CN101838337B - 一种由25个果糖和1个葡萄糖构成的果聚糖 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由25个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成的果聚糖,同时提供了以湖北麦冬为原料制备该果聚糖的方法。本发明果聚糖对2型糖尿病小鼠血糖有显著的降低作用,同时改善对2型糖尿病小鼠的糖耐量;显著增强胰岛素受体(InsR)、胰岛素低物(IRS-1)及蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达,进而促进葡萄糖转化为糖原,促使6-磷酸葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酶的活性增强,从而显著降低胰岛素抵抗作用。
Description
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是与遗传因素有关,又与多种环境因素相关的慢性全身性多发病,是因胰岛素分泌或利用不足而引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的综合症,中医属于“消渴病”的范畴。我国糖尿病患病率正逐年上升,尤以2型糖尿病(non-insulin-dependentdiabetes mellitus,NIDDM)急剧上升为主,但目前国内外还没有理想的治疗药物。目前临床所使用的治疗糖尿病的化学药物多具有严重的不良反应,长期服用需要加量并有继发失效的可能,尤其是不能有效地控制慢性并发症。而中医药具有易于接受、毒副作用小、适合对糖尿病长期控制等特点,在有效预防和缓解糖尿病及其并发症、提高胰岛素敏感性方面具有化学药物不可替代的优势,引起医学界的越来越多的关注。
湖北麦冬【Liriope spicata(Thund.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma】为湖北省道地药材和特有物种,药用其块根,以“山麦冬之名收载于《中国药典》,是常用中药麦冬的主流品种,国家卫生部公布其为“药食同源”品种。湖北省具有独一无二的资源优势,其资源丰富,产量近万吨,市场占有率高,约占全国中药麦冬市场量的50%。
发明内容
本发明的任务是提供一种果聚糖,同时提供该果聚糖的制备方法和应用。本发明的另一个任务是提供该果聚糖在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。本发明的又一个任务是提供含有该果聚糖的药物组合物。
本发明提供的果聚糖是由25个果糖和1个葡萄糖构成的,其结构式如以下式(I)所示:
其中G为α-D-葡萄糖,A、B、C、D、E为β-D-果糖。
本发明提供的果聚糖是由25个β-D-果糖和1个α-D-葡萄糖构成,其主链是以1、2链接的果糖残基构成,其有6个重复单元,每个单元包含2个1、2位连接的双取代果糖残基、1个1、2、6位连接的三取代果糖残基和1个2位连接的单取代果糖残基;多糖主链的一个末端以2位羟基与1个α-D-葡萄糖的1位羟基链接成苷,另一个末端以1位羟基与1个β-D-果糖的2位羟基链接成苷。
以湖北麦冬为原料制备本发明果聚糖的方法包括以下步骤:
A.取湖北麦冬块根,经粉碎制成原药材粉;取1重量份的原药材粉,加10倍药材重量的水,煎煮3次,第一次加4倍量水,第二次加4倍量水,第三次加2倍量水,每次煮沸30分钟,合并水煎液;
B.用磷酸盐缓冲液调节水煎液的pH至6,用蛋白水解酶酶解,然后煮沸5分钟,4℃静置12小时以上,抽滤去沉淀,保留滤液;
C.将滤液装入截留分子量为1000透析袋,用自来水透析1天,蒸馏水再透析1天,将袋内多糖液减压浓缩至浓度为1.5g/mL,加无水乙醇至乙醇体积分数为80%,4℃静置12小时以上,倾去上清液,沉淀减压干燥得湖北麦冬总多糖;
D.取湖北麦冬总多糖加5倍水溶解,上用20倍总多糖重量的填料装成的DEAE-纤维素52层析柱,柱高∶柱直径=10∶1,用2.5倍柱体积的蒸馏水洗脱,用苯酚-硫酸比色法检测是否洗脱完全,洗脱完全后收集洗脱液;
E.将洗脱液浓缩成浓度为每毫升溶液含有1g原药材粉,上用20倍总多糖重量的填料装成的AB-8大孔树脂柱,柱高∶柱直径=6∶1,用3倍柱体积的蒸馏水洗脱,洗脱至洗脱液苯酚-硫酸比色程阴性结果为止,再用3倍柱体积的30%的乙醇水溶液洗脱至苯酚-硫酸比色法检测洗脱完全,收集乙醇洗脱部位,减压浓缩、冷冻干燥得本发明果聚糖。
步骤B中所述的蛋白水解酶可以是木瓜蛋白酶或胰蛋白酶,所述的用蛋白水解酶酶解的具体方法是:加入0.005倍药材重量的活性为12u/mg的木瓜蛋白酶,在45℃水浴条件下酶解2小时。
本发明果聚糖可用于制备治疗II型糖尿病的药物,以本发明果聚糖为有效成分,加上药剂学上可接受的添加剂、赋型剂和/或载体,可制成治疗II型糖尿病的药剂,如胶囊、片剂等。
实验资料
1.实验材料
1.1仪器
DZX-3型真空干燥箱,Cary 100型紫外可见分光光度计(美国Varian),透析袋(美国SPECTRUM),怡成超越JPs-5型手持式快速全血葡萄糖测试仪(北京怡成生物电子技术有限公司),怡成虹吸血糖试条(北京怡成生物电子技术有限公司,生产批号:20071210),GC-1200γ放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司),Aeroset全自动生化分析仪(日本TOSHIBA公司),CHRIST2-4冻干机,高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统(HPIAS-1000),HP1100高效液相色谱仪(美国HP公司),Model 300S蒸发光散射检测器(美国Softa),G4000PWXL高效凝胶色谱柱(日本TOSOH公司),VERTEX 70 FT-IR(德国Bruker公司),DB-5弹性石英毛细管柱(美国Agilent科技),福立GC9790气相色谱仪(浙江福立分析仪器有限公司),Aglient 6890N5975型气质联用仪(GC-MS),Varian Unity Inova-600核磁共振仪(美国),其余设备均为实验室常用仪器。
1.2试药
湖北麦冬产于湖北省襄樊市欧庙镇湖北麦冬药材基地,并经本室陈家春教授鉴定为湖北麦冬的干燥块根。木瓜蛋白酶(12u/mg,广西杰沃利生物公司),罗格列酮(葛兰素史克(天津)有限公司,批号:国药准字H20020475),链脲佐菌素STZ(sigma,批号:SO130),胰岛素放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所,批号:080520),DEAE-纤维素52(Sigma分装),大孔树脂AB-8(武汉创新试剂),InsR(北京博奥森,批号:bs-0681R)、IRS-1(北京博奥森,批号:bs-072R)、PI-3K(北京博奥森,批号:bs-0128R),NADP(Amresco,批号:0760),三磷酸腺苷二钠(Amresco,批号:H10271),6-磷酸葡萄糖脱氢酶(sigma,批号:G8529),葡萄糖-6-磷酸二钠盐(sigma,批号:A3789),葡聚糖Dextran D-1、T-5、T-10、T-40、T-70(Pharmacia),六甲基二硅氮烷(上海化学试剂采购供应五联化工),三甲基氯硅烷(上海飞样化工),其余试剂均为分析纯。
1.3动物
BABL/c小鼠,体重17-19g。由湖北省疾病预防控制中心提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2003-0005。
2型糖尿病动物模型的建立:选健康BABL/c小鼠进行造模用高脂高糖饲料(基础饲料中加入20%蔗糖,10%蛋黄粉,10%熟猪油,1%胆固醇,0.5%脱氧胆酸钠)饲喂4周,然后在禁食24h后,ip链脲佐菌素40mg/kg,两周后测血糖,血糖值大于7.8mmol/L且胰岛素抵抗指数高于正常小鼠平均水平的小鼠即为2型糖尿病小鼠,高脂高糖饲料喂养2周后用于实验。
2实验方法与结果
2.1本发明果聚糖的制备
取湖北麦冬块根,经粉碎制成原药材粉;取原药材粉1重量份,加10倍药材重量的水,煎煮3次,第一次加4倍量水,第二次加4倍量水,第三次加2倍量水,每次煮沸30分钟,合并水煎液;用磷酸盐缓冲液调节水煎液的pH至6,加入0.005倍药材重量的活性为12u/mg的木瓜蛋白酶,在45℃水浴条件下酶解2小时,然后立即煮沸5分钟,4℃静置12小时以上,抽滤去沉淀,保留滤液;将滤液装入截留分子量为1000透析袋,用自来水透析1天,蒸馏水再透析1天,将袋内多糖液减压浓缩至浓度为1.5g/mL,加无水乙醇至乙醇体积分数为80%,4℃静置12小时以上,倾去上清液,沉淀减压干燥得湖北麦冬总多糖,得率为原药材粉重量的22.4%;取湖北麦冬总多糖加5倍水溶解,上用20倍总多糖重量的填料装成的DEAE-纤维素52层析柱,柱高∶柱直径=10∶1,用2.5倍柱体积的蒸馏水洗脱,用苯酚-硫酸比色法检测是否洗脱完全,洗脱完全后收集洗脱液;将洗脱液浓缩成浓度为每毫升溶液含有1g原药材粉,上用20倍总多糖重量的填料装成的AB-8大孔树脂柱,柱高∶柱直径=6∶1,用3倍柱体积的蒸馏水洗脱,洗脱至洗脱液苯酚-硫酸比色程阴性结果为止,再用3倍柱体积的30%的乙醇水溶液洗脱至苯酚-硫酸比色法检测洗脱完全,收集乙醇洗脱部位,减压浓缩、冷冻干燥得本发明果聚糖,得率为原药材粉重量的12.3%。
本发明采用木瓜蛋白酶酶解粗多糖以除去蛋白类杂质,所得本发明果聚糖的水溶液在260nm和280nm处无吸收峰,证实其除蛋白彻底,且不含核酸,见图1和图2。(图1和图2分别为木瓜蛋白酶酶解前的湖北麦冬水煎液和木瓜蛋白酶酶解后的本发明果聚糖紫外扫描图。)本发明首次采用DEAE-纤维素52柱结合AB-8大孔树脂柱对多糖进行分离,分离效果显著。
2.2急性毒性试验
20-24g健康BABL/c小鼠用于急性毒性(24h)试验,分为3组(雌雄各5只),每组一次性给予本发明果聚糖400、800和1500mg/kg。连续地记录所用外在形态、行为、神经、自律变化和毒性效应等。
结果:给药后24h内小鼠的行为正常,没有观察到任何毒性反应和死亡,说明本发明果聚糖无急性毒性,安全性好。
2.3本发明果聚糖对2型糖尿病小鼠血糖的影响
取40只2型糖尿病小鼠,按空腹血糖水平随机分成4组,每组10只,阳性对照组灌胃给与罗格列酮(标准的治疗2型糖尿病的上市药物)2mg/kg;本发明果聚糖高低剂量组分别按200、100mg/kg剂量给药;模型对照组灌胃给予同体积0.9%氯化钠溶液;另将10只正常小鼠设为健康组,给予同体积0.9%氯化钠溶液。灌胃体积0.2ml/10g,2次/d,即每天上午9:00和下午4:00各1次,将连续给药9、15、21、和28天后的小鼠禁食过夜,第二天上午9:00测定尾静脉血糖值。采用t检验评价显著性差异。结果见表1。
表1给药前后小鼠空腹血糖值(mmol/L)
与模型对照组比P<0.05*,P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★
实验证明,在给药9、15、21、28天后,高低剂量组的本发明果聚糖对糖尿病小鼠均有显著的降血糖作用,且高低剂量作用强度相当,给药28天后糖尿病小鼠的血糖基本恢复正常;通过与阳性药罗格列酮组比较,本发明果聚糖高低剂量组降糖速度及强度都和罗格列酮组无统计学差异。
2.4本发明果聚糖对糖尿病小鼠糖耐量的影响
将3.2.3项下给药14天后的小鼠禁食过夜,各组小鼠腹腔注射葡萄糖50mmol/kg,给予葡萄糖0,30,60,120min后用怡成超越血糖仪测血糖,根据血糖值绘制血糖变化图,结果见图3。
实验证明,给药28天后,高低剂量的本发明果聚糖对改善2型糖尿病小鼠的糖耐量有明显的改善作用,且高低剂量作用强度相当,均与阳性药罗格列酮组作用效果无统计学差异。
2.5本发明果聚糖对糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响
将3.2.3项下给药28天后的小鼠禁食过夜,取眼内眦血,离心取血清保存。一部分血清采用放免法测胰岛素浓度并计算胰岛素抵抗指数(空腹血糖(FBS)×空腹胰岛素(INS)/22.5),胰岛素抵抗指数对数转换后采用t检验评价显著性差异。结果见表2。
表2给药28d后小鼠胰岛素抵抗指数
与模型对照组比P<0.05,*P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★
实验证明,给药28天后,高低剂量的本发明果聚糖对糖尿病小鼠均有降低胰岛素抵抗的作用,且高低剂量作用强度相当,均与阳性药罗格列酮组作用效果无统计学差异。
2.6本发明果聚糖对糖尿病小鼠血脂浓度的影响
将上述另一部分血清采用全自动血液生化分析仪做血脂浓度检测,采用t检验评价显著性差异。结果见表3。
表3给药28d后小鼠血脂浓度水平
与模型对照组比P<0.05,*P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★
实验证明,给药28天后,高低剂量的本发明果聚糖对糖尿病小鼠均有降低血总胆固醇和甘油三酯的作用,其作用效果较罗格列酮好。同时,高低剂量的本发明果聚糖都能显著增加高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值,使之恢复正常,其效果较罗格列酮好。故推测本发明果聚糖能有效的防治动脉硬化和血栓形成。
2.7本发明果聚糖抗糖尿病机理的研究
给药28天后的小鼠眼内眦取血,取血后将小鼠处死,取出肝和肾。肾脏分两份,一份用多聚甲醛固定,用以免疫组织化学分析胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体低物-1(IRS-1)及蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)的表达(定性分析),另一份-80℃冰冻用以采用免疫印迹法(Western blotting)对InsR、IRS-1及PI-3K进行定量分析;肝脏分3份冰冻在-80℃冰箱里,用于分析肝葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性及肝糖原含量。
2.7.1本发明果聚糖对糖尿病小鼠肾脏胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体低物-1(IRS-1)及蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)的影响
免疫组化分析:采用经典的SP法。免疫组化图像分析应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统(HPIAS-1000),经标准灰度校正后,随机取5个视野,分别观察InsR、IRS1、PI-3K的分布区域和分布密度。以上免疫组化检测采用盲法。结果见图4。
Western blotting:采用常规免疫印迹法对InsR、IRS-1、PI-3K进行分析。采用Gel-Pro Analyzer4.0对InsR、IRS-1、PI-3K和(参比蛋白)斑点进行灰度值分析,InsR、IRS-1、PI-3K灰度值分别与β-actin的灰度值进行比较来定量。结果见图5和表4。
表4:InsR、IRS-1、PI-3K的Western blotting数据
与模型对照组比P<0.05,*P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★
结果分析:3.2.5项已经证实,本发明果聚糖有显著改善胰岛素抵抗的作用。所以,本实验研究本发明果聚糖对胰岛素信号转导的影响,进而推测其改善胰岛素抵抗及抗糖尿病的机理。2型糖尿病胰岛素信号转导障碍可以发生在受体前水平、受体水平以及受体后水平三个不同的层次。胰岛素经血液循环到达相应靶组织后,与其上的胰岛素受体(InsR)结合,导致InsR自磷酸化;磷酸化的InsR可致胰岛素受体底物-1(IRS-1)磷酸化;IRS-1被磷酸化后能募集并激活蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K),使信号以激酶链式反应下传,最后促使葡萄糖代谢酶酶、糖原合成酶及糖异生酶等活性发生改变,最终起到降血糖作用。所以当信号径路中的任意一个信号分子或环节发生障碍或异常是均可导致糖尿病。
本实验对InsR、IRS-1及PI-3K三个不同的层次进行研究。在免疫组化图片中,小鼠肾组织出现棕黄色物质为阳性结果。结果表明,健康组及给药各组肾组织InsR、IRS-1、PI-3K均分布于肾小管上皮细胞胞浆中,着色强;模型对照组InsR、IRS-1、PI-3K上述部位染色均较健康组和其他给药组弱;说明本发明果聚糖及罗格列酮均可以明显改善InsR、IRS-1、PI-3K这三种信号因子的调节从而起到降低血糖的作用。Western blotting定量的数据分析结果表明,模型对照组小鼠肾组织的Ins-α、IRS-1、PI-3K表达水平均明显低于正常组,表达改变呈同向性。这说明2型糖尿病小鼠的InsR-α、IRS-1、PI-3K表达水平降低,胰岛素信号转导在受体和受体后环节障碍。同时,阳性对照组及各给药组的InsR-α、IRS-1、PI3K的表达水平均明显高于模型对照组,表达改变呈同向性。这说明本发明果聚糖及罗格列酮均能有效增加Ins-α、IRS-1、PI-3K的表达水平。其作用机制可能是通过增加靶组织InsR-α表达,改善其对胰岛素的敏感性从而改善胰岛素受体和受体后环节信号转导,来治疗2型糖尿病的。其中,本发明果聚糖高低剂量组增强InsR表达的效果比罗格列酮更强。
2.7.2本发明果聚糖对对糖尿病小鼠肝葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性及肝糖原含量的影响
葡萄糖激酶活性的测定:精密称取大鼠肝约0.1g剪碎,加9倍体积的匀浆液匀浆,匀浆液经4℃(900×g)离心10min,弃去抗淀,取上清液进行酶反应以测葡萄糖酶活性。检测原理是葡萄糖激酶使反应中NADP被还原生成NADPH,NADPH的产量与样品中葡萄糖激酶活性呈正相关,NADPH在340nm处有一吸收峰,故通过吸光度的增加可间接反应酶活性。结果见表5。
葡萄糖-6-磷酸酶活性的测定:精密称取0.1g肝组织,以5倍体积蔗糖溶液制成匀浆,粗匀浆于4℃高速离心(11000×g),上清液用于酶反应以检测酶活性。酶反应原理是葡萄糖-6-磷酸酶能使葡萄糖-6-磷酸二钠盐水解生成无机磷酸盐,通过测无机磷酸盐生成速度间接检测酶活性(采用钼酸铵法测定无机磷含量)。结果见表5。
肝糖原含量的测定:精密称取0.1g肝组织,放入盛有5倍体积的30%KOH溶液的试管中,置沸水浴中煮30分钟,取出后冷却,离心(11000×g),上清液加无水乙醇至乙醇终浓度为80%,离心(900×g),沉淀蒸馏水溶解并定容为25mL,用以检测肝糖原含量。检测原理是浓H2SO4使糖原脱水生成糠醛衍生物,后者再和蒽酮作用形成蓝色化合物,此蓝色化合物620nm处有强吸收,通过建立标准曲线测定肝糖原含量。结果见图6。
表5小鼠血脂葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性水平
与模型对照组比P<0.05,*P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★
结果分析:3.2.7.1项已经证实,本发明果聚糖有显著改善胰岛素信号转导的作用。胰岛素信号以激酶链式反应下传,最后促使葡萄糖代谢酶、糖原合成酶及糖异生酶等活性发生改变,最终起到降血糖作用。所以,本实验对葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性及肝糖原的含量进行分析,研究本发明果聚糖最直接的降血糖机理。
葡萄糖激酶是体内糖代谢的关键酶,其催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖,对糖在肝脏中的氧化代谢起着重要作用,这对糖尿病患者是有利因素。葡萄糖-6-磷酸酶是体内糖异生的关键酶,其催化蛋白和脂质等物质转化为葡萄糖,促使血糖升高,这对糖尿病患者是不利因素。本实验结果表明,本发明果聚糖高低剂量均有增强葡萄糖激酶活性和减弱葡萄糖-6-磷酸酶活性的作用,从而加速体内葡萄糖氧化代谢和抑制糖异生,推测这是本发明果聚糖降血糖的机理之一。其中高低剂量的本发明果聚糖增强葡萄糖激酶活性的效果比罗格列酮都强。
肝糖原的含量,反映肝脏糖原合成酶的活性,进而间接反映肝脏将血糖转化为糖原而降血糖的功能。本实验结果表明,本发明果聚糖高低剂量都增加了肝糖原的含量,推测本发明果聚糖具有增强肝脏将血糖转化为糖原而降血糖的功能,这可能是本发明果聚糖降血糖的另一机理。其中,本发明果聚糖组与罗格列酮组的糖原量高于正常组,可能是这3组小鼠长期食用高脂高糖饲料的缘故。
2.8本发明果聚糖的结构鉴定
2.8.1本发明果聚糖的纯度及相对分子量测定
采用高效凝胶色谱结合蒸发光检测器(HPGPC-ELSD)测定。取标准葡聚糖D-1(分子量1000)、T-5(分子量5000)、T-10(分子量10000)、T-40(分子量40000)、T-70(分子量70000)和本发明果聚糖,分别配成水溶液进行HPGPC-ELSD检测,以标准葡聚糖的相对分子量对数为横坐标,保留时间为纵坐标,建立标准曲线,由标准曲线及GPC数据处理软件计算出多糖的相对分子量。实验条件为:样品是1%多糖液;G4000PWXL(7.8mm×300mm),流动相为水,流速为0.6mL/min;气压为0.3MPa,雾化室温度为45℃,漂移管温度为110℃。本发明果聚糖HPGPC-ELSD结果见图7。
结果分析:经HPGPC-ELSD检测,本发明果聚糖的纯度在99%以上。以标准葡聚糖的相对分子量对数为横坐标,保留时间为纵坐标,建立标准曲线Y=23.087-1.928X(r=0.9998),由标准曲线及GPC数据处理软件计算出本发明果聚糖的重均相对分子质量(Mw)为4287。
2.8.2均一多糖的紫外及红外,及其他常规检查检测
1%的湖北麦冬均一多糖水溶液在200-400nm进行紫外扫描,结果见图1;充分干燥的湖北麦冬均一多糖进行红外检测,结果见图8,湖北麦冬均一多糖中总多糖的含量采用硫酸比色法测定;经硫酸咔唑反应检测湖北麦冬均一多糖是否含糖醛酸;采用Lowry蛋白定量法检测蛋白含量。
结果分析:经硫酸比色法测定,湖北麦冬均一多糖中总多糖的含量为99.3%;经硫酸咔唑反应检测,其不含糖醛酸;Lowry检测为阴性,说明其无蛋白杂质;紫外扫描图中显示,湖北麦冬均一多糖的水溶液在260nm和280nm处无吸收峰,进一步证实其不含蛋白和核酸;红外扫描图中,在波数930.45cm-1和818.7cm-1的吸收为果聚糖特有的吸收信号,证明该多糖为果聚糖,且在1715cm-1左右无强吸收,进一步说明该果聚糖不含糖醛酸。
2.8.3单糖组成分析
本发明果聚糖的单糖组成分析采用水解-衍生化-GC法。以0.1mol/L三氟乙酸2mL溶解25mg本发明果聚糖样品,封管于70℃水解2h;取出,在70℃水浴中用氮气吹干;再加甲醇并用氮气吹干,如此反复两次;再置干燥器中24h。以1mL吡啶溶解后于冰水浴中依次加入0.4mL六甲基二硅氮烷和0.2mL三甲基氯硅烷,于60℃静置15min,离心,取上清液直接进气相色谱分析。用标准三甲基硅烷化单糖对照,衍生方法同上,正二十烷作内标物,根据保留时间及峰面积大小计算各单糖的组成比例。标准三甲基硅烷化单糖和本发明果聚糖水解产物三甲基硅烷化GC结果分别见图9和图10
结果分析:本实验用0.1mol/L三氟乙酸2mL封管70℃水解多糖2h,水解产物直接进行HPGPC-ELSD和水解产物加果糖进行HPGPC-ELSD,两谱图进行比较分析可以证实多糖水解完全。将水解产物进行衍生化-GC分析,并与标准单糖对照,证实本发明果聚糖由果糖和葡萄糖24.2∶1组成(其中葡萄糖有两个峰,后一个为其在衍生化过程中产生的异构峰)。
2.8.4甲基化分析
取充分干燥得本发明果聚糖10mg,加人无水DMSO 3mL,超声使样品充分溶解,然后加人粉状NaOH 200mg,超声至大部分NaOH溶解,充人N2,冰水浴下缓慢滴加CH3I 3mL,室温密封避光搅拌反应1h,加水2mL淬灭反应。反应液用氯仿萃取(3×2mL),合并氯仿层,用水洗3次,加入无水MgSO4干燥,过滤,滤液旋转蒸发除去氯仿即得甲基化产物。以上步骤反复几次,产物经IR分析是否甲基化完全。将完全甲基化产物先经2ml90%甲酸(v/v)封管70℃水解2h,再经2ml 0.1M TFA于70℃封管水解2h,用氮气吹干.加水1ml溶解,再加入30mgKBH4,室温下还原10h。之后加入50μl HAC中和至中性,减压蒸干,再反复加入3ml甲醇和一滴乙酸,蒸干,再反复加甲醇蒸干。残渣再P2O5存在下真空干燥4h.
最后进行乙酰化:上述产物加入1ml吡啶和1ml乙酸酐,100℃反应1h,N2吹干,3ml三氯甲烷溶解,水(3×3ml)洗涤三氯甲烷层,三氯甲烷层N2吹干,干燥,最后300μl三氯甲烷溶解,GC/MS分析。GC图谱见图11。
表6 本发明果聚糖甲基化-GC/MS数据
结果分析:GC-MS结果出现6个丰度较大的峰(B-G)和几个丰度较小的峰(包括A),其中A-G为葡萄糖和果糖还原衍生后的峰(摩尔比例及代表的连接方式见表6,Glc代表葡萄糖,Fruf代表果糖),其他几个小峰为杂峰。由于一定连接键型的果糖在还原时转变成相应的甘露糖醇和葡萄糖醇的衍生物,所以每种部分甲基化的果糖在GC中出现两个峰,两者之和代表组分的含量(见表6)。该结果证明本发明果聚糖主要由2→1及2→6连接的果糖组成;并可以推测本发明果聚糖的糖链可能由6个重复单元组成,葡萄糖以1位OH连接在糖链末端。
2.8.5过碘酸盐氧化与Smith降解反应
20mg本发明果聚糖溶于0.015mol/L的高碘酸钠溶液20mL中,置于4℃暗处恒温氧化,间或振摇。每天取样0.2mL,水稀释成50mL于223nm波长处测吸光度,直到吸收度基本稳定。将上述氧化完全的溶液中加入乙二醇1mL终止反应,分光光度测定法计算高碘酸钠消耗,甲酸产物的产量用0.1M的NaOH溶液滴定确定。氧化完全的溶液装入透析袋对蒸馏水透析,透析袋内液(未透析部位)于室温用NaBH4还原10h,醋酸中和,再次透析,透析袋内液减压蒸干,然后水解、乙酰化、GC/MS分析。GC/MS结果见图12。
结果分析:本发明果聚糖过碘酸氧化于第7天完全,1mol的已糖残基消耗1.03mol过碘酸钠;过碘酸氧化产物用NaOH溶液滴定,几乎不消耗NaOH,提示没有甲酸产生(或甲酸产生的量小,检测不到),说明所有果糖的2位羟基参与糖苷键的形成。将上述氧化完全的样品进行Smith降解,GC分析结果可见主要氧化降解产物为丙三醇(峰面积占97.8%,见图12)。说明氧化发生在3,4位的邻位羟基之间,果糖的3和4位羟基没有发生取代,进一步证明该多糖主要糖苷键只有1、2和6位羟基参与。
2.8.5核磁分析
100mg本发明果聚糖以D2O溶解,采用600Hz的核磁共振仪进行1H、13C,HSQC,HMBC,1H、1H-COSY,TOCSY,NOESY分析。本发明果聚糖13C-NMR谱图见图13,从谱中可以观察到δ105.8-106.7的5个β-D-果糖的2位碳吸收,同时δ94.8处有一个α-D-葡萄糖1位碳微弱的吸收。
表7本发明果聚糖C及H信号数据(ppm,相对于DSS的信号)
nd:代表没有检测到信号或信号重叠。
结果分析:从13C-NMR谱(见图13)观察到δ105.8-106.7的5个β-D-果糖的2位碳吸收,同时δ94.8处有一个α-D-葡萄糖1位碳微弱的吸收,1H-NMR谱(见图14)中可以观察到δ5.404处微弱的α-D-葡萄糖的1位H吸收,进一步确定葡萄糖的构型为α-D型;从Tocsy谱(见图15)中可以看出糖链中的5个果糖单元(分别编号为A、B、C、D、E)和一个葡萄糖单元(编号G)的H的相关峰,其中E单元的信号较弱,推测为末端果糖;从H,H-cosy谱中(图未列出),可以将这些H信号在各自的糖单元内进行归属(见表7);从HSQC谱中(见图17),可以对每个糖单元中的1、3、4、5、6位碳进行归属;各个糖单元中2位C的归属可以从HBMC谱中与其1、3、4或5位H的相关而确定(见图18);对比Noesy和Tocsy谱(见图16和15),发现在Noesy谱中的相关峰都可以在Tocsy谱找到,因此可以判定每个糖苷键的形成都必须有2位-OH参与;前面的过碘酸盐氧化与Smith降解反应结果证实糖苷键只可能由1、2和6位-OH参与,所以糖苷键只可能是2和6位或2和1位的-OH形成;因此,要判定多糖的连接方式,只需观察HMBC谱中的2位碳与1或6位H相关的位点;在HMBC谱中(见图18),A C-2/Glc H-1的相关峰,其强度较弱,可推测葡萄糖是在糖链的末端以1-OH与A糖的2-OH成苷;同时可以观察到D C-2/B H-6、C C-2/B H-1、A C-2/C H-1、B C-2/A H-1的相关峰,其强度大,可以推测其为多糖中的主要重复单元,连接顺序位为是多糖的主链;虽然在HMBC谱没有观察到E单元连接位置的相关峰,但其1、3、4、6-OH都没有苷化,推测以2-OH连接在糖链的C末端。以之前测得分子量4287计算,多糖中有6.09个(约6个)重复单元,因此果糖∶葡萄糖为25∶1,与之前分析的结果一致。
因此,综合以上化学、光谱和核磁等分析结果,确定本发明果聚糖的分子结构为其中G为α-D-葡萄糖,A、B、C、D、E为β-D-果糖。
本发明是从湖北麦冬块根中提取得到的多糖类药物。湖北麦冬为国家卫生部公布的“药食同源”品种,为湖北省道地药材和特有物种,按本发明提供的制备方法,本发明果聚糖产率为原料药的12.3%,得率高;5千克湖北麦冬药材可以制备2924个湖北麦冬多糖胶囊,成本低,易于产业化,亦便于2型糖尿病老百姓患者购买。
本发明提供的果聚糖对2型糖尿病小鼠血糖有显著的降低作用,给药28天后小鼠的血糖基本恢复正常,同时改善对2型糖尿病小鼠的糖耐量;显著增强胰岛素受体(InsR)、胰岛素低物(IRS-1)及蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达,进而促进葡萄糖转化为糖原,促使6-磷酸葡萄糖(葡萄糖代谢关键酶)、葡萄糖-6-磷酸酶(葡萄糖异生关键酶)的活性增强等,从而显著降低胰岛素抵抗作用。这些作用强度均与阳性药罗格列酮无统计学差异;同时能较罗格列酮更好的降低血总胆固醇和甘油三酯、增加高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值,能更有效的防治动脉硬化和血栓形成,在治疗糖尿病并发症方面较罗格列酮效果好。因此,本发明得到的高度纯化、工艺及性状稳定、结构明确、抗糖尿病疗效及机制确切且无毒副作用的果聚糖,完全可以替代治疗不彻底、毒副作用大、易产生耐受性不适合长期服用的罗格列酮等化学类药物。
由于本发明果聚糖高低剂量作用相当,所以对2型糖尿病小鼠采用低剂量(100mg/kg)即可。按人与小鼠之间用药剂量换算,对于一个60kg的成人,每天服用660mg本发明果聚糖(相当于5.36g湖北麦冬药材)即可。
附图说明
图1:木瓜蛋白酶酶解前的湖北麦冬水煎液的紫外扫描图。纵坐标为吸光度,横坐标为吸收波长。由图可知,本发明果聚糖的水溶液在278nm处有吸收峰,说明其含蛋白。
图2:木瓜蛋白酶酶解后的本发明果聚糖的紫外扫描图。纵坐标为吸光度,横坐标为吸收波长。由图可知,本发明果聚糖的水溶液在260nm和280nm处无吸收峰,说明其不含蛋白和核酸。
图3:灌胃给药14天后小鼠糖耐量实验的血糖变化图示。纵坐标为血糖浓度(mmol/L),横坐标为给葡萄糖后时间。由图示可知,不同剂量的本发明果聚糖组小鼠在注射50mmol/kg葡萄糖后30min内,血糖升高的速度明显比模型对照组平缓;同时,给葡萄糖30min后,本发明果聚糖组小鼠血糖恢复较好,在120min时基本恢复原始(0min时的血糖值),而模型对照组恢复较缓慢,120min时血糖还较原始高许多。高低剂量的本发明果聚糖组的作用效果均与阳性药罗格列酮组无统计学差异。
图4:小鼠胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体低物-1(IRS-1)、蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)的免疫组化结果图片。图A-E分别为健康、模型对照、罗格列酮、本发明果聚糖高和低剂量组的小鼠肾组织的InsR的染色分布;图F-J分别为健康、模型对照、罗格列酮、本发明果聚糖高和低剂量组的小鼠肾组织的IRS-1的染色分布;图K-O分别为健康、模型对照、罗格列酮、本发明果聚糖高和低剂量组的小鼠肾组织的PI-3K的染色分布。在图片中,小鼠肾组织出现棕黄色物质为阳性结果。结果表明,健康组及给药各组肾组织InsR、IRS-1、PI-3K均分布于肾小管上皮细胞胞浆中,着色强;模型对照组InsR、IRS-1、PI-3K的染色均较健康组和其他给药组弱;说明本发明果聚糖及罗格列酮均可以明显改善InsR、IRS-1、PI-3K的表达从而起到降低血糖的作用。
图5:小鼠InsR、IRS-1、PI-3K的Western blotting图。图中A、B、C、D、E分别为模型对照组、健康组、罗格列酮组、本发明果聚糖高剂量组、本发明果聚糖低剂量组的小鼠肾组织的Western blotting显色条带;183KD,131KD,85KD,42KD分别代表IRS-1、Ins-α、PI-3K、β-actin蛋白的大小。由图可知,模型对照组小鼠肾组织的Ins-α、IRS-1、PI3K显色条带的光密度均明显低于正常组,提示Ins-α、IRS-1、PI3K的表达水平均明显低于正常组。这说明2型糖尿病小鼠的InsR-α、IRS-1、PI-3K表达水平降低,胰岛素信号转导在受体和受体后环节障碍。同时,图中显示,阳性对照组及各给药组的InsR-α、IRS-1、PI-3K的显色条带的光密度均明显高于模型对照组,这说明本发明果聚糖及罗格列酮均能有效增加Ins-α、IRS-1、PI-3K的表达水平。
图6:小鼠肝糖原含量水平图示(与模型对照组比P<0.05,*P<0.01**;与罗格列酮组比P<0.05★,P<0.01★★)。纵坐标为每克肝组织所含肝糖原的量(mg),横坐标为小鼠的组别。由图可知,模型对照组肝糖原含量明显较健康组低,本发明果聚糖高低剂量都增加了肝糖原的含量,推测本发明果聚糖具有增强肝脏将血糖转化为糖原而降血糖的功能。
图7:本发明果聚糖的HPLC-ELSD图谱。纵坐标为丰度(mV),横坐标为保留时间(min)。由图可知,本发明果聚糖的HPLC-ELSD色谱图只出现了一个峰形对称的峰,证实本发明果聚糖的纯度高。
图8:湖北麦冬均一多糖的红外扫描图。纵坐标为透光度,横坐标为波数。由图可知,湖北麦冬均一多糖3600~3200cm-1和1649.70cm-1的两组峰,表明为糖类化合物;在波数930.45cm-1和818.7cm-1处有峰吸收,说明该多糖为果聚糖;在1715cm-1左右无强吸收,说明该果聚糖不含糖醛酸。
图9:标准单糖衍生化-GC图谱。纵坐标为丰度(mV),横坐标为保留时间。A(保留时间12.365)、B(13.747)、C(15.257)、D(15.900)、E(16.467)、F(16.698)和G(17.695)分别为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及葡萄糖的三甲基硅烷化衍生物的色谱峰,其中葡萄糖有两个峰(E和G),后一个(G)为其在衍生化过程中产生的异构峰。
图10:本发明果聚糖水解-衍生化-GC图谱。纵坐标为丰度(mV),横坐标为保留时间。通过与图8中标准单糖三甲基硅烷化衍生物的色谱峰进行比较,可知,1(保留时间15.332)为果糖三甲基硅烷化衍生物的色谱峰,2(16.432)和3(17.765)为葡萄糖三甲基硅烷化衍生物的色谱峰,其中葡萄糖有两个峰,后一个为其在衍生化过程中产生的异构峰。通过峰面积的比较,可以推测出果糖和葡萄糖的摩尔比例为24.2∶1。
图11:本发明果聚糖甲基化GC图谱。纵坐标为丰度(mV),横坐标为保留时间。
A:2,3,4,6-Me4-1,5-Ac2-Glucitol;B:1,3,4,6-Me4-2,5-Ac2-Mannitol;
C:1,3,4,6-Me4-2,5-Ac2-Sorbitol;D:3,4,6-Me3-1,2,5-Ac3-Mannitol;
E:3,4,6-Me3-1,2,5-Ac3-Sorbitol;F:3,4,-Me2-1,2,5,6-Ac4-Mannitol;
G:3,4,-Me2-1,2,5,6-Ac4-Sorbitol。A-G的摩尔比例及各代表的连接方式见表7。
图12本发明果聚糖碘酸氧化/Smith降解后GC/MS图谱。纵坐标为丰度(mV),横坐标为保留时间。图中1代表丙三醇乙酰衍生物,其峰面积占97.8,提示本发明果聚糖主要氧化降解产物为丙三醇。
图13:本发明果聚糖13C-NMR谱图。从谱中可以观察到δ105.8-106.7的5个β-D-果糖的2位碳吸收,同时δ94.8处有一个α-D-葡萄糖1位碳微弱的吸收。
图14:本发明果聚糖1H-NMR谱图。从谱中可以观察到δ5.404处微弱的α-D-葡萄糖的1位H吸收,确定葡萄糖的构型为α-D型。
图15:本发明果聚糖TOCSY谱图。从谱中可以看出糖链中的5个果糖单元(分别编号为A、B、C、D、E)和一个葡萄糖单元(编号G)的H的相关峰,其中E单元的信号较弱,推测为末端果糖。见表8。
图16:本发明果聚糖NOESY谱图。此图谱与Tocsy谱(见图12)对比,发现在Noesy谱中的相关峰都可以在Tocsy谱找到,可以判定本发明果聚糖中每个糖苷键的形成都必须有2位-OH参与。
图17:本发明果聚糖HSQC谱图。从谱中,凭借已归属好的氢信号,可以通过相关峰对每个糖单元中的1、3、4、5、6位碳进行归属。见表8。
图18:本发明果聚糖HMBC谱图。从图谱中可以清楚的观察到2位C与同糖单元或异糖单元上的1、3、4或5位H的相关峰(已在图中标出)。
具体实施方式
实施例1
发明果聚糖的制备:取湖北麦冬块根5kg,粉碎成原药材粉,加水煎煮3次,第一次加20升水,第二次加20升水,第三次加10升水,每次煮沸30分钟,合并水煎液;水煎液用磷酸盐缓冲液调节pH6,加入25g活性为12u/mg的木瓜蛋白酶,在45℃条件下水浴酶解2小时,然后立即煮沸5分钟,4℃静置12小时以上,抽滤去沉淀;将滤液装入分子量为1000透析袋,用自来水透析1天,蒸馏水再透析1天,袋内多糖液浓缩成1.5g/mL,加无水乙醇至乙醇体积分数为80%,4℃静置12小时以上,倾去上清液,收集沉淀;沉淀用水溶解并稀释成5500mL,上22.4kg填料装成的DEAE-纤维素52层析柱(柱高∶柱直径=10∶1),用2.5倍柱体积的蒸馏水洗脱,用苯酚-硫酸比色法检测是否洗脱完全,洗脱完全后收集洗脱液,洗脱液浓缩成5000mL;浓缩液上22.4kg填料装成的AB-8大孔树脂柱(柱高∶柱直径=6∶1),用3倍柱体积的蒸馏水洗脱,洗脱至洗脱液苯酚-硫酸比色程阴性结果为止,再用3倍柱体积的30%的乙醇水溶液洗脱至苯酚-硫酸比色法检测洗脱完全,收集乙醇洗脱部位,浓缩、冷冻干燥得本发明果聚糖粉末约965g。
实施例2
本发明果聚糖胶囊的制备:在965g本发明果聚糖粉末中加入35g微晶纤维素,混匀,过筛,干燥后,制得药物胶囊的药用原料。药用原料填充入2924个胶囊中,制得每个含0.33g本发明果聚糖的药物胶囊,相当于每个胶囊含湖北麦冬生药材2.68g。建议成人每天服用本发明果聚糖胶囊早晚饭前各一次,每次1粒胶囊,连续服用4周以上。
实施例3
本发明果聚糖片剂的制备:在965g本发明果聚糖粉末中加入35g微晶纤维素,混匀,过筛,干燥后,制得药物片剂的药用原料。药用原料干法制颗粒压片,制得5848片本发明果聚糖的药物片剂,每片含0.165g本发明果聚糖,相当于每个胶囊含湖北麦冬生药材1.34g。
建议成人每天服用本发明果聚糖片剂两次,早晚饭前各一次,每次2片,连续服用4周以上。
Claims (8)
2.权利要求1所述果聚糖的制备方法,其特征在于它是以湖北麦冬为原料,经以下步骤制取的产物:
A.取湖北麦冬块根,经粉碎制成原药材粉;取1重量份的原药材粉,加10倍药材重量的水,煎煮3次,第一次加4倍量水,第二次加4倍量水,第三次加2倍量水,每次煮沸30分钟,合并水煎液;
B.用磷酸盐缓冲液调节水煎液的pH至6,用木瓜蛋白酶酶解,然后煮沸5分钟,4℃静置12小时以上,抽滤去沉淀,保留滤液;
C.将滤液装入截留分子量为1000透析袋,用自来水透析1天,蒸馏水再透析1天,将袋内多糖液减压浓缩至浓度为1.5g/mL,加无水乙醇至乙醇体积分数为80%,4℃静置12小时以上,倾去上清液,沉淀减压干燥得湖北麦冬总多糖;
D.取湖北麦冬总多糖加5倍水溶解,上用20倍总多糖重量的填料装成的DEAE-纤维素52层析柱,柱高∶柱直径=10∶1,用2.5倍柱体积的蒸馏水洗脱,用苯酚-硫酸比色法检测是否洗脱完全,洗脱完全后收集洗脱液;
E.将洗脱液浓缩成浓度为每毫升溶液含有1g原药材粉,上用20倍总多糖重量的填料装成的AB-8大孔树脂柱,柱高∶柱直径=6∶1,用3倍柱体积的蒸馏水洗脱,洗脱至洗脱液苯酚- 硫酸比色呈阴性结果为止,再用3倍柱体积的30%的乙醇水溶液洗脱至苯酚-硫酸比色法检测洗脱完全,收集乙醇洗脱部位,减压浓缩、冷冻干燥得果聚糖。
3.根据权利要求2所述的果聚糖的制备方法,其特征在于,所述的用木瓜蛋白酶酶解的具体方法是:加入0.005倍药材重量的活性为12u/mg的木瓜蛋白酶,在45℃水浴条件下酶解2小时。
4.权利要求1所述的果聚糖在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。
5.一种用于治疗II型糖尿病的组合物,包含作为活性成分使用的权利要求1所述的果聚糖。
6.一种治疗II型糖尿病的药剂,其特征在于它含有作为活性成分使用的权利要求1所述的果聚糖和药剂学上可接受的添加剂、赋型剂和/或载体。
7.根据权利要求6所述的治疗II型糖尿病的药剂,其特征在于它是以权利要求1所述的果聚糖为活性成分按常规方法制备的胶囊。
8.根据权利要求6所述的治疗II型糖尿病的药剂,其特征在于它是以权利要求1所述的果聚糖为活性成分按常规方法制备的片剂。
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