CN102267891A

CN102267891A - 一种新的三萜化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN102267891A
Application number: CN201110176074A
Authority: CN
Inventors: 华会明; 李占林; 王楠; 裴月湖; 白皎; 景永奎
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: CN102267891B

Abstract

本发明涉及从绯红南五味子根中提取分离的一种新三萜化合物及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的应用，该化合物具有式I化学结构式，实验研究表明，它对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60具有生长抑制作用，且其提取分离方法简易，有利于对其进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种新的三萜化合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种新的三萜化合物及其制备方法，具体涉及从药用植物绯红南五味子根中提取分离得到的新三萜化合物及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的用途。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命的最严重的疾病之一。多年来，科学家们一直致力于解开肿瘤的发生之谜。因此研究肿瘤、攻克癌症已成为医药学界的重要研究课题。植物中活性物质结构的多样性及其活性的广泛性，使得从植物中筛选抗肿瘤活性物质成为研究的热点。国内外学者通过对上万种植物药进行筛选，发现了很多抗肿瘤物质，研究表明，许多萜类成分具有抗肿瘤的作用。

三萜类化合物是五味子科植物中的主要化学成分之一，从结构上看，从该科植物中分离得到的三萜类成分主要为羊毛脂烷型。三萜类化合物在抗肿瘤方面活性广泛，刘嘉森等从长梗南五味子 (Kadsura longipedunculata)根皮中分得的(+)-anwulignan可以明显抑制H⁺，K⁺-ATP酶和白血病P-388细胞的生长。经刘嘉森研究小组筛选，五内酯E、长南酸及五内酯F对白血病P-388细胞有抑制作用。Pu JX等通过体外实验证实，longipedlactones A-C、F及H对A549、HT-29和K562细胞株有细胞毒活性，IC₅₀在0.24～11.38 μM范围间。Chen YG等从中泰南五味子 (Kadsura ananosma)茎中分离得到3个三萜酸ananosic acids A-C对CCRF-CEM和HeLa肿瘤细胞表现出细胞毒性。Pu JX等从长梗南五味子根茎中分离得到的kadlongilactones A和B在体外可以明显抑制人肿瘤细胞株K562增殖。

绯红南五味子是五味子科南五味子属植物，木质藤本，在我国资源丰富，广泛分布于广东、广西、海南、贵州、四川、云南等省，是华南、西南及其邻近地区的常用草药。用于治疗胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、急性胃肠炎、风湿性关节炎、跌打肿痛、痛经、产后瘀血腹痛等症。本发明所涉及的新三萜化合物及其活性，迄今为止尚未见有专利或文献报道。

发明内容

本发明提供一种以药用植物绯红南五味子根为原料提取分离的新的羊毛脂烷型三萜类化合物。

本发明又提供所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述化合物的结构如式I所示：

Figure 2011101760747100002DEST_PATH_IMAGE001

I

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

以绯红南五味子根干燥药材10 kg为原料，以90％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物1500 g。将浓缩的乙醇提取物混悬于水中，以石油醚（4次，1000 mL/次）萃取后，将石油醚萃取部分浸膏经硅胶（200-300目）柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（洗脱液为体积配比为100：1-1：1）梯度洗脱，将石油醚-乙酸乙酯体积配比为100：3的洗脱部分经硅胶（200-300目）柱色谱分离，用石油醚-丙酮（洗脱液为体积配比为100：1-1：1）梯度洗脱，将石油醚-丙酮体积配比为100：3的洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱 (洗脱液为体积配比为1：1的氯仿-甲醇混合溶剂)纯化，得到式（I）化合物。其流程如（图1）所示。

所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：

主要利用包括高分辨质谱、核磁共振谱（¹H NMR，¹³C NMR，2D-NMR）。

无色针晶 (丙酮)，mp148～149 °C，[a]²⁵ _D –32.4 (c 0.030, CHCl₃)，10%硫酸乙醇溶液显紫红色，Liebermann-Burchard反应阳性。HRFABMS给出准分子离子峰m/z：439.3585 [M-H]^-，确定化合物分子式为C₃₀H₄₈O₂。¹H NMR (pyridine-d ₅，500 MHz)谱中给出给出一组末端双键的烯氢质子信号δ4.90 (1H，s)，5.01 (1H，s)和1个烯氢质子信号δ5.58 (1H，t，J = 7.1 Hz)，6个甲基单峰信号δ 0.80、0.98、1.02、1.65、1.71、1.82 (each 3H，s)和1个甲基双峰信号δ0.99 (3H，d，J = 6.2 Hz)。¹³C NMR中给出30个碳信号，经DEPT实验分析，归属为7个甲基、11个亚甲基、4个次甲基和8个季碳，其中包括一个羧基碳信号δ 176.6，一组末端双键烯碳信号δ 147.8、114.1，以及两组双键碳信号δ 139.1、130.1和δ 130.8、125.8。除侧链部分外，化合物I与manwuweizic acid表现出相似的NMR数据。

manwuweizic acid

结合CHSHF、HMBC、DQF-COSY，化合物I的碳氢信号（表1）得以归属。

将式I化合物的¹H NMR、¹³C NMR信号通过CHSHF、HMBC和DQF-COSY谱进行归属。在HMBC谱中，d 0.80 (3H，s，Me-18)与d31.5 (C-12)、44.6 (C-13)、51.1 (C-14)存在远程相关；d 1.02 (3H，s，Me-19)与d 33.6 (C-1)、47.0 (C-5)、130.1 (C-9)、40.7 (C-10)存在远程相关；d 1.82 (3H，s，Me-29)与d 147.8 (C-4)、47.0 (C-5)、114.1 (C-28)存在远程相关；d 0.98 (3H，s，Me-30)与d 139.1 (C-8)、44.6 (C-13)、51.1 (C-14)、31.3 (C-15)存在远程相关；δ4.90、5.01 (H-28)与δ47.0 (C-5)、23.3 (C-29)存在远程相关，以上数据确证该化合物为具有3, 4-seco-lanost-8 (9)-en-3-oic acid结构的三萜。另外，在HMBC谱中，烯氢质子信号δ5.25与δ25.3 (C-23)、25.8 (C-26)、17.7 (C-27)存在远程相关，表明在C-24 (25)位存在双键。

通过上述解析，最终确定结构式I即为本发明C-3，4位裂环的羊毛脂烷型三萜化合物。

表1 式I化合物¹H NMR和¹³C NMR的化学位移值（溶剂为pyridine-d ₅）

申请人通过大量实验证实，C-3，4位裂环的羊毛脂烷型三萜化合物由于母核或侧链上双键位置和数目的不同、－COOH取代基位置及数目的不同，其抗肿瘤的活性会存在很大差异，对所得到的式I化合物进行抑制肿瘤细胞生长方面的研究，体外实验结果表明式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60具有生长抑制作用，其IG₅₀达到28.4 mM，因此，本发明所述的新三萜化合物具有制备临床肿瘤预防和治疗的药物的前景。

本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，且具有抑制肿瘤细胞生长的活性，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗肿瘤药物创造条件。

附图说明：

图1：式I化合物的制备流程；

图2：式I化合物的氢谱；

图3：式I化合物的碳谱；

图4：式I化合物的DQF-COSY谱；

图5：式I化合物的CHSHF谱；

图6：式I化合物的HMBC谱。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：式（I）化合物的制备：

以绯红南五味子根干燥药材10 kg为原料，以90%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物1500 g。将乙醇提取物混悬于水中，用石油醚萃取4次，1000 mL/次。将石油醚萃取部分的浸膏经硅胶（200-300目）柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（洗脱液为体积配比为100：1-1：1）梯度洗脱，将石油醚-乙酸乙酯体积配比为100：3的洗脱部分经硅胶（200-300目）柱色谱分离，用石油醚-丙酮（洗脱液为体积配比为100：1-1：1）梯度洗脱，将石油醚-丙酮体积配比为100：3的洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱 (洗脱液为体积配比为1：1的氯仿-甲醇混合溶剂)纯化，得到式（I）化合物（52 mg）。

实施例2：式（I）化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的生长抑制实验：

HL-60细胞培养于含有10%经加热灭活的胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL链霉素及1 mmol/L L-谷氨酰胺RPMI1640培养液中，37 °C、5％CO₂饱和湿度培养箱中孵育。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4%的储存浓度，用滤纸过滤，4 °C保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0.4%工作浓度。取上述细胞（1′10⁵/mL）接种于12孔板，每孔2 mL。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞悬液，取50 μL细胞悬液加入50 μL的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。化合物对HL-60细胞的生长抑制作用通过细胞计数测得。取HL-60细胞(1′10⁵/mL)接种于12孔板，每孔2 mL。加入不同浓度式I化合物孵育后制备单个细胞悬液，用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。利用下列公式求得细胞生长抑制率：1 – (加药孔细胞数/对照孔细胞数）′ 100%。其IG₅₀结果如表2所示。

表2 式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的生长抑制作用

Compounds	IG₅₀ ± SE (μM)
		式I化合物	28.4 ± 2.54
manwuweizic acid	32.0 ± 1.86

式I化合物结构新颖，且在体外显示出抑制人急性早幼粒白血病细胞株HL-60生长的活性，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的应用。

Claims

1.一种新的三萜化合物，其特征在于，该化合物具有式I的结构：

I 。

2.根据权利要求1所述的三萜化合物，其特征在于，该化合物是从绯红南五味子根中分离得到的。

3.一种制备如权利要求1所述三萜化合物的方法，其特征在于，以绯红南五味子根干燥药材10 kg为原料，以90％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物1500 g，将浓缩后的乙醇提取物混悬于水中，以石油醚萃取4次，每次1000 mL，将石油醚萃取部分经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、重结晶等分离手段进行纯化，具体步骤为：将石油醚萃取部分经200-300目的硅胶柱色谱分离，用体积配比为100：1-1：1的石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱，将其中石油醚-乙酸乙酯体积配比为100：3的洗脱部分经200-300目的硅胶柱色谱分离，用体积配比为100：1-1：1的石油醚-丙酮的混合溶剂梯度洗脱，将其中石油醚-丙酮体积配比为100：3的洗脱部分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，以体积配比为1: 1的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱液洗脱，得到式I化合物。

4.如权利要求1所述的三萜化合物在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的应用。