CN106366154B - 一种七叶皂苷b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种七叶皂苷B的制备方法，它包括娑罗子提取、正丁醇萃取、第一次结晶、第二次结晶和L‑脯氨酸诱导结晶等步骤。本发明采用手性氨基酸——L‑脯氨酸诱导重结晶的方法分离得到七叶皂苷单体B，其纯度达97％以上，收率高达60％左右，具有生产工艺简单，生产周期短，能显著降低生产成本等优势。

Description

一种七叶皂苷B的制备方法

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种七叶皂苷B的制备方法。

背景技术

七叶皂苷又称七叶皂苷酸，为从七叶树科属植物种子提取得到的总皂苷、β-七叶皂苷或异七叶皂苷等的总称，属于三萜皂苷类。七叶皂苷的水溶解度较差，为增加其溶解度，常将其制成钠盐。七叶皂苷中含有很多种皂苷化合物，我国国家标准按液相出峰前后，依次命名为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D。他们互为同分异构体(见附图1)，目前用于临床上的七叶皂苷钠是由七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D以及其它成分组成的钠盐混合物。

七叶皂苷钠长期使用过程中发现药物对肌肉和粘膜具有强刺激作用，患者易出现静脉炎等副作用。此外，部分皂苷类成分具有溶血作用。由于七叶皂苷钠组合物的组分较多，七叶皂苷钠中杂质的定性和定量控制几乎无法实现。这种不可控性会导致七叶皂苷钠产品的质量的均一性和安全性难以得到保证，特别是血管刺激性等不良反应难以掌控。因此，对七叶皂苷的各单体的分离、药理活性和毒理性质的研究并筛选出最适合临床用药的更优单体显得尤为重要。

药理实验研究表明，与七叶皂苷钠组合物相比，七叶皂苷单体B具有更优的抗炎、抗水肿药理活性和更低的肌肉和粘膜刺激性。此外，高纯度的七叶皂苷单体B可解决目前七叶皂苷钠产品质量的均一性和安全性难以得到保证，肌肉和血管刺激性等不良反应难以掌控等问题。因此，七叶皂苷单体B的制备和开发具有重大的临床意义。

现有技术中，提取七叶皂苷单体主要是将提取物通过柱层析、离子交换树脂或者大孔吸附树脂等方法来得到粗品，然后进一步重结晶纯化得到。CN102746363公开了一种高纯度七叶皂苷单体B原料药、其制备方法以及医疗用途。该方法将七叶总皂苷粗品经反相硅胶柱层析分离得到七叶皂苷单体B洗脱液，然后将七叶皂苷单体B洗脱液浓缩、析晶可得到纯度较高的七叶皂苷单体B。但是我们在试验中发现，将七叶皂苷单体B洗脱液浓缩后能成功析出晶体的前提条件是：浓缩液中七叶皂苷单体B单体需要相当高的浓度，浓度至少为80％。然而由于七叶皂苷A和七叶皂苷单体B结构极其类似，它们互为顺反异构体，分离难度非常大，通过实验证明，反相硅胶柱层析将七叶皂苷单体A和七叶皂苷单体B分离开几乎不能实现，通过大幅度延长分离时间和大量使用洗脱溶剂才能够勉强得到极其少量的七叶皂苷单体B。因此该工艺路线费时、费力、溶剂使用量大、七叶皂苷B单体收率低，难以用于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度、高收率的七叶皂苷B的专属性制备方法。该方法设备要求低、纯化费用低、毒性小、环境污染少，适合工业化生产。

本发明提供的七叶皂苷B制备方法包括以下步骤：

1)以娑罗子为原料，用乙醇提取，收集提取液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩液调节pH至2～3，然后用水饱和的正丁醇萃取，分离有机层并浓缩；

3)将步骤2)得到的浓缩液加入到2～5倍体积的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，搅拌下加热回流，然后冷却析晶并干燥；

4)将干燥后的晶体溶解于热水中，然后再次冷却析晶并干燥；

5)将二次析晶后的固体溶解到有机溶剂中，然后再向有机溶剂中加入占二次析晶后的固体重量的10-20％的L-脯氨酸，加热回流10～60min后再冷却到40-50℃，此时加入少量七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至0-20℃析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤或离心，将固体烘干，即得七叶皂苷B。

优选地，步骤(1)中的乙醇为质量浓度为30-70％的乙醇水溶液。

优选地，步骤(3)中的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，丙酮与甲基叔丁基醚的体积比为2-8∶1。

优选地，步骤(5)中的有机溶剂为乙醇/正己烷混合溶剂，所述乙醇与正己烷的体积比为10-30∶1。

优选地，步骤(5)中，所述L-脯氨酸占二次析晶后的固体重量的15％。

本发明的有益效果是：

本发明针对七叶皂苷B单体制备存在的问题，提供一种制备高纯度七叶皂苷B的专属性方法。该方法采用了手性氨基酸——L-脯氨酸诱导重结晶，可得高纯度、高收率的七叶皂苷B，避免了使用柱层析、离子交换树脂等方法，操作简单、设备要求低、纯化费用低、毒性小、环境污染少，可执行性好、适合工业化生产。

与七叶皂苷相比，本发明提供的七叶皂苷B具有更优的抗炎、抗水肿药理活性和更低的肌肉和粘膜刺激性，能够从根本上解决目前七叶皂苷产品质量的均一性和安全性等问题。

附图说明

图1是七叶皂苷A、B、C、D的结构式。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

1)提取：取娑罗子粉末1kg提取两次，每次用10L质量浓度为70％的乙醇水溶液，45℃搅拌提取2h，过滤，将两次过滤的滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至2L。

2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用1mol/L的盐酸调节pH至2，用2L的水饱和的正丁醇萃取3次，合并有机层并浓缩至400mL；

3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到960mL丙酮和240mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至20℃析出白色沉淀，过滤、45℃干燥得白色晶体49g；

4)第二次析晶：将步骤3)得到的49g晶体溶解于200mL的100℃的热水中，搅拌20min，然后将溶液冷却至0℃，析出白色固体，抽滤，将固体在45℃条件下烘干，得β-七叶皂苷32g；

5)七叶皂苷成品的制备：将步骤4)得到的32gβ-七叶皂苷溶解于300mL乙醇和15mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入4.8g L-脯氨酸，加热回流30min，将体系冷却到50℃，此时加入0.2g纯度达98％的七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至20℃，析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤，将固体在45℃烘干，得七叶皂苷B白色结晶12.5g。

本实施例中，步骤1)的目的是将七叶总皂苷从娑罗子中提取分离出来，这是娑罗子总皂苷提取的常规工艺，提取方法可以采用本领域常用的回流、浸泡、渗漏等方法。其中，乙醇的浓度会对七叶总皂苷的纯度、收率产生重要影响，乙醇浓度过低会导致产物提取不充分，乙醇浓度过高会导致杂质含量增加。

步骤2)的萃取和步骤3)、4)的两次析晶目的都是纯化提取物，得到高纯度的β-七叶皂苷。其中，调节pH的目的是提高七叶皂苷的稳定性和萃取效率，pH过高会导致七叶皂苷的水溶性增加，正丁醇萃取效率降低；pH过低会降低七叶皂苷的稳定性。步骤(3)中丙酮与甲基叔丁基醚的比例会影响七叶皂苷晶体的析出速度和收率。

步骤5)中的有机溶剂还可以选择甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷等中的一种或者多种的任意混合，目的是使β-七叶皂苷能很好的溶解，同时又能在诱导重结晶中能更好地析出七叶皂苷B。L-脯氨酸的用量直接影响了七叶皂苷B的分离和析出，本实施例七叶皂苷B不仅能够选择性地顺利析出晶体，并且收率和纯度都较高，晶体形态好。

采用高效液相法对产物中的七叶皂苷B进行检测，具体条件为：色谱柱为C18柱，粒径为5um；流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，乙腈和磷酸水的体积比为35∶65，流动相PH＝2.,5；检测波长为220nm；流速为1.0ml/min，进样量为10μl；

产物中七叶皂苷B的含量为99.7％，收率(产物中七叶皂苷B的总量占投料娑罗子中七叶皂苷B的总量的百分比)为61％。

实施例2

1)提取：取娑罗子粉末1kg回流提取三次，每次用6L质量浓度为30％的乙醇水溶液，过滤，将滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至2L。

2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用3mol/L的盐酸调节pH至3，用水饱和的正丁醇萃取3次，合并有机层并浓缩至200mL；

3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到300mL丙酮和100mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至析出白色沉淀，过滤、干燥得白色晶体38g；

4)第二次析晶：将步骤3)得到的38g七叶皂苷晶体溶解于100ml 80℃的热水中，搅拌60min，然后将溶液冷却析出白色固体，抽滤，将固体烘干，得β-七叶皂苷27g；

5)七叶皂苷成品的制备：将步骤4)得到的27gβ-七叶皂苷溶解于150mL乙醇和15mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入2.7g L-脯氨酸，加热回流10min，将反应体系冷却到45℃，此时加入0.1g七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至20℃，析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤，将固体烘干，得七叶皂苷B白色结晶11.8g。

产物中七叶皂苷单体B的含量为99.5％，收率为56％。

实施例3

1)提取：取娑罗子粉末1kg回流提取二次，每次用15L质量浓度为50％的乙醇水溶液，过滤，将滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至3L。

2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用0.5mol/L的盐酸调节pH至3，用水饱和的正丁醇萃取5次，合并有机层并浓缩至300mL；

3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到1200mL丙酮和150mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至析出白色沉淀，过滤、干燥得白色晶体43g；

4)第二次析晶：将步骤3)得到的43g七叶皂苷晶体溶解于215mL的沸水中，搅拌30min，然后将溶液冷却析出白色固体，离心，将固体烘干，得β-七叶皂苷29g；

5)七叶皂苷成品的制备：将步骤4)得到的29gβ-七叶皂苷溶解于300mL乙醇和10mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入5.8g L-脯氨酸，加热回流60min，将反应体系冷却到40℃，此时加入少量七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至0℃析晶，直到白色晶体不再析出，离心，将固体烘干，得七叶皂苷B白色结晶12.2g。

产物中七叶皂苷B的含量为98.9％，收率为60％。

Claims (2)

1.一种七叶皂苷B的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以娑罗子为原料，用乙醇提取，收集提取液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩液调节pH至2～3，然后用水饱和的正丁醇萃取，分离有机层并浓缩；

3)将步骤2)得到的浓缩液加入到2～5倍体积的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，搅拌下加热回流，然后冷却析晶并干燥；

4)将干燥后的晶体溶解于热水中，然后再次冷却析晶并干燥；

5)将二次析晶后的固体溶解到有机溶剂中，然后再向有机溶剂中加入占二次析晶后的固体重量的10-20％的L-脯氨酸，加热回流10～60min后再冷却到40-50℃，此时加入少量七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至0-20℃析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤或离心，将固体烘干，即得七叶皂苷B，

步骤(1)中的乙醇为质量浓度为30-70％的乙醇水溶液；

步骤(3)中的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，丙酮与甲基叔丁基醚的体积比为2-8∶1；

步骤(5)中的有机溶剂为乙醇/正己烷混合溶剂，所述乙醇与正己烷的体积比为10-30∶1。

2.如权利要求1所述的七叶皂苷B的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述L-脯氨酸占二次析晶后的固体重量的15％。