CN102600191A

CN102600191A - 青葙皂苷类化合物在制备抗肿瘤或抗炎药物中的应用

Info

Publication number: CN102600191A
Application number: CN2012100302676A
Authority: CN
Inventors: 郭美丽; 武清斌; 王燕
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2031-02-21
Also published as: CN102600191B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是青葙皂苷类化合物青葙苷A(Celosin A)、青葙苷B(Celosin B)、青葙苷C₁(Celosin C₁)、青葙苷D₁(Celosin D₁)、青葙苷E(CelosinE)、青葙苷F(Celosin F)、青葙苷G(Celosin G)或青葙苷H(Cristatain)的新用途。经体外细胞实验，青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H均具有良好的抗炎活性，因此可用于制备抗炎药物。本发明为抗炎提供了新的药物来源。

Description

青葙皂苷类化合物在制备抗肿瘤或抗炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是青葙皂苷类化合物青葙苷A(Celosin A)、青葙苷B(Celosin B)、青葙苷C₁(Celosin C₁)、青葙苷D₁(Celosin D₁)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷F(Celosin F)、青葙苷G(Celosin G)或青葙苷H(Cristatain)用于制备抗肿瘤或抗炎药物的新用途。本申请是申请号为201110041349.6的中国专利申请的分案申请。

背景技术

青葙子(Semen Celosiae)为苋科(Amaranthcea)青葙(Celosiaargentea L.)的干燥成熟种子。青葙子味苦，性微寒，具有清肝、明目、祛风热、降血压、抗炎之功效。常用于目赤肿痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒、疥癣的治疗。本发明人已从青葙子中分离得到皂苷类成分青葙苷A、苷B(详见专利ZL200610026789.3)；苷C、苷D(详见专利200910053042.0)；青葙苷C₁、青葙苷D₁、青葙苷E、青葙苷F、青葙苷G(详见专利201010545566.4)和青葙苷H(Wang Yan，Lou ZiYang，Wu QingBin，GuoMeiLi，A novel hepatoprotective saponin from Celosia cristata L.Fitoterapia 2010：81：1246-1252)。至今未见青葙苷A、青葙苷B、青葙苷C₁、青葙苷D₁、青葙苷E、青葙苷F、青葙苷G或青葙苷H具有抗肿瘤或抗炎活性的报道。

发明内容

本发明对青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H提供一种制备抗肿瘤或抗炎药物的新用途。8个青葙皂苷类化合物的化学结构式如下：

本发明青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H的制备方法如下(详见实施例)：

将青葙子粉碎后用水或30％～70％含水乙醇按常规渗漉提取，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过AB-8，D101或NKA-9大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％、45％和60％的乙醇洗脱液，将洗脱液分别减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I、青葙总皂苷II和青葙总皂苷III。

将青葙总皂苷I进行硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇＝30∶1～1∶1的溶剂系统梯度洗脱，再将洗脱液通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，用二氯甲烷∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.3∶2+0.4％冰醋酸溶剂系统，得青葙苷A、B、E、F、G和H。(2)将青葙总皂苷III进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1～7∶3∶0.3的溶剂系统梯度洗脱，再将洗脱液通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，使用正丁醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3.5∶3.5∶0.6∶10+0.5％冰醋酸溶剂系统，得青葙苷C₁和青葙苷D₁；

经药理和药效学实验，青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H均具有明显的抗炎活性，青葙苷A、B或H具有显著的抗肿瘤活性，因此可用于制备抗炎或抗肿瘤药物。本发明为抗炎或抗肿瘤提供了新的药物来源。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1.制备青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G和H

取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L水室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过AB-8大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I55g、青葙总皂苷II25g和青葙总皂苷III150g。其中，青葙总皂苷II主要成分为青葙苷A、青葙B、青葙C和青葙D，(详见ZL200610026789.3和200910053042.0，下同)。

将青葙总皂苷I进行硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇＝30∶1～1∶1的溶剂系统梯度洗脱，再将该洗脱液使用二氯甲烷∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.3∶2+0.4％冰醋酸溶剂系统通过高速逆流色谱仪进行分离纯化，分别得到青葙苷A 4.5g、青葙苷B 2.1g、青葙苷E 1.3g、青葙苷F 2.4g、青葙苷G 2.1g和青葙苷H 1.1g。

将青葙总皂苷III进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水＝9∶1∶0.1～7∶3∶0.3的溶剂系统洗脱，再将该洗脱液用高速逆流色谱仪分离纯化，采用的溶剂系统为：乙酸乙酯∶正丁醇∶甲醇∶水＝3.5∶3.5∶0.6∶10+0.5％乙酸，分别得到青葙苷C₁15.3g和青葙苷D₁7.9g；实施例2.制备青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G和H

取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L 50％含水乙醇室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过D101大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇、和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I 155g、青葙总皂苷II125g和青葙总皂苷III270g。

由青葙总皂苷I制备青葙苷A、B、E、F、G和H的方法同实施例1，分别得到青葙苷A 8.5g、青葙苷B 4.1g、青葙苷E 2.3g、青葙苷F 4.4g、青葙苷G 3.1g和青葙苷H 2.1g。

由青葙总皂苷III制备青葙苷C₁和D₁的方法同实施例1，分别得到青葙苷C₁25.3g和青葙苷D₁18.9g；

实施例3.制备青葙皂苷类化合物青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G和H

取安徽亳州的青葙子50kg，粉碎，用50L70％含水乙醇室温浸泡24小时后，以20L每小时的速度渗漉提取，再收集250L水渗漉液，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过NKA-9大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、45％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇、45％乙醇、和60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，依次得青葙总皂苷I 95g、青葙总皂苷II75g和青葙总皂苷III150g。

由青葙总皂苷I制备青葙苷A、B、E、F、G和H的方法同实施例1，分别得到青葙苷A 6.5g、青葙苷B 3.1g、青葙苷E 1.8g、青葙苷F 3.4g、青葙苷G 2.1g和青葙苷H 1.9g。

由青葙总皂苷III制备青葙苷C₁和D₁的方法同实施例1，分别得到青葙苷C₁21.3g和青葙苷D₁12.9g；

药理药效试验

一、青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H体外抗肿瘤试验

试验材料和方法：

8个化合物由实施例1制备(下同)；

实验用细胞株为：SHG44(人胶质瘤细胞)、HCT116(人肠癌细胞)、CEM(人白血病细胞)、MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)；

培养液为：RPMI1640+15％NBS+双抗；

全自动酶标仪：型号WellscanMK-2(Labsystems)；

将青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G、H和阳性对照药DOX(强力霉素)分别以少量DMSO溶解后，加入含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)配成1000μg/mL的溶液或均匀的混悬液，控制DMSO的终浓度＜3.0％(下同)，然后用含DMSO的PBS溶液10倍稀释，每个浓度取10μL加入90μL的细胞悬液中，共6档浓度(100、10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL)，每档浓度均设双复孔。

96孔板每孔加入浓度为4～5×10⁴个/ml的细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μL/孔，设双复孔，37℃，5％CO₂作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，作用4h后加入溶解液，100μL/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。实验重复三次。结果见表1。

表1 本发明化合物对5种人癌细胞的体外抗肿瘤活性

由表1可见，青葙苷A、B或青葙苷H对5种人癌细胞均有显著的抑制作用，说明具有抗肿瘤活性。

二、青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的体外抗炎试验

由于很多慢性疾病的发病机制都涉及炎症，如炎症性肠病、类风湿关节炎、败血症和癌症等，因此，抑制前炎症分子的产生成为预防或治疗各种疾病的重要靶点。内毒素诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞模型，被广泛用于研究炎症反应。巨噬细胞在外部细菌毒素如脂多糖(L P S)等刺激时，可促使炎症介质如NO等的分泌。因此，本实验以L P S诱导RAW264.7细胞释放NO为靶点，考察8种青葙苷类化合物的抗炎作用。

试验材料和方法：

将8个化合物和阳性对照药消炎痛以少量DMSO溶解后用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成10^-4，10^-5，10^-6，10^-7和10^-8mol/L五个浓度，控制DMSO在样品中的终浓度＜0.1％；

Griess试剂：将1％的磺胺水溶液和0.1％的萘乙二胺磷酸溶液(2.5％)等体积混合，临用前配制；

阴性对照：LPS以少量DMSO溶解后用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释成2μg/mL，控制DMSO的终浓度＜0.1％，细胞加LPS刺激后，加入与上述各化合物处理组等量的培养基。

将RAW 264.7细胞用0.25％胰酶消化，收集细胞，吹打均匀，加入培养基将细胞浓度调整至1×10⁹个/L，将细胞接种至96孔板，每孔100μL，37℃下于5％CO₂孵化箱中培养过夜，次日弃去培养液，加入100μL含2μg/mL LPS的培养基，培养1h后分别加入100μL配制好的各个浓度的化合物或药物，37℃下于5％CO₂孵化箱中培养24h。分别吸取培养上清液100μL于96孔板，每孔再加入100μL Griess试剂，漩涡震荡使之混匀，室温避光静置30min，用酶标仪于540nm波长处测吸光度值ODA。

以{(阴性对照组ODA均数-给药组ODA均数)/阴性对照组ODA均数}×100％作为受试组抑制率，根据药物各个浓度的抑制率计算化合物的IC₅₀(半数抑制率)值，实验重复3次。结果见表2。

表2 本发明化合物对RAW264.7细胞的体外抗炎活性

由表2可见，青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H对RAW264.7细胞有明显的抑制作用，它们的抗炎活性接近甚至优于阳性对照药消炎痛。

上述试验表明，青葙苷A、B、C₁、D₁、E、F、G或H均具有明显的抗炎活性，青葙苷A、B或青葙苷H具有显著的抗肿瘤活性，因此可用于制备抗炎或抗肿瘤药物。

Claims

1.青葙皂苷类化合物青葙苷A(Celosin A)、青葙苷B(Celosin B)、青葙苷C₁(CelosinC₁)、青葙苷D₁(Celosin D₁)、青葙苷E(Celosin E)、青葙苷F(Celosin F)、青葙苷G(Celosin G)或青葙苷H(Cristatain)在制备抗炎药物中的应用，它们的化学结构式分别如下：