CN110179882A - 一种三白草提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三白草提取物，制备方法如下：将三白草地上部分药材粉碎，采用6～10倍重量份，体积百分比浓度为50％以上的乙醇水溶液回流提取2～3次，每次1～3小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩成密度为1.00～1.20的浸膏，干燥即得所述三白草提取物。本发明还提供了所述的三白草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，进一步地，所述抗肿瘤药物为抗鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌的药物，尤其是，从体内体外验证了该三白草提取物针对鼻咽癌具有良好的抑制作用。

Description

一种三白草提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种中药提取物及其制备方法和用途，特别是涉及一种三白草地上部分提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
鼻咽癌主要发生在我国南方沿海地区，是严重影响我国人民群众身体健康的恶性肿瘤之一。目前治疗鼻咽癌的主要手段为放射治疗，但5年生存率仅50％；晚期鼻咽癌的生存时间更短，5年生存率仅为20％。化学治疗在鼻咽癌病人尤其晚期病例仍占有重要地位。目前临床使用的化学药物如顺铂、氟尿嘧啶及环磷酰胺等对鼻咽癌有一定的疗效，但毒副作用大，往往影响疗程的完成。我国的传统医学在采用天然药物治疗肿瘤方面有丰富的临床经验。中草药药效温和，毒副作用小，可以提高病人的生存质量，延长生存期，具有合成药物不可替代的特点。
三白草Saururus Chinensis(Lour.)baill是三白草科多年生草本植物，主要分布在我国中南、西南地区，资源丰富。中国药典(2015)收载的中药三白草为三白草的干燥地上部分，具有清热解毒、利尿消肿之功效，用于小便不利，淋沥涩痛，白带，尿路感染，肾炎水肿，外治疮疡肿毒，湿疹。三白草中的化学成分主要有木脂素类、黄酮类、生物碱类、挥发油类、鞣质类以及多糖类。三白草具有广泛的药理作用，如抗炎、细胞毒及抗肿瘤活性、神经系统作用、心血管系统作用、调脂作用、降血糖、保肝、抗氧化、免疫抑制等。三白草提取物和单体成分具有抗肿瘤作用，但未见报道三白草提取物抗鼻咽癌等肿瘤研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三白草提取物，该物质来源于植物，成分安全。
本发明的目的还在于提供所述方法制备得到的三白草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，该三白草提取物针对人鼻咽癌细胞(CNE2、CNE1、HONE1、SUNE1)、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh7有一定的抑制效果，且在体内体外针对鼻咽癌细胞具有良好的抑制作用。该提取物应用于抗鼻咽癌有特殊疗效，在制备抗肿瘤药物应用上具有较好的应用前景。
本发明的三白草地上部位提取物，制备方法包括：将三白草地上部分药材粉碎，采用6～10倍重量份，体积百分比浓度在50％以上的乙醇水溶液回流提取2～3次，每次1～3小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩成密度为1.00～1.20的浸膏，干燥即得所述三白草提取物。
优选地，所述乙醇的体积百分比浓度为50～95％(V/V)。
优选地，所述干燥为温度低于60℃下，-0.07～-0.1MPa真空条件干燥3～4h。
优选地，所述浓缩的温度为50～70℃。
更优选地，所述乙醇的体积百分比浓度为90％(V/V)。
更优选地，乙醇用量为药材量的8倍。
更优选地，提取次数为3次，每次提取1h。
更优选地，浓缩的温度为60℃。
更优选地，浓缩真空度为-0.07～-0.1MPa。
更优选地，浓缩后浸膏密度为1.05-1.10。
本发明保护所述的三白草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，进一步地，所述抗肿瘤药物为抗鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提供了一种三白草提取物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该物质来源于植物，成分安全，进一步地，所述抗肿瘤药物为抗鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌的药物，尤其是，从体内体外验证了该三白草提取物针对鼻咽癌具有良好的抑制作用。
附图说明
图1为三白草提取物抗肿瘤试验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1三白草提取物的制备
三白草地上部分药材粉碎成粗粉，采用8倍重量份90％(V/V)乙醇水溶液回流3次，每次1小时，滤过，合并3次滤液，在60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下浓缩回收乙醇至密度为1.05-1.10的浸膏，浸膏于60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下干燥4h。
实施例2
三白草地上部分药材粉碎成粗粉，采用6倍重量份50％(V/V)乙醇水溶液回流3次，每次1小时，滤过，合并3次滤液，在60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下浓缩回收乙醇至密度为1.05-1.10的浸膏，浸膏于60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下干燥4h。
实施例3
三白草地上部分药材粉碎成粗粉，采用10倍重量份95％(V/V)乙醇水溶液回流3次，每次1小时，滤过，合并3次滤液，在60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下浓缩回收乙醇至密度为1.05-1.10的浸膏，浸膏于60℃和-0.07～-0.1MPa真空条件下干燥4h。
实验例：
本发明人采用实施例1所得三白草提取物对各种肿瘤细胞进行了体外和体内抗肿瘤实验。体外抗肿瘤实验采用MTT法，筛选的肿瘤细胞有人鼻咽癌细胞(CNE2、CNE1、HONE1、SUNE1)、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh7，体内实验采用人癌异体移植模型，实验动物采用BALB/c裸鼠，阳性药为顺铂，考察了CNE2鼻咽癌接种裸鼠抗肿瘤情况。
以下通过实验数据说明本发明所述三白草提取物具有抗肿瘤方面的有益效果。
一、体外MTT法测定三白草提取物对人肿瘤细胞株的抑制作用。
1、实验材料及配制
(1)细胞株：人鼻咽(CNE2、CNE1、HONE1、SUNE1)、人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Huh7
(2)RPMI1640培养基：添加10％胎牛血清(GIBCO)、双抗。
(3)0.25％胰蛋白酶溶液(GIBCOBRL)。
(4)磷酸缓冲溶液(PBS)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，溶于1升双蒸水，121℃高压消毒20min，4℃保存。
(5)噻唑蓝(MTT,Sigma)溶液：用PBS配成5mg/mL溶液
2、实验方法
样品对上述细胞株的抑制作用通过MTT法测得。
具体步骤如下：
(1)细胞培养：①将细胞从液氮中取出，在37℃水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作台中移入10mL无菌离心管中加6mL细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟。弃去上清液，沉淀中加入5～6mL细胞培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养皿中，置37℃细胞培养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞皿中细胞培养基，加入5～6mL细胞培养基，置37℃细胞培养箱内。③隔日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞皿中细胞培养基，加入PBS(pH＝7.4)2～3mL晃动清洗，倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。在培养皿中加入3～5滴0.25％胰蛋白酶溶液晃动均匀，加盖置于37℃细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察发现细胞自培养瓶壁上脱离，加细胞培养基2mL，滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后，分别移入2个干净培养皿中，加入细胞培养基5～6mL吹打均匀，置于37℃细胞培养箱内。④隔日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生长期。
(2)药物溶液制备方法：取适量三白草提取物，溶于适量DMSO中，配成适当浓度的样品储备液，顺铂用生理盐水溶解配成10μM的储备液。
(3)细胞毒性实验(MTT法)
取对数生长期细胞按每孔1×103-5×103个细胞接种于96孔板中，24h后换液，加入受试药物100μL，每个浓度设3个复孔，另设阴性对照组(仅加入培养基)、阳性药对照组。置5％CO2培养箱内作用48h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h后弃去上清液，加入150μL二甲基亚砜，摇匀10min，使结晶物完全溶解，于492nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值(A)，计算抑制率(IR)。
3、实验结果
表1三白草提取物对8种人肿瘤细胞的抑制效果
4、结论
本发明的三白草提取物在体外对上述8种人肿瘤细胞株有不同程度的抑制作用。
二、测定本发明三白草提取物对移植于裸鼠的人体肿瘤鼻咽癌CNE2的抑制率。
1、实验材料
本发明三白草提取物，顺铂注射液(6mL:30mg江苏豪森药业股份有限公司)、生理盐水
2、实验方法
取对数生长期的CNE2细胞经0.25％胰酶消化后用无血清培养液离心洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度为1×106个/mL，0.4％台盼蓝染色法活细胞计数>98％。无菌条件下用带6号针头的注射器抽取0.1mL细胞悬液接种于经75％酒精消毒的裸鼠背部靠右侧腋窝皮下。接种裸鼠皮下肿瘤体积达到100mm3，裸鼠移植瘤模型建立。
动物的分组及处理方案:用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)、短径(b)，按公式计算移植瘤体积。当移植瘤直径长至100mm3时，将荷瘤裸鼠随机分成6组，分别为溶媒对照(20mL/kg)、顺铂组(5mg/kg)、三白草0.5g生药/kg剂量组、三白草1.0g生药/kg剂量组、三白草2.0g生药/kg剂量组、三白草4.0g生药/kg剂量组、三白草6.0g生药/kg剂量组。溶媒组和三白草提取物组为每天灌胃给药，给药容积为0.2mL/10g；顺铂为每周一次腹腔注射给药，给药容积为0.1mL/10g。各组10只，均为雄性，实验为时3周。治疗过程中，每2-3天测量1次各组裸鼠的体重和瘤体大小，用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径(b)，计算肿瘤体积(V)。观察至给药21d，根据需要取血和组织材料，分析相关指标，最后颈椎脱臼致死，取瘤组织，称瘤重。绘制生长曲线，计算抑瘤率。
3、实验结果(如图1所示)
表2三白草提取物对人鼻咽癌CNE2裸鼠模型抗肿瘤疗效(以肿瘤重量计)
与阴性对照比，*P<0.01
5、实验结论
本发明三白草提取物在0.5g生药/kg、1.0g生药/kg、2.0g生药/kg、4.0g生药/kg、6.0g生药/kg剂量均有抑制裸鼠人鼻咽癌CNE2生长的作用，其中4.0g生药/kg剂量效果和安全性较好。

Claims (8)

1.一种三白草提取物，其特征在于，制备方法如下：将三白草地上部分药材粉碎，采用6～10倍重量份，体积百分比浓度为50％以上的乙醇水溶液回流提取2～3次，每次1～3小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩成密度为1.00～1.20的浸膏，干燥即得所述三白草提取物。
2.根据权利要求1所述的三白草提取物，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为50～95％。
3.根据权利要求1所述的三白草提取物，其特征在于，所述干燥为温度低于60℃下，-0.07～-0.1MPa真空条件干燥3～4h。
4.根据权利要求1所述的三白草提取物，其特征在于，所述浓缩的温度为50～70℃。
5.根据权利要求1或2所述的三白草提取物，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为90％。
6.根据权利要求5所述的三白草提取物，其特征在于，乙醇水溶液为药材量的8倍。
7.权利要求1所述的三白草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌的药物。
8.根据权利要求7所述三白草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗鼻咽癌的药物。
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