CN103566008A - 一种三白草提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种三白草提取物在制备防治EB病毒感染的药物中的新应用，并且给出5种新的化合物，另外再给出三白草提取物的制备方法，本发明提供的三白草提取物对EB病毒有良好的治疗能力，且毒副作用低，是一种有效的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分和药物技术领域，更具体地，涉及一种三白草提取物及其制备方法和应用。
背景技术
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于癌病毒家族中疱疹病毒的γ亚家族，属于γ型人类疱疹病毒。1964年Epstein、Barr等成功的培养非洲恶性淋巴瘤的细胞并首先提取病毒颗粒。EBV感染的靶细胞主要是B淋巴细胞和上皮细胞，还包括一些间质细胞以及Ｔ淋巴细胞，被感染细胞可呈现形态变化和恶性增殖等变化，并表达多种EBV病毒基因，改变细胞正常生理状态，引起患者疾病。EB病毒与多种人类肿瘤发生有关，如Burkitt’s淋巴瘤、何杰金病、鼻咽癌以及胃癌等。虽然已经证实EBV感染可引发以上多种疾病，但目前为止并没有一种针对γ疱疹病毒的特效药。尽管现有的治疗药物包括嘌呤核苷类似物对α和β亚型疱疹病毒感染均有较理想的抑制效果，但对EBV引起的相关疾病并无明显效果，目前医药界迫切需要针对EBV感染疾病的特效药，从而改善γ型人类疱疹病毒相关恶性疾病的治疗效果。从中草药中发现天然抗疱疹病毒活性化合物或先导物是目前国内外研究的重要的方面和非常活跃的领域。至今发现的一些天然化合物具有抗EBV活性，分属于倍半萜、三萜、黄酮类等。目前约有近百个品种正在进行临床前研究和临床实验。从天然生物资源寻找新的抗疱疹病毒药物或先导化合物的研究，是国内外新药研制中非常活跃的领域。现有技术中未见有三白草提取物及其木质素成分的抗EBV病毒裂解复制活性的报道，此外也没有该化合物抑制病毒裂解复制的报道。
发明内容
本发明的目的提供一种三白草提取物在制备防治EB病毒感染的药物中的应用。
本发明的另一目的提供所述的的三白草提取物的制备方法。
上述的三白草提取物的制备方法，将三白草（saururuschinensis）全草，晒干，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并浓缩液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部分。乙酸乙酯部分先过硅胶（200-300目）层析柱，使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到10个部分。各部分再分别过硅胶柱，反相C18柱和半制备液相色谱柱，反复分离纯化得到。
所述的石油醚-乙酸乙酯中的石油醚和乙酸乙酯的体积比为100：0、95：5、90：10、80：20、70：30、60：40、50:50、40:60、30:70或0:100。
由于本发明提供的三白草提取物中有5个新的化合物，因此提供所述的提取物的结构式为
、、
、
或
。
本发明的优点在于该提取物为植物的95%乙醇提取物，抗病毒效果好，毒性小，安全有效。
附图说明
图1为五种新化合物的核磁数据。
图2为SaurucinolA的药理活性数据。
图3为SaurucinolA的细胞毒性。
图4为Saurucinol B的药理活性数据。
图5为Saurucinol B的细胞毒性。
图6为4"-O-demethylmanassantin A的药理活性数据。
图7为4"-O-demethylmanassantin A的细胞毒性。
图8为3"-O-demethylmanassantin B的药理活性数据。
图9为3"-O-demethylmanassantin B的细胞毒性。
图10为Manassantin A的药理活性数据。
图11为Manassantin A的细胞毒性。
图12为Manassantin B的药理活性数据。
图13为Manassantin B的细胞毒性。
图14为4-O-demethylmanassantin B的药理活性数据。
图15为4-O-demethylmanassantin B的细胞毒性。
图16为(-)-(7″R, 8″R)-saucerneol J的药理活性数据。
图17为(-)-(7″R, 8″R)-saucerneol J的细胞毒性。
图18为Saucerneol methyl ether的药理活性数据。
图19为Saucerneol methyl ether的细胞毒性。
图20为Saucerneol D的药理活性数据。
图21为Saucerneol D的细胞毒性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1
从三白草（Saururuschinensis）中制备化合物式（I）和式（II）的方法：
三白草（Saururuschinensis）全株（5kg），晒干，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并浓缩液，得粗提物（296g），分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯（68g）部分直接经硅胶柱层析（1500g，200-300目，7.0×100cm），用石油醚-乙酸乙酯（100：0，95：5，90：10，80：20，70：30，60：40，V/V）梯度洗脱，每500mL收集一份，TLC检测合并相同部分，共得到九个流分Fr. A-I。Fr. C（15g）部分经硅胶柱层析（250g，200-300目，4.5×60cm），用石油醚-乙酸乙酯（90:10，V/V）洗脱，得到四个流份Fr.C1-4，Fr.C1（2g）经Sephadex LH-20，用氯仿-甲醇（200:1）洗脱，得以下10种化合物
化合物1（新化合物）：
Saurucinol A (1): 白色粉末; [α]20 D ?287.7 (c 0.014, CHCl3); UV (MeOH) λ max (log ε) 212 (4.37), 230 (4.44), 280 (4.35) nm; CD (MeOH) λ max (Δε) 217 (?0.068), 348 (?0.200), 375 (+0.007) nm; IR ν max 3449, 3367, 2924, 2853, 1658, 1511, 1261, 1219, 771 cm-1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) and 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) data, see Table 1; HRESIMS m/z 753.2892 [M +Na]+ (calcd for C41H46O12Na, 753.2882). 。
化合物2（新化合物）：
Saurucinol B(2): 白色无定型固体; [α]20 D ?80.0 (c 0.011, CHCl3); UV (MeOH) λ max (log ε) 214 (4.28), 233 (4.37), 279 (4.00) nm; CD (MeOH) λ max (Δε) 207 (?0.095), 283 (?0.099) nm; IR (KBr) ν max 3477，2925，2853，1660，1512，1264，1219，1035，771 cm-1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) and 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) data, see Table 1; positive HRESIMS m/z 747.3362 [M+1]+ (calcd for C42H51O12, 747.3375).。
化合物3（新化合物）：
4″-O-demethylmanassantin A(3): 白色无定型固体; [α]20 D ?34.6 (c 0.026, CHCl3); UV (MeOH) λmax (log ε) 210 (4.49), 231 (4.37), 280 (3.88) nm, CD (MeOH) λ max (Δε) 220 (?0.169), 278 (?0.051) nm; IR (KBr) ν max 3483, 2963, 2930, 1512, 1263, 1219, 1031, 771 cm-1, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) and 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) data, see Table 1; HRESIMS m/z 741.3245 [M+Na]+ (calcd for C41H50O11Na, 741.3294).。
化合物4（新化合物）：
3″-O-demethylmanassantin B (4): 白色无定型固体; [α]20 D ?111.7 (c 0.017, CHCl3); UV (MeOH) λ max (log ε) 208 (4.44), 231 (4.03), 286 (3.61) nm; CD (MeOH) λ max (Δε) 220 (?0.074), 290 (?0.034) nm; IR (KBr) ν max 3499, 2963, 2926, 1596, 1506, 1452, 1262, 1035, 755 cm-1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) and 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) data, see Table 1; HRESIMS m/z 725.2950 [M +Na]+ (calcd for C40H46O11Na, 725.2932).。
化合物5（已知化合物）：
名称为Manassantin A。
化合物6（已知化合物）：
名称为Manassantin B。
化合物7（已知化合物）
名称为4-O-demethylmanassantin B。
化合物8（新化合物）
(-)-(7″R, 8″R)-saucerneol J (8): 白色粉末; [α]20 D –85.7 (c 0.021, CHCl3); UV (MeOH) λmax (log ε) 212(4.27), 231 (4.28), 280 (3.89) nm; CD (MeOH) λmax (Δε) 220 (?0.023), 278 (?0.012) nm; IR (KBr) νmax 3499, 2961, 1607, 1513, 1459, 1376, 1269, 1224, 1132, 1032, 764 cm-1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) and 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) data, see Table 1, HRESIMS m/z 547.2334 [M+Na]+ (calcd for C30H36O8Na, 547.2302).。
化合物9（已知化合物）
化合物10（已知化合物）
名称为Saucerneol D
其中化合物1、2、3、4和8的氢谱和碳谱如图1所示。
实施例2 实施例1所得的10个化合物的药效相关实验
本发明化合物1~10对EBV裂解复制抑制活性测定。
（1）细胞培养。体外培养P3HR-1细胞（原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期的EBV）。使用含有10%胎牛血清，链霉素 (100 微克/毫升),青霉素(100 单位/毫升)的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
（2）药物干预。调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3×105cells/ml,使用20ng/ml Tetradecanoylphorbol acetate（TPA）和丁酸钠 (0.3 mM)诱导P3HR-1细胞进入裂解复制期。使用DMSO将待测化合物配置不同浓度的药物溶液。P3HR-1细胞经TPA处理3小时后，对细胞进行不同浓度的化合物1~10处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不进行TPA诱导和不经化合物处理的对照组进行比较。
（3）测试方法。P3HR-1细胞经TPA诱导2天后收集细胞，提取细胞总DNA。应用实时定量PCR技术，使用LightCyclerFastStart DNA MasterPlus SYBR green 试剂盒、EBNA1引物（sense: 5'-CATTGAGTCGTCTCCCCTTTGGAAT-3'; antisense: 5'-TCATAACAAGGTCCTTAATCGCATC-3'）和GAPDH引物分别检测上述细胞总DNA中EBNA1和GADPH的拷贝数，并计算EBNA1/GADPH的相对比值。
（4）结果处理。按照公式：EBV裂解复制相对抑制数=（EBNA1/GAPDH TPA+&compound+- EBNA1/GAPDH TPA-&compound+）/（EBNA1/GAPDH TPA+&compound- - EBNA1/GAPDH TPA-&compound-）计算各化合物在不同浓度下的EBV裂解复制相对抑制数。以EBV相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对EBV裂解复制的抑制曲线图，并计算各药物的复制半数抑制剂量（IC50）以评价各化合物对EBV裂解复制的抑制活性。如表1所示，化合物1~10的IC50。说明化合物1~10能有效抑制EBV裂解复制。
表1 化合物1~10的抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性
| 化合物编号 | 化合物名称 | IC50（μM） | CC50（μM） | Selectivity Index (SI) |
| 1 | SaurucinolA | 16.2 | >200 | 12.4 |
| 2 | Saurucinol B | 14.5 | 64.8 | 4.4 |
| 3 | 4"-O-demethylmanassantin A | 7.50 | 69.5 | 9.2 |
| 4 | 3"-O-demethylmanassantin B | 2.69 | 26.5 | 20.2 |
| 5 | Manassantin A | 3.42 | >200 | 58.5 |
| 6 | Manassantin B | 1.72 | >200 | 116.4 |
| 7 | 4-O-demethylmanassantin B | 3.52 | 70.8 | 20.2 |
| 8 | (-)-(7″R, 8″R)-saucerneol J | 6.95 | 23.2 | 3.3 |
| 9 | Saucerneol methyl ether | 1.70 | 110.2 | 65.0 |
| 10 | Saucerneol D | 1.09 | 45.0 | 41.1 |
实施例3本发明化合物1~10对宿主细胞毒性测试
（1）细胞培养。体外培养P3HR-1细胞（原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期的EBV）。使用含有10%胎牛血清，400ug/mlG418，100ng/ml多西环素的RPMI1640培养基，在37 ℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
（2）测试方法。调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3×105cells/ml,使用不同浓度化合物处理细胞，每个浓度设3个平行复孔，2天后使用台盼蓝染色，光镜下计数活细胞数。
（3）结果处理。按照公式：相对毒性=1-live cellcompound+/ live cellcompound_计算各化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量（CC50），用于评价各化合物的细胞毒性。另按照公式：选择抑制常数（SI）=CC50/IC50计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。如图2~11所示，说明化合物1~10对EBV的裂解复制抑制活性有很高的选择性，药用安全性很高，有很高的成药性。
Claims (7)
1.一种三白草提取物在制备防治EB病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的三白草提取物含有如下化合物：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的提取物为二聚新木质素和倍半木质素。
4.一种权利要1中所述的三白草提取物的制备方法，其特征在于，将三白草（saururuschinensis）根，晒干，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并浓缩液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分过硅胶柱，再分别使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，反复分离得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所述的石油醚-乙酸乙酯中的石油醚和乙酸乙酯的体积比为100：0、95：5、90：10、80：20、70：30、60：40、50:50、40:60、30:70或0:100。
6.一种三白草提取物，其特征在于，所述的提取物的结构式为
、
、、
或
。
7.用于抗EBV的药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求2中所述的化合物和/或药学上可接受的载体。
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