CN113892394B - 一种栽培培养基在黑皮鸡枞菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种栽培培养基在黑皮鸡枞菌中的应用，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35～55％、棉籽壳10～30％、麦麸10～20％、石灰1～2％、石膏1％，余量为玉米芯。本发明的栽培培养基通过各组分的协同作用不仅能够满足黑皮鸡枞菌菌丝体生长在营养和生理上的要求，还在不同程度上促进了黑皮鸡枞菌营养成分和有效抗氧化活性物质的积累，其中蛋白质、总糖和多酚含量最高分别可以达到42.78％、23.54％和4.19mg/g，多酚提取物对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的清除率分别为88.64％，99.81％和93.48％，明显高于前人研究成果。因此生产上应根据不同的使用目的而选择相应的栽培基质配方，旨在为高品质黑皮鸡枞菌规模化生产及其功能产品的开发和利用提供理论依据。

Description

一种栽培培养基在黑皮鸡枞菌中的应用

技术领域

本发明涉及农业生产技术领域，特别的涉及一种栽培培养基在用于黑皮鸡枞菌中的应用。

背景技术

黑皮鸡枞菌，又名长根金钱菌、露水鸡枞菌、长根小奥德蘑等，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、小奥德蘑属。中偏高温型菇类，是珍稀且药食用价值极高的食用菌，与松茸、羊肚、黑虎掌同列为我国四大名菌，被誉为菌中之冠。黑皮鸡枞菌不同于香菇、木耳等季节性食用菌，它一年四季都能采摘，在市场很受欢迎。黑皮鸡枞菌口感独特、肉质细嫩，富含蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素，生食、熟食皆可，备受人们青睐，是食药用菌中的上品。

现如今黑皮鸡枞菌在种植和管理技术上都已经有所建树，如发明专利CN112913578A公开了一种黑皮鸡枞菌的种植培育方法，包括荔枝木糠的制备、母种的制备、原种的制备、栽培种的制备及人工栽植，原种是由荔枝木糠、麦麸、石灰、石膏、红糖通过搅拌得到配制好的原种培养料，原种培养料灭菌后，无菌条件下将母种转接在原种培养料中，扩大繁殖，栽培种的栽培原料与原种的一致，将原种接入栽培料中，待菌丝长满栽培袋即可进行人工栽植。发明专利CN107299063B公开了一种黑皮鸡枞菌液体菌种制备方法，包括如下步骤：(1)培养基配制；(2)培养基灭菌；(3)菌种接种；(4)发酵培养；将步骤(3)中振荡培养好的液体菌种置于发酵罐中，在28～30℃的条件下，发酵培养3～5d。其中，培养基中含有麦芽营养液300～400g、葡萄汁100～200g、蛋白胨1～3g、石膏粉0.5～1g、构树发酵粉3～6g和余量的水。上述方法虽然解决了黑皮鸡枞菌的人工培养，但随着社会的发展，人们生活水平日益提高的同时，人们对食品的选择性也有所提高，营养价值无疑是很重要的一方面，如何提高食品的营养价值也成为了当今的研究热点。

大量研究成果表明，在可食植物中既含有营养素等食物成分、又含有抗氧化剂或与抗氧化剂有关的、有益健康的、可延缓衰老的、或对某些疾病防治有效的化学成分如植物化合物。已知很多的天然抗氧化剂就是植物化合物，如植物多酚。从食用菌中提取的多糖、蛋白质和多酚等有效物质可用于药物研发和临床治疗，增强医疗保健功能或开发新食品。尽管营养成分和抗氧化活性广泛存在于食用菌中，但是不同食用菌中的含量和结构差异性很大，并且含量受诸多因素的影响，如培养基质、条件等。多酚类物质在食用菌中的含量同样也因品种不同而差异性较大，导致其活性差异较大，对人体具有不同的生理功能，对其药用价值的开发利用方向也不尽相同。目前，在黑皮鸡枞菌的营养成分和抗氧化活性上的研究相对较少。研究黑皮鸡枞菌的栽培配方和其子实体营养成分的相关性更未见报道。因此有关黑皮鸡枞菌的开发利用受到极大的限制。鉴于传统合成的抗氧化剂存在毒性和不安全性，因此从天然物质中提取无毒、安全的抗氧化活性物质是人们在回归大自然的绿色保健浪潮下的必然选择，所以研究开发天然抗氧化物已引起各国科学家的高度重视。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种栽培培养基在黑皮鸡枞菌中的应用，探讨栽培基质种类与子实体营养间的相关性，为高品质黑皮鸡枞菌规模化栽培基质的选择及其功能产品的开发利用提供理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种栽培培养基用于黑皮鸡枞菌高效生产营养成分中的应用，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35～55％、棉籽壳10～30％、麦麸10～20％、石灰1～2％、石膏1％，余量为玉米芯。

作为优选的，所述营养成分为蛋白质和/或多酚。

作为优选的，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35～55％、棉籽壳10～30％、麦麸20％、石灰1.0％、石膏1.0％，余量为玉米芯。这样栽培得到的子实体中蛋白质含量较高，其中蛋白质含量主要与培养基质中的麦麸含量呈正相关关系。

作为优选的，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟45～55％、棉籽壳20～30％、麦麸10～20％、石灰1.0％、石膏1.0％，余量为玉米芯。这样栽培培养基质中较高的酒糟含量使栽培出的黑皮鸡枞菌子实体中的多酚含量较高。

本发明的另一个目的，还在于提供了一种栽培培养基用于黑皮鸡枞菌提高抗氧化活性中的应用，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35％、棉籽壳20～30％、麦麸15～20％、石灰1.0～1.5％、石膏1％，余量为玉米芯。酒糟的质量分数在35～55％范围内，随着栽培培养基中酒糟含量的增加，反而黑皮鸡枞菌子实体的抗氧化能力有降低的趋势。

作为优选的，所述栽培培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35％、棉籽壳30％、麦麸20％、石灰1.0％，石膏1％，余量为玉米芯。这样栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体的提取液对DPPH自由基和ABTS自由基清除率最高。

作为优选的，所述培养基包括以下质量分数的组分：酒糟35％、棉籽壳20％、麦麸15％、石灰1.5％，石膏1％，余量为玉米芯。这样栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体的提取液对羟自由基清除率最高。

本发明的另一个目的还在于，提供了一种黑皮鸡枞菌高效生产营养成分的培养方法，包括以下步骤：

1)将黑皮鸡枞菌菌丝体接种至母种培养基上，在23～27℃下培养7～10d，得到母种；所述母种培养基包括如下组分：麦麸35g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、硫酸镁2g/L、琼脂20g/L，pH 6.5；

2)将步骤1)的母种接种到原种培养基中，在23～27℃下避光培养40d，得到的原种作为栽培黑皮鸡枞菌的菌种；所述原种培养基包括如下质量分数的组分：棉籽壳61％、果渣15％、麦麸20％、黄豆粉2％、石灰1％、石膏1％；

3)将步骤2)得到的黑皮鸡枞菌菌种接种于上述的栽培培养基中，在23～27℃下培养40～47d即可。

本发明的另一个目的还在于，提供了一种增加黑皮鸡枞菌的抗氧化活性的培养方法，包括以下步骤：

1)将黑皮鸡枞菌菌丝体接种至母种培养基上，在23～27℃下培养7～10d，得到母种；所述母种培养基包括如下组分：麦麸35g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、硫酸镁2g/L、琼脂20g/L，pH 6.5；

2)将步骤1)的母种接种到原种培养基中，在23～27℃下避光培养40d，得到的原种作为栽培黑皮鸡枞菌的菌种；所述原种培养基包括如下质量分数的组分：棉籽壳61％、果渣15％、麦麸20％、黄豆粉2％、石灰1％、石膏1％；

3)将步骤2)得到的黑皮鸡枞菌菌种接种于上述的栽培培养基中，在23～27℃下培养40～47d即可。

作为优选的，步骤3)中所述接种量为10％。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明以人工代料床架式栽培的黑皮鸡枞菌子实体为研究对象，对不同基质配方栽培出的黑皮鸡枞菌子实体的营养成分包括粗蛋白、总糖、维生素C和水分含量进行了测定，并对各配方子实体的多酚含量及其抗氧化活性进行了测定。探讨栽培培养基种类与子实体营养间的相关性，本发明的栽培培养基通过各组分的协同作用不仅能够满足黑皮鸡枞菌菌丝体生长在营养和生理上的要求，还在不同程度上促进了黑皮鸡枞菌营养成分和有效抗氧化活性物质的积累，因此生产上应根据不同的使用目的而选择相应的栽培基质配方，为高品质黑皮鸡枞菌规模化栽培及其功能产品的开发和利用提供理论依据。本发明优化的栽培培养基的配方，可以有针对性的提高栽培产量和有效活性物质的含量，对开发利用该真菌子实体及菌丝体发酵产品具有较大的理论意义和应用价值。

2、采用本发明的培养基栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体中的蛋白质含量、总糖和多酚含量最高分别可以达到42.78％、23.54％和4.19mg/g，较常规方法(安晓雯,王彦立,杨子怡,等.黑皮鸡枞菌营养与质构特性分析及其抗氧化活性评价[J].食品工业科技,2021,42(05):236-242+249.)栽培得到的黑皮鸡枞菌中的蛋白含量提高了12.67％；采用本发明培养基得到的黑皮鸡枞菌子实体中的多酚提取液对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的清除率分别为83.86％，99.81％和93.48％，明显高于前人研究成果。且该培养基配料均为常见化合物，廉价易得，成本低，制备方法简便。为黑皮鸡枞菌的栽培配方与其子实体营养成分的相关性提供了理论依据，同时也为开发天然抗氧化物提供了新的方向，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是葡萄糖的标准曲线图。

图2是没食子酸的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种黑皮鸡枞菌的栽培方法，包括以下步骤：

1)配制培养基

母种培养基包括如下组分：麦麸35g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、硫酸镁2g/L、琼脂20g/L，pH 6.5。按照配方分别称取所需的麦麸、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁。先将称好的麦麸用6～8层的纱布包裹后放入煮锅中，加水200mL煮沸后计时15～30min，再用6～8层的纱布过滤，将滤液倒入500mL大烧杯中，依次加入其它称好的药品，用玻璃棒搅拌至溶解，量取足量的水倒入烧杯中定容。用1mol/L的盐酸溶液将培养基的pH调至6.5，分装试管，封口，装入高压蒸汽锅中灭菌，于121℃灭菌20min。

原种培养基包括如下质量分数的组分：棉籽壳61％、果渣15％、麦麸20％、黄豆粉2％、石灰1％、石膏1％。按上述配方分别称取原料，将称好的棉籽壳和麦麸进行混合，将石灰石膏溶解于拌料用水中，搅拌时边加水边测试含水量。将含水量控制在60％左右。将拌好的培养料装入15cm×24cm×0.05cm的聚丙烯单开口袋中。每袋重量控制在湿重500g，装料时做到松紧适中，袋壁不留空隙，装填好后用木棒在中间打3cm深的孔方便接种，随后盖上无棉盖体装入高压灭菌锅中，126℃灭菌2h。

栽培培养基包括如下质量分数的组分：酒糟35％、棉籽壳30％、麦麸20％、石灰1.0％、石膏1％，玉米芯13％。分别按上述配方进行配料，其中拌料、装袋及灭菌方法同原种培养基制作。

2)将黑皮鸡枞菌菌丝体接种至母种培养基上，在25℃下培养7～10d，长满试管后，即得到母种。

3)将步骤2)的母种接种到原种培养基中，其中1支母种可接种5袋原种培养基，然后将接种后的菌袋置于25℃下避光培养40d，菌丝长满菌袋，即得到的原种作为栽培黑皮鸡枞菌的菌种。

4)将步骤3)培养好的原种放入超净工作台准备接种栽培培养基，用消毒好的镊子将原种取出，接种量约10％，盖上无棉盖体即接种完成，置于25℃恒温培养箱中培养40～47d满袋。培养期间注意观察菌包是否有染菌情况，一经发现立即剔除，记录菌丝生长速度、生长势等情况。将长满菌丝的栽培袋转移至20℃以下的出菇室进行生理后熟，黑皮鸡枞菌菌丝具有生理后熟的特性，约经30～40d菌丝变褐色后把袋口切掉，1周后可现原基，随原基生长，加大空气相对湿度至90％。重庆地区于6月中旬，气温稳定在25℃左右，空气相对湿度80％以上即可出菇，现原基后1周即可采收，采收后停止加湿，再经2～3周即可采收第二潮菇，黑皮鸡枞菌床架式栽培可采收3潮以上，出菇期长达3个多月，生物学效率达62％，既节省了空间，又免去了覆土出菇等繁琐步骤，具有推广和应用价值。

实施例2～9的操作步骤同实施例1，仅栽培培养基组分不同，具体见表1所示。

表1栽培基质配方组合(％)

注：配方不足100％，用玉米芯补充。

二、产物检测

1、蛋白质含量测定

参考GB5009.5-2016食品中蛋白质的测定方法—凯氏定氮法对干燥黑皮鸡枞菌的粗蛋白质含量进行测定。

60℃烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。称取0.2g实施例1～9栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体粉末，移入500mL定氮瓶中，加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，在通风处消化至液体变澄清透明蓝绿色再消化0.5h以确保消化完全。然后定容到100mL容量瓶中，同时做空白试验，再通过定氮蒸馏装置将样液中的氮蒸到接收瓶中，接收瓶加入10mL硼酸和2滴混合指示剂，当接收瓶颜色从粉红色全部变为绿色后再蒸馏3min，冲洗冷凝管下端外部，立即用盐酸溶液进行滴定至终点。同时做试剂空白。结果如表2所示。

黑皮鸡枞菌的蛋白质含量按公式计算：

式中，X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g)。

V₁——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)。

V₂——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)。

C——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。

m——试样的质量，单位为克(g)。

V₃——吸取消化液的体积，单位为毫升(mL)。

F——氮换算为蛋白质的系数，6.25。

0.0140——1.0mL盐酸[c(HCl)＝1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克(g)。

10000——换算系数。

表2不同栽培培养基栽培的黑皮鸡枞菌的蛋白质含量

由表2可以看出，实施例1的蛋白质含量最高为42.78％，但在0.05水平下，实施例1与实施例8、实施例7、实施例6之间的含量差异不显著。其中实施例1、实施例6、实施例8的培养基质中麦麸的含量都是20％，三者的蛋白质含量都比较高。而实施例3、实施例5、实施例7的培养基质中麦麸含量仅为10％，且实施例5的蛋白质含量最低为29.92％，其次为实施例3，两者间差异不显著，除实施例7之外，其余实施例的蛋白质含量均与培养基质中的麦麸含量相对应。故推测子实体中蛋白质含量主要与培养基质中的麦麸含量有关，且呈正相关关系。此外，实施例7、实施例8、实施例9的蛋白质含量总体偏高，且均用55％的酒糟配方栽培的，因此，栽培基质中的酒糟含量可能与蛋白质含量具有一定的相关性。与常规方法(安晓雯,王彦立,杨子怡,等.黑皮鸡枞菌营养与质构特性分析及其抗氧化活性评价[J].食品工业科技,2021,42(05):236-242+249)栽培得到的黑皮鸡枞菌的蛋白质含量30.11％相比，本发明的蛋白含量最高可提高12.67％。

2、总糖含量测定

采用GB/T15672-2009食用菌中总糖的测定方法。

60℃烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。称取0.3g实施例1～9栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体粉末，放入250mL锥形瓶中，加入50mL水和15mL浓盐酸。接上冷凝回流装置，在90℃左右水浴3h。然后过滤，洗涤滤液并定容到250mL容量瓶中。此液为测试液。吸取1mL测试液在10mL试管中，再加入1mL 5％苯酚溶液和5mL浓硫酸，反应液静止10min，再用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放入30℃的水浴锅中水浴20min取适量反应液在490nm波长测出吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线，如图1所示。

黑皮鸡枞菌的总糖含量按公式计算：

式中，X——试样中总糖的含量，单位为克每百克(g/100g)。

V₁——实施例定容体积，单位为毫升(mL)。

V₂——比色测定时所移取实施例测定液体积，单位为毫升(mL)。

m₁——从标准曲线上查得实施例测定液中的含糖量，单位为微克(μg)。

m₂——实施例质量，单位为克(g)。

ω——实施例含水量，％。

10000——换算系数。

表3不同栽培培养基栽培的黑皮鸡枞菌的总糖含量

从表3可以看出，实施例4的总糖含量最高为23.54％。在0.05水平下，实施例4与除实施例7和实施例1之外的其余6个实施例间的含量差异不显著，而实施例1的总糖含量最低，其与实施例7的总糖含量间差异不显著，由于实施例4与实施例7和实施例1之间的总糖含量差异显著，而三者所用栽培基质中的棉籽壳含量都为30％，故子实体中总糖含量和培养料中棉籽壳的含量没有关系。与常规方法(安晓雯,王彦立,杨子怡,等.黑皮鸡枞菌营养与质构特性分析及其抗氧化活性评价[J].食品工业科技,2021,42(05):236-242+249)栽培得到的黑皮鸡枞菌的总糖含量相比，本发明得到的总糖含量稍低，推测可能是实验水解过程中水浴锅的温度没有维持在100℃导致糖类水解不完全，糖类未完全转化为可溶性糖，所以所测结果偏低。

3、维生素C含量测定

采用GB5009.86-2016食品中抗坏血酸的测定—2,6-二氯靛酚滴定法。

60℃烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。取1g实施例1～9栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体粉末，加入10g草酸溶液，迅速捣成匀浆，定容到100mL容量瓶，摇匀后过滤。准确吸取10mL滤液于50mL锥形瓶中，用标定的2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15s不褪色为止，同时做空白试验。

黑皮鸡枞菌的维生素C含量按公式计算：

式中，X——试样中抗坏血酸的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)。

V₁——滴定抗坏血酸标准溶液所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升(mL)。

T——2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数，单位为毫克每毫升(mg/mL)。

V₀——滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升(mL)。

A——稀释倍数。

m——试样质量，单位为克(g)。

表4不同栽培培养基栽培的黑皮鸡枞菌的维生素C含量

由表4可以看出，实施例7的维生素C含量最高为4.32mg/100g，在0.05水平下，其与实施例2和实施例6的维生素C含量差异不显著。由于实施例7、实施例2和实施例6培养基质中的石灰含量均为1.5％。故推测维生素C的含量与培养基质中的石灰含量可能有关，当石灰含量达到1.5％会使维生素C含量增加，而石灰含量过高或过低均不利于栽培子实体中维生素C的积累。维生素C具有比较强的抗氧化活性，含量高证明其抗氧化活性好。而实施例5、实施例8和实施例9的维生素C含量最低，其与实施例1、实施例4、实施例3之间的含量差异不显著。

4、水分含量测定

参照GB 5009.3-2016食品中水分的测定--直接干燥法。

取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于101～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重，此值记为m₁。将样品尽可能切碎，称取0.5g实施例1～9栽培得到的黑皮鸡枞菌子实体粉末(试样)，放入此称量瓶中，加盖，精密称量后，此值记为m₂。置于101～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重，此值记为m₃。

试样中的水分含量，按公式进行计算:

结果如表5所示。

表5不同栽培培养基栽培的黑皮鸡枞菌的水分含量

由表5可以看出，实施例3的水分含量最低为10.81％，其与实施例1、实施例4、实施例9之间的水分含量差异不显著，而实施例8的水分含量最高为16.06％，其与实施例7、2、5和6之间的水分含量差异不显著，可以看出培养基质配比与子实体中的水分含量并没有明显的联系。

5、黑皮鸡枞菌中多酚含量的测定

配制标准浓度为0、4、12、20、30、40、60、80、100、120(μg/mL)的没食子酸溶液。加50μL样品(或标准溶液)于96孔板中---加10μL福林-酚试剂，让样品充分混合，保持6min(时间范围5～8min)----加入100μL 7％Na₂CO₃溶液和80μL去离子水，充分混合后保持90min(时间范围1～2h)---于760nm处在酶标仪上读数，对照标准曲线计算样品总酚含量，以当量表示，制备没食子酸标准曲线，结果如图2所示。称取实施例1～9栽培得到的黑皮鸡枞菌粉0.3g，以乙醇浓度85％液相，物液比为1:44，超声时间为38min提取多酚。将提取液装入离心管中离心，得到上清液为待测液。将待测液按照上述方法进行吸光度检测，并将其带入得到的没食子酸标准曲线中得到待测液中多酚含量，结果如表6所示。

表6不同栽培培养基栽培的黑皮鸡枞菌的多酚含量

由表6可以看出，实施例6的多酚含量最低为3.59mg/g。对定量分析结果进行单因素方差分析和多重比较分析发现，在0.05水平下，其与实施例2间的多酚含量差异不显著；而实施例9的多酚含量最高为4.19mg/g，其与实施例4的多酚含量间差异不显著，两者与其它实施例间的含量差异均达到了显著性水平。由实施例4与实施例9、实施例5之间差异不显著来分析，实施例9的栽培基质中酒糟的含量最高，为55％，而实施例4和实施例5的栽培基质中酒糟的含量均为45％，故推测可能是培养基质中较高的酒糟含量使栽培出的黑皮鸡枞菌子实体中的多酚含量较高。

6、对DPPH自由基清除能力的测定

按照DPPH试剂盒的方法，分别吸0μL、50μL、100μL、150μL、200μL试样(多酚提取液)溶液于试管中，加入400μL工作液(DPPH试剂盒中配制的，无水乙醇：试剂＝21:4)。再依次加入250μL、200μL、150μL、100μL、50μL无水乙醇混合均匀后静置30min。用酶标仪在515nm波长下测定其吸光度。其中0μL样液的吸光度值为A₀，其它浓度的样液记为A。

试样对DPPH自由基清除率按公式进行计算：

表7多酚提取液对DPPH自由基的清除率

注：数据以均值+标准差表示，表中标注的小写字母表示在0.05水平上的差异显著性，下同。

9个实施例的多酚提取液对DPPH自由基清除率的影响如表7所示，当多酚提取液添加量在50～150μL时，对DPPH自由基的清除率随样液增加而增大，呈线性关系。在多酚提取液添加量高于150μL低于200μL时，对DPPH自由基的清除率变化不大，除了实施例1、实施例4、实施例9的多酚提取液对DPPH自由基的清除率降低外，其余6个实施例均是随多酚提取液添加而增大，只是增加趋于平缓。当清除率达到73％附近时，曲线斜率变得很平缓，表明继续加大样液对DPPH自由基的清除率基本不变，说明对DPPH自由基已清除完全。当多酚提取液添加量处于50μL时，9个实施例的多酚提取液对DPPH自由基的清除率最低，在16.47％～31.92％，当多酚提取液添加量在150～200μL时，黑皮鸡枞菌多酚对DPPH自由基的清除率最高，在67.21％～88.64％。9个实施例的多酚提取液对DPPH自由基清除能力表现为实施例1>实施例4>实施例3>实施例2>实施例6>实施例5>实施例8>实施例7>实施例9，其中实施例1的多酚提取液对DPPH自由基的清除率与其余8个实施例间的达到了差异显著性水平。从培养基质组成上来看，有随着酒糟含量的增加，抗氧化能力减弱的趋势。

7、对ABTS⁺的清除能力测定

ABTS二铵盐储备液(7.4mmol/L)：取ABTS二铵盐3mg，加蒸馏水0.735mL。

过二硫酸钾(K₂S₂O₈)储备液(2.6mmol/L)：取K₂S₂O₈1 mg，加蒸馏水1.43mL。

将ABTS二铵盐储备液和过二硫酸钾(K₂S₂O₈)储备液按1：1配制，再用无水乙醇稀释28倍，测得吸光度为0.71。此稀释液为ABTS工作液。

分别吸取0μL、10μL、20μL、30μL、40μL实施例多酚提取溶液于试管中，然后加600μLABTS工作液，定容至750μL，混匀，放置6min，734nm下测定吸光值。其中0μL的样液的吸光度值为A₀，其他浓度的样液记为A。

试样对ABTS⁺自由基清除率按下式进行计算:

表8多酚提取液对ABTS⁺的清除率

由表8可以看出，各实施例黑皮鸡枞菌的多酚提取样液添加量对ABTS自由基清除率呈正相关。当多酚提取样液添加量低于30μL时，对ABTS自由基的清除率随添加液体积变化很大，基本上呈线性关系。当清除率达到90％附近时，曲线斜率变得很平缓，当多酚提取样液添加量为40μL时，对ABTS自由基的清除率最高。并且均具有很强的清除能力，实施例1更是达到了99.81±0.79％，其次为实施例3(99.51±3.59％)，两者间的差异不显著，再次为实施例2(96.05±0.51％)，而实施例1、3和实施例2的栽培基质中均含有35％的酒糟含量，这可能与栽培基质中含有相对较低的酒糟含量有关。其它实施例得到的多酚提取液对ABTS自由基的清除能力表现为实施例4>实施例5>实施例9>实施例8>实施例7>实施例6。从培养基质组成来看，总体上有随着酒糟含量的增加，对ABTS自由基清除能力减弱的趋势，这与上个实验实施例多酚对DPPH自由基清除率的结果相一致。

8、对·OH清除能力测定

400μL·OH母体溶液(7.5mmol/L FeSO₄∶7.5mmol/L H₂O₂∶7.5mmol/L水杨酸按1∶2∶1混合)分别加入50μL、100μL、150μL、250μL的实施例得到的多酚提取液，用去离子水定容到750μL，37℃水浴15min，在530nm下测定各组的吸光值为A₁，将·OH母体溶液用相同体积的去离子水代替，其它方法相同，测定吸光度为A₂；将实施例得到的多酚提取液/总提取液用同等体积的去离子水代替，其它操作相同，记为A₀。

试样对·OH自由基清除率按下式进行计算:

表9多酚提取液对·OH的清除率

由表9可以看出，当多酚提取样液添加量在250μL以下时，黑皮鸡枞菌多酚提取样液添加量和羟基清除率呈线性关系。当清除率在80％附近时，曲线斜率很小，表示随着多酚提取液的增加对羟自由基清除率的影响基本不变，说明羟自由基的清除率已经完全。其中实施例2的羟自由基清除率最高为93.48±1.56％，与其余8个实施例多酚提取液对羟自由基清除率达到了差异显著性水平，具体表现为实施例4>实施例1>实施例8>实施例6>>实施例9>实施例7>实施例5>实施例3。从培养基质组成上来看，实施例3、实施例5、实施例7的麦麸含量都为10％，且对羟自由基的清除率都较低。实施例1、实施例6、实施例8的麦麸含量均为20％，三者整体的抗氧化能力强于栽培基质中含10％麦麸的实施例3、实施例5、实施例7。而实施例2和实施例4栽培基质中的麦麸含量为15％，羟自由基清除率最高，高于90％，说明适量添加栽培基质中的麦麸含量可提高子实体多酚的羟自由基清除率，过高或过低均会降低其清除率。

综上，卢彩会等人研究表明黑皮鸡枞菌多酚提取物对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的最高清除能力分别为69.51％，98.66％，80％，而本研究采用不同栽培培养基优化得到的黑皮鸡枞菌多酚提取物对三者的最高清除能力分别可以达到83.86％，99.81％和93.48％，明显高于前人的研究结果。由此可见，不同栽培基质对黑皮鸡枞菌的多酚抗氧化能力影响较大。且多酚含量高产配方为酒糟55％、棉籽壳10％、麦麸15％、石灰1.0％，其多酚含量为4.19mg/g，使用该配方栽培子实体的多酚提取液对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的清除率分别为67.21±0.22、90.63±0.70％和85.43±2.80％。而对DPPH自由基和ABTS自由基清除率最高的配方为：酒糟35％、棉籽壳30％、麦麸20％、石灰1.0％，其清除率分别为88.64±0.38％和99.81±0.79％。对羟自由基清除率最高的配方为酒糟35％、棉籽壳20％、麦麸15％、石灰1.5％，其清除率为93.48±1.56％，可见，黑皮鸡枞菌的抗氧化活性主要和多酚有关，但却不完全依赖多酚的含量，可能待测液中还有其他物质影响抗氧化活性。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种黑皮鸡枞菌高效生产蛋白质的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将黑皮鸡枞菌菌丝体接种至母种培养基上，在23～27℃下培养7～10d，得到母种；所述母种培养基包括如下组分：麦麸35g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、硫酸镁2g/L、琼脂20g/L，pH 6.5；

2)将步骤1)的母种接种到原种培养基中，在23～27℃下避光培养40d，得到的原种用于栽培黑皮鸡枞菌的菌种；所述原种培养基包括如下质量分数的组分：棉籽壳61％、果渣15％、麦麸20％、黄豆粉2％、石灰1％、石膏1％；

3)将步骤2)得到的黑皮鸡枞菌菌种接种于栽培培养基中，在23～27℃下培养40～47d；所述栽培培养基包括如下质量分数的组分：酒糟35％、棉籽壳30％、麦麸20％、石灰1％、石膏1％，余量为玉米芯或酒糟55％、棉籽壳20％、麦麸20％、石灰2％、石膏1％，余量为玉米芯。

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