CN101531721A - 一种三萜皂苷单体的工业化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种从中药威灵仙中提取分离一种三萜皂苷单体威灵仙皂苷AR的制备方法，其特征是将威灵仙总皂苷用有机溶剂加热回流提取，提取液减压浓缩到总体积的1/10～6/10，浓缩液低温下放置，高速离心或过滤，离心或过滤得到的沉淀蒸干，即得威灵仙皂苷AR。本发明的制备方法简单，适合用于工业化大生产。产品含量达85－99％，得率20％以上。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种从中药威灵仙中提取分离一种三萜皂苷单体的制备方法。
背景技术
威灵仙为我国常用中药材，自古以来，多种毛茛科铁线莲属植物的干燥根及根茎被作为威灵仙药用。中国药典收载威灵仙药材来源为毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck，棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根及根茎。秋季采挖，除去泥沙，晒干。威灵仙具有祛风除湿，通络止痛的功效。临床上用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利，骨哽咽喉等症，铁线莲属植物中富含皂苷类成分，现已从其中分离鉴定出60余种齐墩果烷型三萜皂苷，其苷元主要为齐墩果酸和常春藤苷元等，这些皂苷据报道具有抗肿瘤、抗炎等多种药理活性。
发明人前期的研究成果已表明，威灵仙药材中的总皂苷部位具有显著的抗免疫性炎症及镇痛作用(专利号：ZL2005100408257)。而占总皂苷部位50％以上的一种三萜皂苷：3-O-β-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃核糖基-(1→3)-α-O-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖基酯(3-O-β-[(O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-ribopyranosyl-(1→3)-α-O-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl)oxy]olean-12-en-28-olic acid O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl ester)(以下简称威灵仙皂苷AR，英文名：clematichinenoside AR)，分子式为：C82H134O43，分子量为：1806，其结构式如下：
威灵仙皂苷AR是发挥上述多种药理活性的主要物质基础，具有重要的应用价值(ZL2005100408242)。以往该化合物的分离主要经过下列步骤：药材用50％的乙醇液提取，提取液减压浓缩后溶于水中，经乙酸乙酯萃取后，弃去乙酸乙酯提取液，水层继续用正丁醇萃取，正丁醇提取物上D-101大孔树脂柱，依次用水，30％和70％甲醇液洗脱，收集70％甲醇洗脱液，减压浓缩至干后，再经硅胶柱分离，依次用氯仿-甲醇-水(7：3：0.1；3：3：0.1；3：3：1)洗脱，收集3：3：0.1洗脱液，蒸干溶剂后再经ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱分离，以甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水(2：1)部分，再经ODS高效制备柱分离，获得该化合物(见参考文献1)。发明人前期获得该化合物的方法则是以20-60％乙醇回流提取2次，提取液减压浓缩至无醇味，高速离心或过滤，滤液上大孔树脂柱吸附后，依次用碱水、水、20％乙醇液、70％乙醇液洗脱至流出液无色，收集70％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得总皂苷，该总皂苷再经Sephadex LH 20(交联葡聚糖凝胶)和ODS柱，氯仿-甲醇梯度洗脱即得。
上述制备方法步骤繁琐，费时，得率低，成本高，有毒溶剂用量较大，对环境易造成污染，产品易残留有机溶剂而不能充分保证产品的安全性，不适合工业化制备生产。
发明内容
本发明研究得到国家自然科学基金项目(项目号：30772770)和江苏省高技术项目(项目号：BG2007613)资助。
本发明公开了威灵仙皂苷AR的制备方法，大大简化了制备步骤，省时，得率高，成本低，有毒溶剂用量少，可以进行工业化生产。通过精制去除有毒溶剂残留，产品安全性得到保证，适合于从铁线莲属植物中工业化制备提取该化合物。
本发明制备威灵仙皂苷AR的方法如下：将威灵仙总皂苷用有机溶剂加热回流提取，提取液减压浓缩到总体积的1/10～6/10，浓缩液低温下放置，高速离心或过滤，离心或过滤得到的沉淀蒸干，即得威灵仙皂苷AR，所述有机溶剂选自甲醇、丙酮、异丙醇、乙醇中的一种或几种，有机溶剂浓度为大于70％。本发明中的百分比均为重量百分比。上述方法可以重复2～3次。
其中有机溶剂的用量优选为威灵仙总皂苷重量的5～100倍。
其中浓缩液低温放置的温度优选-10～10℃，放置时间优选4～12小时。
上述制备方法得到的样品优选还包括精制，精制方法优选下列几种：
1、将得到的威灵仙皂苷AR用2-5倍量的80％以上的乙醇洗涤。
2、将得到的威灵仙皂苷AR经活性炭脱色精制。
3、将得到的威灵仙皂苷AR用截留分子量为2000Da以上的超滤膜超滤。
4、将得到的威灵仙皂苷AR用水溶解后上反相色谱柱(C18柱或C8柱)，先用5-10％的乙醇洗脱3-4倍柱体积后，用40-50％的乙醇洗脱10-15倍柱体积后用乙醇洗脱，收集40-50％的乙醇洗脱液，蒸干。
上述四种方法中，可以只选一种方法精制，还可任选其中的两种或三种。
威灵仙总皂苷的制备方法优选：毛茛科铁线莲属植物干燥根或根茎粉碎后，以5-10倍量的水或1～20％的乙醇溶液冷浸、渗漉、超声或加热回流提取，提取液经减压浓缩后，高速离心或过滤，滤液上大孔树脂吸附后，依次用水、20％、30～50％，70～95％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30～50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，沉淀物干燥即得，其中乙醇浓度百分比为重量百分比。
上述得到的威灵仙总皂苷优选再次上大孔树脂精制1次。
其中毛茛科铁线莲属植物优选威灵仙、棉团铁线莲或东北铁线莲。
其中高速离心的转速优选8000转/分钟以上。
大孔树脂优选D-101、HPD-100、HPD-600、HPD-900，AB-8或ADS-7。
本发明的制备方法简单，适合用于工业化大生产。产品含量达85-99％，得率20％以上。
附图说明
图1是威灵仙皂苷AR的HPLC图谱
具体实施方式
实施例1
取威灵仙药材10kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根及根茎，以5倍量10％乙醇回流提取4次，每次1小时，提取液减压浓缩至无醇味，经12000转/分高速离心，上清液上HPD-100型大孔树脂柱吸附后，依次用水、20％乙醇液、30％-50％，70％-90％乙醇液洗脱至流出液无色，收集40-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得威灵仙总皂苷，威灵仙总皂苷再经HPD-100柱，依次用水、20％、30-50％，90％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，该提取物进一步用20倍量的70％以上的甲醇液分别加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/4，置5℃下放置8小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用5倍量的80％以上的乙醇洗涤3次，蒸干溶剂，得白色或类白色无定形粉末，为威灵仙皂苷AR粗品，将粗品溶于水后再经活性炭脱色，干燥后即得威灵仙皂苷AR 56g，含量为92.7％。
威灵仙皂苷AR的含量测定(HPLC-ELSD法)
色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18(5um，4.6×250mm)；
柱温：25℃；
流动相：乙腈：水(30：70)
流速：1.0ml/min；
ELSD条件：漂移管温度：110℃；载气流速：2.8L/min。
样品溶液的制备：精密称取威灵仙皂苷AR样品10mg至10ml量瓶中，以30％甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪，计算，即得，色谱图见图1。
计算方法：面积归一化法。
威灵仙皂苷AR的保留时间：8.244min
分析结果：
| # | 保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 峰宽 | 面积百分比 |
| 1 | 2.483 | 687.1 | 138.4 | 0.0739 | 5.9160 |
| 2 | 8.244 | 10771.9 | 571.4 | 0.2759 | 92.7406 |
| 3 | 9.325 | 156 | 9.4 | 0.2817 | 1.3434 |
| TOTAL： | 11615.0 | 719.21068 | 100.0 |
实施例2
取威灵仙药材10kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.的干燥根及根茎。以10倍量的水煎煮提取3次，每次2小时，提取液浓缩后，高速离心(转速12000转/分钟以上)或过滤，滤液浓缩后上D-101大孔树脂吸附后，依次用水、20％、30-50％，70-95％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，得威灵仙总皂苷，威灵仙总皂苷用20倍量80％以上的乙醇液加热回流提取4次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至总体积的2/10，置5℃下放置10小时，高速离心(转速12000转/分钟以上)或过滤，沉淀用5倍量的80％以上的乙醇洗涤2次，蒸干溶剂，得白色或类白色无定形粉末，为威灵仙皂苷AR粗品，将粗品溶于水后再经超滤法(超滤膜的截留分子量为3000Da，流速100-200ml/min)脱色，干燥后即得威灵仙皂苷AR 50g，测定含量为90.9％。
实施例3
取威灵仙药材10kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物东北铁线莲Clematis manshuricaRupr.的干燥根及根茎。以8倍量20％的乙醇溶液冷浸2次，每次24小时，提取液高速离心(转速8000转/分钟以上)，过滤，取上清液减压浓缩至干，得到浸膏。将浸膏用水溶解，上D-101大孔树脂柱。分别用水，10％，20-50％和95％乙醇洗脱，收集30-50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得威灵仙总皂苷。威灵仙总皂苷再经D-101大孔树脂柱，依次用水、20％、30-50％，90％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，提取物进一步用50倍量以上的80％以上的异丙醇液分别加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/10，置5℃下放置8小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用5倍量的80％以上的乙醇液洗涤3次，减压回收溶剂，干燥得白色或类白色无定形粉末，即得威灵仙皂苷AR 35g，测定含量为90.1％。
实施例4
取威灵仙药材10kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根及根茎。以20倍量20％的乙醇溶液渗漉提取，渗漉液高速离心(转速8000转/分钟以上)或过滤，取上清液减压浓缩至干，得到浸膏。将浸膏用水溶解，上D-101大孔树脂柱。分别用水，10％，20-50％和95％乙醇洗脱，收集30-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，得威灵仙总皂苷。威灵仙总皂苷再经D-101大孔树脂柱，依次用水、20％、30-50％，90％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，该提取物用50倍量的80％以上的异丙醇液分别加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/10，置-2℃下放置8小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用20倍量的丙酮分别加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/4，置-2℃下放置10小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用5倍量的80％以上的乙醇液洗涤2次，干燥，即得威灵仙皂苷AR30g，测定含量为91.4％。
实施例5
取威灵仙药材10kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.的干燥根及根茎。分别以20倍量水超声提取4次(功率150W，频率40kHz)，渗漉液高速离心(转速8000转/分钟以上)或过滤，取上清液减压浓缩至干，得到浸膏。将浸膏用水溶解，上ADS-7大孔树脂柱。分别用水，10％，20-70％和95％乙醇洗脱，收集30-70％乙醇洗脱液，减压蒸干，得威灵仙总皂苷。提取物进一步用50倍量的甲醇-乙醇(5：5)混合液分别加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/10，置0℃下放置4-8小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用20倍量的乙醇分别加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/4，置5℃下放置12小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用5倍量的乙醇洗涤2次，干燥，即得白色或类白色无定形粉末，即为威灵仙皂苷AR25g，测定含量为90.4％。
实施例6
取威灵仙药材5kg，其药材来源为毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根及根茎。以5倍量水加热回流提取3次，每次2小时。提取液浓缩至总体积的1/3后高速离心(转速8000转/分钟以上)或过滤，取上清液减压浓缩至干，得到浸膏。将浸膏用水溶解，上D-101大孔树脂柱。分别用水，10％，20-50％和95％乙醇洗脱，收集40-50％乙醇洗脱液，减压蒸干，得威灵仙总皂苷。威灵仙总皂苷用50倍量的乙醇分别加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩到总体积的1/10，置-2℃下放置8小时，高速离心(转速12000转/分钟)或过滤，沉淀用水溶解后上反相柱(C18，上样量与填料比为1：10)，用10％的乙醇洗脱3-4倍柱体积后，用40-50％的乙醇洗脱10倍柱体积后用乙醇洗脱，收集40-50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，残渣用2倍量乙醇液洗涤2次，干燥，即得威灵仙皂苷AR25g，测定含量为96.8％。
Claims (10)
1、一种结构式I的威灵仙皂苷的制备方法，其特征是包括以下步骤：将威灵仙总皂苷用有机溶剂加热回流提取，提取液减压浓缩到总体积的1/10～6/10，浓缩液低温下放置，高速离心或过滤，离心或过滤得到的沉淀蒸干，即得，所述有机溶剂选自甲醇、丙酮、异丙醇、乙醇中的一种或几种，有机溶剂浓度大于70％，为重量百分比
2、权利要求1的制备方法，其中有机溶剂的用量为威灵仙总皂苷重量的5～100倍。
3、权利要求1的制备方法，其中浓缩液低温放置的温度为-10～10℃，放置时间为4～12小时。
4、权利要求1的制备方法，进一步包括用2-5倍量的80％以上的乙醇洗涤。
5、权利要求1的制备方法，还包括经活性炭脱色精制。
6、权利要求1的制备方法，还包括用截留分子量为2000Da以上的超滤膜超滤。
7、权利要求1的制备方法，还包括用反相色谱柱精制，先用5～10％的乙醇洗脱3～4倍柱体积后，再用10～15倍柱体积40～50％的乙醇洗脱后用乙醇洗脱，收集40～50％的乙醇洗脱液，蒸干。
8、权利要求1的制备方法，其中威灵仙总皂苷的制备方法包括：毛茛科铁线莲属植物干燥根或根茎粉碎后，以5～10倍量的水或1～20％的乙醇溶液冷浸、渗漉、超声或加热回流提取，提取液经减压浓缩后，高速离心或过滤，滤液上大孔树脂吸附后，依次用水、20％、30～50％，70～95％乙醇液洗脱至流出液无色，收集30～50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，沉淀物干燥即得，其中乙醇浓度百分比为重量百分比。
9、权利要求8的制备方法，还包括将得到的威灵仙总皂苷再次上大孔树脂精制1次。
10、权利要求8的制备方法，其中毛茛科铁线莲属植物为威灵仙、棉团铁线莲或东北铁线莲。
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