KR19990081595A - 신규한 면역증강활성 물질을 생산하는 펠리누스속 균주 - Google Patents

신규한 면역증강활성 물질을 생산하는 펠리누스속 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역증강활성을 나타내므로써 면역항암치료제로서 유용한 신규한 면역활성 다당류물질을 생산하는 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo; KCTC 0399BP)에 관한 것이다.
본 발명은 생체내 면역기능을 매개로하여 암전이를 억제하는 신규한 면역활성 다당류물질을 생산하는 펠리누스속 균주의 미토콘드리아 DNA를 분리한 후 제한효소로 처리하여 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 결과를 분석하고 미생물학적 특징을 조사하므로써 신규한 펠리누스 린테우스 유를 동정하는 효과가 있다.

Description

신규한 면역증강활성 물질을 생산하는 펠리누스속 균주
본 발명은 신규한 면역증강활성 다당류물질을 생산하는 펠리누스속 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 신규한 면역증강활성을 나타내는 다당류물질을 생산하는 펠리누스속(Phellinus)균주의 동정에 관한것이다.
진균류의 고등균류에 속하는 버섯은 현미경적 구조의 균사에 의하여 외부로부터 영양공급을 받은 종속 영양생활을 하고(Whittaker, 1969), 생태계 내에서는 복잡한 유기물질을 분해하여 자연으로 환원시키는 분해자의 역할을 담당한다. 전형적인 버섯 종류들은 대부분 고등균류 중에서도 담자병을 형성하여 4개의 담자포자를 외생하는 담자균류(Basidiomycetes)에 속하고 담자균류 중에서도 자실층이 노출되어 포자를 능동적으로 방출하는 균심류(Hymenomycetes)에 속한다. 균심류는 민주름버섯목(Aphyllophorales)과 주름버섯목(Agaricales)이 주종을 이루며 민주름버섯목에는 싸리버섯, 소나무비늘버섯, 수염버섯, 구름버섯, 구멍장이버섯, 잔나비걸상버섯 등의 종류가 있고 주름버섯목엔 느타리, 표고, 치마버섯, 민가닥버섯, 송이, 광대버섯, 먹물버섯 등의 종류가 대표적이다(이 등, 1985).
담자균의 일종으로 민주름버섯목(Aphyllophorales)에 속하는 버섯류의 많은 종류가 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료효과가 있다는 사실이 오래 전부터 알려져 왔으며 주로 한방약 또는 민간약으로 전승되어왔다. 그 중에서도 구멍장이 버섯과(polyporaceae)의 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)는 한방에서는 상황(桑黃)으로 불리우는 귀중한 약재로 사용되어왔다. 그러나 상황은 자연계에서는 매우 희귀종으로 자실체(fruiting body)를 입수하기가 대단히 어려울 뿐만아니라, 균사체(mycelium)를 분리하여 인공배양하기도 매우 어려운 단점이 있다. 따라서 상황이 종양치료제로서 매우 효과가 있다는 사실을 인지하고 있었음에도 불구하고 적극적으로 활용하지 못하고 있었다. 또한 상황균주의 미생물학적 또는 유전학적 특성을 규명하여 보고한 연구도 전무하였다. 미생물의 경우 동일한 종(species)이라도 각 균주가 생산하는 활성물질의 종류나 생산량 등에 현격한 차이가 있을 뿐만아니라 배양조건, 균주의 안정성, 유전적 변이의 빈도 등에도 큰 차이를 보이고 있다. 따라서 강력한 항암면역활성 물질을 다량으로 생산함과 동시에 인공 액체 배양이 가능하며 유전적 변이가 적은 안정된 미생물의 선발이 제일 중요한 요인들이 된다. 진흙버섯류는 형태적으로나 현미경으로 변이가 심하고 다양하여 동정이 어려운 분류군으로서 주로 형태적인 관찰에 의한 분류 방법이 시도되고 있는 실정이다.
최근에 집단유전학과 계통유전학에서는 DNA분석법을 많이 이용한다. 그중 RFLP(restriction fragment length polymorphism)는 염기서열의 변이 추정에 의해 결과를 분석할 수 있는 방법으로서(Dowling et al., 1990) DNA 분석법은 표현형에 의한 분석방법과 달리 유전형을 진화속도나 유전경향에 근거하여 분석할 수 있는 장점을 지니고 있다. 그런데 DNA 분석의 경우 핵의 DNA는 너무 크고 분석이 용이하지 않다는 단점이 있어 주로 세포 게놈(organellar genome)을 많이 사용한다(White and Densmore, 1992). 그 중에서도 미토콘드리아 DNA를 많이 이용하는데 일반적으로 미토콘드리아 DNA는 핵의 DNA보다 크기가 작고 진화적 변화속도가 상대적으로 빠르며 모계반수체 유전을 하므로 집단의 구조와 역사 연구에 용이하다. 특히 미토콘드리아 DNA의 RFLP는 여러 종 사이의 종간 변이 연구에 사용되고 있다(Foster et al., 1987, 1988).
따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 사실들을 감안하여 면역증강활성을 나타내는 신규한 다당류물질을 생산하는 펠리누스속 균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 면역증강활성을 나타내는 신규한 다당류물질을 생산하는 상기 펠리누스속 균주의 미토콘드리아 DNA를 제한효소로 처리하고 RFLP 패턴을 조사하여 동정함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 다양한 펠리누스속 균주들을 배양하여 SDS-Phenol법으로 DNA를 분리한 후 이중 미토콘드리아 DNA만을 분리하여 제한효소 BamHI, ClaI, EcoRI 및 PvuII로 각각 처리하고 처리된 시료를 아가로스겔(Agarose gel)에 전기영동한 다음 이어서 펠리누스속 균주들간의 DNA 유연관계를 Nei와 Li의 방법(1979)에 따라 분석 및 조사하여 유연관계가 있다고 판단된 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP의 자실체에 대한 미생물학적 특성을 조사한 후 균주로부터 다당류물질을 추출 및 정제하고 면역증강활성을 측정하므로써 달성하였다.
도 1은 펠리누스속(Phellinus) 균주들 간의 유연관계를 나타내는 진화계통도이다.
도 2는 상황균사체 및 다당류 생산을 위한 배양특성을 나타낸 것이다.
도3은 상황균주로부터 면역증강활성 다당류물질을 정제하는 과정을 나타낸 것이다.
본 발명은 신규 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP를 포함하여 펠리누스속(Phellinus) 균주 13종을 포테이토 덱스트로스 아가(Potato dextrose agar: PDA)배지에서 각각 배양하는 단계; 배양된 각각의 균사체로부터 전체 DNA를 SDS-phenol법으로 분리하는 단계; 상기 분리된 전체 DNA로부터 미토콘드리아 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 미토콘드리아 DNA를 제한효소로 처리하는 단계; 상기 제한효소 처리된 DNA를 아가로스 겔(Agarose gel)에 전기영동하는 단계; 상기 전기영동 결과에 따라 거리이동을 조사하여 제한효소 유사도(F 값)을 구한 후, 이 값을 이용하여 염기위치당 염기치환도(P 값)을 구하여 실험에 사용한 균주의 유연관계를 분석 및 조사하는 단계; 상기 조사에 의해 유연관계가 있다고 판단된 본 발명의 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP의 자실체에 대한 미생물학적 특성을 조사하는 단계; 상기 본 발명의 신규한 균주를 배양하여 다당류물질을 추출분리하는 단계 및; 상기 추출분리한 다당류물질의 면역증강활성을 측정하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 신규한 펠리누스속 균주의 구체적인 동정방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 균주 배양
공시 균주는 표1에 나타낸 다양한 펠리누스속 균주로서 이들을 각각 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar:PDA) 배지에서 28℃를 유지하면서 5 ~ 12일간 배양한 후 450㎖의 PD브로스(broth)에 접종하여 28℃, 120rpm의 조건으로 12일간 배양하였다.
본 발명의 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP를 포함한 펠리누스속 균주(13종)와 그 출처
균주 출처
P.linteus WD1222 Japan
p.linteus ATCC 26710 U. S. A
P.linteus KCTC 0399BP Korea
P.linteus PL5 Korea
P.linteus PL4 Korea
P.linteus PLM Korea
P.linteus Hansin Korea
P.tremulae ATCC 32233 U. S. A
P.jhonsonianus ATCC 60051 U. S. A
P.pini ATCC 12240 U. S. A
P.tuberculosis ATCC 13271 U. S. A
P.nigricans FP-71807-S U. S. A
P.chrysoloma HHB-3585-Sp U. S. A
실시예 2: 전체 DNA 분리
균사체로부터 전체 DNA 분리는 SDS-phenol법을 이용하였다. 상기 실시예 1에서 배양이 끝난 균사체 각각은 20mM EDTA로 세척한 후 필터 페이퍼(filter paper; Waterman no. 1)를 사용한 진공여과법으로 수확하여 -70℃에서 얼린다음 동결건조하였다. 동결건조된 균사체는 막자사발로 곱게 갈아 분말 형태를 만든 후 2g을 달아 20㎖의 추출 완충용액(extraction buffer; 0.2M Tris·HCl, pH 8.5, 0.25M NaCl, 25mM EDTA, 0.5%(w/v) SDS)에 넣고 페놀 14㎖과 클로로포름 6㎖을 넣어 천천히 흔들어 주었다. 원심분리하여 상등액만을 취한 후 RNase A(10㎎/㎖) 15㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고 프로테인나제 K(proteinase K)(10㎎/㎖) 15㎕를 첨가하여 60℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 동일부피의 페놀:클로로포름:아이소아밀 알콜(25:24:1)을 가하여 잘 섞은 다음 4℃, 12000 X g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 분리한 상등액에 동량의 클로로포름:아이소아밀 알콜(24:1)을 넣고 잘 섞은 후 동일조건으로 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 용액에 0.54 volume의 아이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 동일 조건에서 원심분리하여 DNA 펠렛(pellet)을 얻었다. DNA 펠렛은 70% 에탄올로 세척하여 공기중에서 건조시켜 8㎖의 TE 완충용액(10mM Tris·HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 녹여 -20℃에 보관하면서 사용하였다.
실시예 3: 미토콘드리아 DNA 분리
상기 실시예 2에서 분리된 균주 각각의 전체 DNA로부터 미토콘드리아 DNA를 얻기 위해 초원심분리를 하였다. 즉 8㎖의 DNA 용액에 8.8g의 염화세슘(Cesium chloride; Sigma, U. S. A)과 6㎕의 비스벤즈아미드 용액(bisbenzimide solution)(10㎎/㎖)을 섞고 20℃, 40000 X g의 조건으로 40시간 동안 초원심분리하였다. 초원심분리 후 자외선등 하에서 나타나는 두 개의 DNA 밴드중 위 밴드만을 21게이지(gauge) 주사침으로 회수하였다. 회수한 미토콘드리아 DNA 분획은 비스벤즈아미드(bisbenzimide)를 제거하기 위해 포화염화세슘 아이소프로판올(CsCl -saturated isopropanol)을 동일부피로 첨가한 후 약하게 볼텍싱(Vortexing)하고 4℃에서 1200 X g로 원심분리하여 6 ~ 7차례 세척하였다. 염화세슘을 제거하기 위하여 미토콘드리아 DNA 분획 3배 부피의 70% 에탄올을 첨가하여 4℃에서 100 X g로 10분간 원심분리하여 미토콘드리아 DNA를 침전시켰다. 미토콘드리아 DNA는 70% 에탄올로 다시 세척한 다음 상온에서 건조시켜 TE buffer(pH 8.0)에 녹인 후 분광 광도계(DU-64 Spectrometer Beckman, U. S. A)로 260nm의 파장에서 정량하고 -20℃에 보관하면서 사용하였다.
실시예 4: 미토콘드리아 DNA의 제한효소 처리
본 실시예의 실험에서 사용한 제한효소 및 완충용액은 Boehringer Mannheim(Germany)으로부터 구입하였고 제한효소와 인지 염기서열은 표 2에 나타냈다. 상기 실시예 3에서 얻은 균주 각각의 미토콘드리아 DNA 시료는 제한효소 반응용액 10㎕에 1㎍되도록 사용하였으며 37℃에서 3시간 반응시켰다.
제한효소와 염기서열 인지부위
제한 효소 인지 부위
BamHI G↓GATCC
ClaI AT↓CGAT
EcoRI G↓AATTC
PvuII CAG↓CTG
실시예 5: 아가로스겔(Agarose gel) 전기영동
상기 실시예 4에서 제한효소 반응이 끝난 시료는 겔 로딩 완충용액(gel loading buffer; 0.25% bromophenol blue, 0.25% 크실렌 사이아놀 FF, 30% 글리세롤 수용액)을 섞어 전기영동하였다. 전기영동은 수평 전기영동기(BRL, U. S. A)를 사용하여 1% 아가로스겔(agarose MP, Boehringer Mannheim co. Germany)에서 TAE 완충용액(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.0)을 사용하여 50V로 4시간동안 수행하였다. 전개 후의 겔은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; 0.5㎍/㎖ in water)로 염색하였다. 실험결과는 표 3에 각 균주들의 미토콘드리아 DNA의 크기를 정리하였다.
펠리누스속 균주들로부터 분리한 미토콘드리아 DNA의 크기
균주 DNA 크기
P.linteus WD1222 58Kb
p.linteus ATCC 26710 59Kb
P.linteus KCTC 0399BP 61Kb
P.linteus PL5 61Kb
P.linteus PL4 73Kb
P.linteus PLM 63Kb
P.tremulae ATCC 32233 77Kb
P.jhonsonianus ATCC 60051 76Kb
P.pini ATCC 12240 76Kb
P.tuberculosis ATCC 13271 57Kb
P.nigricans FP-71807-S 58Kb
P.chrysoloma HHB-3585-Sp 60Kb
실시예 6: RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석
펠리누스속 균주들간 DNA 유연관계의 분석 및 조사는 Nei와 Li의 방법(1979)에 따라 수행하였다. 즉, 제한효소를 처리한 각 균주의 미토콘드리아 DNA 조각들을 상기 실시예 5에서 설명한 바와 같이 아가로스 겔에 전기영동하고 같은거리를 이동하는 DNA 조각들을 동일한 것으로 가정하여 제한효소 유사도 F값과 염기위치당 염기치환도 P값을 구하였고 P값으로부터 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP와 다른 펠리누스속 균주들의 유연관계를 UPGMA(Unweighted Pair-Group Method, arithmetic average) Clustring방법으로 분석하였다. P값과 F값은 아래의 수식에 의거하여 계산하였다.
제한효소 유사도 F=2nxy/(nx+ ny)
(nx, ny는 각 균주 x, y의 DNA 절편의 전체 개수, nxy는 두 펠리누스 균주간의 공통 DNA 절편수)
염기위치당 염기치환도 P=-(1n F)/r
(r은 제한효소의 인식염기쌍 수)
실험결과, 이는 표 4에 제한효소 BamHI으로 처리된 각 균주의 F값과 이에 상응하는 P값을, 또 표 5에는 제한효소 CIaI으로 처리된 각 균주의 F값과 이에 상응하는 P값을, 표 6에는 제한효소 EcoRI으로 처리된 각 균주의 F값과 이에 상응하는 P값을, 표 7에는 제한효소 PvuII로 처리된 각 균주의 F값과 이에 상응하는 P값을 나타내며 그리고 표 8에는 공통절편의 비율과 표 4 ~ 7의 사선위 P값에 상응하는 산술평균적인 거리를 나타냈다. 또 이 결과에 따라 도 1과 같은 진화계통도를 작성하고 이에따라 본 발명의 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유 KCTC 0399BP는 펠리누스속 균주와 유연관계가 있는 새롭게 분화된 균주임을 나타냈다.
제한효소 BamHI로 처리된 미토콘드리아 DNA를 RFLP 분석하여 얻은 F값과 P값
WD1222 ATCC26710 KCTC0399BP PL5 PL4 PLM Hansin ATCC32233 ATCC60051 ATCC12240 ATCC13271 FP-71807-S HHB-3585-Sp
WD1222 - 0.1921 0.4142 0.3465 0.2310
ATCC26710 NC - 0.0257 0.2570 0.3120 0.2841 0.2682 0.2310 0.2841 0.2203
KCTC0399BP NC 0.8571 - 0.0000 0.3120 0.2841 0.2682 0.2310 0.2841 0.3358
PL5 NC 0.8571 1.0000 - 0.3120 0.2841 0.2682 0.2310 0.2841 0.3358
PL4 NC 0.1538 0.1538 0.1538 - 0.2507 0.3358 0.3243 0.3120
PLM NC 0.1818 0.1818 0.1818 NC - 0.2841
Hansin NC 0.2000 0.2000 0.2000 0.2222 NC - 0.2987 0.3662
ATCC32233 NC 0.2500 0.2500 0.2500 0.1333 NC 0.1666 - 0.3753 0.2987 0.1735 0.3465
ATCC60051 0.3158 NC NC NC NC NC NC 0.1052 - 0.4209 0.3666 0.2411 0.3567
ATCC12240 0.0833 0.1818 0.1818 0.1818 NC NC 0.1111 0.1666 0.0800 - 0.2915 0.3996 0.2165
ATCC13271 NC 0.2666 0.1313 0.1333 0.1428 NC NC 0.3530 0.1111 0.1739 - 0.2203
FP-71807-S 0.1250 NC NC NC NC NC NC NC 0.2353 0.0909 0.2666 -
HHB-3585-Sp 0.2500 NC NC NC 0.1538 0.1818 NC 0.1250 0.1176 0.2727 NC NC -
제한효소 ClaI로 처리된 미토콘드리아 DNA를 RFLP 분석하여 얻은 F값과 P값
WD1222 ATCC26710 KCTC0399BP PL5 PL4 PLM Hansin ATCC32233 ATCC60051 ATCC12240 ATCC13271 FP-71807-S HHB-3585-Sp
WD1222 - 0.1155 0.1351 0.1527 0.2841 0.2987 0.1351 0.3243 0.0372 0.1412 0.2310 0.2507
ATCC26710 0.5000 - 0.0196 0.0851 0.1686 0.1831 0.1351 0.2088 0.1527 0.1155 0.2507
KCTC0399BP 0.4444 0.8888 - 0.0531 0.1831 0.1288 0.1527 0.2203 0.1686 0.1351 0.2682
PL5 0.4000 0.6000 0.7272 - 0.1964 0.1412 0.1010 0.3465 0.1831 0.1527 0.2841
PL4 0.1818 0.3636 0.3333 0.3077 - 0.1047 0.1831 0.2411 0.1964 0.1736 0.1256 0.1686 0.2987
PLM 0.1666 0.3333 0.4615 0.4285 0.5333 - 0.3120 0.3666 0.3243 0.1831 0.1831 0.1831 0.3120
Hansin 0.4444 0.4444 0.4000 0.5454 0.3333 0.1538 - 0.1527 0.1686 0.3837 0.3358 0.1351 0.1527
ATCC32233 0.1428 0.2587 0.2666 0.1250 0.2353 0.1111 0.4000 - 0.2310 0.2006 0.2006 0.2088 0.2203
ATCC60051 0.8000 0.4000 0.3636 0.3333 0.3077 0.1428 0.3636 0.2500 - 0.3465 0.1682 0.2841
ATCC12240 0.4285 NC NC NC 0.3529 0.3333 0.1000 0.3000 NC - 0.2682 0.3243 0.2203
ATCC13271 NC NC NC NC 0.4706 0.3333 0.1333 0.3000 0.1250 0.2000 - 0.3243
FP-71807-S 0.2500 0.5000. 0.4444 0.4000 0.3636 0.3333 0.4444 0.2857 0.2000 0.1428 0.1482 - 0.2507
HHB-3585-Sp 0.2222 0.2222 0.2000 0.1818 0.1666 0.1538 0.4000 0.2666 0.1818 0.2666 NC 0.2222 -
제한효소 EcoRI으로 처리된 미토콘드리아 DNA를 RFLP 분석하여 얻은 F값과 P값
WD1222 ATCC26710 KCTC0399BP PL5 PL4 PLM Hansin ATCC32233 ATCC60051 ATCC12240 ATCC13271 FP-71807-S HHB-3585-Sp
WD1222 - 0.3837 0.1921 0.2006 0.2764 0.2597 0.2764 0.3302 0.0175 0.4339 0.1899 0.4071 0.2987
ATCC26710 0.1000 - 0.1442 0.2006 0.1608 0.2597 0.3919 0.3302 0.3837 0.3183 0.3054 0.4071 0.4142
KCTC0399BP 0.3158 0.4210 - 0.0509 0.2006 0.2507 0.3837 0.2567 0.4275 0.3120 0.2310 0.2165 0.2915
PL5 0.3000 0.3000 0.7368 - 0.2764 0.2597 0.3919 0.1470 0.2682 0.3183 0.2378 0.2240 0.2987
PL4 0.1904 0.3809 0.3000 0.1904 - 0.3837 0.2165 0.2682 0.2764 0.4399 0.3120 0.2987 0.3054
PLM 0.2105 0.2105 0.2222 0.2105 0.1000 - 0.3243 0.2597 0.3120 0.4142 0.1964
Hansin 0.1904 0.0952 0.1000 0.0952 0.2727 NC - 0.2203 0.3919 0.4819 0.3120 0.4142 0.3054
ATCC32233 0.1397 0.1379 0.2143 0.4138 0.2000 0.1428 0.2666 - 0.3302 0.3662 0.1256 0.3465 0.2362
ATCC60051 0.9000 0.1000 0.0769 0.2000 0.1904 0.2105 0.0952 0.1379 - 0.4339 0.2738 0.2915 0.4142
ATCC12240 0.0740 0.1481 0.1538 0.1481 0.0714 0.1538 0.0555 0.1111 0.0740 - 0.3465 0.2203 0.2737
ATCC13271 0.3200 0.1600 0.2500 0.2400 0.1538 0.0833 0.1538 0.4705 0.2400 0.1250 - 0.2568 0.2915
FP-71807-S 0.0869 0.0869 0.2727 0.2680 0.1666 NC 0.0833 0.1250 0.1739 0.2666 0.2142 - 0.4339
HHB-3585-Sp 0.1666 0.0833 0.1739 0.1666 0.1600 0.3077 0.1600 0.2424 0.0833 0.1935 0.1379 0.0740 -
제한효소 PvuII로 처리된 미토콘드리아 DNA를 RFLP 분석하여 얻은 F값과 P값
WD1222 ATCC26710 KCTC0399BP PL5 PL4 PLM Hansin ATCC32233 ATCC60051 ATCC12240 ATCC13271 FP-71807-S HHB-3585-Sp
WD1222 - 0.2507 0.2682 0.2507 0.2411 0.0851 0.3567 0.2987 0.3358 0.3465
ATCC26710 0.2222 - 0.1155 0.1155 0.2987 0.2507 0.3465 0.3465 0.3243
KCTC0399BP NC 0.5000 - 0.0479 0.3465 0.3243
PL5 NC 0.5000 0.7500 - 0.3465
PL4 NC 0.1666 NC NC - 0.1968 0.2987 0.2682 0.3358
PLM 0.2000 0.2222 NC NC 0.3070 - 0.3567 0.2682
Hansin 0.2222 NC NC NC 0.1666 NC - 0.2310 0.2507 0.2310 0.2841 0.3243 0.2203
ATCC32233 0.2353 0.1250 NC NC 0.2000 0.1176 0.2500 - 0.2310 0.3996 0.4071
ATCC60051 0.6000 NC NC NC NC 0.2000 0.2222 NC - 0.567 0.2987 0.3358 0.3465
ATCC12240 0.1176 0.1250 0.1250 0.1250 NC NC 0.2500 0.2500 0.1176 - 0.2597 0.1010 0.1760
ATCC13271 0.1666 NC NC NC 0.1333 NC 0.1818 NC 0.1666 0.2105 - 0.1256 0.2507
FP-71807-S 0.1333 0.1428 0.1428 NC NC NC 0.1428 0.0909 0.1333 0.5454 0.4706 - 0.2088
HHB-3585-Sp 0.1250 NC NC NC NC NC 0.2666 0.0869 0.1250 0.3478 0.2222 0.2857 -
공통절편a의 비율과 표 2 ~ 5b의 사선위 P값에 상응하는 산술평균적인 거리
WD1222 ATCC26710 KCTC0399BP PL5 PL4 PLM Hansin ATCC32233 ATCC60051 ATCC12240 ATCC13271 FP-71807-S HHB-3585-Sp
WD1222 - 4/53 5/53 5/55 3/60 4/54 5/51 5/78 19/59 6/82 5/68 5/62 6/65
ATCC26710 0.2499 - 16/50 14/52 8/60 6/51 4/48 7/75 3/56 5/79 4/65 4/59 2/62
KCTC0399BP 0.1636 0.0762 - 21/52 6/57 6/51 4/48 7/75 3/56 5/79 4/65 6/59 3/62
PL5 0.1766 0.1645 0.0379 - 5/59 6/51 5/50 9/77 4/58 5/81 4/67 5/61 3/64
PL4 0.2802 0.2350 0.2393 0.2616 - 7/58 7/55 8/82 4/63 4/86 8/72 4/66 4/69
PLM 0.2755 0.2444 0.2212 0.2283 0.2284 - 1/49 4/76 4/57 5/80 4/66 2/60 6/63
Hansin 0.2207 0.2650 0.2682 0.2537 0.2372 0.3120 - 10/73 4/54 5/77 4/63 4/57 6/60
ATCC32233 0.2985 0.2791 0.2360 0.2415 0.2783 0.3490 0.2256 - 5/81 10/104 14/90 5/74 8/87
ATCC60051 0.0823 0.2682 0.2980 0.2256 0.2364 0.2840 0.2704 0.3121 - 3/85 6/71 6/65 4/68
ATCC12240 0.3365 0.3163 0.3142 0.3163 0.3067 0.2475 0.3657 0.2741 0.4038 - 6/94 12/88 12/91
ATCC13271 0.2443 0.2628 0.2834 0.2868 0.2744 0.2986 0.3106 0.1665 0.3123 0.2914 - 10/74 4/77
FP-71807-S 0.3301 0.2823 0.2253 0.1883 0.2336 0.1831 0.2912 0.3183 0.2591 0.2613 0.2317 - 5/71
HHB-3585-Sp 0.3817 0.3324 0.2498 0.2914 0.3053 0.2641 0.2261 0.3025 0.3503 0.2216 0.2711 0.2978 -
a사선위: 공통절편수/절편총수b사선아래: 염치위치당 염기치환도(P)값의 평균
실시예 7: 본 발명 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo) 균주 KCTC 0399BP의 미생물학적 특성 조사
본 발명의 상기 실시예 1 ~ 6까지의 결과로부터 펠리누스속 균주로부터 분화하였으나 전혀 신규한 균주임이 증명된 본 발명의 신규한 균주의 미생물학적 특성을 조사하였다. 이 균주의 자실체는 무병하며 다년생으로 목질부분이 형성되어 있으며 갓은 반원형으로 폭 약 10cm, 두께 약 4cm이였다. 채취한 상황버섯의 표면은 처음에는 암갈색을 나타내고 있었으나 나중에는 흑갈색으로 변화였으며 많은 거열을 나타내며 거칠었다. 하면(下面)은 처음에는 선황색을 띈 후 황갈색으로 변하였다. 하면의 관공은 다층이였으며 구멍입구는 미세하였고 포자는 유구형, 담황갈색으로 3 ~ 4㎛, 강모체는 다수이며 후막은 15 ~ 30 X 8 ~ 10㎛이였다. 실험결과, 이 균주는 일본에서 발행한 「원색 일본 신균류도감(II), Hoikusha 발행, 이마제끼 로꾸야 및 홍고 쓰꼬우 편저 pp189」에 기록된 상황버섯(Phellius linteus)과 거의 일치하여 상황버섯의 새로운 균주로 인정하고 본 발명자들은 이 균주의 균주명을 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo)로 명명하였다. 이 균주는 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자 은행에 1997년 11월 17일자로 기탁번호 KCTC 0399BP로 기탁하였다.
실시예 8: 펠리누스 린테우스 유(Phellius linteus Yoo;KCTC 0399BP)의 배양
본 발명의 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유를 액체 배양하기 위하여 배지 1리터당 포도당 50g, 펩톤 10g, 효모추출액 10g 및 KH2PO40.8g, MgSO4·7H2O 0.5g, CaCl20.3g을 혼합한 무기염류용액 1mL가 들어있는 액체배지를 pH 6.0으로 조절한 다음 멸균하여 사용하였다. 이때, 균사체를 배양하기 위하여 5ℓ 발효조를 사용하여 3.5ℓ의 액체배지를 만든 후 온도 28℃, 통기량 2vvm, 회전수 160rpm 조건에서 11일 동안 배양하였으며, 이때의 균사체 수율은 5일후 가장 높았으며 리터당 30g이였다(도 2). 5일간 배양된 균사체의 열수추출로 얻어지는 다당류물질의 수율은 표 9에서 볼 수 있듯이 균사체 건조중량당 0.873%이었다.
본 발명 신규한 상황 균사체의 균사체 생산성과 다당류의 생산성
조 사 항 목 상황 5일 배양 균사체
균사체 건조중량(g/L) 30
조 다당류의 건조중량(㎎/L) 262
조 다당류의 수율(%) 0.873
실시예 9: 펠리누스 린테우스 유의 배양 균사체 추출
본발명의 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유의 배양 균사체를 다음과 같은 방법으로 추출 정제하여 면역증강활성 조추출물을 얻었다. 상기 실시예 8에서 얻어진 배양 균사체 280g을 열수추출한 후 농축하여 3g의 열수 추출액을 얻었다. 이 추출액에 에탄올 농도가 80%가 되게 에탄올을 가한 후 4℃에서 24시간 동안 방치한 후 원심분리하면 상등액과 침전물을 얻었다. 침전물은 물에 녹인 후 투석막(cellulose tubing, 일본 삼광순약제품)을 사용하여 10℃ 저온에서 72시간 동안 12시간 간격으로 투석액을 교환하면서 투석하였다. 투석막속의 내액을 동결건조하여 2.45g의 조 추출물을 얻었다.
실시예 10: 순수한 면역활성물질의 정제
상기 실시예 9에서 얻어진 조 추출물을 DEAE-셀룰로스와 겔 여과 크로마토그라피를 순차적으로 행하여 순수한 활성분획을 얻었다. 먼저 조추출물을 5mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.2)에 용해한 후 DEAE-셀룰로스 칼럼에 적용하고 동일 완충액으로 세척한 다음, 동일 완충액에 0에서 1M 농도의 NaCl을 조제하여 gradient로 분당 5mL의 유속으로 용출시켜 각 시험관에 15mL씩 분취하였다. 페놀-황산정량법에 의해 당 함량을, 브래드포드방법에 의해 단백질 함량을 결정하였다. 이때 얻어진 당 함량 조 추출물 분획은 Toyopearl HW 65F 겔 여과 크로마토그라피를 수행하여 분자량이 균일하고 성질이 동일한 순수 활성분획을 얻었다. 이때 용출은 물로 실시하였다. 당과 단백질 함량은 상기와 동일한 방법으로 결정하였다. 순수한 면역활성물질의 추출 및 정제과정은 도 3에 나타냈다.
실시예 11: 추출분획 다당류의 면역증강활성 조사
담자균 유래 다당류물질은 생체내의 면역기구인 임파구의 증식 또는 활성에 영향을 줌으로써 외부 인자에 대한 면역성을 증강시키고, 이러한 결과는 암세포의 파괴를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용은 직접적인 세포독성에 기인하는 것이 아니라, 면역활성에 의하여 매개되는 것으로 생체내의 부작용이 적은 장점이 있다. 즉, T- 세포와 B- 세포등 임파구의 각각에 대한 세포독성 작용과 면역작용체인 항체 형성을 유도하여 면역활성이 증가되고, 그 결과로서 항암면역활성을 나타낸다. 따라서, 항체형성 림포사이트를 계수하고 임파구와 T-세포의 증식정도를 측정함으로 항암면역활성을 간접적으로 증명할 수 있다. 본 발명에서는 항체형성 림포사이트를 계수하는 항체형성 세포계산법(antibody forming cell method), T-세포의 증식정도를 측정하는 임파구 혼합 반응효과(Mixed lymphocytes response)와 임파구의 증식효과를 알 수 있는 세포내의 핵 합성량 정도를 동위원소로 치환된 티아민(3H thiamine)을 사용하여 측정하므로써 활성의 지표로 삼았다. 실험결과는 표 10에 나타냈다.
본 발명의 신규한 상황균주 추출분획 다당류물질에 대한 면역증강활성
처리구 임파구 증식효과 (DPM x 104) T 세포활성 (DPM x 104) B 세포 항체형성능 (흡광도 576nm)
펠리누스 린테우스 유 8.4±0.5 2.5±0.1 0.66±0.01
리포폴리사카라이드 (LPS, 양성대조구) - - 0.81±0.23
대조구 1.6±0.5 0.5±0.05 0.00±0.00
주: 각 시료는 10㎍/㎖ 농도로 처리하였다.
본 발명의 신규한 균주 상황 균사체로부터 얻은 다당류물질은 대조구에 비해 약 5배의 높은 임파구 증식 및 T 세포 활성효과를 나타냈으며 B 세포의 항체 형성능의 경우 면역제제 가운데 효과가 가장 뛰어나지만 생체내의 부작용으로 인하여 사용할 수 없는 양성 대조구 리포폴리사카라이드의 활성 정도와는 거의 유사한 수준을 나타냈다.
본 발명은 이상, 실시예에서 설명한 바와 같이 다양한 펠리누스속 균주로부터 미토콘드리아 DNA를 분리하여 제한효소로 처리한 후 RFLP(restriction fragment length polymorphism)결과를 분석하고 미생물학적 특징을 조사하므로써 신규한 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo)를 동정하여 제공하는 효과가 있을 뿐만아니라 이 신규한 상황균주가 생성하는 임파구의 증식 및 T세포 활성이 있는 신규한 다당류물질을 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 기초생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

  1. 면역증강활성 다당류물질을 생산하고 미토콘드리아 DNA의 크기가 61kb임을 특징으로 하는 신규한 균주 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo; KCTC 0399BP).
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ES99120033T ES2241219T3 (es) 1998-04-30 1999-10-18 Nuevo polisacarido inmunoestimulante procedente de la cepa de la especie phellinus, y su uso.
EP99120033A EP1096022B1 (en) 1998-04-30 1999-10-18 Immuno-stimulating polysaccharide substance from Phellinus spp. strain and use thereof
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040045795A (ko) * 2002-11-25 2004-06-02 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스에서 추출한 다당류와 마이토마이신ｃ를 포함하는 복합 항암제
KR20040045794A (ko) * 2002-11-25 2004-06-02 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스에서 추출한 다당류와 아드리아마이신을포함하는 복합 항암제
KR100435153B1 (ko) * 2001-07-11 2004-06-14 대한민국 목질진흙버섯 특이 ｄｎａ 단편 검출을 위한 ｐｃｒ프라이머
KR100455906B1 (ko) * 2001-10-26 2004-11-15 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스의 균사체를 추출 정제하여 얻은다당류를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물
KR100852490B1 (ko) * 2007-01-03 2008-08-18 임창수 알파-아밀라제를 생산하는 이노노투스 린테우스 및 그를 이용하여 다당체 함량이 증가된 이노노투스 린테우스 균사체를 제조하는 방법

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KR100435153B1 (ko) * 2001-07-11 2004-06-14 대한민국 목질진흙버섯 특이 ｄｎａ 단편 검출을 위한 ｐｃｒ프라이머
KR100455906B1 (ko) * 2001-10-26 2004-11-15 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스의 균사체를 추출 정제하여 얻은다당류를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물
KR20040045795A (ko) * 2002-11-25 2004-06-02 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스에서 추출한 다당류와 마이토마이신ｃ를 포함하는 복합 항암제
KR20040045794A (ko) * 2002-11-25 2004-06-02 주식회사한국신약 펠리누스 린테우스에서 추출한 다당류와 아드리아마이신을포함하는 복합 항암제
KR100852490B1 (ko) * 2007-01-03 2008-08-18 임창수 알파-아밀라제를 생산하는 이노노투스 린테우스 및 그를 이용하여 다당체 함량이 증가된 이노노투스 린테우스 균사체를 제조하는 방법

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