CN104644743A - 一种半枝莲提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药材提取技术领域，具体公开了一种半枝莲提取物及其制备方法和应用。本发明从半枝莲提取物中分离得到2种新结构的化合物和2种已知结构的化合物，这4种化合物对EB病毒复制有良好的抑制作用，且毒副作用低，因此，这4种化合物在制备防治EB病毒感染的药物中具有很大的应用前景。

Description

一种半枝莲提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药材提取技术领域，更具体地，涉及一种半枝莲提取物及其制备方法和应用。

背景技术

人类疱疹病毒根据其生物学特征可分为α、β和γ三种亚型，其中EB病毒(Epstein-Barr virus)属于γ亚型，也称为4型人类疱疹病毒(HHV-4)。EB病毒是1964年Epstein和Barr最先从非洲儿童恶性淋巴瘤(Burkitt lymphoma)体外培养的淋巴瘤细胞系中，用电镜发现的一种新的疱疹病毒，并命名为EB病毒。EBV的基因组为线性双链DNA，长度172kb，编码约100个基因。与人类疱疹病毒一样，EBV有两种生活周期，潜伏期和裂解期。在潜伏期EBV只表达少量的基因以逃逸宿主的杀伤；而在裂解期EBV表达几乎全部的基因，病毒进行大量复制以维持其生命活动并使疾病进展。EBV编码的早期基因ZTA和RTA表达可以启动下游大量基因表达，使EBV由潜伏期进入裂解期。EBV可以感染人类的B淋巴细胞、上皮细胞和NK/T细胞等。与EBV相关的人类疾病有传染性单核细胞增多症、慢性活动性EBV感染、EBV相关嗜血淋巴组织细胞增生症、Burkitt’s淋巴瘤、何杰金病、鼻咽癌等。虽然已经证实EBV感染可以引起上述疾病，但目前还没有一种针对于γ疱疹病毒的特效药。目前医药界迫切需要针对EBV感染疾病的特效药，从而改善γ型人类疱疹病毒相关恶性疾病的治疗效果。从中草药中发现天然抗疱疹病毒活性化合物或先导物是目前国内外研究的重要的方面和非常活跃的领域。至今发现的一些天然化合物具有抗EBV活性，分属于倍半萜、三萜、黄酮、木质素类等。目前约有近百个品种正在进行临床前研究和临床实验。中草药半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲的干燥全草，在我国分布广泛，资源丰富。该植物具有突出的抗菌、消炎、抗病毒及抗肿瘤等功能，现多单用或者与其他药组成复方，治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、肝硬化等疾病。目前从半枝莲全草中发现的化合物主要是黄酮化合物和一系列具有细胞毒性的新克罗烷型二萜类化合物。但现有技术中未见有半枝莲提取物及其新克罗烷型二萜成分的抗EBV病毒裂解复制活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供半枝莲提取物在制备防治EB病毒感染的药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种新的来源于半枝莲新克罗烷型二萜类化合物。

本发明的另一目的在于提供所述的半枝莲提取物的制备方法。

本发明通过研究发现，半枝莲提取物对EB病毒复制有良好的抑制作用，因此，本发明要求保护半枝莲提取物在制备防治EB病毒感染药物中的应用。

所述半枝莲提取物的制备方法为，将半枝莲(Scutellaria barbata)全草，晒干，粉碎，用95％乙醇室温浸提三次，每次24小时，合并浓缩液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩回收溶剂，得到乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分先过大孔树脂(D101)，以乙醇/水梯度洗脱，得到6个馏分。各馏分再分别过硅胶柱，反相C₁₈柱和半制备液相色谱柱，反复分离得到。

所述的乙醇/水体系中乙醇和水的体积比为：0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20:、95:5、100:0。

本发明从半枝莲提取物中分离得到2种新结构的化合物和2种已知结构的化合物，这4种化合物对EB病毒复制有良好的抑制作用，这4种化合物的结构分别如下：

新化合物1-2可以统一用式(Ⅰ)所示结构来表示，化合物3-4可以统一用式(Ⅱ)所示结构来表示。

所以本发明要求保护一种从半枝莲提取物中分离的新克罗烷型二萜类化合物，具有式(Ⅰ)所示结构：

从半枝莲提取物中分离的结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的化合物在制备防治EB病毒感染药物中的应用，

防治EB病毒感染的药物，含有有效量如上所述的半枝莲提取物和/或药学上可接受的载体。

防治EB病毒感染的药物，含有有效量式(Ⅰ)、式(Ⅱ)所示化合物中的一种或多种和/或药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次研究发现，半枝莲提取物对EB病毒复制有良好的抑制作用，而且，本发明从半枝莲提取物中分离得到2种新结构的化合物和2种已知结构的化合物，这4种化合物对EB病毒复制有良好的抑制作用，在制备防治EB病毒感染的药物中具有很大的应用前景。

附图说明

图1为Scutolide K的药理活性数据。

图2为Scutolide K的毒性数据。

图3为(14R)-14β-hydroxyscutolide K的药理活性数据。

图4为(14R)-14β-hydroxyscutolide K的毒性数据。

图5为scutebatas D的药理活性数据。

图6为scutebatas D的毒性数据。

图7为barbatines D的药理活性数据。

图8为barbatines D的毒性数据。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

从半枝莲(Scutellaria barbata)中制备化合物1-4的方法：

半枝莲(Scutellaria barbata)全株(3.5Kg)，晒干，粉碎，用95％乙醇室温浸提3次，每次1天，合并浓缩液，得粗提物(362g)，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯层(183g)直接经大孔树脂(D101)，用乙醇/水(0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20:、95:5、100:0，V/V)梯度洗脱，每450mL收集一份，TLC检测合并相同部分，共得到六个馏分Fr.1-6。Fr.3-5部分分别经过硅胶柱层析(200-300目)、Sephadex LH-20、C₁₈柱以及半制备液相色谱柱，反复分离，得到以下4种化合物。

化合物1(新化合物)：

Scutolide K(4):白色粉末；[α]³⁰ _D-14.5(c0.11,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)203(3.99)229(4.34)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)202(-1.10),222(-1.24),243(0.19)nm；IRν_max2966,1784,1713,1267,1095,1037,801,711cm^-1；¹HNMR(CDCl₃,400MHz)and¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)data,see Table3；HRESIMSm/z573.25096[M-H]^-(calcd for C₃₄H₃₇O₈,573.25123)；The absolute configurationis 5R,6R,7R,8R,9S,10R,13S。

化合物2(新化合物)：

(14R)-14β-hydroxyscutolide K(5):白色粉末；[α]³⁰ _D-52.8(c0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)205(3.84),229(4.24)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)213(-2.87)nm；IR ν_max3489,2963,1789,1715,1452,1382,1270,1104,1032,711cm^-1；¹HNMR(CDCl₃,400MHz)and ¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)data,seeTable3；HRESIMS m/z589.24469[M-H]^-(calcd for C₃₄H₃₇O₉,589.24480)；The absoluteconfiguration is5R,6R,7R,8R,9S,10R,13S,14R。

化合物3(已知化合物)：

名称为scutebatas D。

化合物4(已知化合物)：

名称为barbatines D。

其中化合物1-2的氢谱和碳谱如表1所示。化合物1-2的单晶结构如图1-2所示，

表1化合物1-2的氢谱和碳谱数据

注释：¹H谱的核磁频率为400MHz,¹³C谱的核磁频率为100MHz,所有核磁谱图均以CDCl₃为溶剂且TMS为内标化合物。所有信号归属均由HSQC和HMBC谱图支持。

实施例2 实施例1所得的4个化合物的药效相关实验

本发明化合物1-4对EBV裂解复制抑制活性测定。

(1)细胞培养：体外培养P3HR-1细胞(原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期的EBV)，使用含有10％胎牛血清，链霉素(100微克/毫升)，青霉素(100单位/毫升)的RPMI1640培养基，在37℃，5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

(2)药物干预：调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3×10⁵cells/mL，使用20ng/mL的12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)和丁酸钠(0.3mM)诱导P3HR-1细胞进入裂解复制期。使用DMSO将待测化合物1-4分别配置不同浓度(150，100，50，20，10，1，0.1，0μM)的药物溶液。P3HR-1细胞经TPA处理3小时后，对细胞进行不同浓度的化合物1-4处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不进行TPA诱导和不经化合物处理的对照组进行比较。

(3)测试方法。P3HR-1细胞经TPA诱导2天后收集细胞，提取细胞总DNA。应用实时定量PCR技术，使用LightCyclerFastStart DNA MasterPlus SYBR green试剂盒、EBNA1引物(sense:5'-CATTGAGTCGTCTCCCCTTTGGAAT-3'；antisense:5'-TCATAACAAGGTCCTTAATCGCATC-3')和GAPDH引物(sense:5’-ACATCATCCCTGCCTCTAC-3’；antisense:

5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’)分别检测上述细胞总DNA中EBNA1和GADPH的拷贝数，并计算EBNA1/GADPH的相对比值。

(4)结果处理。按照公式：EBV裂解复制相对抑制数＝(EBNA1/GAPDH_{TPA+&compound+}-EBNA1/GAPDH _{TPA-&compound+})/(EBNA1/GAPDH _{TPA+&compound-}-EBNA1/GAPDH _{TPA-&compound-})计算各化合物在不同浓度下的EBV裂解复制相对抑制数。以EBV相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对EBV裂解复制的抑制曲线图，并计算各药物的复制半数抑制剂量(IC₅₀)以评价各化合物对EBV裂解复制的抑制活性。化合物1-4的IC₅₀如表2所示。表2结果说明化合物1-4能有效抑制EBV裂解复制。

表2化合物1-4抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性

实施例3本发明化合物1-4对宿主细胞毒性测试

(1)细胞培养：体外培养P3HR-1细胞(原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期的EBV)。使用含有10％胎牛血清，400ug/mlG418，100ng/ml多西环素的RPMI1640培养基，在37℃，5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

(2)测试方法：调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3×10⁵cells/ml，使用不同浓度化合物1-4(150，100，50，20，10，1，0.1，0μM)处理细胞，每个浓度设3个平行复孔，2天后使用台盼蓝染色，光镜下计数活细胞数。

(3)结果处理：按照公式：相对毒性＝1-livecell_compound+/live cell_{compound_}计算各化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量(CC₅₀)，用于评价各化合物的细胞毒性。另按照公式：选择抑制常数(SI)＝CC₅₀/IC₅₀计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。结果如图1-8所示，说明化合物1-4对EBV的裂解复制抑制活性有很高的选择性，药用安全性很高，有很高的成药性。

Claims (7)

1.半枝莲提取物在制备防治EB病毒感染药物中的应用。

2.权利要求1所述半枝莲提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，将半枝莲全草，晒干后粉碎，用95%乙醇室温浸提三次，每次24小时，合并浓缩液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分过大孔树脂，以乙醇/水过柱，馏分再经反复分离得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的乙醇/水体系中乙醇和水的体积比为：0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20:、95:5、100:0。

4.一种从半枝莲提取物中分离的新克罗烷型二萜类化合物，其特征在于，具有式（Ⅰ）所示结构：

式（Ⅰ）。

5.从半枝莲提取物中分离的结构式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的化合物在制备防治EB病毒感染药物中的应用，

   

     式（Ⅰ）            式（Ⅱ）。

6.防治EB病毒感染的药物，其特征在于，含有有效量权利要求1所述的半枝莲提取物和/或药学上可接受的载体。

7.防治EB病毒感染的药物，其特征在于，含有有效量式（Ⅰ）、式（Ⅱ）所示化合物中的一种或多种和/或药学上可接受的载体。