的未鈣化骨質區域的表現量。結果顯示，Injury +Saline組於骨缺損周邊沒有觀察到osteocalcin的表現；骨缺損範圍內，僅有少量osteocalcin被釋放到組織中。Injury+ WJD、與Injury+WJF單獨治療組不僅在骨缺損周邊、或骨缺損範圍內均有發現osteocalcin存在，也可以觀察到成群的骨母細胞，代表骨母細胞正進行骨生成反應。以OCN染色結果定量骨缺損範圍內OCN⁺ 的面積百分比。Injury+Saline組OCN⁺ 面積僅有2.4±1.6 %。而Injury+WJD、與Injury+WJF單獨治療組，OCN⁺ 面積百分比分別達到14.8±4.8 %、和15.5±1.5 %，與Injury+Saline組相比，有顯著增加（p＜0.05，圖8D）。以抗骨鈣蛋白(anti-osteocalcin)組織免疫染色微觀觀察，給予冷凍乾燥、新鮮冷凍的瓦頓氏凝膠製品治療組，進一步促進骨母細胞之表現osteocalcin，以促進硬骨的新生。

2.9 給予瓦頓氏凝膠製品，可明顯促進新生骨質的發育

分別以抗骨鈣蛋白(anti-osteocalcin)免疫組織染色標識未成熟(immature)骨母細胞、以ALP組織染色標識成熟(mature)骨母細胞、再以H&E染色標識成熟骨質。將三種染色的定量數據加總，評估顱骨缺損大白鼠之骨質發育。結果顯示，Injury+Saline組的骨質發育約25%。Injury +WJD、與Injury+WJF治療組的骨質發育分別約52%、與57%，具有較高的骨質發育（圖9）。

3. 結論

將瓦頓氏凝膠製品移植到顱骨缺損的大白鼠。結果發現，不論是新鮮冷凍的、或冷凍乾燥的瓦頓氏凝膠製品處理後，由微電腦斷層掃描觀察到骨質新生的情形，且經過切片染色也證明影像呈現的訊號為成熟的骨質，也促進宿主骨質的發育。根據以上實驗結果顯示，瓦頓氏凝膠製品可做為臨床醫學上促進骨質新生的天然醫材，讓仍為骨缺損受苦之患者，提供新型的治療方法。

無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解前面的概述以及以下對本發明的詳細描述。 為了說明本發明，在附圖中示出了目前較佳的實施例。 然而，應該理解的是，本發明不限於所示的精確佈置和手段。

在附圖中：

圖1顯示本發明新鮮冷凍、或冷凍乾燥之瓦頓氏凝膠製品的組織型態分析。其中：（A）為自臍帶取下之新鮮冷凍瓦頓氏凝膠製品(WJF)、與（B）經過冷凍乾燥處理後的瓦頓氏凝膠製品(WJD)，進行石蠟包埋、切片。（A1、B1）為以H&E染色顯示，新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠製品呈現緻密結構，組織內富含間質幹細胞的細胞體；冷凍乾燥之瓦頓氏凝膠製品呈現疏散多孔洞結構。（A2、B2）為以天狼星紅（Sirius Red）染色顯示，新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠之膠原蛋白成束而緻密地排列，冷凍乾燥的瓦頓氏凝膠之膠原蛋白則圍繞在空隙外圍。（A3、B3）為以PAS染色顯示，多醣體充滿在瓦頓氏凝膠的組織中。（C、D）為將冷凍乾燥處理的瓦頓氏凝膠製品(WJD)經掃描式電子顯微鏡下觀察組織型態，呈現大小不一的多孔洞結構。（E）冷凍乾燥處理的瓦頓氏凝膠，不論是經石蠟包埋切片，再以HE染色定量、或經掃描式電子顯微鏡影像分析，均呈現大小不一的多孔洞結構；而且，孔洞直徑分布大多落在10~ 70微米範圍內。

圖2顯示大白鼠骨母細胞與兩種瓦頓氏凝膠製品共同培養，能提升骨母細胞內骨分化基因的表現量。其中：（A）單獨體外培養大白鼠骨母細胞、與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠製品(WJD)、或新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠製品(WJF) 非直接共同培養14天後，進行大白鼠RUNX2的RT-PCR檢測，結果顯示，各組均有大白鼠RUNX2的表現。（B）以及時(real time) RT-PCR定量大白鼠骨母細胞內大白鼠RUNX2的表現量。結果顯示， ROB/WJD組、與ROB/WJF組的骨母細胞內大白鼠RUNX2的表現量相較於ROB組，有顯著增加（p＜0.05）。*：與ROB組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖3顯示以鹼性磷酸酶定量顯示，與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠細胞製品(WJD)、或新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠製品(WJF)共同培養下，均會提升大白鼠骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現量。其中：（A）為大白鼠骨母細胞，與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠細胞製品(WJD)、或新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠細胞製品(WJF)非直接、或直接的共同培養模式圖。（B）為培養14天後，進行鹼性磷酸酶的細胞染色。（C）為定量細胞內鹼性磷酸酶的濃度，以OD 595吸光值顯示，ROB/WJD組、ROB+WJD組、ROB/WJF組、或ROB+WJF組大白鼠骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現量相較於單獨ROB組，有顯著增加（p＜0.05）。*：與ROB組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖4顯示大白鼠骨母細胞與兩種瓦頓氏凝膠製品共同培養，能促進骨母細胞鈣沉積的表現。其中：（A）為單獨體外培養大白鼠骨母細胞、與冷凍乾燥瓦頓氏凝膠細胞製品(WJD)或新鮮冷凍之瓦頓氏凝膠細胞製品(WJF)非直接的共同培養21天，以茜素紅S（alizarin red S）染色，逐漸放大影像顯示，各組骨母細胞於骨分化培養液處理後，均有鈣沉積的表現。（B）為定量各組鈣離子的濃度，以OD 540吸光值顯示， ROB/WJD組、與ROB/WJF組的鈣沉積含量都較於ROB組、與ROB+BMP2組為高（p＜0.05）。*：與ROB組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖5顯示由微電腦斷層掃描觀察，分別植入兩種瓦頓氏凝膠製品治療組，有效促進大白鼠顱骨缺損的骨質新生。顱骨缺損大白鼠於術後第一、二、三、四、五個月，均以micro-CT追蹤骨癒合情形。其中：(A) Injury+Saline組僅有少量骨質沿缺損處周邊生長， Injury+WJD、或Injury+WJF組，除了缺損處周邊，缺損範圍內亦有游離新生骨質。(B) 以紅色虛線標示出缺損範圍，定量缺損範圍內新生骨質的面積百分比。結果顯示，Injury+WJD、或Injury+WJF單獨治療組新生骨百分比相較於Injury+Saline組，有顯著增加（p＜0.05）。*：與同一個月齡的Injury+Saline組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖6顯示由H&E染色觀察，分別植入兩種瓦頓氏凝膠製品治療組，有效增加顱骨缺損大白鼠新生骨質之面積百分比。其中：（A）各組顱骨水平面組織切片，以H&E染色之低倍全景圖，以白色虛線標示出骨缺損範圍。再分別由低倍逐漸放大骨缺損的邊界區域（B）、或骨缺損的內部區域（C，scale bar分別是1mm與200 μm）。（D）由H&E染色來定量新生骨質的面積百分比，結果顯示， Injury+WJD組、與Injury+WJF組，新生骨質面積百分比，較Injury+ Saline組，有顯著增加（p＜0.05，n=5）。*：與Injury+Saline組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖7顯示由ALP染色觀察，分別植入兩種瓦頓氏凝膠製品，有效提升顱骨缺損大白鼠成熟成骨細胞（mature osteoblast）的分布情形。其中：（A）為各組顱骨水平面組織切片，以ALP染色之低倍全景圖，再分別由低倍逐漸放大骨缺損的邊界區域（B）、或骨缺損的內部區域（C）。（D）為由ALP染色來定量成熟成骨細胞（mature osteoblast）的面積百分比，結果顯示， Injury+WJD組、Injury+WJF組，成熟成骨細胞（mature osteoblast）分布面積百分比，較Injury+Saline組，有顯著增加（p＜0.05，n=5）。*：與Injury+Saline組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖8顯示由抗骨鈣素（anti-osteocalcin）免疫組織染色觀察，分別植入兩種瓦頓氏凝膠製品，有效促進顱骨缺損大白鼠未成熟成骨細胞（immature osteoblast）的分布情形。（A）為各組顱骨水平面組織切片，以抗骨鈣素（anti-osteocalcin）染色之低倍全景圖，再分別由低倍逐漸放大骨缺損的邊界區域（B）、或骨缺損的內部區域（C）。（D）為由抗骨鈣素（anti-osteocalcin）染色來定量未成熟成骨細胞（immature osteoblast）的面積百分比，結果顯示， Injury+WJD組、Injury+WJF組，未成熟成骨細胞（immature osteoblast）分布面積百分比，較Injury+Saline組，有顯著增加（p＜0.05，n=5）。*：與Injury+Saline組相比，有顯著差異，p＜0.05。

圖9顯示新生顱骨骨質發展之趨勢圖。分別以抗骨鈣素（anti-osteocalcin）免疫組織染色用以標識出未成熟骨母細胞、以ALP組織染色標識成熟骨母細胞、以H&E染色標識成熟骨質，將三種染色的定量數據加總，可以代表不同階段的骨質發育，綜合評估大白鼠顱骨缺損之骨質新生的趨勢。結果顯示，不論是植入新鮮冷凍、或冷凍乾燥之瓦頓氏凝膠製品於新生骨質的發展都明顯較高。

Claims (10)

1. 一種臍帶瓦頓氏凝膠製品，具有促進骨質新生的功效，其中該製品係由以下兩種方法製得：(1)取臍帶之瓦頓氏凝膠，以抗凍劑處理後冷凍保存，使用前解凍；或(2)取臍帶之瓦頓氏凝膠，直接冷凍乾燥，使用前保存於乾燥條件中。
2. 如請求項1之製品，其中該臍帶來自人類或非人類哺乳動物。
3. 如請求項1之製品，其中抗凍劑為10%DMSO溶液。
4. 如請求項1之製品，其中冷凍保存係於液態氮中保存。
5. 2、3或4之製品，其中該冷凍保存之瓦頓氏凝膠含有細胞體。
6. 如請求項1之製品，其中冷凍乾燥步驟包括取下小塊狀之新鮮瓦頓氏凝膠，直接存放-80°C下冷凍保存，再使用冷凍乾燥機，抽乾組織間的水分。
7. 如請求項6之製品，其中該瓦頓氏凝膠不含有細胞體。
8. 如請求項1之製品，其能使骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現增加、增加骨母細胞內骨分化基因的表現量、促進骨母細胞分化、加強鈣沉積的表現，能有效提升骨質的產量、能使骨缺損處的骨質新生、提升骨缺損處骨母細胞的活性表現、或促使新生骨質的發育。
9. 一種如請求項1之製品用於製備促進骨質新生藥劑或醫材之用途。
10. 如請求項9之用途，其中該製品能使骨母細胞內鹼性磷酸酶的表現增加、增加骨母細胞內骨分化基因的表現量、促進骨母細胞分化、加強鈣沉積的表現，能有效提升骨質的產量、能使骨缺損處的骨質新生、提升骨缺損處骨母細胞的活性表現、或促使新生骨質的發育。

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