CN108165496B - 富克尔核盘菌3a00494及其发酵化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494及其发酵化合物的应用。本发明富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017636,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年10月30日。本发明富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494的发酵化合物为一类二萜类化合物,具有抗肿瘤活性,可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研发抗癌药物提供了新的化合物来源,对我国海洋药物开发具有重要意义,还可促进深海生物资源的有效应用,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋真菌提取化合物的应用领域,更具体地说,本发明涉及富克尔核盘菌 Botryotinia fuckeliana 3A00494及其发酵化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤又称癌症,是导致人们死亡的主要“杀手”之一。随着城市化、工业化、老龄化的加剧,生态环境恶化、职业暴露、不良生活方式、生物学因素和遗传学因素的影响,我国恶性肿瘤发病率和死亡率均呈现逐年上升的趋势,其中占比例最高的为肝癌、食道癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌等。各国均投入大量的人力、物力和财力,在深入研究发病机理的同时不断开发抗癌新药,但疗效好,毒副作用小,不产生交叉耐药性的药物仍然不多。究其原因,肿瘤是一种很复杂的疾病,其特征是多种遗传和分子的改变影响了细胞的增殖、存活和分化。绝大部分肿瘤的生长和存活不仅仅依赖于一种受体或一种信号通路,而且信号通路之间存在着交叉和代偿。这使得仅作用于一个靶点不能完全杀灭肿瘤细胞。因此,临床上需要能作用于多种受体或信号通路从而影响多个肿瘤生长重要环节的药物。
天然化合物是创新药物研究的重要源泉,近年来临床上批准的小分子药物中,来自天然化合物及其衍生物的占比高达60%。随着研究的不断深入,已有越来越多的证据表明:大多数的天然药物或先导化合物实际上是由其共附生的微生物所产生的。随着陆地微生物次级代谢产物发现的重复率越来越高,人们开始将关注度转向海洋,尤其是深海。海洋的微生物资源多样性远比陆地微生物丰富。生存于特殊的深海环境中的微生物蕴含着活性天然产物开发的巨大潜力。结合现代天然药物化学、微生物学、生命科学等的技术手段,从海洋微生物来源的天然化合物或其衍生物中寻找发现具有新颖作用机制、高效、低毒的抗癌新药是抗癌药物研发的一个重要方向。在海洋微生物中筛选发现具有抗肿瘤活性的天然产物对于海洋药物的研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于:克服现有技术中存在的上述问题,提供一种富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494及其发酵化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017636,保藏地址为中国.武汉. 武汉大学,保藏日期为2017年10月30日。
本发明富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494的发酵化合物可用于制备抗肿瘤的药物。
本发明富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494的发酵化合物为一类二萜类化合物,其结构式如式(I)~式(XV)所示;
一共77个化合物,式(I)对应的化合物为化合物1;式(II)对应的化合物2~6如表1所示;式(III)对应的化合物7~12如表2所示;式(IV)对应的化合物为化合物13;式(V) 对应的化合物14~26如表3所示;式(VI)对应的化合物为化合物27;式(VII)对应的化合物28~46如表4所示;式(VIII)对应的化合物为化合物47和48;式(IX)对应的化合物49~59如表5所示;式(X)对应的化合物60~63如表6所示;式(XI)对应的化合物64~70 如表7所示;式(XII)对应的化合物为化合物71;式(XIII)对应的化合物为化合物72;式(XIV)对应的化合物为化合物73和74;式(XV)对应的化合物75~77如表8所示。表1化合物2~6在式(II)的取代情况表
表2化合物7~12在式(III)的取代情况表
表3化合物14~26在式(V)的取代情况表
表4化合物28~46在式(VII)的取代情况表
表5化合物49~59在式(IX)的取代情况表
表6化合物60~63在式(X)的取代情况表
表7化合物64~70在式(XI)的取代情况表
表8化合物75~77在式(XV)的取代情况表
具体取代基的取代方案如下文字表示:
式(II)中,R1和R3为OH时,R2为CH2OH、CH2OAc或CH3;R1为H时,R2为CH2OAc, R3为OH;R1为OH时,R2为COOH,R3为H;
式(III)中,R2为CH2OAc、R3为H、R4为H时,R1为OH或H;R1为H、R2为CH2OH、 R3为H时,R4为酮基或α-OH;R1为H、R2为COOH时,R3为H,R4为β-OH;R1为H、 R2为CH2OH时,R3为OH,R4为H;
式(IV)中,R为COOH;
式(V)中,R1为CH2OH、R2为酮基、R3为H、R4为CH2OH、R5、R6、R7为H时, R8为OH或酮基;R1为CH2OH、R3为H、R4为CH2OAc、R5、R6、R7为H、R8为OH时, R2为酮基或β-OH;R1为CHO时,R2为酮基、R3为H、R4为CH2OH、R5、R6、R7为H、 R8为OH;R1为CH2OH、R2、R3为H、R4为CH2OAc、R5为H、R6为OH时,R7为H、R8为OH;R1为COOH时,R2、R3为H,R4为CH2OAc或COOH,R5、R6、R7为H,R8为OH; R1为CH2OH、R2为H、R3为α-OH时,R4为CH2OAc,R5、R6、R7为H,R8为OH;R1为 CH2OH、R2为H、R3为β-OH时,R4为COOH,R5、R6、R7为H,R8为OH;R1为CH2OH、 R2、R3、R6、R7为H、R5、R8为OH时,R4为CH2OH或CH2OAc;R7、R8为OH时,R1为 CH2OH、R2、R3、R5、R6为H,R4为CH2OAc;
式(VII)中,R1为CH2OH、R2、R3、R5为H、R6为α-OH时,R4为CH2OH、CH2OAc 或COOH;R2、R3、R5为H、R4为CH2OH、R6为α-OH时,R1为CH2OAc、CHO或COOH;R1为CH2OH、R2、R5为H、R3为OH时,R4为CH2OH,R6为α-OH;R1为CH2OH、R2、 R3为H、R5为OH、R6为α-OH时,R4为CH2OH或CH2OAc;R1为CH2OH、R3、R5为H、 R4为CH2OH、R6为α-OH时,R2为α-OH或β-OH;R1为CH2OH、R3、R5为H、R4为CH2OAc、 R6为α-OH时,R2为α-OH或β-OH;R1为CH2OH、R2、R3、R5为H、R4为CH2OH时,R6为酮基;R1为CH2OH、R2为α-OH、R3、R5为H、R4为CH2OAc时,R6为酮基;R1为CH2OH、 R2为α-OH、R3、R5为H、R4为CH2OH时,R6为H;R2、R3、R5为H、R4为CH2OAc、R6为α-OH时,R1为CHO或COOH;R1为CHO、R2、R3、R5为H、R4为CH2OH时,R6为β-OH;
式(VIII)中,R为H或Ac;
式(IX)中,R1为CH2OH、R2为H、R3、R5为OH时,R4为CH2OH、CH2OAc或CH3; R1为CH2OH、R2、R5为H、R3为OH时,R4为CH2OH或CH2OAc;R1为CH3、R2、R3为 OH时,R4为CH2OH,R5为H;R1为CH2OH、R2、R3为H、R5为OH时,R4为CH2OH、 CH2OAc或COOH;R1为CH2OAc时,R2、R3为H,R4为CH2OH,R5为OH;R1为CH2OH、 R2为酮基时,R3为H,R4为CH2OH,R5为OH;
式(X)中,R2为OH时,R1为α-OH、β-OH或H;R2为H时,R1为H;
式(XI)中,R2、R3为H、R4为OH时,R1为CH2OH、CH2OAc或COOH;R1为CH2OH、 R2为OH时,R3为H,R4为OH;R3、R4为OH时,R1为CH2OAc,R2为H;R4为酮基时, R1为CH2OH,R2、R3为H;R1为CH2OH、R2为H、R3为OH时,R4为H;
式(XIV)中,R为H或Ac;
式(XV)中,R1、R2为H时,R3为酮基;R1为Ac、R3为OH时,R2为H或Ac。
本发明二萜类化合物的制备方法包括如下步骤:
S1、将富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494进行液体或固体发酵培养,得到发酵物;
S2、将发酵物萃取,所得萃取物经分离纯化,得到二萜类化合物;
所述富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017636,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年10 月30日。
本发明二萜类化合物可用于制备抗肿瘤的药物。
为了实现上述发明目的,本发明还提供了一种抗肿瘤药物,其包括有效剂量的作为活性成分的富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494发酵化合物及其盐类中的一种或几种的组合,以及药学上可以接受的载体;
所述富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017636,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年10 月30日。
为了实现上述发明目的,本发明还提供了一种抗肿瘤药物,其特征在于,包括有效剂量的作为活性成分的二萜类化合物及其盐类中的一种或几种的组合,以及药学上可以接受的载体。
相对于现有技术,本发明富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494的发酵化合物为一类二萜类化合物,具有抗肿瘤活性,可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研发抗癌药物提供了新的化合物来源,对我国海洋药物开发具有重要意义,还可促进深海生物资源的有效应用,具有良好的应用前景。
菌种保藏信息:
Botryotinia fuckeliana 3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO: M 2017636,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年10月30日。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明,实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
本实施例以深海真菌中的富克尔核盘菌(Botryotinia fuckeliana 3A00494)为原料,制备式(I)~式(XV)所示的富克尔核盘菌发酵化合物,具体步骤如下:
(1)真菌富克尔核盘菌(Botryotinia fuckeliana 3A00494)接种到PDA培养基上,放置于25℃培养箱中生长4天,然后把菌丝体接种到20个装有30mL PDB液体培养基的250mL三角瓶中中,作为种子培养液,此种子培养液置于28℃摇床中以180rpm培养5天,最后将此种子培养液接种到85个1L三角瓶,每个三角瓶中放置80g大米以及120mL蒸馏水,接种后放置于28℃静止培养32天,发酵结束得到发酵产物;
(2)将步骤(1)中得到的发酵产物利用乙酸乙酯萃取四次得到有机提取物110g;
(3)将步骤(2)中所得有机提取物利用90%的甲醇溶解,溶解之后再利用石油醚萃取四次以去除大量的脂肪酸,甲醇层蒸干合并得到去脂提取物24g;
(4)将步骤(3)中得到的去脂提取物通过正相硅胶柱(200-300目),采用石油醚:丙酮梯度洗脱(1:0→0:1)得到8个组份(Fr.1-Fr.8);
(5)将步骤(4)中得到的组份Fr.3(2.8g)首先通过反向ODS柱采用5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱得到6个亚组份(Fr.3-1-Fr.3-6);
(6)将步骤(5)中得到的亚组份Fr.3-1通过Sephadex LH-20柱以氯仿:甲醇(1:1)洗脱、ODS柱以甲醇:水梯度洗脱(5%→100%)、正相硅胶柱以氯仿:甲醇(25:1)等度洗脱以及厚层制备(PTLC)以乙酸乙酯:甲醇(15:1)等度洗脱得到化合物15(10.4mg),17(11.2mg),50(15.0mg),72(3.9mg)。亚组份Fr.3-2通过正相硅胶柱以氯仿:甲醇(50:1)等度洗脱、然后再以30:1洗脱、最后通过ODS柱5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱得到化合物12(5.6mg),37(12.1mg),51(14.7mg),73(15.0mg),77(7.9mg)。亚组份Fr.3-3通过ODS柱以甲醇:水梯度洗脱(5%→100%);然后采用正相硅胶柱以氯仿:甲醇(15:1),氯仿:丙酮(2:1)先后洗脱,以及利用重结晶方法得到化合物23(13.2mg),61(4.2mg),67(3.0mg)。亚组份Fr.3-4通过Sephadex LH-20柱(氯仿:甲醇,1:1),反复正相硅胶柱采用纯乙酸乙酯洗脱、然后采用氯仿:甲醇(25:1)等度洗脱得到化合物3(24.6mg)和4(6.2mg)。亚组份Fr.3-5和Fr.3-6分别通过反相ODS柱以甲醇:水梯度洗脱(5%→100%)以及正相硅胶柱以氯仿:甲醇(15:1)等度洗脱得到化合物2(28.5mg),35(27.4mg),49(18.5mg)。
(7)将步骤(4)中得到的组份Fr.4(3.7g)首先通过正相硅胶柱以氯仿:甲醇梯度洗脱 (1:0→0:1)得到5个亚组份(Fr.4-1-Fr.4-5);
(8)将步骤(7)中得到的亚组份Fr.4-1通过Sephadex LH-20柱以甲醇洗脱,反相ODS 柱以甲醇:水梯度洗脱(5%→100%),以及正相硅胶柱以乙酸乙酯:甲醇(150:1)得到化合物40(17.0mg)和64(15.2mg)。亚组份Fr.4-2和4-3分别采用反相ODS柱以5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱;反复正相硅胶柱以石油醚:乙酸乙酯(2:1);氯仿:丙酮(3:1);以及氯仿:甲醇(20:1)得到化合物39(12.4mg),44(2.0mg),53(5.0mg),60(10.5mg),74(4.4mg),14(29.6mg),32(9.8mg),59(24.1mg),62(35.8mg),66(39.3mg)。亚组份Fr.4-4采用反相ODS柱以5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱以及重结晶方法得到化合物16(82.0mg)和36(68.2mg)。亚组份Fr.4-5通过反复的正相硅胶柱以氯仿:甲醇(50:1);石油醚:乙酸乙酯(2:1);以及厚层制备PTLC以石油醚:乙酸乙酯(1:1)洗脱得到化合物5(3.2mg)。
(9)将步骤(4)中得到的组份Fr.5(1.8g)采用反相ODS柱以5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱得到3个亚组份(Fr.5-1-Fr.5-3)。
(10)将步骤(9)中得到的亚组份Fr.5-1与Fr.5-2分别采用反复正相硅胶柱以石油醚:乙酸乙酯(1:1);氯仿:丙酮(2:1);乙酸乙酯:甲醇(200:1)以及反相ODS梯度洗脱得到化合物7(11.0mg),10(21.4mg),11(8.4mg),12(7.8mg),22(7.7mg),26(42.8mg),76(1.9mg),28 (20.1mg),33(12.8mg),43(15.6mg),47(39.2mg),69(3.2mg)。
(11)将步骤(4)中得到的组份Fr.6(3.24g)首先采用正相硅胶柱以氯仿:甲醇(100:1)洗脱得到7个亚组份(Fr.6-1-Fr.6-7)。
(12)将步骤(11)中得到的亚组份Fr.6-1与Fr.6-2采用反复正相硅胶柱以纯乙酸乙酯;氯仿:丙酮(10:1);氯仿:甲醇(50:1)以及反相ODS梯度洗脱得到化合物1(5.1mg),9(12.6 mg),34(30.4mg),48(4.2mg),65(40.7mg),68(7.1mg),71(6.6mg),75(2.9mg)。亚组份Fr.6-3 采用和Fr.6-1相同的分离方法得到化合物6(12.2mg),13(1.8mg),21(31.1mg),58(16.7mg)。亚组份Fr.6-4和Fr.6-5分别采用反相ODS柱以5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱、正相硅胶柱以石油醚:丙酮(5:1)、以及重结晶方法得到化合物27(18.6mg),24(5.9mg),41(1.2mg),52(1.1 mg),54(2.5mg),63(1.6mg),8(7.2mg)。
(13)将步骤(4)中得到的组份Fr.8(4.2g)采用反相ODS柱以5%甲醇到100%甲醇梯度洗脱得到10个亚组份(Fr.8-1-Fr.8-10)。
(14)将步骤(13)中得到的亚组份Fr.8-3与Fr.8-4采用反复正相硅胶柱以氯仿:甲醇 (50:1)、氯仿:甲醇(15:1)、石油醚:丙酮(5:1)、以及反相ODS柱梯度洗脱得到化合物18(7.0 mg),19(3.7mg),38(11.5mg),45(1.4mg),30(1.4mg),31(17.5mg),55(6.0mg),57(2.0mg)。亚组份Fr.8-5采用正相硅胶柱以氯仿:甲醇(30:1)、反相ODS柱、以及复的正相硅胶柱以氯仿:甲醇(50:1)、氯仿:丙酮(30:1)、石油醚:丙酮(5:1)、石油醚:乙酸乙酯(1:1)得到化合物20(22.3mg),25(11.4mg),29(11.7mg),42(6.9mg),46(5.5mg),56(9.6mg),70(8.8mg)。
将上述所得化合物用1H-NMR和13C-NMR谱分析。
化合物1为无色油状。通过高分辨质谱HRESIMS正离子峰m/z 401.2322[M+Na]+(计算值为C22H34O5Na,401.2304)确定其分子式为C22H34O5。核磁共振1H和13C NMR数据见表9 与表10。1H NMR谱显示3个单峰甲基信号(δH 0.68,0.94,2.01),9个亚甲基信号(其中包括2个与氧原子相连,δH 3.20,3.36;δH 4.01,4.06),4个次甲基信号(其中1个连接氧原子,δH3.50)。核磁共振13C NMR谱显示22个碳信号,分别为3个甲基(δC 17.1,17.6,20.8),6 个季碳(δC 35.9,40.0,80.5,130.2,147.7,170.5),9个亚甲基(δC 18.0,25.6,26.3,29.8,30.2,34.3, 37.6,68.8,69.3),4个次甲基(δC 39.9,46.7,53.4,73.1)。通过二维核磁共振1H-1HCOSY谱推出3个结构片段:C-1/C-2/C-3,C-5/C-6/C-7,C-15/C-14/C-11/C-12/C-13。通过二维HMBC谱重要氢信号(Me-19,Me-20,H2-7,H2-13,H2-14,H2-17)与各碳相关信号推出结构新颖的6/6/5/5 胼合的四环二萜骨架,此碳骨架首次报道。该化合物的相对构型通过二维核磁共振NOESY 谱确定。质子相关信号从Me-20到Me-19/H-2a(δH 1.79)/H-6b(δH 1.38)以及Me-19到H-3推出这些质子位于同一个方向(假定为β方向);质子信号H-11(δH 3.11)到Me-20/H-12/OH-16 (δH 4.42)以及H2-17到H2-13确定H-11,H-12,OH-16共同位于β方向。因此该化合物的相对构型确定为3R*,4R*,5R*,10S*,11R*,12R*,16R*。其绝对构型通过量子化学计算方法确定,分别采用计算ECD和OR两种方法。化合物1的两种可能构型(3R,4R,5R,10S,11R,12R,16R)-1 (1a)以及对映异构体(3S,4S,5S,10R,11S,12S,16S)-1(1b)采用TDDFT方法分别以MMFF94, B3LYP/6-311G**水平理论计算其ECD及OR值。理论计算1a的ECD谱与其实验测试的ECD 谱(MeOH)几乎完全重合,而1b却完全相反,从而确定化合物1和1a具有相同的绝对构型。该推断进一步得到理论计算OR的确认,理论计算OR值1a(-36.2),1b(+31.8)以及实验测试值(-44.1)进一步验证化合物1的绝对构型为3R,4R,R,10S,11R,12R,16R。该新骨架化合物命名为bofuckelin A。
化合物2为无色油状。分子式C20H32O5通过高分辨质谱HRESIMS正离子峰m/z375.2134 [M+Na]+(计算值C20H32O5Na,375.2147)以及二倍钠离子峰m/z 727.4371[2M+Na]+(计算值C40H64O10Na,727.4397)确定。其核磁共振1H和13C NMR数据见表9与表10。通过分析化合物2的1H和13C NMR数据发现与已知化合物aphidicolin及其相似,说明化合物2为其结构类似物。仔细比对发现显著差异如下:化合物2中含有两个额外烯碳(δC 117.1,155.7) 以及含氧次甲基(δH 3.33,δC 82.4)。通过二维核磁共振谱(1H-1H COSY,HSQC,HMBC)确定化合物2的结构为C-14与C-8连接从而形成新骨架二萜,并非在aphidicolin中C-14与C-9 连接。化合物2的相对构型通过NOESY确定。关键NOESY相关信号从Me-20(δH 1.03)到 Me-19(δH0.72)/H-2a(δH 1.78)/OH-13(δH 3.97)推出这些质子处于相同方向;另外NOESY相关从OH-3(δH 4.62)到H-5(δH 1.92)确定其共面并且与Me-20处于相反面,从而确定化合物 2的相对构型为3R*,4R*,5R*,8R*,10S*,12S*,13R*,16R*。其绝对构型通过丙叉以及改良的Mosher’s反应确定。首先化合物2通过丙叉反应保护C-3及C-18位羟基,然后丙叉反应产物再与R-/S-MPA,DCC,DMAP反应得到R-MPA/S-MPA酯化产物,最后对酯化产物的1H NMR 核磁数据分析,从而确定化合物2的绝对构型为3R,4R,5R,8R,10S,12S,16R。该结构新颖新化合物2命名为bofuckelin B。其化学反应过程如式(XVI)所示:
化合物3(C22H34O6),4(C20H32O4),5(C22H34O5),6(C20H30O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS分别得以确定。这四个化合物的1H和13C NMR数据见表9与表10。这些化合物的核磁数据与化合物2及其相似,表明它们为结构类似物。部分差异信号如下:化合物3中存在额外的乙酰基信号(δH 2.04;δC 20.9,170.5)且从HMBC谱中推出该基团通过氧原子与 C-17(δC 69.2)连接,从而确定化合物3的结构为2的C-17乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为bofuckelin C。化合物4的核磁数据中显示多1个单峰甲基(δH 1.18;δC 27.7)而少1个羟甲基,HMBC谱推出该额外单峰甲基位于C-16位,从而确定化合物4为2的C-17羟甲基还原成甲基产物,该新结构化合物命名为bofuckelin D。化合物5的核磁数据较化合物2少1个含氧的次甲基,通过HMBC以及COSY谱确定该少的次甲基位于C-3位,从而确定新颖结构化合物5为2的C-3位还原产物,该新颖结构化合物命名为bofuckelin E。化合物6的核磁数据与2相比较发现6中少1个含氧次甲基与此同时多1个羰基碳(δC 177.0),结合HMBC谱推出该羧基基团位于C-16位,表明化合物6的结构为2的C-13脱羟基以及C-17羟甲基氧化为羧基衍生物,该新颖结构化合物命名为bofuckelin F。
化合物7(C25H40O6),8(C25H40O5),9(C23H36O5),10(C23H38O5),11(C23H36O6),12(C23H36O5) 的分子式通过高分辨质谱HRESIMS分别得以确定。这六个化合物的1H和13C NMR数据见
表11和表12。这些化合物的核磁数据与已知化合物 3α,18-isopropylidenedioxyaphidicolane-16β,17-diol及其相似,部分差异信号如下:化合物7中存在额外含氧次甲基(δH 4.26,δC 68.6)及乙酰基信号(δH 2.07;δC 20.8,173.1),结合COSY和 HMBC谱确定该含氧次甲基位于C-1位,而乙酰氧基位于C-17,从而确定化合物7的结构为已知物的C-1羟基化以及C-17乙酰化产物,命名该新结构化合物为aphidicolin A1。化合物8 NMR数据与已知化合物相比较,仅存在额外乙酰基基团(δH 2.01;δC 20.8,170.5),通过其 HMBC谱确定该乙酰基通过氧原子与C-17相连,从而确定化合物8的结构为已知物的C-17 乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A2。化合物9核磁数据与已知化合物相比较发现存在1个酮羰基碳(δC 211.1)并且少1个亚甲基,结合HMBC谱确定该酮羰基碳位于 C-6位,因此化合物9的结构确定为已知物的C-6位氧化产物,该新颖结构化合物命名为 aphidicolin A3。化合物10的核磁数据与已知化合物相比多1个含氧次甲基(δH 3.58;δC69.8),结合COSY和HMBC谱推出1个羟基基团位于C-6位,从而确定新颖结构化合物10为C-6位羟基化产物,命名为aphidicolin A4。化合物11核磁数据与已知化合物相比多1个含氧次甲基(δH 4.13;δC 65.9)和1个羰基碳(δC 176.8),结合COSY以及HMBC谱确定额外羟基位于C-6位,羧基基团位于C-16位,因此化合物11的结构确定为已知物的C-6羟基化以及C-17 羟甲基氧化为羧基衍生物,该新化合物命名为aphidicolin A5。化合物12与已知化合物核磁数据相比较,发现存在2个sp2碳(δC 119.7;δC 148.9)以及1个含氧次甲基(δH 4.03,δC72.4), 通过2D NMR确定多出的2个sp2碳构成1个双键位于Δ7(8),而羟基位于C-13位。因此化合物12的结构确定为双键位于Δ7(8),C-13羟基化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A6。
化合物13的分子式通过高分辨质谱HRESIMS钠离子峰m/z 415.2444[M+Na]+确定为 C23H36O5,其1H和13C NMR数据见
表11和表12。该化合物的核磁数据与已知化合物16β,17-isopropylidenedioxyaphidicolin 非常相似,其明显差别为13中存在1个羰基碳(δC178.1)同时少1个含氧亚甲基,结合HMBC 谱确定羧基基团位于C-4位,因此13的结构确定为已知物的C-18羟甲基氧化为羧基产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A7。
化合物14的分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C20H32O5。其NMR数据与已知化合物aphidicolin极其类似,其显著差别为化合物14的13C NMR中出现1个酮羰基碳(δC 211.2)同时少1个亚甲基,结合HMBC谱推断酮羰基取代已知物的C-6位亚甲基。因此化合物14 的结构为新颖的C-6羰基化产物,命名为aphidicolin A8,其1H和13C NMR数据见表12和表13。
化合物15(C20H30O5),16(C22H34O6),17(C20H30O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。化合物15-17的1H和13C NMR数据见表12和表13。化合物15的核磁数据与14极其类似,其主要差别为15中多1个酮羰基碳(δC 213.9) 同时少1个含氧次甲基,借助COSY以及HMBC谱推出多出的酮羰基取代14的C-3位含氧次甲基。因此化合物15的结构确定为14的C-3位脱氢形成酮基团衍生物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A9。化合物16的核磁数据与14极其类似,不同之处为16中存在额外的乙酰基信号(δH 2.02,δC 20.8,170.5),结合HMBC谱确定乙酰氧基位于C-17位,因此化合物16的结构确定为14的C-17乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A10。化合物17的核磁数据与14非常类似,其明显差别在于17中出现醛基信号(δH 9.24,δC 208.0)同时少1个羟甲基,说明化合物17中的醛基取代羟甲基。结合HMBC谱确定该醛基位于C-4 位。因此化合物17的结构鉴定为14的C-18羟甲基被醛基取代产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A11。
化合物18(C22H36O6),19(C22H36O6),20(C22H34O6),21(C20H30O6)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。这四个化合物的1H和13C NMR数据见表13与表14。化合物18的核磁数据与已知化合物3α,6β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane 及其类似,其明显差别为化合物18中多1个乙酰基基团(δH 2.01;δC 20.8,170.5),通过HMBC 谱推出该基团通过氧原子与C-17相连,因此化合物18的结构确定为已知物的C-17乙酰化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A12。化合物19的1H和13C NMR数据与18 极其类似。不同之处为19中多1个羟甲基(δH 3.77,δC 58.8)同时少1个单峰甲基,说明羟甲基取代18中的甲基基团。HMBC和COSY谱验证了该推断,因此化合物19的结构确定为18 的C-20位羟基化产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A13。化合物20的NMR数据与18非常相似,不同之处在于20中少1个羟甲基,同时在13C NMR中多1个羰基碳(δC 177.5),表明羧基基团取代羟甲基,该推测通过COSY以及HMBC谱得到验证。因此化合物 20的结构鉴定为18的C-18羟甲基氧化为羧基产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A14。化合物21的NMR数据与已知化合物3α,16,17-trihydroxyaphidicolan-18-oate非常相似,差别在于21的13C NMR中少1个羟甲基与此同时多1个羰基碳(δC 176.9),结合HMBC谱推出化合物21中的羧基基团取代已知物中的C-17羟甲基。因此化合物21结构鉴定为已知物的C-17羟甲基氧化为羧基衍生物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A15。
化合物22(C22H36O6),23(C20H32O6),24(C20H34O5),25(C22H36O6),26(C22H36O6)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。化合物22和23的1H和13C NMR数据分别见表13与表14;化合物24-26的1H和13C NMR数据见表14与表15。化合物22的NMR数据与已知化合物3α,7β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane及其相似,其主要差别在于22中存在1个乙酰基基团(δH 2.01;δC 20.8,170.5),除此之外22中C-7羟基为7α-OH方向而非已知物中的7β-OH方向,该推断由NOESY谱中的相关质子信号[Me-20(δH 0.88)到Me-19(δH 0.70)/H-8(δH1.83)/H-11a(δH 1.14)以及从H-5(δH 2.43)到OH-7(δH 4.20)]确定。因此化合物 22的结构确定为已知化合物3α,7β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane的7α-OH以及C-17乙酰化衍生物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A16。化合物23的NMR数据与已知物 3α,7β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane非常相似,其明显差别在于化合物23的1H NMR中少1个羟甲基同时13C NMR中多1个羰基碳(δC 176.8),表明已知化合物中的羟甲基被羧基基团取代,HMBC谱推出取代位置为C-17位。因此化合物23结构确定为已知物 3α,7β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane的C-17羟甲基氧化为羧基衍生物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A17。化合物24的NMR数据与已知物aphidicoilin极其相似,其不同点为24中存在1个额外羟基基团,结合COSY谱确定其位于C-14位,因此化合物24的结构确定为aphidicoilin的C-14位羟基化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A18。化合物25的核磁数据与24高度类似,主要差别在于25中存在1个乙酰基(δH 2.00;δC 20.9, 170.4),结合HMBC谱确定该基团通过氧原子氧与C-17连接。因此化合物25结构鉴定为24 的C-17位乙酰化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A19。化合物26的NMR数据与已知物aphidicolin-17-monoacetate非常接近,其差别在于26中多1个羟基基团,结合 COSY谱确定该基团位于C-1(δC 66.0)位。因此化合物26的结构鉴定为 aphidicolin-17-monoacetate的C-1羟基化产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A20。
化合物27的分子式通过高分辨质谱HRESIMS正离子峰m/z 419.2406[M+Na]+确定为 C22H36O6,其1H和13C NMR数据见表14与表15。该化合物的核磁数据与已知化合物 3α,11β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane极其类似,其不同点为27中存在1个乙酰基基团(δH 2.00;δC 20.8,170.4),结合HMBC推出该基团通过氧原子与C-17相连。因此化合物27的结构鉴定为3α,11β,16β,17,18-pentahydroxyaphidicolane的C-17乙酰化衍生物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A21。
化合物28(C20H32O4),29(C22H34O5),30(C22H34O5),31(C20H30O5),32(C20H32O5),33(C20H32O5),34(C22H34O6)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。化合物28和 29的1H和13C NMR数据见表14与表15;化合物30-34的1H和13C NMR数据见表15与表17。化合物28的NMR数据与aphidicolin及其类似,不同点为28中存在1个烯双键(δH 5.35;δC 124.1,144.6),结合COSY以及HMBC谱确定该双键位于Δ8(13)位。因此化合物28结构鉴定为aphidicolin的C-8/C-13还原产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A22。化合物29的NMR数据与28类似,其明显差别为29中存在1个乙酰基(δH 2.01;δC 20.8,170.4),结合HMBC谱确定该基团通过氧原子与C-17相连接。因此29的结构确定为28的C-17乙酰化产物,该结构新颖的化合物命名为aphidicolin A23。化合物30的NMR数据与28极其相似,其显著差异为30中存在1个乙酰基基团(δH 2.00;δC 20.9,170.6),结合HMBC谱确定其通过氧原子与C-18连接。因此化合物30的结构确定为28的C-18乙酰化产物,命名该新颖结构化合物为aphidicolin A24。化合物31的NMR数据与28极其类似,不同之处为31的13C NMR 中多1个羰基碳(δC 177.4)与此同时少1个羟甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱推出羧基基团取代28的C-17位羟甲基。因此化合物31的结构确定为28的C-17羟甲基氧化为羧基衍生物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A25。化合物32的核磁数据与28极其类似,比较发现32中存在1个含氧季碳(δC 85.0),与此同时少掉1个次甲基,结合COSY以及HMBC 谱推出此额外羟基位于C-12位。因此化合物32的结构鉴定为28的C-12位羟基化产物,该结构新颖化合物命名为aphidicolin A26。化合物33的NMR数据与28非常类似,不同之处在于33中存在额外C-14位羟基基团。HMBC以及COSY谱验证了该推断。因此化合物33的结构确定为28的C-14位羟基化产物,该结构新颖的化合物命名为aphidicolin A27。化合物 34的核磁数据与33非常相近,不同点为34中存在1个乙酰基基团(δH 2.02;δC 20.7,170.4),结合HMBC谱推出该取代基通过氧原子与C-17连接。因此化合物34的结构确定为33的C-17 乙酰化衍生物,该结构新颖的化合物命名为aphidicolin A28。
化合物35(C20H32O4),36(C22H34O5),37(C22H34O5),38(C20H30O5),39(C20H32O5),40(C20H32O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。这六个化合物的1H和13C NMR数据见表16与表17。化合物35的1H和13C NMR数据与28非常相似,不同点为35 中存在1个额外羟基,通过COSY谱确定其位于C-7位。因此化合物35结构鉴定为28的C-7 位羟基化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A29。化合物36的NMR数据与35 非常相似,其差异为36中OH-7为α方向而非35中的OH-7β方向,通过NOESY谱中的相关质子信号得以确定。因此化合物36结构鉴定为35的C-7位差向异构体,同时该结构新颖化合物命名为aphidicolinA30。化合物37的NMR数据与35非常相似,其显著差异为37中存在1个乙酰基团(δH 2.02;δC20.8,170.5),借助HMBC谱确定其通过氧原子与C-17相连。因此37的结构鉴定为35的C-17乙酰化产物,同时该结构新颖的化合物命名为aphidicolin A31。化合物38的结构通过HRESIMS以及2D NMR谱鉴定为36的C-17乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolinA32。化合物39的NMR数据与28非常接近,不同之处为 39的13C NMR谱中出现1个酮羰基碳(δC215.2)同时少1个含氧次甲基,结合HMBC谱推出酮羰基碳取代28中的C-3位含氧次甲基。因此化合物39的结构鉴定为28的C-3脱氢形成酮基团产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A33。化合物40的NMR数据与39非常相似,不同点为40中多1个羟基基团,结合COSY谱推出该基团位于C-7位。因此化合物40 的结构鉴定为39的C-7羟基化产物,同时该新结构化合物命名为aphidicolin A34。
化合物41(C22H34O6),42(C22H36O6),43(C20H32O6),44(C20H34O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。这四个化合物的1H和13C NMR数据见表16与表18。化合物 41的核磁数据与36非常相似,不同之处为41的13C NMR谱中少1个含氧次甲基与此同时多 1个亚甲基(δH 1.29;δC 35.8),结合COSY以及HMBC谱确定亚甲基取代36中的C-3位含氧次甲基。因此化合物41的结构鉴定为36的C-3位脱羟基产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A35。化合物42的NMR数据与38非常相似,主要差异在于42中出现1个醛基基团(δH 9.34,δC 207.6)同时少1个羟甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱推出醛基取代 38中的C-18位羟甲基。因此42的结构鉴定为38的C-18位羟甲基取代为醛基产物,该结构新颖化合物命名为aphidicolin A36。化合物43的核磁数据与42非常接近,其差别为43中不存在乙酰基信号,因此化合物43的结构鉴定为42的C-17脱乙酰基衍生物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A37。化合物44的NMR数据与43相似,通过HSQC,COSY,HMBC, NOESY谱确定44的结构为43的C-3差向异构体,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A38。
化合物45的分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C22H36O6。其NMR数据与28非常相似,显著差别为45的13C NMR中多1个羰基碳(δC 177.8)同时少1个羟甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱确定羧基基团取代羟甲基。因此45的结构鉴定为28的C-18位羟甲基氧化为羧基产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A39。
化合物46的分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C22H36O6。其NMR数据与45非常接近,差别为46中存在1个乙酰基基团(δH 2.02;δC 20.7,170.4),分析HMBC谱确定该基团通过氧原子与C-17位相连。因此化合物46的结构鉴定为45的C-17乙酰化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A40。
化合物47的分子式通过高分辨质谱HRESIMS钠离子峰m/z 357.2037[M+Na]+(理论计算值C20H30O4Na,357.2042),二倍峰m/z 691.4184[2M+Na]+(理论计算值C40H60O8Na,691.4186)确定为C20H30O4。其NMR数据与28极其类似,不同点为化合物47中存在额外烯双键(δH 5.62,6.16;δC 123.8,130.4),结合COSY以及HMBC谱确定其位于Δ6(7)位。因此47 的结构鉴定为28的C-6/C-7脱氢产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A41。
化合物48的NMR数据与47非常类似,该化合物的分子式通过高分辨质谱HRESIMS正离子峰m/z 399.2143[M+Na]+(理论计算值C22H32O5Na,399.2147),二倍峰m/z 755.4402[2M+Na]+(理论计算值C44H64O10Na,775.4397)确定为C22H32O5。其NMR数据与47非常相似,其显著差别为48中存在1个乙酰基基团(δH 2.02;δC 20.7,170.4),结合HMBC谱确定其通过氧原子与C-17连接。因此48结构鉴定为47的C-17位乙酰化产物,同时命名该结构新颖的化合物为aphidicolin A42。其中化合物45-48的1H和13C NMR数据见表18与表19。
化合物49(C20H32O5),50(C22H34O6),51(C20H32O4),52(C20H32O4),53(C22H34O5),54(C20H32O4)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。化合物49的NMR数据与已知化合物3α,13β,16β-trihydroxyaphidicol-7-ene非常接近,明显差别为49中多2个羟甲基与此同时少2个单峰甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱推出2个羟甲基分别取代已知物中的 C-17以及C-18位甲基。因此49的结构鉴定为3α,13β,16β-trihydroxyaphidicol-7-ene中的C-17以及C-18位羟基化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A43。化合物50核磁数据与49非常相似,不同之处为50中出现了1个乙酰基(δH 2.03;δC 20.8,170.5),结合HMBC谱确定该基团通过氧与C-17相连。因此化合物50的结构鉴定为49的C-17乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A44。化合物51核磁数据与49及其类似,不同点为51的13CNMR谱中少1个羟甲基同时多1个单峰甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱确定甲基取代49中的C-17羟甲基。因此51的结构鉴定为49的C-17羟甲基脱氧产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A45。化合物52的NMR数据与49非常相似,其差别之处为52的13C NMR 谱中少1个含氧次甲基与此同时多1个亚甲基(δH 1.16,1.42;δC 35.8),结合COSY以及HMBC 谱确定亚甲基取代49中的C-3位含氧次甲基。因此52的结构鉴定为49中的C-3位脱氧产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A46。化合物53的NMR数据与52类似,结合 HRESIMS,COSY以及HMBC谱鉴定53的结构为52的C-17乙酰化产物,同时命名该结构新颖化合物为aphidicolin A47。化合物54的NMR数据与52非常相似,其不同点为54的13C NMR谱中多1个单峰甲基(δH 1.10;δC 36.8)同时少1个羟甲基,结合HMBC谱确定52中的 C-18位羟甲基被单峰甲基取代。因此54的结构鉴定为52的C-18位羟甲基脱氧产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A48。其中化合物49-51的1H和13C NMR数据见表18与表 19;化合物52-54的1H和13C NMR数据见表19与表21。
化合物55(C20H32O4),56(C22H34O5),57(C22H34O5),58(C20H30O5),59(C20H30O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。这五个化合物的1H和13C NMR数据见表20与表21。化合物55的NMR数据与49非常相似,不同点为55中少1个含氧次甲基同时多1个亚甲基(δH 2.09;δC 33.7),结合COSY以及HRESIMS确定化合物55的结构为49的C-13脱氧产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A49。化合物56的NMR数据与55非常相似,主要差别为56中存在1个乙酰基(δH 2.02;δC 20.8,170.4),结合HMBC谱确定56的结构为55的C-17乙酰化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A50。化合物57的分子式与56 相同且NMR数据非常接近,结合2D NMR谱确定57的结构为56的C-18位乙酰化产物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A51。化合物58的NMR数据与55非常相似,不同点为58的13C NMR谱中多1个羰基碳(δC 176.9)同时少1个羟甲基,结合HRESIMS以及HMBC 谱鉴定58的结构为55的C-17羟甲基氧化为羧基产物,同时该结构新颖化合物命名为 aphidicolin A52。化合物59的NMR数据与55相似,显著差异为59的13C NMR谱中出现1 个酮羰基碳(δC 199.8)同时少1个亚甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱确定59的结构为 55的C-6亚甲基被氧化为酮羰基产物,同时该结构新颖化合物命名为aphidicolin A53。
化合物60(C20H32O4),61(C22H34O5),62(C22H34O5),63(C20H30O5)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。化合物60的NMR数据与49极其相似,不同点为60的H-13(δH4.61)化学位移明显偏向低场,分子量同时比49少18,结合HMBC谱中的H2-17(δH 3.55,3.60)与C-13(δC 83.8)相关信号确定C-13与C-17通过氧原子连接形成呋喃环结构。因此60的结构确定为49的C-13与C-17通过脱水缩合形成呋喃环衍生物,同时该结构新颖化合物命名为aphidicolin A54。化合物61的结构通过HRESIMS以及2D NMR谱确定为60的C-6羟基化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A55。化合物62的结构通过HRESIMS以及2D NMR 谱鉴定为61的C-6差向异构体,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A56。化合物63 的结构同样通过HRESIMS以及2D NMR谱鉴定为60的C-3脱氧产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A57。其中化合物60-62的1H和13C NMR数据见表20与表21;化合物63 的1H和13CNMR数据见表20与表23。
化合物64(C20H30O4),65(C22H32O5),66(C20H28O5),67(C20H30O5),68(C22H32O6),69(C20H28O4),70(C20H30O4)的分子式分别通过高分辨质谱HRESIMS得以确定。这七个化合物的1H和13C NMR数据见表20、表22与表23。化合物64的NMR数据与aphidicolin类似,其显著差别为64中存在1个烯双键(δC 114.3,150.4),结合H2-18(δH 3.71,4.40)到C-6(δC 150.4)的HMBC相关信号以及HRESIMS确定该双键位于Δ5(6)位且C-6与C-18通过氧原子连接形成呋喃环结构。因此64结构鉴定为aphidicolin的C-5/C-6脱氢以及C-6/C-18通过氧连接形成呋喃环衍生物,同时该新颖结构化合物命名为aphidicolin A58。化合物65的结构通过 HRESIMS以及2D NMR谱鉴定为64的C-17乙酰化产物,同时命名该结构新颖化合物为 aphidicolin A59。化合物66的NMR数据与64极其相似,不同点为66的13C NMR谱中出现 1个羰基碳(δC 177.0)同时少掉1个羟甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱确定66的结构为 64的C-17羟甲基氧化为羧基产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A60。化合物 67的结构通过HRESIMS以及HMBC谱鉴定为64的C-15羟基化产物,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A61。化合物68的NMR数据与65非常接近,不同之处为68中多1个羟基与此同时少1个亚甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱鉴定化合物68的结构为65的C-15 羟基化产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A62。化合物69的核磁数据与64非常相似,主要区别为69的13C NMR谱中出现1个酮羰基碳(δC 214.8)与此同时少1个含氧次甲基,结合HRESIM以及COSY谱确定69的结构为64的C-3脱氢形成酮羰基基团,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A63。化合物70的NMR数据与68非常相似,不同之处为70中不存在乙酰基同时少1个含氧次甲基,结合HRESIMS以及HMBC谱确定70的结构为68的C-3脱羟基以及C-17脱乙酰基衍生物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A64。
化合物71分子式通过高分辨质谱HRESIMS钠离子峰m/z 389.2320[M+Na]+(理论计算值C21H34O5Na,389.2304),二倍离子峰m/z 755.4750[2M+Na]+(理论计算值C42H68O10Na,755.4710)确定为C21H34O5。该化合物的NMR数据与已知物aphidicolin-17-monoacetate非常相似,不同之处为71的13C NMR中少1个羟甲基碳,结合HRESIMS以及HMBC谱确定71 的结构为aphidicolin-17-monoacetate的C-20降二萜,同时1个额外羟基位于C-4(δC 72.4)位,该新颖结构化合物命名为aphidicolin A65。
化合物72分子式通过高分辨质谱HRESIMS钠离子峰m/z 343.1884[M+Na]+(理论计算值C19H28O4Na,343.1885),二倍峰m/z 663.3879[2M+Na]+(理论计算值C38H56O8Na,663.3873) 确定为C19H28O4。其NMR数据与52非常相似,不同点为72中出现1个酮羰基碳(δC211.8) 同时少1个亚甲基以及1个羟甲基,结合HRESIMS,COSY以及HMBC谱确定72的结构为52的C-3位酮羰基化以及降C-18羟甲基衍生物,该新颖结构化合物命名为aphidicolinA66。
化合物73分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C19H26O4。该化合物的NMR数据与15非常相似,其显著差别为73的13C NMR谱中出现2个sp2碳(δC 134.5,155.3)以及少1 个羟甲基,结合HRESIMS,COSY以及HMBC谱确定73的结构为15的C-4/C-5脱氢以及降 C-18羟甲基产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A67。
化合物74的结构通过分析HRESIMS以及2D NMR谱确定为73的C-17乙酰化产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A68。化合物71-74 1H和13C NMR数据见表24与表25。
化合物75的分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C23H34O6。该化合物的NMR数据与化合物71非常相似,不同之处为出现2个烯碳构成双键位于C-3(δC 129.1)和C-4(δC134.8) 位,乙酰化的羟甲基(δH 4.43,4.38;δC 65.6,C-19;乙酰基δH 2.02;δC 20.7,170.0)取代化合物71中单峰甲基位于C-4位,此外1个羟基基团位于C-2(δC 65.2)而非化合物71中的 C-3位。该推断通过2D NMR谱得以验证,同时命名该结构新颖化合物为aphidicolin A69。
化合物76分子式通过高分辨质谱HRESIMS确定为C21H32O5。该化合物的结构通过分析 HRESIMS以及2D NMR谱确定为75的C-19乙酰化产物,同时命名该新颖结构化合物为aphidicolin A70。
化合物76和77的分子式分别通过高分辨HRESIMS确定为C21H32O5和C19H28O4。这两个化合物的NMR数据与化合物75非常相似,不同之处为化合物76中少1个乙酰基,剩余的1 个乙酰基基团通过HMBC谱中相关信号确定通过氧与C-19连接。因此化合物76的结构确定为化合物75的C-17脱乙酰基产物同时命名该结构新颖化合物为aphidicolin A70。化合物77 与75的差别在于少掉两个乙酰基基团,此外存在1个酮羰基基团取代原来75中的羟基基团。该推断通过2D NMR谱得到验证。因此化合物77的结构鉴定为化合物75的C-17和C-19脱乙酰基以及C-3位酮基化衍生物,同时命名该结构新颖化合物为aphidicolin A71。化合物75-77
1H和13C NMR数据见表24和表25。
表9化合物1-6的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表10化合物1-6的13C NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表11化合物7(CD3OD,400MHz)和8-13的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表12化合物7-17的13C NMR(400MHz)数据
表13化合物14-23的1H NMR(400MHz)数据
表14化合物18-29的13C NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表15化合物24-34的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)数据((24-29和31-34,400MHz,30,600MHz)
表16化合物35-44的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表17化合物30和40(600MHz)的以及31-39(400MHz)在DMSO-d6中的13C NMR数据
表18化合物41-51在DMSO-d6中的13C NMR数据
表19化合物45和52(600MHz)以及46-51、53和54(400MHz)在DMSO-d6中的1H NMR数据
表20化合物55-64的1H NMR(DMSO-d6)数据
表21化合物52和57(600MHz)的以及53-56和58-62(400MHz)在DMSO-d6中的13C NMR数据
表22化合物65-70的1H NMR(400MHz)数据
表23化合物63-70的13C NMR(400MHz)数据
表24化合物71-77的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
表25化合物71-77的13C NMR(DMSO-d6,400MHz)数据
实施例2实施例1制备得到的化合物的MTT法抗肿瘤活性考察
本实施例选择6株肿瘤细胞,包括7402(肝癌)、BIU-87(膀胱癌)、PANC-1(胰腺癌)、Hela-S3(子宫癌)、ECA109(食管癌)和HL-60(白血病)。通过检测化合物样品对这些肿瘤细胞的的抑制率,从而检测实施例1中化合物1-77的抗肿瘤活性。
本实施例分为以下3组:
(1)细胞培养液中不加化合物的阴性对照组;
(2)不含细胞,但有等量培养液的空白对照组;
(3)富克尔核盘菌发酵化合物实验组:实施例1中所得富克尔核盘菌发酵化合物;
本实施例采用如下操作:
(1)细胞常规消化后,于全培中重悬并吹打成单细胞悬液,然后以每孔2000-5000个细胞接种到96孔板,每孔体积200μl。
(2)37℃,5%CO2的培养箱中培养24h,然后加入不同浓度的化合物处理细胞。
(3)继续培养72h后,每孔加10μl 5mg/mL MTT (3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide),37℃避光反应3 h。小心吸弃上清液后,每孔加入150μl DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。
(4)酶标仪测定570nm光吸收值,然后计算抑制率。
(5)IC50表示抑制率为50%时的化合物浓度。
结果显示,化合物1-77的IC50数据如表26所示。
表26化合物1-77对不同肿瘤细胞的IC50数据(μM)
实施例3实施例1制备得到的化合物的CCK-8法抗肿瘤活性考察
本实施例选择细胞增殖检测法(CCK-8),使用16株肿瘤细胞,包括HL-60(白血病)、BEL-7402(肝癌)、MDMBA-231(乳腺癌)、Hela(子宫颈癌)、BIU-87(膀胱癌)、H446(肺癌)、ECA-109(食管癌)、B16(黑色素瘤)、HepG2(肝癌)、H460(肺癌)、MGC-803(胃癌)、U2OS(成骨肉瘤)、HCT116(结肠癌)、H1299(肺癌)、A549(肺癌)、PANC-1(胰腺癌细胞),通过检测化合物样品对这些肿瘤细胞的的抑制率,从而检测实施例1中化合物 14的抗肿瘤活性。
本实施例采用如下操作:
(1)在96孔板中配制100ml的细胞悬液,将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃,5%CO2的条件下)。
(2)向培养板加入10ml不同浓度的待测物质。
(3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间。
(4)向每孔加入10ml CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度,然后计算抑制率。
(6)IC50表示抑制率为50%时的化合物浓度。
结果显示化合物14能明显抑制体外培养的多种肿瘤细胞系,化合物14对白血病细胞 HL-60、肝癌细胞BEL-7402、乳腺癌细胞MD-MBA-231、子宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞BIU-87、肺癌细胞H446、人胃癌MGC803、食管癌细胞ECA-109、胰腺癌细胞株PANC-1、人宫颈癌HeLa、人成骨肉瘤U2OS、肝癌HepG2、结肠癌HCT116、小鼠黑色素瘤B16等肿瘤细胞的生长均具有显著抑制作用(表27)。对白血病细胞HL-60的IC50只有6.11μM,有非常良好的开发成为抗肿瘤药物的前景。
表27化合物14对不同肿瘤细胞的IC50数据(μM)
根据上述说明书的揭示和教导,本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此,本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式,对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外,尽管本说明书中使用了一些特定的术语,但这些术语只是为了方便说明,并不对本发明构成任何限制。
Claims (3)
1.二萜类化合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494进行液体或固体发酵培养,得到发酵物;
S2、将发酵物萃取,所得萃取物经分离纯化,得到所述的二萜类化合物;
所述二萜类化合物的结构式如式(II)所示:
其中,R1和R3为OH时,R2为CH2OH、CH2OAc或CH3;R1为H时,R2为CH2OAc,R3为OH;R1为OH时,R2为COOH,R3为H;
所述富克尔核盘菌Botryotinia fuckeliana 3A00494,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017636,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年10月30日。
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