KR100408852B1

KR100408852B1 - 항암 효과가 있는 생약 조성물

Info

Publication number: KR100408852B1
Application number: KR10-2000-0057298A
Authority: KR
Inventors: 최용주; 황완균; 심상수; 성환길; 이상대
Original assignee: 최용주
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2003-12-06
Also published as: KR20020025462A

Abstract

본 발명은 상황(桑黃; 胡孫眼, Elfvinga) 및 시호(柴胡; Bupleuri Radix)의 추출물을 조합하는 것에 의해 항암 효과를 증진시킨 생약 조성물에 관한 것으로, 상황 및 시호를 50 % 메탄올로 추출하여 얻은 건조 엑스를 동량 혼합한 것을 특징으로 하는 본 발명의 생약 조성물은, 마우스의 복수암에 대하여 생명연장율을 현저하게 증가시키는 효과가 있으면서도 부작용이 없는 안전한 생약 제제로 경구적으로도 투여할 수 있으므로, 암환자에 대하여 단독으로, 또는 타약제와 병용하여 장기간에 걸쳐 암의 치료 또는 예방 목적으로 사용할 수 있다.

Description

항암 효과가 있는 생약 조성물{HERB COMPOSITION HAVING ANTI-CANCER EFFECT}

본 발명은 상황 및 시호 추출물을 포함하는 생약 조성물에 관한 것으로, 상황과 시호 추출물을 조합하는 것에 의해 항암 효과를 증진시킨 생약 조성물과 관련된다.

상황(桑黃; 胡孫眼, Elfvinga)은 담자균류(Basidiomycetes)의 다공균과(Polyporaceae)에 속하는 잔나비걸상(Elfvinga applanata(PERS) KARST.) 등의 자실체로서, 주로 뽕나무(Morus alba, Moraceae)의 줄기에 기생한다. 전체가 목질화되어 있는 편구형 또는 말굽 모양을 하고 있으며 갈색, 암회갈색 또는 흑색을 띤다. 어린 버섯에는 약간의 털이 있으나 성장하면서 없어지고, 등은 거북이 등 모양을 하며 껍질은 없다.

상황은 중국의 「약성론」에 처음 약으로서 수록이 되었으며, 상신(桑臣), 상이(桑耳)라는 별명으로 사용되기도 하였다. 성분으로는 다당류를 비롯하여 아가릭산(agaricic acid)이 약 4 % 포함되어 있고, 라릭산(laricic acid), 포화 지방산 (주로 C₂₂, C₂₄), 포화 탄화수소(C₂₃, C₂₅), 아미노산(글리신, 아스파르트산), 트리테르페노이드, 옥살산 및 에르고스테롤 등과, 그 밖에 당분해 효소도 함유되어 있다. 상황의 약성은 감(甘), 평(平)하며, 본초학적으로는 구어혈(驅瘀血), 지혈약으로서 혈붕(血崩), 혈림(血淋), 탈항(脫肛)으로 인한 출혈, 대하, 월경불순 등에 응용된다. 민간에서 상황은 늑막염, 페염, 감기 등의 열성병에 해열제로서 사용되고, 일본의 큐슈 지방에서는 심장병 및 반신불수 등에 민간약으로 사용되어 왔다.

최근 담자균류의 버섯 종류가 항암제 및 면역 증강제로서 각광을 받고 있는데, 특히 구름버섯(Coriolus versicolor)은 그 효과가 탁월한 것으로 알려져, 그 다당류가 항암제로 개발되어 일본에서는 크레스틴^R, 우리나라에서는 코포랑^R으로서 항암제 시장에서 매출 1 위를 기록하고 있다. 일본의 마에다(Maeta) 등은 이러한 사실에 착안, 각종 담자균류 및 식용 버섯에 대하여 사르코마 180(sarcoma 180)을이용한 항종양활성 실험을 실시한 결과, 상황버섯의 물추출물이 96.7 %, 송이버섯의 물추출물이 91.8 %로 우수한 종양억제율을 갖는 반면, 약으로 개발된 구름버섯의 경우에는 77.5 %에 불과한 것으로 나타났다.

이처럼 상황은 우수한 항암제로서의 가능성에도 불구하고, 그 연구가 체계화되어 있지 않을 뿐 아니라, 항암제로서 다양한 제형으로 개발되어 있지도 않다.

또한, 상황 이외에도 항암제로서의 효능이 언급되고 있는 몇 가지 민간 생약들이 있는데, 시호, 느릅나무, 꾸지뽕나무 등을 들 수 있다. 시호(柴胡; Bupleuri Radix)는 시호(Bupleurum falcatumL.), 참시호(Bupleurum scorzoneraefoliumWILLD.), 복시호(Bupleurum chinenseDC.) 등의 근(根)으로, 해열, 진통, 소염, 항병원, 청간, 승양 등의 효능이 있어 민간 및 한방에서 한열왕래, 흉협고만, 고혈압, 목현, 간염, 담낭염, 황달, 자궁하수, 탈항 등에 사용되고 있다.

현재 항암제로서는, 신속하게 증식하는 암세포에 대하여 세포독으로 작용하는 알킬화제로서 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide; Cytoxan, Endoxan), 엽산 길항제인 메토트렉세이트(Methotrexate), 핵산 염기의 길항제로 작용하는 머캡토푸린(Mercaptopurine)이나 플루오로우라실(Fluorouracil; 5-FU) 등, 그리고 방사성 동위원소(³²P,¹³¹I), 호르몬 제제, 일부 항생물질들도 사용되고 있다. 그러나, 이들 항암제로 사용되는 약제 대부분은 심각한 부작용 때문에 투약과 복용을 어렵게 만들고 있다.

본 발명에서는 이상과 같은 점을 고려하여, 항암 활성이 연구되고 있는 천연물질인 상황버섯에 한방이나 민간에서 사용되는 안전한 생약을 조합하여 항암 효과를 증진시킴으로써, 장기간 계속적으로 복용하여도 부작용이 없는 안전한 생약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 Raw 264.7 세포의 증식에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프,

도 2는 리포폴리사카라이드로 처리한 Raw 264.7 세포의 증식에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프,

도 3은 Raw 264.7 세포에서의 아질산염(NO) 생성에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프,

도 4는 리포폴리사카라이드와 인터페론으로 자극된 Raw 264.7 세포에서의 아질산염(NO) 생성에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항암 효과가 있는 생약 조성물은 상황 (桑黃; 胡孫眼, Elfvinga) 및 시호(柴胡; Bupleuri Radix)의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 상기 추출물은 상황 및 시호를 50 % 메탄올로 추출하여 얻은 건조 엑스를 동량 혼합한 것이 바람직하다.

본 발명은 항암 활성이 있는 것으로 알려진 상황버섯과, 한방이나 민간에서 사용되는 안전한 생약을 조합하여 사용함으로써, 상황의 항암 효과를 한층 증진시키도록 한 것이다.

이러한 본 발명의 조성물은 한방이나 민간에서 오래 전부터 사용되어 안전성이 확보된 상황과 시호 생약으로 이루어진 것이므로, 여타의 합성물질 항암제와는 달리 장기간 계속적으로 복용하여도 부작용이 없기 때문에 암의 치료 및 예방에도 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명의 생약 조성물은 상황 및 시호를 각각 잘게 분쇄한 후, 생약 중량의 10∼15 배의 50 % 메탄올을 가하여 1∼3 시간 동안 1∼3 회 가열 추출하고, 추출액을 모아 저온 농축 및 동결 건조하여 건조 엑스로 하고, 이들 건조 엑스를 동량 혼합하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 이 때, 각 생약의 건조 엑스의 양은 원료 생약의 비율, 추출액의 양 및 추출 시간 등에 따라 달라질 수 있지만, 통상적으로는 원료 생약 100 g에 대하여 상황은 약 8±2 g(수득율 6∼10 %), 시호는 약 12±2 g(수득율 10∼14 %)의 양으로 얻어진다. 또한, 본 발명의 생약 조성물은 상황 및 시호를 먼저 동량 혼합한 후 용매를 넣고 추출, 농축 및 건조하는 방법에 의해서도 제조될 수 있다.

이와 같이 제조된 본 발명의 생약 조성물은 필요에 따라 통상의 부형제와 혼합되어 통상의 산제, 과립제, 캅셀제 및 정제 등의 제법에 따라 각각의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 생약 조성물은 성인의 경우 1 일 10∼1000 ㎎/㎏, 바람직하게는 25∼100 ㎎/㎏의 양을 1∼3 회에 나누어 경구 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예에서는 상황과 시호 외에도 비교 목적으로 느릅나무 수피와 꾸지뽕나무 수피를 동일하게 건조 엑스로 제조하여 효과 실험에 사용하였다.

실시예: 생약 조성물의 제조

상황은 5 ㎏을 직접 재배지에서, 느릅나무 수피와 꾸지뽕나무 수피는 각각 3.7 ㎏ 및 3.1 ㎏을 공동연구자로부터, 그리고 시호는 4 ㎏을 국일무약으로부터 공급받았다.

이들 생약을 정밀하게 달아 각각에 대하여 10∼15 배의 50 % 메탄올을 가해서 2 시간씩 2 회 환류추출한 후 각각을 저온 농축하고, 농축된 엑스를 각각 동결건조하여 상황 엑스 383.5 g(7.7 %), 느릅나무 수피 엑스 472 g(12.8 %), 꾸지뽕나무 수피 엑스 366.1 g(11.8 %), 및 시호 엑스 500 g(12.5 %)을 얻었다.

각각의 생약 엑스를, ① 상황, ② 상황+느릅나무 수피, ③ 상황+꾸지뽕나무 수피, ④ 상황+시호 엑스로 동량씩 조합하여 다음 생리활성 시험에 사용하였다.

양성 대조약물로는, 한국신약의 상황 균사체 배양액 제제인 메시마 엑스를 사용하였다.

효과 시험예: 생리활성 실험

(1) 복수암에 대한 항암 실험

마우스 복수형 암종인 사르코마(sarcoma)-180 종양세포를 HBSS(Hank's balanced salt solution)으로 세척하고, 0.1 ㎖(10⁶세포)를 ICR 마우스 복강 내에 주사하여 1 주일 간격으로 계대배양하였다. 복강에서 채취한 사르코마-180 세포를 원심분리한 후 HBSS 용액으로 세척하여 복수암 발생에 사용하였다(Park JH,et al., Antitumor activity of the extract of Unripe cotton ball.Yakhak Hoeji 43,23-27, 1999).

1 주일 동안 안정화시킨 5주령의 ICR 마우스(약 20 g)에 사르코마-180 세포 0.1 ㎖(10⁷세포/㎖)를 복강내 주사하였다. 복강 주사후 24 시간이 경과한 후에 10 일 동안 위 ①, ②, ③, ④ 생약 엑스와 양성 대조약물을 각각 25, 50, 100 ㎎/㎏의 농도로 경구투여하였다.

시료의 항암 효과는, 대조군과 비교하여 평균 생존일수와 평균 생존일수 연장율을 계산하여 결정하였다. 즉,

생존일수 연장율(%)=(투여군의 평균 생존일수/대조군의 평균 생존일수)×100

실험값은 평균±표준편차로 표시하였으며, 실험성적은 t-검정(non-paired Student's test)으로 분석하였으며, P 값이 5 % 미만일 때 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

표 1은 사르코마-180으로 발생시킨 마우스 복수암에 대한 상황 추출물 등의 영향을 생존일수 연장율(%)로 나타낸 것이다.

군	투여량(㎎/㎏)	실험동물수	생존일수(일)	생존일수 연장율(%)
대조군	-	6	23.8±2.3	100
양성 대조군	100	6	30.5±1.9 a	128
상황	2550100	6	25.2±2.028.3±2.3 a31.0±3.2 a	106119130
상황+꾸지뽕나무	2550100	6	24.0±2.226.8±2.631.8±3.2 a	101113134
상황+느릅나무	2550100	6	25.3±2.328.2±2.6 a32.0±3.3 a	106118134
상황+시호	2550100	6	25.8±2.430.3±2.3 a34.2±2.6 a	108127143

a; P<0.05, 대조군과 유의적으로 차이.

ICR 마우스에 사르코마-180 세포 10⁶개를 복강 주사한 결과, 평균 수명은 23.8±2.3일, 생존기간은 21일 내지 27일로 나타났다. 항암 효과가 있는 것으로 알려진 메시마 엑스(한국신약)를 양성 대조군으로 사용한 결과, 100 ㎎/㎏ 투여시 생명연장율이 28 %나 증가하였다. 상황 엑스를 25, 50 및 100 ㎎/㎏ 투여한 결과 평균수명은 각각 25.2±2.0, 28.3±2.3, 및 31.0±3.2일로 농도의존적으로 생명연장율이 증가하였다. 특히 양성 대조군과는 같은 농도인 100 ㎎/㎏에서 비교할 때 항암 효과에 따른 생명연장율이 2 % 높았다.

또한, 민간에서 항암치료요법에 사용하는 꾸지뽕나무 수피 엑스를 상황 엑스와 조합하여 25, 50 및 100 ㎎/㎏ 투여한 결과, 평균수명이 각각 24.0±2.2, 26.8±2.6 및 31.8±3.2일로 역시 농도의존적으로 생명연장율이 증가하였으며, 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 상황 단독투여군보다 4 % 높게 나타났다.

느릅나무 수피 엑스를 상황 엑스와 조합하여 25, 50 및 100 ㎎/㎏ 투여한 결과, 평균수명이 각각 25.3±2.3, 28.2±2.6 및 32.0±3.3일로 역시 농도의존적으로 생명연장율이 증가하였으며, 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 상황 단독투여군보다 4 % 높게 나타났으며, 상황과 꾸지뽕나무 수피 엑스 혼합 투여군과는 비슷하게 나타났다.

한편, 시호 엑스를 상황 엑스와 조합하여 25, 50 및 100 ㎎/㎏ 투여한 결과, 평균수명이 각각 25.8±2.4, 30.3±2.3 및 34.2±2.6일로 역시 농도의존적으로 생명연장율이 증가하였으며, 50, 100 ㎎/㎏ 투여군에서 모두 상황 단독 투여군보다 생명연장율이 높게 나타났다. 특히 다른 투여군과 비교할 때, 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 양성 대조군보다 15 %, 상황 단독 투여군보다 13 %, 꾸지뽕나무 수피 엑스나 느릅나무 수피 엑스 병용 투여군보다 9 % 이상 생명연장율이 높은 것을 알 수 있다.

(2) Raw 264.7 세포 증식에 미치는 영향

마우스 단핵구 기원의 Raw 264.7을 이용하여 본 발명의 생약 조성물이 세포증식 및 NO(nitrite) 생성에 미치는 영향을 관찰하였다.

세포 배양은, 10 % 우태아혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 Raw 264.7 세포를 10⁶세포/㎖로 분산시킨 후 96웰 플레이트에 200 ㎕ 씩 분주하여 2 시간 동안 배양하여 시행하였다.

① 세포증식 측정

Raw 264.7 세포를 10 % 우태아혈청을 함유한 DMEM 배양액에서 증식시킨 후 생약 조성물을 처리하였을 때, 0.5 ㎍/㎖ 리포폴리사카라이드에 의한 Raw 264.7 세포의 증식이 억제되는지를 관찰하였다.

즉, Raw 264.7 세포를 10⁴세포/㎖로 균질화한 후 200 ㎕씩 96웰 플레이트의 각 웰에 소분하였다. 여기에 위 ①, ②, ③, ④ 생약 엑스와 양성 대조약물을 각각 1, 3, 10 및 30 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 5 % CO₂배양기에서 72 시간 배양한 후, 차가운 50 % 트리클로로아세트산 50 ㎕를 가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 방치하여 세포를 플레이트에 완전히 고정시켰다. 다음에, 증류수로 4 회 세척한 후, 1 % 아세트산에 0.4 %로 용해시킨 설포로다민 B(SRB) 용액을 가하여 30 분 동안 염색하고 0.1 % 아세트산으로 5 회 반복 세척하였다. 세포와 결합된 SRB는 10 mM 트리스 염기(pH 10.5)에 녹여 564 nm에서 흡광도를 측정하였다(Skehan P,et al., New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening.J. Natl. Cancer Inst. 82,1107-1112, 1990). 세포의 생존율은 리포폴리사카라이드(LPS)만을 처리한 대조군에 대한 %로 표기하였다.

도 1은 Raw 264.7 세포의 증식에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프이고, 도 2는 리포폴리사카라이드로 처리한 Raw 264.7 세포의 증식에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 양성 대조군(메시마 엑스 투여군), 2는 상황 엑스 단독 투여군, 3은 상황과 꾸지뽕나무 수피 엑스 혼합 투여군, 4는 상황과 느릅나무 수피 엑스 혼합 투여군, 그리고 5는 상황과 시호 엑스 혼합 투여군을 나타낸다.

도 1에서 보면 LPS를 처리하지 않은 실험군에서 상황은 낮은 농도(1, 3, 10 ㎍/㎖)에서는 Raw 264.7 세포의 증식을 증가시켰으나 30 ㎍/㎖에서는 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 도 2에서 보면 LPS를 처리한 실험군은 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포 증식이 77.5 % 증가하였다. LPS 처리한 실험군에서 상황은 농도 의존적으로 Raw 264.7 세포의 증식을 억제하였으며, 양성 대조군인 메시마 엑스 역시 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였다. 상황에 꾸지뽕나무 수피 엑스, 느릅나무 수피 엑스 또는 시호 엑스를 병용 투여한 군에서는, 상황 단독 투여군에 비하여 유의적인 차이가 발견되지 않았다.

이러한 결과로 볼 때, LPS가 없는 상태에서 상황은 Raw 264.7 세포를 미약하나마 자극하는 작용을 하지만, 외인적인 자극에 의한 Raw 264.7 세포의 증식은 억제하는 것으로 보인다.

② NO(nitrite)의 측정

마크로파지(macrophage)의 활성이 증가하면 NO의 생성이 증가하는 것을 이용하여 간접적으로 마크로파지의 활성을 측정하였다.

즉, 분리한 마크로파지를 24웰 플레이트에 10⁶세포로 분주한 후, LPS 0.5 ㎍/㎖와 γ-IFN 10 units/㎖를 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누고, 이들을 생약 조성물을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 다시 나누어, 37 ℃, CO₂-배양기에서 24 시간 배양하였다. 생성된 NO는 그리스(Griess) 시약으로 측정하였다(Eun JS,et al., A suppressive component on phagocytosis of murine peritoneal macrophage in Aurantii immaturi pericarpium,Yakhak Hoeji 42, 567-571, 1998). 즉, 배지 100 ㎕와 그리스 시약(Griess reagent; 5 % 인산 중 1 % 술아닐아미드 (sulanilamide) 50 ㎕ + 0.2 % N-나프틸에틸렌디아민 2HCl 50 ㎕) 100 ㎕를 혼합하여 96웰 플레이트에 넣고, 540 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 측정한 후, 미리 작성한 NaNO₂검량선을 이용하여 NO 양을 측정하였다.

도 3은 Raw 264.7 세포에서의 아질산염(NO) 생성에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프이고, 도 4는 리포폴리사카라이드와 인터페론으로 자극된 Raw 264.7 세포에서의 아질산염(NO) 생성에 대한 상황 추출물 등의 효과를 농도별로 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 양성 대조군(메시마 엑스 투여군), 2는 상황 엑스 단독 투여군, 3은 상황과 꾸지뽕나무 수피 엑스 혼합 투여군, 4는 상황과 느릅나무 수피 엑스 혼합 투여군, 그리고 5는 상황과 시호 엑스 혼합 투여군을 나타낸다.

도 3 및 도 4에서 보면, Raw 264.7 세포는 아무 자극이 없는 상태에서 5.7±3.8 μM의 NO를 생성하지만, LPS 0.5 ㎍/㎖와 γ-IFN 10 units/㎖를 투여한상태에서는 24.5±2.7 μM의 NO를 생성하여 4.3 배 증가한 것을 알 수 있다. 상황은 자극제의 유무에 상관 없이 Raw 264.7 세포에서 NO의 생성을 농도의존적으로 증가시켰으며, 양성 대조군인 메시마 엑스도 농도의존적으로 NO의 생성을 증가시켰다. 또한, 상황에 꾸지뽕나무 수피 엑스, 느릅나무 수피 엑스 또는 시호 엑스를 병용 투여한 군에서도, 농도의존적으로 NO의 생성을 증가시켰으나, 상황 단독 투여군에 비하여 유의적인 차이는 발견되지 않았다.

즉, 상황은 농도의존적으로 마크로파지(macrophage)의 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 항암 활성이 있는 것으로 알려진 상황버섯과 시호의 추출물을 조합한 본 발명의 생약 조성물은, 마우스의 복수암에 대하여 생명 연장율을 현저하게 증가시키는 효과가 있으면서도 부작용이 없는 안전한 생약 제제로 경구적으로도 투여할 수 있으므로, 암환자에 대하여 단독으로, 또는 타약제와 병용하여 장기간에 걸쳐 암의 치료 또는 예방 목적으로 사용할 수 있다.

Claims

상황(桑黃; 胡孫眼, Elfvinga) 및 시호(柴胡; Bupleuri Radix)의 추출물을 포함하는, 항암 효과가 있는 생약 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 상황 및 시호를 50 % 메탄올로 추출하여 얻은 건조 엑스를 동량 혼합한 것인 조성물.
상황 및 시호를 각각 잘게 분쇄하고;

상황 및 시호 중량의 10∼15 배의 50 % 메탄올을 가하여 1∼3 시간 동안 1∼3 회 가열 추출하고;

상기 추출액을 모아 저온 농축 및 동결 건조하여 건조 엑스로 하고; 그리고,

상기 상황과 시호의 건조 엑스를 동량 혼합하는 단계를 포함하는,

항암 효과가 있는 생약 조성물의 제조 방법.