CN102228519A - 藏边大黄提取物用于制备防治缺血性心脏病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了藏边大黄提取物的新应用，具体是其在制备预防治疗缺血性心脏病药物中的应用。经动物试验证明从藏边大黄中制备的经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物与3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷一方面能够激活PI3K/AKT信号通路，通过多种途径影响心肌细胞的抗凋亡机制的活化，有效抑制低氧诱导的心肌细胞凋亡发生与缺血再灌注心肌细胞凋亡，另一方面能够通过抗氧化作用恢复氧自由基及其清除系统的平衡，进一步作用于心肌细胞凋亡。因而藏边大黄提取物对多种原因所致的实验动物心肌缺血均有显著的保护作用，能够应用于治疗或预防缺血性心脏病药物的制备。

Description

藏边大黄提取物用于制备防治缺血性心脏病药物的应用

技术领域

本发明涉及藏边大黄提取物的应用，特别是涉及藏边大黄提取物在制备防治缺血性心脏病药物中的应用，属于化合物或药物制剂的治疗活性领域。

背景技术

藏边大黄(Rheum emodi Wall.)系蓼科大黄属波叶组植物的根与根茎，主要分布在西藏、青海、四川及云南等地，均系野生。藏边大黄味酸、苦，性寒，藏医称曲扎(Quza)，是藏医的传统药材。申请号为201110124226.9名称为一种藏边大黄提取物及其制备方法的中国发明专利申请公开了一种藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物。该提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是

或H。该提取物中含有30％～99％的结构式如式(II)的单体化合物：

式(II)

结构式如式(II)的单体化合物可以经上述藏边大黄提取物经进一步萃取、洗脱制备得到，并经NMR分析鉴定为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)(3，5，3′，4′-tetrahydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside)。基于与现有化合物的比对分析，初步确定3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷具有与何首乌成份2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷类似的生物活性，包括抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、保护肝脏、舒张血管、防治老年痴呆、提高记忆力等，能够应用于相关药物的开发。

参考资料：吕丽爽.何首乌中二苯乙烯苷的制备及抗氧化机理研究[D].无锡：江南大学，2006.

发明内容

本发明的目的在于提供藏边大黄提取物用于制备预防治疗缺血性心脏病药物的应用。

本发明的目的还在于提供3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)用于制备预防治疗缺血性心脏病药物的应用，以及含有PDG的药物组合物在制备治疗或预防缺血性心脏病药物中的用途。

缺血性心脏病(IHD)是一类由于冠状动脉循环障碍而导致心肌供血缺乏的疾病，其防治是全球性首要卫生健康问题之一。缺血性心脏病表现渐进性的心功能的下降，从而导致患者生活质量的显著性降低。当前开展的内外科治疗手段，可以改善冠状动脉供血以及挽救缺血心肌，但对梗死心肌或无功能心肌，尚无良好治疗措施。研究结果表明，当疾病进展到心肌梗死后，产生了一系列心室重塑过程的细胞表型及功能的改变，心室重塑将进展为失代偿的缺血性心力衰竭，其病理特征是心肌细胞数量减少和心脏功能降低。

本发明所述的缺血性心脏病包括无症状性心肌缺血、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及瘁死等。本发明将藏边大黄提取物，特别是3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)应用于预防治疗缺血性心脏病药物制备的药效原理主要在于两方面：

(1)PDG水溶液具有减轻心肌缺血再灌注损伤保护功能，其作用机制在于PDG激活PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号转导通路，与细胞生命活动密切相关，参与细胞激活、蛋白合成、葡萄糖转运及血管生成等重要生理功能的调控，并介导众多外界刺激信号诱导细胞生长、分化、存活、凋亡及恶变等过程，在对抗心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。在缺血预处理和后处理的研究中发现，该通路的活化，通过磷酸化的AKT，能够向细胞质或细胞核转运，使底物蛋白特定部位的丝氨酸、苏氨酸发生磷酸化，通过多种途径影响心肌细胞的抗凋亡机制的活化，有效抑制低氧诱导的心肌细胞凋亡发生与缺血再灌注心肌细胞凋亡。

(2)PDG水溶液具有抑制心肌梗死后心室重塑和延缓心衰进展的作用，其作用机制在于PGD能具有抗氧化应激作用，能够维持体内氧化-抗氧化反应的动态平衡。缺血性心脏病心衰时，氧自由基的产生量大于其清除量，机体处于氧化应激状态，氧化应激(oxidative stress，OS)产生的活性代谢产物，即活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)，是一组含有化学性质活泼的含氧功能基团的化合物，包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、对氧化物、氢过氧化物、脂质过氧化物、环氧代谢物等，可介导心肌细胞凋亡。缺血性心脏病心衰时，活性氧物质产生增多，活性氧物质的增多又可加重心肌损伤，二者之间形成恶性循环。氧化应激已被证实在许多培养的细胞类型中诱导细胞凋亡，被认为是细胞凋亡的共同介质。动物试验表明，PDG能够恢复大鼠急性心肌梗死后心肌总抗氧化能力，降低组织中活性氧物质的含量，改善心肌梗死后心室重塑过程中的氧化应激状态，该ROS的改变与相应的血流动力学和心功能的改善呈正相关。显示出PDG能够通过抗氧化作用恢复氧自由基及其清除系统的平衡，进一步作用于心肌细胞凋亡，对缺血性心脏病心衰起到防治作用。

基于PDG的药效原理，本发明提供以藏边大黄提取物为药效成分的药物组合物与以PDG为药效成分的药物组合物。此二者药物组合分别以藏边大黄提取物与PDG为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料并依照本领域的常规方法制备而成。所制得的药物组合可进一步制备成为药物制剂。基于现有植物提取物的制药技术，特别是现有制药技术对2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的应用，本发明制备的药物制剂可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。此外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明。上述制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。

本发明通过试验研究证明，藏边大黄提取物以及PDG对多种原因所致的实验动物心肌缺血均有显著的保护作用，能够应用于治疗或预防缺血性心脏病药物的制备。原料药藏边大黄是传统藏医药材，安全可靠；PDG经动物毒性试验同样证明具有药用安全性。

具体实施方式

下面通过相关试验例对本发明的内容做进一步描述。

试验例一

此试验例用以说明3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)通过激活PI3K/AKT信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的药效。

1、材料和方法

1.1主要试剂：

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，依照CN201110124226.9所述方法从藏边大黄药材中提取获得，含量92.80％，具体方法参见实施例一、二。PDG加入蒸馏水配置成20mg·ml^-1水溶液，以下简称PDG水溶液；小鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，AKT活性检测试剂盒、P-AKT(CST)试剂盒，SP9001、SP9002免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥)，蛋白抽提试剂盒、ECL发光液(北京中杉金桥)，凝胶成像仪(美国UVP)。

1.2心肌细胞的培养和分组

取半日龄Wistar大鼠乳鼠，消毒后处死，迅速打开胸腔，取出心，剪心尖，剪成1mm的组织小块，加入0.1％的胰蛋白酶37℃消化10min，吸上清液，以含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，以1000r·min^-1的转速离心10min，弃上清液，DMEM重悬，重复至消化完全。收集所有细胞悬液，用培养基将细胞密度调整至5×10⁵ml^-1，接种至培养瓶或底部预先放置盖玻片的培养板中，放入培养箱培养，每2～3天换液1次。培养的心肌细胞分成：正常对照组(Co组)，缺血再灌注组(I/R组)，I/R+PDG水溶液组(Pi组)和I/R+PDG水溶液组+LY294002组(Pi+Ly组)共4组。

1.3免疫细胞化学法鉴定心肌细胞

待心肌细胞爬满盖玻片，将心肌细胞爬片从培养板中取出，冷丙酮固定(室温20min)，PBS液(PH7.0)洗涤3次，每次3min。3％H₂O₂浸泡(室温25min)以阻断内源性过氧化物酶；PBS洗涤3次，每次5min。山羊血清37℃孵育30min。滴加1％Triton稀释小鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(1∶200)100μl，置于湿盒中4℃过夜。PBS溶液洗涤3次，每次5min。加入过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶500)100μl，37℃孵育30min；洗涤3次，每次5min。加入底物显色剂DAB，在镜下观察，显色至清晰时用PBS终止反应。苏木精复染(室温2min)，自来水反复冲洗10min。常规乙醇脱水，二甲苯透明。中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。用PBS取代小鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体作为阴性对照。Image-pro plus 6.0软件分析图片，得出OD值。

1.4缺血再灌注损伤模型的建立

培养第4日，换无血清低糖DMEM培养细胞过夜。缺氧之前将DMEM培养基放入三气培养箱中用95％的氮气和5％氧气平衡30min，降低培养基中氧的含量。弃去培养板中原有的培养基，加入低糖培养基(DMEM)，并按分组要求加入PDG水溶液。调节三气培养箱参数(95％氮气，5％二氧化碳)进入低氧环境，37℃下处理3hr，然后转换到常氧条件下复氧处理3hr。Co组在常氧条件下培养。

1.5免疫细胞化学法检测细胞内AKT、P-AKT蛋白含量

方法同1.3所述鉴定心肌细胞(不用苏木素复染核)。

1.6Western-bloting检测AKT、P-AKT蛋白质

依蛋白提取试剂盒方法提取蛋白质并测蛋白质浓度。配置12％分离胶5ml及5％基层胶2ml(冰上配防止速凝)。灌注分离胶，蒸馏水液封，30min聚合分离胶。分界处标记后灌注基层胶及插梳子，补胶后30min聚合基层胶，标记梳齿后拔出梳子根据分组上样。80V跑基层胶(约30～45min)120V跑至底部。电泳结束前剪滤纸及膜，并依次用甲醇、蒸馏水、转膜缓冲液泡膜，切胶，并在缓冲液中依次放好三层滤纸膜胶，三层滤纸放入转膜槽中，25V，30mA，40min。未切胶考马斯亮兰染色，检查蛋白质转移是否完整。丽春红染色。5％脱脂奶粉封闭1hr。加AKT、P-AKT一抗，保鲜膜封口，4℃冰箱过夜。加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗孵育1hr，用TBST洗三次后，用ECL混合发光液(ECL发光液A：ECL发光液B(V/V)＝1∶1)泡膜，暗室中感光及拍照(UVP凝胶成像系统)。Quantity One软件分析条带，得出光密度OD值。

统计学处理：各组数据以

表示，用SPSS12.0软件进行统计处理。各组间用单因素方差分析(ANOVA)，各组之间的两两比较用SNK-q检验。

2结果

2.1免疫细胞化学法鉴定心肌细胞

用小鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体对培养的细胞进行鉴定，结果显示，细胞胞质中有棕黄色致密颗粒，表明体外培养的细胞为心肌细胞。

2.2免疫细胞化学法测AKT表达：

各组间无明显差异(P＞0.05)；P-AKT表达：细胞核中棕黄色致密颗粒。I/R组、Pi组、Pi+Ly组OD值明显高于Co组(P＜0.05)，Pi组OD值明显高于I/R组(P＜0.05)及Pi+Ly组(P＜0.05)。表1。

表1免疫细胞化学法(ICC)测定心肌细胞P-AKT产物OD值(

n＝20)

*vsCo  P＜0.05，**vsI/R  P＜0.05，***vsPi orI/R  P＜0.05

2.3Western-bloting法测相对OD值

细胞内AKT蛋白表达各组间无明显差异(P＞0.05)。各组间P-AKT表达水平差异均有统计学意义(P＜0.05)。Pi组OD值与I/R组比较增大，差异有统计学意义(P＜0.05)。Pi+Ly组OD值与Pi组比较减小，差异有统计学意义(P＜0.05)。表2。

表2Western-bloting法测定心肌细胞P-AKT产物OD值(

n＝10)

*vsI/R  P＜0.05，**vsPi  P＜0.05

在本试验研究中，与I/R组比较，Pi组P-AKT表达明显增多(P＜0.05)；与Pi组比较，Pi+Ly组P-AKT表达明显减少(P＜0.05)。LY294002是PI3K的特异性抑制剂，能特异阻滞PI3K/AKT信号传导途径，应用LY294002后，PI3K/AKT信号传导通路下游分子P-AKT表达明显减少，提示PDG水溶液能通过激活PI3K/AKT信号传导通路、促进AKT磷酸化，减轻缺血再灌注心肌细胞凋亡。试验结果表明PDG水溶液处理可能通过激活PI3K/AKT信号通路作用心肌增加心肌组织P-AKT蛋白水平的表达产生心肌保护作用，以减轻心肌缺血及再灌注损伤造成的心肌受损、心肌收缩和舒张功能降低，以及心肌细胞凋亡。

试验例二

本试验例用以说明3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)防治缺血性心脏病心衰及其抗氧化应激作用的药效。

1材料和方法

1.1动物

雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体质量230g～280g(华中科技大学同济医学院实验动物中心)。

1.2药物与试剂

PDG水溶液，同试验例一；心肌总抗氧化能力(TAOC)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；总RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒购(MBI公司)；引物序列包括αMHC cDNA引物上游序列：5′-AGTATGTCACCAAGGGGCAG-3′，下游序列：5′-CGAACATGTGGTTGAAG-3′，扩增片段258bp；βMHC cDNA引物上游序列：5′-TGGCACCGTGGAC-TACAATA-3′，下游序列：5′-TACAGGTGCAT2CAGCTCCAG-3′，扩增片段145bp；β-actin cDNA引物上游序列：5′-CCTAAGGCCAACCGTAAAG-3′，下游序列：5′-TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA-3′，扩增片段623bp(北京赛百盛基因技术有限公司)。

1.3鼠心肌梗死心衰模型制备及分组

10g·L^-1戊巴比妥钠30mg·kg^-1，ip；气管插管，接人工呼吸机，开胸暴露心脏，翻开左心耳，结扎大鼠左冠状动脉前降支(左心耳和肺动脉圆锥之间距主动脉根部1～2mm)，根据体表心电图II导联R波高尖，ST段抬高为结扎成功。术后6hr存活的42只大鼠随机分为3组：①急性心肌梗死(AMI)对照组(AMI组，n＝24)；②PDG水溶液组(PDG组，n＝18)；③假手术组(Sham组，n＝10)，相当于冠脉结扎部位穿线，但不结扎，然后立即缝合。心肌梗死造模后6hr开始，PDG组给予PDG80mg·kg^-1·d^-1，每日分两次直接灌胃给药，AMI组及Sham组大鼠灌等量自来水，共计8周。

1.4高频多普勒超声检查

治疗8周后按上述方法麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰卧位。应用GE公司Vivid27彩色多普勒超声诊断仪(探头频率11.4MHz)，图像深度调至适当距离，取胸骨旁左室长轴、心尖两腔及心尖四腔切面。由二维图像引导取M型进行测量，分别测量作室舒张末期内径(LVEDd)，左室舒末容积(LVEDV)，短轴缩短率(FS)，射血分数(EF，用Simpsons′测定)，E峰、E峰减速度及E/A比值。

1.5血流动力学测定

10g·L^-1戊巴比妥钠30mg·kg^-1，ip，麻醉大鼠，固定后分离右颈总动脉，插入内充满生理盐水的PE250聚己烯导管至升主动脉，稳定20min后用成都仪器厂的Rm6240C型多道生理记录仪描记平均动脉压(MAP)，然后插管至左室腔，稳定20min后描记左室舒张末压(LVEDP)。

1.6心室质量及梗死面积测定

完成压力曲线记录后立即开胸取出心脏，分别称取左心室(包括室间隔)、右心室湿质量。计算左心室湿质量/体质量(LVRW/BW，mg/g)和右心室湿质量/体质量(RVRW/BW，mg/g)，分别为左、右心室心肌肥厚指数。在长轴中点处垂直于长轴将左室一分为二，心底部分(AMI组取非梗死区心肌)液氮冻存；心尖半40g·L^-1甲醛溶液固定，石蜡包埋，切取4μm厚的截面标本行Masson染色制成病理切片，用武汉千屏影像技术有限责任公司的HPIAS22000高清晰度病理图文分析系统计算梗死面积占左室的百分比。

1.7心肌αMHC、βMHC的mRNA检测

应用TRIZOL抽提组织总RNA，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测mRNA的表达，PCR扩增，1.5％琼脂糖电泳，采用四星Bio Imagine凝胶成像系统记录，计算αMHC/β-actin、βMHC/β-actin的积光度比值。

1.8生化指标测定

取液氮冻存的左室肌称重后，于冰浴中剪碎，加入9倍重量的预冷生理盐水，应用内切式组织匀浆器制成匀浆，将匀浆离心(4000r·min^-1，15min)后取上清液即为10％的心肌组织匀浆液。用考马斯亮兰法测定心肌组织蛋白含量，比色法测定心肌组织的TAOC和MDA。

1.9统计学分析

各组数据均以

表示，多组间比较用方差分析，两两比较用Newman-Keuls检验，P≤0.05为差异有显著性。

2结果

2.1多普勒超声评估

与Sham组相比，AMI组的LVEDd、LVEDV、E峰、E峰减速度及E/A显著增加(均P＜0.01)，FS和EF显著减小(均P＜0.01)。而与AMI组相比，PDG组LVEDd、LVEDV、E峰、E峰减速度及E/A显著减少(均P＜0.01)，FS和EF显著增加(均P＜0.01)。见表1。

表1大鼠左室结构和功能的多普勒超声检查结果

与Sham组相比，^bP＜0.01；与AMI组相比，^dP＜0.01。

2.2大鼠血流动力学和心室质量的变化

心率及梗死面积在AMI组和PDG组差异无显著性(P＞0.05)。与Sham组比较，AMI组的MAP显著降低(P＜0.01)，LVEDP、LVRW和RVRW均显著增加(P＜0.01)。而与AMI组相比，PDG组MAP显著增加(P＜0.05)，LVEDP、LVRW和RVRW显著减少(P＜0.01)。见表2。

表2大鼠血流动力学和心室质量的变化

与Sham组相比，^bP＜0.01；与AMI组相比，^cP＜0.05，^dP＜0.01。1mm Hg＝0.1333kPa。

2.3大鼠左室心肌α、βMHC的mRNA表达的变化

与Sham组相比，AMI组αMHC mRNA降低，βMHC mRNA显著升高(均P＜0.01)。而与AMI组相比，PDG组αMHC mRNA升高，βMHC mR2NA显著降低(均P＜0.01)。见表3。

表3大鼠心肌TAOC和MDA浓度及α、βMHC mRNA表达的变化

与Sham组相比，^bP＜0.01；与AMI组相比，^dP＜0.01。

2.4大鼠心肌TAOC和MDA浓度的变化

与Sham组相比，AMI组的MDA增高，TAOC降低(均P＜0.01)。而与AMI组相比，PDG组的MDA降低，TAOC增高(均P＜0.01)。见表3。

本试验研究结果显示，大鼠AMI造模8周后心肌组织TAOC降低，MDA升高，表明氧自由基代谢系统失衡，同时心肌αMHC mRNA水平明显降低，而心肌βMHC mRNA水平升高，表明腹主动脉狭窄所致压力负荷增加大鼠心肌αMHC向βMHC发生了转化，即心肌球蛋白ATP酶活性降低，心肌收缩时ATP的水解作用减弱，不能为心肌收缩提供足够的能量，使化学能转化为机械能的过程变弱变慢，心肌收缩速度减慢，心肌收缩力降低。大鼠心肌梗死后心肌组织中氧自由基的不适当堆积是心室重塑、心衰发生发展的重要因素。而PGD组与AMI组相比，PGD干预后LVEDd显著降低，FS明显升高，心室重塑和心功能明显获得改善，胚胎基因再表达明显受到抑制，同时，这种变化与前者心肌组织中TAOC升高，MDA降低的结果相一致。本试验提示PDG具有抑制心肌梗死后心室重塑和延缓心衰进展的作用，且这种保护作用与其维护体内氧化-抗氧化动态平衡有关。

试验例三

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的化合物毒性试验。

1、实验材料

ICR小鼠，雄性，体重18g～22g，(四川大学华西实验动物中心，合格证号：1037764)；PDG水溶液，同试验例一。

2、试验方法和结果

将本发明化合物作为试验样品给小鼠灌服进行急性毒性试验。结果显示：小鼠灌服本发明化合物的最大耐受量为20g·kg^-1·24hr^-1，约为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物的服用剂量标准(60kg体重成人口服日用量1.2g·kg^-1·24hr^-1)的1000倍；小鼠一次性灌服的LD50为15.2g·kg^-1·次^-1，95％置信限为22.60～34.23g·kg^-1。

长期毒性试验表明，大鼠灌服本发明化合物0.4、0.8、1.6g·kg^-1·d^-1(相当于2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物临床量的20、40、80倍)，24周后血液学、血液生化学指标、脏器系数和对照组比较均无明显差异，病理检查结果亦未见保健食品引起的病理性改变。停用本发明化合物2周后，各给药组的各项指标与空白对照组比较，均无明显差异，提示该化合物无明显延迟性毒性。说明本发明化合物长期服用也是安全的。

试验例四

此试验例用以说明藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠的保护作用。

1材料

1.1药品与试剂

藏边大黄提取物，具体是藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物，依照CN201110124226.9所述方法从藏边大黄药材中提取获得(具体方法参见实施例一)，本品约含30％3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，为棕褐色粉末，实验时以蒸馏水配制成40mg·ml^-1水溶液，经过0.22μm孔径滤膜滤过除菌后使用，以下称藏边大黄提取物水溶液；氯化硝基四氮唑蓝(NB-T)(上海前进试剂厂)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、游离脂肪酸(FFA)、乳酸(LA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)放免药盒(中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所)。

1.2实验动物

Wistar大鼠，雌雄各半，体质量220～250g(吉林大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK-(吉)2003-0001)。

2方法

2.1模型制备

急性心肌梗死造模：将大鼠乙醚麻醉，仰位固定，自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出左冠脉动脉前降支(LAD)，除假手术组仅穿线不结扎外，其余各组均以0号线立即结扎冠脉，将心脏送回胸腔，挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，开胸时间不超过30s。

2.2分组与给药

将造模后存活的大鼠60只随机分为3组，每组20只，即模型组，藏边大黄提取物低剂量组(低剂量组)、藏边大黄提取物高剂量组(高剂量组)。另取20只大鼠作为假手术组，该组大鼠LAD仅穿线不结扎。假手术组和模型组给予生理盐水2ml·kg^-1；低剂量组给予藏边大黄提取物100mg·kg^-1，高剂量给予藏边大黄提取物200mg·kg^-1。各组大鼠在术后0、6hr分别舌下iv给药1次。

2.3检测指标

待冠脉结扎24hr后，以戊巴比妥钠30mg·kg^-1麻醉大鼠。各组取10只大鼠，分离右颈总动脉，将内径1mm的塑料管插入左心室，与RM-6000型多道生理记录仪连接，记录血流动力学指标：左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室压最大上升/下降速率(+dp/dtmax)；分离左颈总动脉，插入内径1mm的塑料管，与RM-6000型多道生理记录仪连接，记录动脉收缩压(SBP)、动脉舒张压(DBP)及平均主动脉压(MAP)，并同时根据血压搏动信号触发来检测心率(HR)。术后稳定20min，记录上述相应的指标。记录后，取动脉血，用COBAS-FARA自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)及天冬氨酸转氨酶(AST)活性。取血后剖取心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称质量。将左心室心肌横切4～5片，浸入NB-T磷酸缓冲液中，置37℃恒温水浴，待染色完全后取出，肉眼观察：正常组织染色，缺血组织不染色；切下缺血心肌称质量，用缺血心肌与左心室湿质量的百分比计算心肌梗死范围(MIS)。每组另10只大鼠腹主动脉插管，取部分非抗凝血按照试剂盒说明书测血清MDA水平及SOD、GSH-Px活性；另一部分抗凝血分离血浆，用放免法测血浆TNF-α及IL-6水平。取血后剖取心脏，取缺血及非缺血区心肌，测定心肌组织中FFA及LA水平。

2.4统计学分析

实验数据以

表示，采用t检验比较组间差异。

3结果

3.1对急性心肌梗死大鼠血流动力学指标的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVSP、±dp/dtmax明显降低(P＜0.05)，LVEDP明显增加(P＜0.01)，HR、SBP、DBP、MAP均显著减小(P＜0.05)。藏边大黄提取物200mg·kg^-1可显著升高LVSP、±dp/dtmax(P＜0.05)，降低LVEDP(P＜0.05)，提高HR、SBP(P＜0.05)，但对DBP、MAP的增加作用不显著。见表1。

表1藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠血流动力学指标的影响(

n＝10)

与假手术组比较：*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05

*P＜0.05**P＜0.01vsSham group；△P＜0.05vsmodel group

3.2对急性心肌梗死大鼠MIS及血清CK、LDH及AST活性的影响

与假手术组相比，模型组的MIS及CK、LDH及AST活性明显增强(P＜0.01、0.001)。与模型组相比，藏边大黄提取物100、200mg·kg^-1均能明显缩小MIS，降低血清心肌酶活性(P＜0.05、0.01)。见表2。

表2藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠MIS及血清CK、LDH、AST活性的影响(

n＝10)

与假手术组比较：**P＜0.01***P＜0.001；与模型组比较：△P＜0.05△△P＜0.01

**P＜0.01***P＜0.001vsSham group；△P＜0.05△△P＜0.001vsmodel group

3.3对急性心肌梗死大鼠血清MDA水平及SOD、GSH-Px活性的影响

与假手术组相比，模型组血清MDA水平明显升高(P＜0.01)，而SOD、GSH-Px活性明显降低(P＜0.05、0.01)。与模型组相比，藏边大黄提取物100、200mg·kg^-1均可显著降低血清MDA水平，提高SOD、GSH-Px活性(P＜0.05、0.01)。见表3。

表3藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠血清MDA水平及SOD、GSH-Px活性的影响(

n＝10)

与假手术组比较：*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05△△P＜0.01；

*P＜0.05**P＜0.01vsSham group；△P＜0.05△△P＜0.01vsmodel group。

3.4对急性心肌梗死大鼠心肌FFA、LA水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠心肌梗死区、非梗死区FFA水平及梗死区LA水平均明显升高(P＜0.05、0.01)，非梗死区LA水平也升高，但无明显差异(P＞0.05)。与模型组相比，藏边大黄提取物100、200mg·kg^-1均可明显降低梗死区、非梗死区FFA水平及梗死区LA水平(P＜0.05、0.01)，但对非梗死区LA水平的降低无显著意义。见表4。

表4藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠心肌FFA、LA水平的影响(n＝10)

与假手术组比较：*P＜0.05**P＜0.01，与模型组比较：△P＜0.05△△P＜0.01；

*P＜0.05**P＜0.01vsSham group，△P＜0.05△△P＜0.01vsmodel group

3.5对急性心肌梗死大鼠血浆TNF-α及IL-6水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血浆TNF-α及IL-6水平明显升高(P＜0.05、0.01)。与模型组相比，藏边大黄提取物100mg·kg^-1可明显降低血浆TNF-α水平(P＜0.05)，藏边大黄提取物200mg·kg^-1可明显降低血浆TNF-α及IL-6水平(P＜0.05、0.01)。见表5。

表5藏边大黄提取物对急性心肌梗死大鼠血浆TNF-α及IL-6水平的影响(

n＝10)

与假手术组比较：*P＜0.05**P＜0.01/模型组比较：△P＜0.05

*P＜0.05**P＜0.01vsSham group、△P＜0.05vsmodel group

本试验研究结果显示，藏边大黄提取物可改善急性心肌梗死大鼠心功能，缩小MIS，降低心肌酶活性等，对心肌缺血有保护作用。试验的多指标对比分析表明该保护作用是是通过多途径综合作用的结果。本试验研究显示申请号为CN201110124226.9的发明专利申请公开藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物可有效地保护实验性心肌缺血，可作为一种有效的抗心肌缺血药物成分进行开发利用。

实施例一

从藏边大黄中制备一种提取物。

1、材料、主要试剂与仪器

1.1材料

藏边大黄(Rheum emodi Wall.)生药。

1.2主要试剂

80％乙醇

1.3主要仪器设备

渗漉器，液相色谱仪，大孔吸附树脂分离柱；

2、制备方法

步骤S1、药材打粉

取藏边大黄适量粉碎过20目筛制成粗粉；

步骤S2、藏边大黄粗粉渗漉提取

取步骤S1所得藏边大黄粗粉加入12倍体积渗漉溶剂浸泡约30hr后填装入渗漉器加入渗漉溶剂进行渗漉提取；收集渗漉液；

渗漉提取条件：渗漉溶剂80％乙醇；渗漉溶剂流速7ml·min^-1，常温；

步骤S3、渗漉液洗脱

取步骤S2所得渗漉液缓慢加入大孔吸附树脂分离柱中，再用80％乙醇洗脱剂洗脱，收集洗脱液减压浓缩。浓缩至干即得到藏边大黄提取物。

实施例二

从藏边大黄中制备PDG，其与实施例一相同之处不再重复，其不同之处在于对实施例一中获得的提取物进一步提取。

1、材料、主要试剂与仪器

1.1材料

同实施例一

1.2主要试剂

乙醇(80％、10％、20％、30％、40％)，石油醚(沸程60～90℃)，乙酸乙酯，氯仿，甲醇，氯仿-甲醇(12∶1、5∶1)、3∶1)；

1.3主要仪器设备

液相色谱仪，聚酰胺层析柱(100～200目)，硅胶层析柱(200～300目)，渗漉器；

2、制备方法

步骤S1、药材打粉，步骤S2、藏边大黄粗粉渗漉提取，步骤S3、渗漉液洗脱，同实施例一。

步骤S4、石油醚萃取

收集步骤S3所得洗脱部分减压浓缩至适量制得浓缩液；取浓缩液用4倍体积石油醚萃取多次，分离得到石油醚萃取物+水层残留物。

步骤S5、乙酸乙酯萃取

取步骤S4所得水层残留物，用等体积乙酸乙酯萃取多次，分离得到乙酸乙酯萃取物+水层残留物。

步骤S6、聚酰胺柱层析

取步骤S5所得乙酸乙酯萃取物溶于少量蒸馏水中，称重；称取约40倍乙酸乙酯萃取物溶液重量的100～200目聚酰胺进行聚酰胺柱层析；采用湿法装柱，采用水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇作为梯度洗脱剂，每个梯度用4倍柱床体积洗脱剂洗脱，洗脱剂流速均为7ml·min^-1；收集合并30％乙醇和40％乙醇洗脱部分，减压浓缩至适量得到浓缩液。

步骤S7、乙酸乙酯萃取

取步骤S6所得浓缩液，用1.5倍乙酸乙酯萃取多次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至干燥固体物。

步骤S8、硅胶柱层析

取步骤S7所得固体物进行硅胶柱层析(200～300目)；采用湿法装柱，干法上样；采用氯仿-甲醇系统洗脱，以氯仿、氯仿-甲醇(12∶1)、氯仿-甲醇(5∶1)、氯仿-甲醇(3∶1)、甲醇作为梯度洗脱剂，每个梯度用4倍柱床体积洗脱剂洗脱，洗脱剂流速均为7ml·min^-1；收集氯仿-甲醇(5∶1)的洗脱部分减压浓缩至干，得到结构式如式(II)的化合物。

Claims (10)

1.藏边大黄提取物用于制备预防治疗缺血性心脏病药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述藏边大黄提取物激活PI3K/AKT信号传导通路。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述藏边大黄提取物抑制机体的氧化应激作用。

4.含有藏边大黄提取物的药物组合用于制备预防治疗缺血性心脏病药物的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药物组合物含有藏边大黄提取物与药学上可接受的药用辅料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物组合物是口服给药的剂型或者非口服给药的剂型。

7.根据权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于：所述藏边大黄提取物是藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述藏边大黄提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是

或H；所述R₁是

的单体化合物为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如式(II)：

式(II)。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述藏边大黄提取物含有30％～99％的3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、8、9任一所述的应用，其特征在于：所述缺血性心脏病包括无症状性心肌缺血、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及瘁死等。