CN103784940B - 提高造血干细胞归巢及植入率的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高造血干细胞归巢及植入率的方法和试剂。所述方法包括下述步骤：含造血干细胞的供体细胞与阳离子肽衍生物共同孵育后，将细胞移植到受体体内，以达到增强造血干细胞归巢及植入，缩短受体造血重建时间，提高造血干细胞移植成功率的效果。本发明也提供了阳离子肽衍生物在制备治疗血液系统疾病药物中的应用。

Description

提高造血干细胞归巢及植入率的方法和试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体属于造血干细胞移植领域，更具体地涉及一种提高造血干细胞归巢及植入率的方法和试剂。

背景技术

自从上世纪五十年代，学者发现骨髓移植能够治疗致死剂量照射小鼠以来，造血干细胞的造血重建功能受到广泛关注。造血干细胞是一类能够自我复制并能够分化为成熟全血细胞的细胞。在成体内，造血干细胞存在于特定的微环境—龛位中。微环境通过可溶性及膜表面因子支持造血干细胞保持其正常的生物学功能，包括自我复制、分化、迁移等。成人体内，骨髓被认为是造血干细胞最主要的龛位。目前确定的龛位有两种类型，包括内皮型龛位，由内皮细胞、成骨细胞及破骨细胞组成；血管周围型龛位，由毛细血管内皮、间质细胞及网状细胞等组成。另外，龛位中的细胞外因子，包括Ca²⁺、CXCL12/SDF-1、干细胞因子等也具有保持造血细胞功能及定位的功能。人源干细胞的表面标记包括CXCR4,CD34,CD150及CD133等，在实验条件下，CD34⁺CD133⁺Lin^-细胞被定义为人体造血干细胞。

造血干细胞归巢和植入到骨髓是造血干细胞移植成功与否的关键。造血干细胞归巢及植入是一个复杂的过程，包括以下三个步骤1）造血干细胞在内皮细胞上的滚动及固定；2）与内皮细胞的粘附及跨膜运动；3）归巢及植入到龛位。在上述步骤中，造血干细胞表面表达的VLA-4,VLA-5,CD44及LFA-1等多种粘附分子与骨髓微环境中表达的VCAM-1,ICAM-1,纤维连接蛋白及纤维蛋白原等相互结合，是影响造血干细胞归巢及植入的关键因素。

SDF-1是一种干细胞趋化因子，参与包括迁移、激活及分化在内的多种干细胞生物学活动。造血干细胞表达两种SDF-1受体，CXCR4和CXCR7。SDF-1/CXCR4反应轴被证实在胚胎发育过程中及成体内对造血干细胞的迁移起到关键的作用。实验证明，在经过放射线或者化疗药物处理过的小鼠骨髓内的SDF-1水平的增高，对造血干细胞的归巢和植入以及造血重建具有重要作用。CXCR4在包括造血干细胞在内的多种血细胞中均有表达。SDF-1/CXCR4反应轴影响造血干细胞的多种生物学活动，包括趋化运动、粘附分子的表达、蛋白酶的释放等；这些生物学效应对造血干细胞的归巢及植入具有重要作用：例如：SDF-1与造血干细胞表面CXCR4受体结合后，1）可以增加其表面LFA-1、VLA-4、VLA-5等粘附分子的表达，促进其与骨髓微环境的粘附；2）增加造血干细胞MMP-2andMMP-9的释放，促进其跨膜运动；3）刺激肌动蛋白聚合，改变细胞骨架状态，使造血干细胞更易于迁移。因此，SDF-1/CXCR4轴对造血干细胞的归巢、植入及移植成功率具有重要作用。

造血干细胞存在于多种组织，包括胎儿肝脏、成体骨髓、动员后的成体外周血、脐带血及胎盘组织等。造血干细胞移植被认为是目前治疗多种血液肿瘤及遗传性疾病的有效手段。临床上，造血干细胞移植成功率取决于有效归巢及植入的造血干细胞数量。由于造血干细胞动员、脐带血、胎盘等来源的造血干细胞数量较少，而经过体外扩增后的造血干细胞归巢及植入效率大大降低，难以达到有效移植，所以提高有限数量的造血干细胞的归巢及植入效率的方法对造血干细胞移植成功率具有重要意义。

C3a被证明能够通过提高造血干细胞表面CXCR4受体对SDF-1的应答来增强造血干细胞的归巢和植入。C3a作为一种补体激肽，具有细胞激肽样作用，可以增加毛细血管的通透性，引起炎性渗出、水肿等多种急性炎性反应，而且该类炎性反应不为抗组胺药抑制。另外，C3a还是一种过敏毒素，能够直接引发多种细胞的脱颗粒反应，包括内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞等，从而引发局部的急性炎症反应，如果脱颗粒反应扩散，会引起过敏性休克。C3a还可以间接引起平滑肌收缩，导致支气管和消化系统痉挛等。另外，C3a还对其他免疫细胞具有趋化作用，引发更多炎性细胞的集中和过敏毒素的释放，从而加剧炎症反应。因此，静脉输注C3a对于经过放射或者化疗治疗的骨髓移植患者来说，安全性方面的障碍难以克服，亟待提供了一种更安全的并能够提高造血干细胞归巢和植入效率的预处理方法。

阳离子肽，又被称为抗菌肽，是一类携带正电荷的小分子肽，是一种在进化过程中非常保守的天然抑菌物，存在于多种动物的不同组织中。阳离子肽主要通过与细菌及病毒等外膜作用，影响膜结构，实现其抑菌功能。目前发现的阳离子肽已超过1500种。除了直接的抗菌作用外，阳离子肽还具有多种生物学功能，包括免疫调节、介导免疫细胞趋化运动、促进细胞因子和趋化因子的释放、促进组织修复和血管再生及免疫细胞间的转化等。hLF1–11是人源乳铁蛋白的衍生物，是一种具有其N端11个残基序列的合成肽，能够刺激人单核细胞释放细胞因子和趋化因子。作为一种新的抗菌素，该合成肽正处于临床试验阶段。OP-145是cathelicidin家族的体外合成衍生物，在结构和生物学效应上均与LL-37相似，该合成肽正处于临床试验阶段，作为一种新的治疗中耳炎的抗生素。hLF1–11和OP-145均已进入二期临床试验，其安全性已经得到验证，但尚未发现有人利用hLF1–11和OP-145体外预处理造血干细胞以提高其归巢和植入效率。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种提高造血干细胞归巢及植入率的方法和试剂。本发明方法通过体外预处理造血干细胞，以达到提高造血干细胞归巢及植入率和提高造血干细胞移植成功率的效果。

本发明采用的技术方案如下：

将含有造血干细胞的供体单核细胞，与至少一种阳离子肽衍生物进行混合孵育，将造血干细胞与阳离子肽衍生物混合物或者分离后的造血干细胞用于造血干细胞移植。

所述阳离子肽衍生物包括hLF1–11（GRRRRSVQWCA）和OP145（IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR）中一种或者两种。

孵育时，阳离子肽衍生物hLF1–11的浓度为1-100微克/毫升；阳离子肽衍生物OP145的浓度为1-20微克/毫升。

所述孵育为造血干细胞与阳离子肽衍生物于37℃，5%CO₂条件下共培养30分钟。

所述分离后造血干细胞为经过细胞缓冲液冲洗、离心分离后细胞，其中不含或仅含微量阳离子肽衍生物。

所述造血干细胞包括来源于供体骨髓、脐带血、胎盘及外周血造血干细胞动员所获得的含有造血干细胞的细胞样品。

本发明方法以阳离子肽衍生物为主要成分对造血干细胞预处理，提高了造血干细胞在体外对SDF-1的应答效应，增加造血干细胞在体内的归巢和植入效率，缩短造血系统重建所需的时间，提高造血干细胞移植成功率，弥补造血干细胞来源不足的现状。另外，阳离子肽作为一种天然存在的人体成分，静脉低剂量输注其衍生成分对人体安全性没有不良影响。由此可见，本发明实际上也提供了阳离子肽衍生物在制备治疗血液系统疾病药物中的应用。所述的阳离子肽衍生物为hLF1–11（GRRRRSVQWCA）和OP145（IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR）中一种或者两种。

附图说明

1.阳离子肽衍生物不影响脐带血来源的人体造血干细胞的分化功能：阳离子肽衍生物预处理后的脐带血来源的人体造血干细胞向全系血细胞分化的能力不受影响。（CFU,集落形成单位；GM,粒细胞和巨噬细胞；G,粒细胞；M，巨噬细胞；BFU-E,红系爆式集落形成单位；Meg，巨核细胞；Ctl，阴性对照）。

2.阳离子肽衍生物在体外能够提高脐带血来源的人体造血干细胞对SDF-1的趋化反应：阳离子肽衍生物与SDF-1共同存在时，造血干细胞对SDF-1的趋化反应明显提高，表现为迁移的造血干细胞（能够分化为全系血细胞的干/祖细胞）数量的增加。

3.阳离子肽衍生物预处理能够提高脐带血来源的人体造血干细胞的归巢效率：细胞移植11天后，受体骨髓中单核细胞数量，造血干细胞数量均比阴性对照组有明显提高。

4.阳离子肽衍生物预处理能够提高脐带血来源的人体造血干细胞的植入效率：细胞移植后11天，小鼠脾脏集落形成单位（CFU-S）数量均比阴性对照组有明显提高。

5.阳离子肽衍生物预处理能够缩短脐带血来源的人体造血干细胞的对放射处理小鼠的造血重建所需时间：细胞移植后4周内，小鼠外周血细胞（WBC,白细胞；neutrophil，中性粒细胞；lymphocyte，淋巴细胞；platelet，血小板）恢复时间均比阴性对照组有明显缩短。

具体实施方式

1.获取人源脐带血单核细胞：健康供者提供的脐带血与磷酸盐缓冲液混合后离心，获得的细胞与红细胞裂解液（PharmLysebuffer，BDBiosciences）混合，去除红细胞后，用磷酸盐缓冲液冲洗，离心，获得含有造血干细胞的人源脐带血单核细胞，重悬于适当溶液中，备用。

2.检测阳离子肽衍生物对人脐带血造血干细胞分化功能的影响：上述方式获得的人脐带血单核细胞重悬于含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培养基中（Hyclone）与20ug/mlhLF1–11（Peptisyntha）或/和2ug/mlOP145(OctoPlusTechnologiesandLeidenUniversityMedicalCenter)在37℃，5%CO₂条件下孵育1小时后，将细胞与阳离子肽衍生物混合物，进行集落形成单位试验。具体步骤如下：细胞计数重悬后，按照1:9的体积与人甲级纤维素（R&DSystems）混合，在CFU-GM中加入25ng/mlGM-CSF和10ng/mlIL-3(Millipore)；在CFU-G中加入20ng/mlG-CSF；在CFU-M中加入10ng/mlM-CSF；在BFU-E中加入5ng/ml干细胞因子和5U/ml红细胞生成素(StemCellTech)；在CFU-Meg中加入100ng/ml血小板生成素。在孵箱中培育7-14天，在显微镜下进行集落计数。结果如图1所示，阳离子肽衍生物预处理后的人脐带血来源的造血干细胞向全系血细胞分化的能力不受影响。

3.检测阳离子肽衍生物对于人脐带血造血干细胞对SDF-1趋化反应的影响：利用Transwell（24孔板，滤网孔径8微米，CostarCorning）板检测造血干细胞对SDF-1;SDF-1+OP145;SDF-1+hLF1–11;SDF-1+OP145+hLF1–11的趋化反应。步骤如下：计数后，将100ul细胞悬液（含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培养基）加入滤网内，培养孔内加入650ul含有不同因子组合的基础溶液（含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培养基），置于二氧化碳孵箱中孵育3小时，取滤网外细胞进行计数和集落形成单位试验。结果如图2所示，阳离子肽衍生物与SDF-1共存时，造血干细胞对SDF-1的趋化反应明显提高，表现为迁移的造血干细胞（能够分化为全系血细胞的干/祖细胞）数量的增加。

4.检测阳离子肽衍生物预处理对人脐带血造血干细胞的归巢和植入效率以及造血重建时间的影响：经阳离子肽衍生物预处理（20ug/mlhLF1–11或/和2ug/mlOP145，37℃，5%CO₂条件下孵育30分钟）的人脐带血造血干细胞，通过尾静脉注射，移植到接受γ射线照射（450cGY）的重症联合免疫缺陷小鼠（NOD-SCID小鼠，6-8周，雄性）体内。于移植后第11天，取小鼠股骨进行单个核细胞计数和集落形成单位试验，检测预处理对造血干细胞归巢影响。如图3所示，经阳离子肽衍生物预处理的人脐带血造血干细胞的归巢效率明显增加，表现为骨髓中单核细胞数量，造血干细胞数量均比阴性对照组有明显提高；于移植后第11天，取小鼠脾脏并进行脾脏集落形成单位计数，检测预处理对造血干细胞植入的影响。如图4所示，经阳离子肽衍生物预处理的人脐带血造血干细胞的植入效率明显增加，表现为脾脏集落形成单位计数较对照组有明显增加。细胞移植后，于第0,5,7,11,16,21天，经小鼠眼窝血管丛取血进行血细胞计数（白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞及血小板计数；Hemavet950，DrewScientificInc），检测预处理对造血干细胞对受体造血系统重建时间的影响。如图5所示，经阳离子肽衍生物预处理的人脐带血造血干细胞能够缩短小鼠的造血系统重建所需时间，表现为小鼠外周血细胞（白细胞；中性粒细胞；淋巴细胞；血小板）恢复时间均比阴性对照组有明显缩短。

Claims (3)

1.阳离子肽衍生物在制备提高造血干细胞归巢及植入率的预处理药物上的用途，其特征在于，将含有造血干细胞的供体单核细胞，与至少一种阳离子肽衍生物进行混合孵育，所述阳离子肽衍生物为hLF1–11和OP145中一种或者两种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，孵育时，阳离子肽衍生物hLF1–11的浓度为1-100微克/毫升；阳离子肽衍生物OP145的浓度为1-20微克/毫升。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述孵育为造血干细胞与阳离子肽衍生物于37℃，5%CO₂条件下共培养30分钟。