KR100435153B1

KR100435153B1 - 목질진흙버섯 특이 ｄｎａ 단편 검출을 위한 ｐｃｒ프라이머

Info

Publication number: KR100435153B1
Application number: KR10-2001-0041698A
Authority: KR
Inventors: 강희완; 박동석; 이병무; 고승주; 은무영; 김기태
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2004-06-14
Also published as: KR20030006126A

Abstract

본 발명은 목질진흙버섯 특이 DNA 단편 검출을 위한 PCR 프라이머에 관한 것으로, 목질진흙버섯 특이성을 가지는 서열번호 2의 DNA 단편 및 상기 DNA 단편을 포함하는 목질진흙버섯 검정방법을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 2의 염기서열내의 연속된 10 내지 40 mer의 서열을 포함하는 목질진흙버섯 검정용 프라이머를 제공하여 목질진흙버섯의 진위여부를 신속, 정확하게 확인할 수 있다.

Description

목질진흙버섯 특이 ＤＮＡ 단편 검출을 위한 ＰＣＲ 프라이머{PCR PRIMERS FOR SPECIFIC DNA FRAGMENT OF PHELLINUS LINTEUS}

본 발명은 목질진흙버섯 특이 DNA 단편 검출을 위한 PCR 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 균주간에 특이하게 존재하는 PCR 다형성 밴드(pPLSB)를 분리 및 염기배열을 결정하여 목질진흙버섯 (Phellinus linteus) 특이 DNA 단편을 신속, 정확하게 특이적으로 검출 할 수 있는 PCR 프라이머에 관한 것이다.

진흙버섯류(Phellinus sp)는 목질진흙버섯(Phellinus linteus),말똥진흙버섯(P. igniarius),찰진흙버섯(P. robustus),낙엽송진흙버섯(P. pini) 등 전세계적으로 220종이 알려져 있으며, 한국에서는 7종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 진흙버섯류는 참나무, 뽕나무 등의 다양한 활엽수, 소나무, 가문비나무 등과 같은 침엽수에 서식하며, 자실체는 줄기와 갓의 구분이 없고 죽은 나무의 기부, 고목 그루터기에서 발생한다. 또한 진흙버섯류는 목재를 표백시키는 전형적인 백색부후균류에 속하며, 종에 따라 산림에 병을 유발하여 막대한 피해를 초래하기도 한다. 그러나 진흙버섯류는 형태가 유사하고 변이가 심하여 종을 동종하기 어렵다.

목질진흙버섯은 분류학적으로 열대와 아열대에 분포하는 것으로 보고 되고 있으나, 중국과 일본은 물론 한국에서도 채집되고 있다. 목질진흙버섯과 말똥진흙버섯은 뽕나무의 그루터기에서 자생한다고 하여 상황버섯으로도 알려져 있다. 특히 목질진흙버섯은 항종면역기능, 위장기능활성화, 해독작용이 우수하고, 동물실험에서 96.7 %의 높은 항암효과가 있는 것으로 확인되었으며, 다른 진흙버섯류들에 비하여 약효가 탁월하다. 또한 목질진흙버섯은 임상실험에서 그 안정성이 입증되어 산업적 응용연구가 활발하게 진행되고 있으며, 약제 유용성으로 인하여 중국, 인도 등으로부터 다량 들어와 고가로 유통되고 있다. 그러나, 자실체 형태에 있어서, 목질진흙버섯은 다른 종과 매우 유사하여 진위판별이 어려우며, 객관적인 판별 표준지표가 요구되고 있다. 국내 농가에서는 상황버섯이라 하여 경북안동 등 국내 여러 지역에서 재배되고 있으나, 형태적 특징 및 rDNA 등의 유전분석결과 목질진흙버섯과는 다른 변이종(장수 상황버섯)이임을 확인할 수 있었다.

버섯의 변이성 확인은 기존의 형태적, 이화학적인 방법으로 실시할 수 있으나, 균사의 생장 단계에 따라 환경요인에 의한 변이가 발생하기 쉽고 많은 시간, 노력 비용이 요구되며, 장기간의 경험과 전문성을 필요로 하여 현실적으로 적용하기 어렵다. 그러나 최근 분자생물학의 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 생물 종의 다양성(Biodiversity)연구를 가능하게 하는 핵산지문분석 기술이 개발되어 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고, 간단, 신속, 정확하게 변이성 유무를 확인할 수 있게 되었다.

핵산지문기술은 유용형질 탐색, 생물의 종판별, 미생물의 분류 동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등 다양한 목적으로 이용되고 있다. 지금까지 개발된 핵산지문법으로는 제한효소단편장다형(restriction fragment length polymorphism: RFLP법)과 핵산중합반응(Polymerase Chain Reaction: PCR법)이 있으며, 전자는 제한효소(restriction enzyme)에 의해 DNA를 절단한 다음 절단단편들을 나이론막에 전사한 후, 방사성동위원소 등으로 표지한 프로브(probe)를 이용해 DNA 다형성을 검출하는 방법이며, 후자의 방법은 프라이머(primer)라고 불리우는 짧은 핵산염기(6-20여개의 핵산염기)를 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)하여 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)로 프라이머가 결합된 영역을 증폭시키고, PCR산물을 전기영동하여 DNA를 염색한 후 DNA 다형성을 검출하는 방법이다.

RFLP방법은 다량의 게놈유전자(5 ㎍ 이상)가 필요하고, 방사성동위원소에 의한 프로브 제작 등에 과도한 시간, 노력 및 비용이 소요되는 단점이 있다. 반면에 PCR법은 소량의 게놈유전자(10-50 ng)만으로 신속, 간단하게 생물의 DNA 다형성을 검출할 수 있어 최근 여러 분야에서 그 이용이 급증하고 있다.

버섯을 포함하는 균류를 분류하는데 있어서, 가장 많이 이용되고 있는 방법은 라이보조말 DNA(Ribosomal DNA; rDNA)의 ITS(internal transcribed spacer)와 같은 부위를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하고, 계통발생학적으로 비교, 분석하는 방법이나, 속간 및 일부 종간 판별에는 어려운 점이 있다.

이를 극복하기 위한 방법으로 RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), AP-PCR(arbitrary primer-PCR) 등이 개발되어 적용되고 있다. 이들의 PCR 기법은 많은 유전자 증폭으로 많은 밴드를 생성할 수 있어, 이들 밴드의 차이에 의하여 미생물의 종 다양성을 구분할 수 있다. 그러나, 재현성이 떨어져 분석결과가 일정하지 못한 것이 단점으로 지적되고 있다. 또한 목질진흙버섯을 진흙버섯 종으로부터 구분하기 위하여, 상기의 방법이 적용되었으나 재현성이 떨어지고 목질진흙버섯 특이 DNA 단편검출에는 성공하지 못하였다.

최근에는 동물, 식물 및 미생물 종들의 PCR 핵산지문에 모두 이용 할 수 있는 URP(universal rice primer)가 벼 반복배열 DNA 염기서열을 기초로 하여 개발되었다.

국, 내외로부터 진흙버섯 종은 대부분 자실체 상태로 도입되고 있으며, 본 발명의 프라이머로 이들을 신속하게 판별하기 위하여 자실체 자체로부터 DNA를 분리하여 분석하여야만 한다. 만약에 균사체로부터 DNA를 분리하려면 자실체에서 조직을 분리하여 균사생장을 유도하여야 하고, 이 기간이 대략 30일 정도가 소요되는 실정이다.

따라서, 본 발명은 목질진흙버섯의 변이성을 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 목질진흙버섯에만 특이하게 존재하는 DNA 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 목질진흙버섯에 존재하는 특이적 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 URP1F 프라이머를 이용하여 목질진흙버섯 및 다른 진흙버섯 종을 PCR하여, DNA다형성 밴드를 관찰한 것이고,

도 2는 목질진흙검정용 프라이머의 결합부분을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 PLSPR 프라이머와 PLSPF 프라이머 쌍을 이용하여 목질진흙버섯 특이 DNA단편을 검출한 사진이고,

도 4는 본 발명의 PLSPR 프라이머와 PLSPF 프라이머 쌍을 이용하여 목질진흙버섯 균사체와 자실체로부터 분리한 DNA에 대한 PCR 산물을 나타낸 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 목질진흙버섯 특이성을 가지는 서열번호 2의 DNA 단편을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 2의 DNA 단편의 존재유무를 목질진흙버섯 균사체 또는 목질진흙버섯 자실체에서 확인함으로써 목질진흙버섯 진위여부를 결정하는 목질진흙버섯 검정방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 염기서열내의 연속된 10 내지 40 mer의 서열을 포함하는 목질진흙버섯 검정용 프라이머를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 목질진흙버섯에 특이적인 DNA 단편을 확인하였고, 상기 특이적인 DNA 단편을 이용한 목질진흙버섯 검정방법을 제공한다.

목질진흙버섯 특이 DNA 단편은 프라이머로 PCR 하였을 때 증폭된 2.8 kb 단편 또는 상기 2.8 kb 내의 단편들이다.

본 발명에서는 상기 목질진흙버섯 특이 DNA 단편을 검정할 수 있는 방법을 제공한다. 바람직한 검정방법은 서열번호 2의 2.8 kb내의 단편을 이용하여 확인하는 것으로, PCR 방법이 가장 바람직하다.

목질진흙버섯의 검정하기 위한 PCR에서 가장 중요한 것은 특정 부분을 증폭할 수 있는 프라이머이다. 본 발명의 목질진흙버섯 검정용 프라이머는 상기 목질진흙버섯 특이 2.8 kb에 포함된 일련의 염기서열을 포함하는 단편 또는 2.8 kb를 포함하는 단편을 증폭할 수 있도록 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 목질진흙버섯 검정용 프라이머는 서열번호 2의 염기서열을 이용하여 제조할 수 있으며, PCR을 용이하게 실시하기 위하여 통상적인 최적 프라이머 제조방법을 근간으로 제조하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 목질진흙버섯 검정용 프라이머는 10 내지 40 mer를 포함하고, 프라이머내에 GC %가 45 내지 65 %인 것이 좋다. GC %가 45 미만인 경우 프라이머와 DNA간의 결합이 약한 문제가 있고, GC %가 65를 초과할 경우 프라이머와 DNA 간의 접촉이 어려운 문제점이 있다. 상기 프라이머는 서열번호 3의 PLSPF1 프라이머, 서열번호 4의 PLSPF2 프라이머, 서열번호 5의 PLSPR2 프라이머 또는 서열번호 6의 PLSPR1 프라이머가 바람직하며, PLSPF1 프라이머/PLSPR2 프라이머, PLSPF2 프라이머/PLSPR1 프라이머, PLSPF1 프라이머/PLSPR1 프라이머, PLSPF2 프라이머/PLSPR2 프라이머, 또는 상기 프라이머와 다른 프라이머를 한쌍으로 사용할 수 있다.

본 발명의 PCR을 이용한 목질진흙버섯 검정방법은 상기 프라이머를 이용하여 이루어지며, PCR 조건은 통상의 방법이 바람직하고, 프라이머의 특성에 따라 적절히 조절하여 실시가능하다. PCR에 사용되는 목질진흙버섯은 균사체 또는 자실체가 바람직하고, 상기 균사체 또는 자실체에서 DNA를 분리하여 PCR 하는 것이다.

본 발명의 목질진흙버섯 특이 DNA 단편은 다른 종의 진흙버섯 또는 버섯류에서는 검출되지 않아, 목질진흙버섯을 검정할 수 있는 마커로 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 PCR 검정법으로 상기 목질진흙버섯 특이 DNA 단편을 신속, 정확하게 증폭시켜 목질진흙버섯 진위여부를 쉽게 판별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

(1) 목질진흙버섯 특이 DNA 단편 검출

URP1F 프라이머(서열번호 1)를 이용하여 목질진흙버섯 5 균주(PL-2, PL-5, N9, WD1222, ATCC 26710)와 유사한 종인 페리누스 길브스(Phellinus gilvsATCC 26729), 페리누스 존슨니아누스(P. jhonsonianusKCTC 6654), 페리누스 투버쿨로시스(Phellinus tuberculosisKCTC 6656), 페리누스 이그니아리우스 피브이 이그니아리우스(Phellinus igniarius pv igniariusKCTC 6227), 페리누스 피니(P. pini), 페리누스 리그리칸스(P. rigricansCBS 213.48), 페리누스 웨이(P. weiiCNU 6017), 페리누스 이그니아리우스(P. igniarius),농가에서 재배되고 있는 장수상황버섯(Phellinussp.) 4균주(농공농산, 흥림농산, 부평종균, 안동버섯)를 대상으로 PCR 공정을 실시하였다.

DNA를 분리하기 위하여, 상기 버섯 균사들을 PDA(Difco사 제품) 고체배지에서 10일 배양하였고, 배지에 형성한 균총을 PD 브로스 액체배지에 옮겨 진탕배양(120 rpm)으로 균주에 따라 20일 내지 30일간 배양하였다. 배양된 균사체를 여지에 걸러낸 다음 동결건조하였다. 동결 건조한 균사체를 이쑤시개로 곱게 마쇄한 다음 100 ㎍를 1.5 ml의 시험관에 옮기고, 추출용 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5 % SDS) 400 ㎕와 프로테아제 K (20mg/ml)를 첨가하여 유리봉으로 완충액상에서 잘 혼합한 다음 37 ℃에서 1시간 동안 항온하였다. 상기 혼합액에 2 X CTAB 완충액을 동량 첨가하여 65 ℃에서 15분간 방치한 다음 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 넣고 철저히 혼합하였다. 이후 12,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 수거하였고, 0.7 부피배의 이소프로판올을 첨가하여 실온에서 10분간 둔 다음 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 침전된 DNA는 70 % 에탄올로 세척하고 진공건조한 다음 TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 ㎕에 용해하였다. 상기 용해물에 10 mg/ml RNase 2 ㎕를 넣어 37 ℃에서 30분 처리하여 RNA를 제거하였고, DNA는 아가로즈 젤(1.0 %)에 전기영동하여 정량된 DNA와 비교함으로서 정량하였다.

PCR 반응 총량은 50 ㎕으로 하였고, 각각의 버섯샘플로부터 분리한 DNA 50 ng와 4종류의 dNTP(각 2.5 mM), 텍 중합효소(Taq polymerase, 2.5 unit, Promega사 제품), 20 pmol URP1F 프라이머 및 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01 % 젤라틴)을 함유하게 하였다.

PCR은 PTC-200(MJ. Reasearch사)에서 실시하였고, 94 ℃에서 4분간 열 처리한 후 연쇄반응 34회(94 ℃, 1분(denaturing)-> 55 ℃, 1분(annealing)-> 72 ℃, 2분(DNA polymerization)) 실시하였다. PCR 증폭산물을 1.5 %의 아가로스 젤에서 전기영동하고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 DNA 다양성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, 폴라로이드사진으로 촬영하여 도 1에 나타내었다. 도 1의 M은 DNA 크기측정 마커(1 kb ladder)이고, 레인 1은 페리누스 길브스(Phellinus gilvsATCC 26729)이고, 레인 2는 페리누스 존슨니아누스(P. jhonsonianusKCTC 6654)이고, 레인 3은: 페리누스 투버쿨로시스(Phellinus tuberculosisKCTC 6656)이고 레인 4는 목질진흙버섯(PL-2)이고, 레인 5는 목질진흙버섯(PL-5)이고, 레인 6은 목질진흙버섯(N9)이고, 레인 7은 목질진흙버섯(WD1222)이고, 레인 8은 페리누스 이그니아리우스 피브이 이그니아리우스(Phellinus igniarius pv igniariusKCTC 6227)이고, 레인 9는 페리누스 리그리칸스(P. rigricansCBS 213.48)이고, 레인 10은 목질진흙버섯(ATCC 26710)이고, 레인 11은 페리누스 웨이(P. weiiCNU 6017)이고, 레인 12는 장수상황버섯(농공농산)이고, 레인 13은 장수상황버섯(흥림농산)이고, 레인 14는 장수상황버섯(부평종균)이고, 레인 15는 장수상황버섯(안동버섯)이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 사용한 모든 페리누르스 종들에서 서로 다른 DNA 다형성이 검출됨을 확인하였고, 따라서 이들 종간에 유전적 구성이 다르다는 것을 알 수 있다. 또한 목질진흙버섯 5 균주들(레인 4, 5, 6, 7, 10) 간에는 거의 유사한 DNA 밴드양상이 나타났으며, 특히 2.8 kb 크기에서 공통적인 밴드가 특이적으로 검출되었다.

(2) 클로닝

상기 특이밴드를 SUPREC TM-01 용출 키트(Takara 사 제품)로 정제하고, pGEM-T벡터(Promega사 제품)에 T4 라이게이즈로 삽입시켜 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환여부를 알아보기 위하여 X-gal(50 ㎍)을 포함하는 LB 고체배지(증류수 1 L에 트립톤 10 g, 효모 추출물 10 g, NaCl 5 g, 아가 15 g)에 도말하고, 16시간 배양하여 백색의 콜로니(colony)를 선별하여 LB 액체배지 3 ml에 16시간동안 진탕배양(rpm 200)하였다.

DNA단편(2.8 kb)이 pGEM-T 벡터에 삽입되어있는지 확인하기 위하여 플라스미드를 분리하였고(Wizard Plus SV minipreps DNA purification system, Promega), 분리한 플라스미드를 제한효소 EcoR I으로 절단하여 DNA단편의 삽입여부를 확인하였다. 이후 삽입이 확인된 플라스미드를 pPLSB(plasmid Phellinus linteus specific band)라고 명명하고, 특이적 DNA 단편을 PLSB라 명하였다.

[실시예 2] pPLSB의 염기배열분석 및 프라이머 제작

상기 실시예 1에서 분리한 목질진흙 특이 DNA 단편에 특이적인 프라이머 제작을 위하여, 상기 PLSB의 양 말단 염기서열을 분석하였다.

염기서열 분석은 BigDye 터미네이터(Perkin Elmer)에서 실시하였고, 총 10 ㎕ 반응액(BigDye 혼합액 4 ㎕, 0.5 ㎍의 pPLSB)을 제품회사가 제공한 방법으로 PCR로 반응시킨 다음 반응산물을 4 %의 아크릴아마이드 젤에 전기영동 하여 ABI PRISMTM 377 DNA 서열분석기(Perkin Elmer)으로 염기서열을 결정하였다. 서열번호 2는 실시예 1에서 분리한 목질진흙버섯 특이 DNA 단편으로, N 부분은 서열을 분석하지 못한 것이고, 5' 말단에서 376 bp, 3' 말단에서 440 bp를 확인하였다.

상기 서열번호 2의 염기서열을 근간으로 20 bp의 프라이머 한 쌍을 제조하였다. 프라이머는 컴퓨터 프로그램(Primer Designer V. 1.01, Scientific and educational software IBM 사 제품)을 이용하여 제조하였다.

도 2는 목질진흙검정용 프라이머의 결합부분을 나타낸 것으로, 서열번호 3은 PLSPF1(Phellinus linteusspecific primer forward 1) 프라이머이고, 서열번호 4는 PLSPF2(Phellinus linteusspecific primer forward 2) 프라이머이고, 서열번호 5는 PLSPR1(Phellinus linteusspecific primer reverse 1)프라이머이고, 서열번호 6은 PLSPR2(Phellinus linteusspecific primer reverse 2) 프라이머이다.

[실시예 3]

미국미생물보존센터인 ATCC(America Type Culture Collection),네덜란드 미생물균주보존센터인 CBS(Cetraalburea voor Schimmercultures), 한국생명공학연구소 미생물균주보존센터 KCTC(Korean Culture Center of Type Culture), 국내외 연구소, 대학 등에서 보존된 것을 분양받아 하기 실험에 사용하였다. 목질진흙버섯은 국내외의 다양한 지역으로부터 수집한 목질진흙버섯(ATCC 26710), 목질진흙버섯(IFO 6989), 목질진흙버섯(PL-2), 목질진흙버섯(PL-5), 목질진흙버섯(WD1222), 목질진흙버섯(N7),목질진흙버섯(N9) 로 총 7 균주를 사용하였다. 유사종으로는, 페리누스 길부스(ATCC 26729), 페리누스 존슨니아누스(KCTC 6654), 페리누스 피니(KCTC 6655), 페리누스 니그리칸스(CBS 213.48), 페리누스 크리솔로마(Phellinus chrysolomaKCTC 6225), 페리누스 스피쿨로서스(Phellinus spiculosusKCTC 6658), 페리누스 투버쿨로시스(Phellinus tuberculosisKCTC 6656), 페리누스 웨이(CNU6017), 페리누스 비스커스피다투스(Phellinus biscuspidatusKCTC 6651), 페리누스 이그니아리우스 바르 이르니아리우스(Phellinus igniariusvarigniariusKCTC6227), 페리누스 페레우스(Phellinus ferreusCBS 444.48), 페리누스 토룰로서스(Phellinus torulosusCBS 100117), 페리누스 프라그란스(Phellinusfragrans CBS 202.90), 페리누스 립스(Phellinus ribsCBS 175.29), 페리누스 웨리아누스(Phellinusweirianus CBS 618.89), 페리누스 시네레우스(Phellinus cinereusCBS 10016)로 16 종의 진흙버섯과, 농가에서 재배되고 있는 4점의 미 확인종인 진흙버섯 종을 사용하였다.

상기 종 들은 실시예 1의 방법으로 DNA를 분리한 다음 50 내지 100 ng의 DNA에 대하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응시 총 반응액은 50 ㎕이고, 2.5 mM dNTP(Promega 사 제품), 2.5 unit의 텍 중합효소(Promega 사 제품),각각20 pmol농도를 갖는 PLSPF2 프라이머/PLSPR1 프라이머 및 완충액(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01 % 젤라틴)을 포함한다. PCR 반응은 PTC-200(MJ. Reasearch사)로 실시하였고, PCR 반응조건은 하기 표 1과 같다.

변성단계	94 ℃, 4분	1회
연쇄반응	변성	94 ℃, 1분	35회 반복
	프라이머 결합	58 ℃, 1분
	DNA 중합	72 ℃, 3분

상기 방법으로 증폭된 PCR 산물은 1 %의 아가로스젤상에서 전기영동후 EtBr 염색으로 DNA 밴드양상을 확인하였고, 폴라로이드사진으로 촬영하여 도 3에 나타내었다. M은 DNA 크기 측정 마커(1 kb ladder)이고, 레인 1은 목질진흙버섯(ATCC 26710)이고, 레인 2는 목질진흙버섯(IFO 6989)이고, 레인 3은 목질진흙버섯(PL-2)이고, 레인 4는 목질진흙버섯(PL-5)이고, 레인 5는 목질진흙버섯(WD1222)이고, 레인 6은 목질진흙버섯(N7)이고, 레인 7은 목질진흙버섯(N9)이고, 레인 8은 장수상황버섯(농공농산)이고, 레인 9는 장수상황버섯(흥림농산)이고, 레인10은 장수상황버섯(부평종균)이고, 레인 11은 장수상황버섯(안동버섯)이고, 레인 12는 페리누스 길부스(ATCC 26729)이고, 레인 13은 페리누스 존슨니아누스(KCTC 6654)이고, 레인 14는 페리누스 피니(KCTC 6655)이고, 레인 15는 페리누스 니그리칸스(CBS 213.48)이고, 레인 16은 페리누스 크리솔로마(KCTC 6225)이고, 레인 17은 페리누스 스피쿨로서스(KCTC 6658)이고, 레인 18은 페리누스 투버쿨로시스(KCTC 6656)이고, 레인 19는 페리누스 웨이(CNU6017)이고, 레인 20은 페리누스 비스커스피다투스(KCTC 6651)이고, 레인 21은 페리누스 이그니아리우스 바르 이르니아리우스(KCTC 6227)이고, 레인 22는 페리누스 페레우스(CBS 444.48)이고, 레인 23은 페리누스 토룰로서스(CBS 100117)이고, 레인 24는 페리누스 프라그란스(CBS 202.90)이고, 레인 25는 페리누스 립스(CBS 175.29)이고, 레인 26은 페리누스 웨리아누스(CBS 618.89)이고, 레인 27은 페리누스 시네레우스(CBS 10016)이다.

도 3에서 나타난 바와 같이, 실시예 2의 PLSPF2 프라이머/PLSPR1 프라이머는 진흙버섯 중 목질진흙버섯(레인 1 내지 레인 7)에만 2.2 kb크기의 유전자 단편을 증폭시킴을 알 수 있었다.

따라서, PLSPF2 프라이머와 PLSPR1 프라이머는 목질진흙버섯만을 특이적으로검출하여 신속, 정확한 목질진흙버섯 판별 프라이머로 이용가능하다.

[실시예 4]

PLSPF2 프라이머와 PLSPR1 프라이머의 균체 조직별 PCR 증폭여부 확인

자실체와 균사체에서 각각 DNA를 분리한 후에 PLSPF2 프라이머와 PLSPR1 프라이머 쌍을 이용한 PCR증폭을 실시하였다. 자실체로부터의 DNA분리는 많은 다당류와 기타 PCR 저해물질로 인하여 PCR 수행시 의도된 PCR산물이 증폭되지 않는 경우가 많으며 DNA자체도 잘 분리되지 않아 문제점이 있다. 특히 진흙버섯 종은 대부분 건조한 상태에 있고, 조직이 매우 견고하여 자실체로부터의 DNA 분리가 매우 어려워, 새로운 DNA 분리 방법을 고안하고 본 실험에서 적용하였다. 목질진흙 DNA 분리방법은 다음의 순서로 실시하였다.

자실체의 조직을 날카로운 칼로 슬라이스로 자른 다음 질소가스로 마쇄하였다. 마쇄된 자실체 분말 200 ㎍을 1.5 ml의 시험관에 넣고, PBS 완충액(Phosphate-buffered saline: NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na₂HPO₄0.24 g, KH₂PO₄0.24 g/L, HCl로 pH7.4로 조정) 200 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 다음, 동량의 용혈완충액(Lysis buffer : 100 mM NaCl, 0.5 M Tris-HCl, pH 8.0, 10 % SDS)를 혼합하여 65 ℃ 수조에서 항온하였다. 1시간 후, 2 X CTAB 완충액(2 % CTAB(w/v), 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA(pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1 % PVP(polyvinylpyrrolidone) Mr 40,000)를 400 ㎕을 넣고, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 첨가하였다. 철저히 혼합한 후 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮기고, 0.7 부피배의 이소프로판올을 가한 다음 실온에서 10분간 방치하고, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 70 %의 에탄올로 DNA 침전물을 세척하여 진공 건조한 후, TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 ㎕에 용해하였다. 용해물에 10 mg/ml RNase 2 ㎕를 넣어 37 ℃에서 30분 처리하여 RNA를 제거하였으며, 2 X CTAB 완충액 100 ㎕를 다시 첨가, 혼합하여 65 ℃ 수조에서 30분동안 항온하였다. 항온 후 클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 200 ㎕를 넣고 혼합하여 원심분리하였다. 상등액을 취하고, 2.5 부피배의 99 %의 에탄올을 가한 다음 원심분리로 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA 펠렛을 70 % 에탄올로 세척하고 진공건조한 후 TE 완충액 100 ㎕에 녹여 정량하여 PCR에 이용하였다. PCR조건들은 실시예 3의 방법으로 실시하였다. 도 4의 균사체 및 자실체에서 DNA를 분리한 다음 PLSPF2 프라이머와 PLSPR1 프라이머로 PCR한 결과이고, 레인 1은 균사체에 대한 PCR 산물이고, 레인 2는 자실체에 대한 PCR 산물이다. 균사체 및 자실체를 이용한 PCR에서 모두 2.2 kb의 목질진흙버섯 특이밴드를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 방법으로 자실체에서 직접 목질진흙버섯의 진위 여부를 판별할 수 있게 되어, 신속하고도 저가의 비용으로 확인이 가능하게 되었다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 목질진흙버섯을 검정할 수 있는 특이 DNA 단편을 확인하고, 상기 특이 DNA 단편을 검출할 수 있는 방법 및 프라이머를 제공하여 목질진흙버섯(Phellinus linteus)의 진위여부를 신속, 정확하게 판별할수 있다.

Claims

서열번호 2의 서열중 1 에서 377번 위치의 염기서열을 5'말단으로 포함하고;

서열번호 2의 서열중 379 에서 817번 위치의 염기서열을 3'말단으로 포함하고; 및

전체 2.8 kb 길이를 갖는 서열번호 2의 목질진흙버섯 특이적 DNA 단편.
제 1항의 목질진흙버섯 특이적 DNA 단편의 존재유무를 PCR을 통하여 목질진흙버섯 균사체 또는 목질진흙버섯 자실체에서 확인함으로써 목질진흙버섯 진위여부를 결정하는 목질진흙버섯 검정방법.
목질진흙버섯으로 추정되는 시료의 DNA를, 서열번호 2의 서열중 1 에서 377번 위치의 염기서열에 특이적인 프라이머와, 서열번호 2의 서열중 379 내지 817번 위치의 염기서열에 특이적인 프라이머로 PCR을 실시하고;

상기 PCR 에 의한 증폭산물 생성여부를 확인하고; 및

상기 증폭산물이 생성된 경우 상기 시료는 목질진흙버섯인 것으로 판별하는 것을 포함하는 목질진흙버섯 검정방법.
제 3항에 있어서,

상기 서열번호 2의 서열중 1 에서 377번 위치의 염기서열에 특이적인 프라이머는, 서열번호 3 또는 4의 서열을 포함하는 프라이머이며; 및

상기 서열번호 2의 서열중 379 에서 817번 위치의 염기서열에 특이적인 프라이머는, 서열번호 5 또는 6의 서열을 포함하는 프라이머인 목질진흙버섯 검정방법.
서열번호 3 내지 6로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 목질진흙버섯 검정용 프라이머.
제 5항에 있어서, 상기 목질진흙버섯 검정용 프라이머는

서열번호 3 또는 4의 서열을 포함하는 프라이머와, 서열번호 5 또는 6의 서열을 포함하는 프라이머를 한쌍으로 포함하는 것인 목질진흙버섯 검정용 프라이머.
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