CN105794955A - 一种桦褐孔菌硒化多糖制剂及其在树莓保鲜中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桦褐孔菌硒化多糖制剂及其在树莓保鲜中的用途。本发明所述的多糖制剂中含有桦褐孔菌硒化多糖、丙酸钙、抗坏血酸钙以及无菌水。在树莓园选取约7成熟果实喷施本发明的桦褐孔菌硒化多糖制剂，风干后摘取果实装盒，放于3℃低温条件下贮藏。结果表明，使用本发明桦褐孔菌硒化多糖制剂处理的树莓果实在3℃贮藏20d，果实色泽鲜艳，果实硬度和风味未发生明显变化，好果率在92％以上。未喷施本发明生物保鲜剂的树莓果实，同样温度下贮藏7d开始出现颜色变褐、失水萎缩，同时出现果实变软腐烂，局部发霉现象。此外，本发明还具有易获得，成本低，安全、高效、可食用的特点，因此本发明为树莓果实的贮藏保鲜提供了一种有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗氧化性能较高的桦褐孔菌硒化多糖制剂及其制备方法，还涉及将其做为生物保鲜剂在对树莓进行保鲜中的用途。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotusobliquus)是一种传统野生的食药用真菌，有较强的抗氧化、抗肿瘤、降血糖血脂等功能，属于珍贵的天然保健品。但由于其子实体的人工栽培技术不成熟，生产周期长、生产成本高，制约了桦褐孔菌有益产品的生产和研发。利用桦褐孔菌菌丝体液体发酵提取多糖，具有周期短，生长条件易控制，产量高，抗氧化性强等优点，因此具有更广阔的发展前景。
硒(selenium)是人体所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗癌、延缓衰老、增强人体免疫力等功效。硒多糖作为一种有机硒化合物，具有抗氧化、抗金属中毒、抗癌细胞和病毒等多种作用。以亚硒酸钠和桦褐孔菌多糖为原料合成硒化多糖，兼有硒与桦褐孔菌多糖的活性，抗氧化活性能力及抑菌活性提高。
树莓为近年来大面积人工栽培的小浆果，果实含丰富的糖类、蛋白质、有机酸、维生素、氨基酸，并且含有较高的SOD、不饱和脂肪酸和矿质元素，具有很好的市场需求和发展前景。由于树莓果实柔嫩易破，果实采收后稍受挤压即破裂出汁，极易腐烂变质，较难保鲜。目前主要采用充气及速冻贮藏等方法延长保鲜期，或采摘后立即进行加工，而鲜食的运输、销售受到很大限制。
本发明针对树莓果实采收后容易软化、腐烂的特点，通过桦褐孔菌菌丝体液体发酵提取桦褐孔菌多糖，多糖硒化后其抗氧化能力和抑菌活性明显提高，可制成生物保鲜剂，对树莓果实进行保鲜。控制果实软化进程、抑制腐败菌生长繁殖，为树莓果实的贮藏保鲜提供了一种有效的技术手段。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种桦褐孔菌硒化多糖制剂及其制备方法。
本发明的目的之二在于提供该桦褐孔菌硒化多糖制剂在树莓保鲜中的用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种桦褐孔菌硒化多糖制剂，其含有桦褐孔菌硒化多糖、丙酸钙、抗坏血酸钙以及无菌水。
在本发明中，优选的，所述的桦褐孔菌硒化多糖的浓度为1-5g/L，所述的丙酸钙的浓度为15-25g/L，所述的抗坏血酸钙的浓度为2-8g/L。更优选的，所述的桦褐孔菌硒化多糖的浓度为2g/L，所述的丙酸钙的浓度为20g/L，所述的抗坏血酸钙的浓度为5g/L。
在本发明中，优选的，所述的桦褐孔菌硒化多糖是通过以下方法制备得到的：
(1)桦褐孔菌液体菌种制备
将桦褐孔菌菌种经斜面PDA培养基活化后，取0.5-1.5cm2的菌丝块接种到PD液体培养基中，28℃、60-100r/min摇床振荡培养5-8d，得到种子液；
(2)桦褐孔菌菌丝体多糖发酵
按0.1％(v/v)的接种量取步骤(1)得到的种子液接种到多糖液体发酵培养基中，28℃，60-100r/min摇床振荡培养20-30d，得到多糖发酵液；
(3)粗多糖的提取
将多糖发酵液过滤，得到菌丝体和滤液，取滤液，60℃旋转蒸发浓缩，浓缩后所得的粗糖溶液加入3-5倍体积的95％(v/v)乙醇，静置进行多糖沉淀，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将多糖发酵液过滤分离出的菌丝体于60℃恒温烘干箱内烘干至恒重，所得干燥菌丝体称重后研磨，加入30-50倍体积的蒸馏水在60℃水浴煮提1-2h，过滤收集滤液，向剩余物中继续加30-50倍体积的蒸馏水，在60℃水浴煮提1-2h，收集滤液；合并滤液，所得滤液中加入3-5倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜进行多糖沉淀，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将步骤(3)得到的两种多糖混合后用75％(v/v)乙醇洗涤沉淀数次，直至多糖颜色不再变化，于50℃烘箱中烘干，即得到粗多糖；
(4)粗多糖纯化
将步骤(3)所得粗多糖配成浓度为2％(w/w)的溶液，将该粗多糖溶液与sevage试剂按体积比为5:1的比例混合，120rpm恒温振荡120min后离心，取上清液，以除去凝胶状蛋白质，于280nm测定吸光度，经多次重复，直到无吸收峰则表示蛋白质已除尽，然后加入2-4倍体积95％(v/v)的乙醇4℃过夜沉淀，冷冻干燥得纯化的多糖；
(5)桦褐孔菌多糖的硒化
称取1.0g纯化的多糖，缓慢滴加体积百分数为0.5％的稀HNO3至溶液pH6.5，边加边搅拌，摇床震荡使之完全溶解，加入BaCl2以及Na2SeO3于70℃下搅拌反应5-9h，反应液冷却后过滤，使用无水Na2CO3调pH为7，加入Na2SO3除去Ba2+，离心，上清液浓缩后，流水透析2-3d，蒸馏水透析1-2d，透析液用3-5倍体积的无水乙醇沉淀，沉淀后冷冻干燥，得到桦褐孔菌硒化多糖。
在本发明中，优选的，所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然；所述的PD液体培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然。
在本发明中，优选的，所述的液体多糖发酵培养基配方为：按质量百分比计，葡萄糖3％，麦麸0.7％，玉米粉0.8％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.05％，培养基的起始pH自然。
在本发明中，优选的，步骤(5)中多糖与Na2SeO3的重量比例为1:1，Na2SeO3与BaCl2的重量比例为1:1.5。
在本发明中，优选的，所述的桦褐孔菌，购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc83414。
通过体外羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及SOD(超氧化物歧化酶)活性测定，结果表明，硒化多糖的羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及SOD(超氧化物歧化酶)活性显著高于未硒化多糖，浓度为2mg/mL的桦褐孔菌硒化多糖对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到86.3％和82.5％，SOD活性达到85.8％。在树莓园选取约7成熟果实喷施本发明的桦褐孔菌硒化多糖制剂，风干后摘取果实装盒，放于3℃低温条件下贮藏。取未喷施生物保鲜剂的7成熟树莓果实为对照，置于同样条件下贮藏。结果表明，使用本发明桦褐孔菌硒化多糖制剂处理的树莓果实在3℃贮藏20d，果实色泽鲜艳，果实硬度和风味未发生明显变化，好果率在92％以上。未喷施本发明桦褐孔菌硒化多糖制剂的树莓果实，同样温度下贮藏7d开始出现颜色变褐、失水萎缩，同时出现果实变软腐烂，局部发霉现象。
因此，在上述研究的基础上，本发明还提出了所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂树莓保鲜中的用途。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明用于硒化的桦褐孔菌多糖来自于菌丝体发酵，具有生产成本低，生产工艺简单易行，产率高，无抗生素、无化学污染，可食用，对人体安全性高的优点，桦褐孔菌硒化多糖抗氧化能力强，抑菌活性高，易成膜，具有调节果蔬生理生化反应，延缓果蔬衰老，抑制腐败菌和霉菌的作用。
(2)本发明的桦褐孔菌硒化多糖制剂中的丙酸钙可强化树莓果实细胞壁结构，减缓软化速度的作用。
(3)本发明的桦褐孔菌硒化多糖制剂中的抗坏血酸进一步增强硒化多糖的抗氧化作用，可食用，对人体高度安全。
(4)将该生物保鲜剂应用于树莓保鲜安全、高效，在保持树莓品质的同时，可有效降低树莓果实的腐烂率。
附图说明
图1本发明中发酵22天的桦褐孔菌菌丝体发酵液；
图2本发明中乙醇过夜沉淀的发酵液多糖；
图3本发明中冷冻干燥后的硒化桦褐孔菌多糖；
图4桦褐孔菌多糖和硒化桦褐孔菌多糖对羟自由基的清除率曲线；
图5桦褐孔菌多糖和硒化桦褐孔菌多糖对超氧阴离子自由基的清除率曲线；
图6桦褐孔菌多糖和硒化桦褐孔菌多糖SOD活性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1桦褐孔菌硒化多糖的制备
1、菌种
桦褐孔菌菌种购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc83414。
2、培养基
多糖液体发酵培养基配方为：葡萄糖3％，麦麸0.7％，玉米粉0.8％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.05％，培养基的起始pH自然。
PDA培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然；
PD液体培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然。
3、方法
(1)桦褐孔菌液体菌种制备
将桦褐孔菌菌种经斜面PDA培养基活化后，取约1cm2的菌丝块接种到PD液体培养基中，28℃、80r/min摇床振荡培养7d，得到种子液；
(2)桦褐孔菌菌丝体多糖发酵
按0.1％(v/v)的接种量取种子液接种到无菌液体多糖发酵培养基中，28℃，80r/min摇床振荡培养25d，得到多糖发酵液；发酵22天的桦褐孔菌菌丝体发酵液如图1所示；
(3)粗多糖的提取
将多糖发酵液过滤，得到菌丝体和滤液，取滤液，60℃旋转蒸发浓缩，浓缩后所得的粗糖溶液加入4倍体积的95％(v/v)乙醇，4℃静置24h进行多糖沉淀(图2)，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将多糖发酵液过滤分离出的菌丝体于60℃恒温烘干箱内烘干至恒重，所得干燥菌丝体称质量后研磨，加入40倍体积的蒸馏水在60℃水浴煮提2h，过滤收集滤液，向剩余物中继续加40倍体积的蒸馏水，在60℃水浴煮提2h，收集滤液；合并滤液，所得滤液中加入4倍体积的95％(v/v)乙醇，4℃静置24h进行多糖沉淀，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将步骤(3)得到的两种多糖混合后用75％(v/v)乙醇洗涤沉淀数次，直至多糖颜色不再变化，于50℃烘箱中烘干，即得到粗多糖；
(4)粗多糖纯化
将步骤(3)所得粗多糖配成浓度为2％(w/w)的溶液，将该粗多糖溶液与sevage试剂(氯仿与正丁醇按5:1体积比混合)按体积比为5:1的比例混合，120rpm恒温振荡120min后离心，取上清液，以除去凝胶状蛋白质，于280nm测定吸光度，经多次重复，直到无吸收峰则表示蛋白质已除尽，然后加入2-4倍体积95％(v/v)乙醇4℃过夜沉淀，冷冻干燥得纯化的多糖；
(5)桦褐孔菌多糖的硒化
称取1.0g纯化多糖，缓慢滴加0.5％(v/v)稀HNO3至溶液pH6.5，边加边搅拌，摇床震荡4h，使之完全溶解。加入一定量(约1.5g)BaCl2，加Na2SeO31g于70℃下搅拌反应7h，反应液冷却后过滤，无水Na2CO3调pH为7，加入适量Na2SO3除Ba2+，离心，上清液浓缩后，流水透析2d，蒸馏水透析1d，透析液用4倍体积无水乙醇沉淀，沉淀后冷冻干燥，得硒化桦褐孔菌多糖(图3)。
4、桦褐孔菌硒化多糖体外抗氧化能力测试
通过体外羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及SOD(超氧化物歧化酶)活性测定，考查桦褐孔菌硒化多糖体外抗氧化能力。结果表明，硒化多糖的羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力及SOD(超氧化物歧化酶)活性显著高于未硒化多糖，浓度为2mg/mL的桦褐孔菌硒化多糖对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到86.3％和82.5％，SOD活性达到85.8％，如图4-6所示。
实施例2桦褐孔菌硒化多糖制剂的制备
分别称取桦褐孔菌硒化多糖(实施例1制备得到)2g，丙酸钙20g，抗坏血酸5g溶于1L无菌水中，即得。
实施例3桦褐孔菌硒化多糖制剂的制备
分别称取桦褐孔菌硒化多糖(实施例1制备得到)3g，丙酸钙22g，抗坏血酸3g溶于1L无菌水中，即得。
实施例4桦褐孔菌硒化多糖制剂的制备
分别称取桦褐孔菌硒化多糖(实施例1制备得到)1g，丙酸钙18g，抗坏血酸6g溶于1L无菌水中，即得。
实施例5桦褐孔菌硒化多糖制剂树莓保鲜中的用途
在位于东北农业大学实验基地的树莓园中选取约7成熟果实喷施本发明生物保鲜剂。风干后摘取果实装盒。放于3℃低温条件下贮藏。取未喷施生物保鲜剂的7成熟树莓果实为对照，置于同样条件下贮藏。用本发明生物保鲜剂处理的树莓果实在3℃贮藏20d，果实色泽鲜艳，果实硬度和风味未发生明显变化，好果率在92％以上。未喷施本发明生物保鲜剂的树莓果实，同样温度下贮藏7d开始出现颜色变褐、失水萎缩，同时出现果实变软腐烂，局部发霉现象。
Claims (10)
1.一种桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于含有桦褐孔菌硒化多糖、丙酸钙、抗坏血酸钙以及无菌水。
2.如权利要求1所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的桦褐孔菌硒化多糖的浓度为1-5g/L，所述的丙酸钙的浓度为15-25g/L，所述的抗坏血酸钙的浓度为2-8g/L。
3.如权利要求2所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的桦褐孔菌硒化多糖的浓度为2g/L，所述的丙酸钙的浓度为20g/L，所述的抗坏血酸钙的浓度为5g/L。
4.如权利要求1-3任一项所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的桦褐孔菌硒化多糖是通过以下方法制备得到的：
(1)桦褐孔菌液体菌种制备
将桦褐孔菌菌种经斜面PDA培养基活化后，取0.5-1.5cm2的菌丝块接种到PD液体培养基中，28℃、60-100r/min摇床振荡培养5-8d，得到种子液；
(2)桦褐孔菌菌丝体多糖发酵
按0.1％(v/v)的接种量取步骤(1)得到的种子液接种到多糖液体发酵培养基中，28℃，60-100r/min摇床振荡培养20-30d，得到多糖发酵液；
(3)粗多糖的提取
将多糖发酵液过滤，得到菌丝体和滤液，取滤液，60℃旋转蒸发浓缩，浓缩后所得的粗糖溶液加入3-5倍体积的95％(v/v)乙醇，静置进行多糖沉淀，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将多糖发酵液过滤分离出的菌丝体于60℃恒温烘干箱内烘干至恒重，所得干燥菌丝体称重后研磨，加入30-50倍体积的蒸馏水在60℃水浴煮提1-2h，过滤收集滤液，向剩余物中继续加30-50倍体积的蒸馏水，在60℃水浴煮提1-2h，收集滤液；合并滤液，所得滤液中加入3-5倍体积的95％(v/v)乙醇，静置过夜进行多糖沉淀，将醇析所得的多糖沉淀用水溶解后，转移至离心管，放入真空冷冻干燥器干燥，干燥后称重；
将步骤(3)得到的两种多糖混合后用75％(v/v)乙醇洗涤沉淀数次，直至多糖颜色不再变化，于50℃烘箱中烘干，即得到粗多糖；
(4)粗多糖纯化
将步骤(3)所得粗多糖配成浓度为2％(w/w)的溶液，将该粗多糖溶液与sevage试剂按体积比为5:1的比例混合，120rpm恒温振荡120min后离心，取上清液，以除去凝胶状蛋白质，于280nm测定吸光度，经多次重复，直到无吸收峰则表示蛋白质已除尽，然后加入2-4倍体积95％(v/v)的乙醇4℃过夜沉淀，冷冻干燥得纯化的多糖；
(5)桦褐孔菌多糖的硒化
称取1.0g纯化的多糖，缓慢滴加0.5％(v/v)的稀HNO3至溶液pH6.5，边加边搅拌，摇床震荡使之完全溶解，加入BaCl2以及Na2SeO3于70℃下搅拌反应5-9h，反应液冷却后过滤，使用无水Na2CO3调pH为7，加入Na2SO3除去Ba2+，离心，上清液浓缩后，流水透析2-3d，蒸馏水透析1-2d，透析液用3-5倍体积的无水乙醇沉淀，沉淀后冷冻干燥，得到桦褐孔菌硒化多糖。
5.如权利要求4所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的PDA培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然；所述的PD液体培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升，培养基的起始pH自然。
6.如权利要求4所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的液体多糖发酵培养基配方为：按质量百分比计，葡萄糖3％，麦麸0.7％，玉米粉0.8％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.05％，培养基的起始pH自然。
7.根据权利要求4所述桦褐孔菌硒化多糖的制备，其特征在于多糖与Na2SeO3的重量比例为1:1，Na2SeO3与BaCl2的重量比例为1:1.5。
8.如权利要求4所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，其特征在于所述的桦褐孔菌，购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc83414。
9.权利要求1-8任一项所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂树莓保鲜中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于在树莓园选取6-7成熟的果实喷施权利要求1-8任一项所述的桦褐孔菌硒化多糖制剂，风干后摘取果实装盒，放于3℃低温条件下贮藏。
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