KR20100022883A - 길경 추출물로부터 고속향류크로마토그래피를 이용한 길경 사포닌―고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 고순도 플라티코딘 ｄ을 대량으로 분리 및 생산하는 방법 - Google Patents

길경 추출물로부터 고속향류크로마토그래피를 이용한 길경 사포닌―고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 고순도 플라티코딘 ｄ을 대량으로 분리 및 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

길경추출물로부터 고속향류크로마토그래피를 이용한 길경사포닌-고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 분리되는 고순도 플라티코딘 D를 대량으로 분리 및 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 길경추출물로부터 컬럼을 고속으로 회전시켜 물질의 분리효율을 극대화시킨 고속향류크로마토그래피 (High speed countercurrent chromatography, HSCCC)를 이용하여 길경 사포닌-고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 추가로 더 정제된 고순도 플라티코딘 D를 대량으로 분리 및 생산하는 방법으로 유용하게 이용할 수 있다.
길경추출물, 고속향류크로마토그래피, 길경사포닌, 플라티코딘 D

Description

길경 추출물로부터 고속향류크로마토그래피를 이용한 길경 사포닌―고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 고순도 플라티코딘 Ｄ을 대량으로 분리 및 생산하는 방법{A method for isolating and producing the saponin- rich fractions and further highly purified platycodin D from the root extract of Platycodon grandiflorum using by high-speed count-current chromatography}
본 발명은 길경 추출물로부터 컬럼을 고속으로 회전시켜 물질의 분리 효율을 극대화시킨 고속향류크로마토그래피(HSCCC)를 이용하여 길경사포닌-고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 분리되는 고순도 플라티코딘 D을 대량으로 분리 및 생산하는 방법에 관한 것이다.
[문헌 1] Ito Y J., Chromatography, 147, p.221, 1978
[문헌 2] 한국생약학교수협의회, 본초학, 1994
[문헌 3] Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 20, p.1957, 1972
[문헌 4] Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 24, p.1965, 1972
[문헌 5] Kubota T., Chem . Commun., p.1313, 1969
[문헌 6] 대한민국 등록번호 제10-0564927호
[문헌 7] 대한민국 등록번호 제10-0750333호
[문헌 8] 대한민국 등록번호 제10-0696647호
[문헌 9] Hahn J., Nutr., 130, p.2760, 2000
현재, 질병을 치료하는 약물이나 질병의 치료를 기대하는 물질이 동물, 식물, 미생물 등으로부터 다양하게 분리되어 있지만, 이러한 물질들은 구조적으로 화학적 합성에 의해 확보하기가 어려워 물질의 기원으로부터 분리를 통해 얻어지고 있다.
예를 들어 항암제로 쓰이고 있는 탁솔의 경우 전합성의 곤란성으로 인해 탁솔의 기원인 주목나무로부터 직접 분리하거나 영국산 주목나무 잎에서 탁산유도체(10-deacetyltaxol, 10-deacetrylbaccation, cephalomannine)를 분리하여 반합성을 이용하는 방법으로 생산하고 있다. 따라서 천연물로부터 이러한 약리활성을 나타내는 화합물들을 효율적으로 분리하기 위하여 많은 연구자들이 이들의 추출, 분리, 정제과정에 관한 여러 방법들을 개발, 보고하고 있는 실정이다. 일반적으로 천연물 성분분리는 여러 종류의 고체 정지상과 액체 이동상을 이용한 칼럼크로마토그래피법을 이용하고 있다. 최근에 많이 사용되고 있는 분취용 HPLC 분리법은 여러 단계를 거쳐야 하는 오픈 칼럼 크로마토그래피 또는 중기압 칼럼 크로마토그래피(medium pressure column chromatography)에 비해 고 분리능과 분리시간의 단축을 장점으로 하는 분리방법으로 보고되고 있다. 하지만 이 방법은 한 번에 분리할 수 있는 양에 제한이 있고, 장비의 가격과 고체 정지상의 주기적인 교체의 이유로 분리 양에 비해 비용이 많이 들어 대량분리/생산 방식의 공업화에 어려움이 있다. 또한 고체 정지상을 사용할 경우 고체 정지상에 대한 시료의 흡착 문제로 시료의 손실이 발생한다.
고속향류크로마토그래피 (high-speed counter-current chrom atography, 이하 HSCCC 라 함)법은 액체-액체 분배크로마토그래피법의 하나로써 서로 섞이지 않고 혼합 후 2개의 층으로 분리되는 용매시스템을 이용한 것으로서, 분리되는 2개의 층 중에 한층을 이동상으로, 또 다른 한 층을 고정상으로 하여 고체 지지체가 없이 물질을 분리 및 정제가능하며(Ito Y J., Chromatography, 147, p.221, 1978), 분배 과정은 한 개의 튜브내에서 연속적으로 일어나도록 고안되어, 칼럼은 PTFE (polytetrafluoroethylene)튜브가 다층으로 감겨 있는 원통형의 홀더 3개가 회전과 공전을 통해 튜브의 꼬임을 방지하는 시스템으로, 정지상을 액체로 사용하여 기존 분리 방법에서 시료의 고체 정지상에 대한 흡착으로 인한 손실, 고체 정지상과의 반응으로 인한 물질의 변형 등을 막을 수 있고, 빠른 시간에 대량의 시료를 분리할 수 있는 점 및 분리 비용의 저렴성 등의 많은 장점을 지니고 있다.
도라지(Platycodon grandiflorum A. DC.)는 초롱과(Campanulaceae)에 속한 다년생 초본으로서, 인삼과 마찬가지로 뿌리를 약재로 사용하고 있으며 많은 양이 외국에서 수입되고 있다. 줄기에 상처를 내면 흰색 즙이 나오고, 이 즙은 인삼과 흡사한 사포닌(saponin) 성분을 포함하며, 특히 생약으로 사용하고 있는 뿌리부분을 '길경'(桔梗)이라 하며 한방에서 기침, 담석, 거담제, 코막힘, 감기, 편도선염, 농증의 약으로 이용되고 있다(한국생약학교수협의회, 본초학, 1994). 길경의 주요 약리성분으로 길경사포닌들이며, 약 20여종의 5환성 올레아난(oleanane)형 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)을 약 2% 함유하고 있다. 길경사포닌은 기본적으로 배당체의 4번 위치에 알코올기의 결합유무에 따라 플라티코디게닌 (platycodigenin)을 배당체로 하는 사포닌과 폴리갈라식산(polygalacic acid)을 배당체로 하는 사포닌들로 구성되어 있고, 이들 사포닌의 3번과 28번에 결합되어 있는 당들의 종류와 수에 따라 여러 길경 사포닌들이 최근까지 보고되었다(Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 20, p.1957, 1972; Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 24, p.1965, 1972; Kubota T., Chem . Commun., p.1313, 1969). 이 중 플라티코딘 D와 플라티코사이드(platycoside) E, 폴리갈라신 D가 함량적으로 길경의 주성분이다(도 1 참조).
특히, 플라티코딘 D는 길경(Platycodon grandiflorum A. DC.)의 주요 약리성분을 가지는 사포닌으로써, 항세포사멸(anti-apoptosis, 대한민국 등록번호 제10-0564927호), 항비만(anti-obesity, 대한민국 등록번호 제10-0750333호) 항염증(anti-inflammation, 대한민국 등록번호 제10-0696647호)의 효능이 알려져 있어, 약물학적 가치가 큰 단일성분(Hahn J., Nutr., 130, p.2760, 2000)로 알려져 있다.
일반적으로, 길경사포닌(Platycosides) 및 플라티코딘 D는 보통 극성이 높은 용매로 추출을 한 후, 길경 추출물을 물에 녹여 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethylacetate), 부탄올(butanol), 물(aquous)의 순으로 분획하고, 여기에서 얻은 부탄올 층을 농축하여 이를 다시 HP-20 칼럼에 통과시켜 얻는 통상의 분리방법으로 분리되는데, 이 경우에 길경추출물로부터 플라티코딘을 분리하기 위해서는 다이아이온 HP-20와 같은 역상 C-18 충진제를 이용하여 최소 4번 이상 오픈 칼럼 크 로마토그래피를 실시하여야 하고 각 단계별 TLC로 물질 확인 및 LC-MS로 구조동정 및 순도측정의 단계를 거치는 소요시간만 최소 7-9개월이 걸리는 산업적으로 효용가치가 없는 분리 방법을 사용하여 왔다.
또한, 길경사포닌 (플라티코사이드)의 경우에 배당체 3번 위치의 당의 결합 개수에 따라 플라티코딘 D와 플라티코딘 D3로, 4번 위치의 알코올 그룹(group)기 유무에 따라 플라티코딘 D와 폴리갈라신 D로 나누어지는 용매조건 및 칼럼 내, 외부 환경에 따라 변화될 수 있는 성질이 많은 극성이 높은 화합물이므로 일반적인 칼럼크로마토그래피에서는 손실이 많아 수율이 떨어지는 단점이 인해 단일 길경사포닌 및 플라티코딘 D의 다량확보가 어렵고 제한된 양 밖에 수득할 수 없는 기존의 분리방법으로는 정확한 생리활성 연구가 거의 불가능하고 약리성분으로서의 상업화에 난점이 있어 왔다.
그러나, 상기 문헌의 어디에도 길경 추출물로부터 길경사포닌 및 더욱 정제된 플라티코딘 D를 대량으로 분리 및 생산하는 효율적인 방법과 개시내용이 교시되거나 기재된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 컬럼을 고속으로 회전시켜 물질의 분리효율을 극대화시킨 고속향류크로마토그래피의 장점을 살린 용매조건 및 분리방법을 이용하여 단시간에 길경사포닌-고 함유 분획물 및 이 분획물로부터 더욱 정제된 플라티코딘 D를 대량으로 분리 및 생산하는 방법을 개발함으로서, 비용, 시간 등의 절감 효과뿐만 아니라, 최종 산물의 고수율, 및 고순도 효과 등의 장점을 확인하여 본 발명을 완 성하게 되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 길경을 추출하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 다이아이온계 컬럼을 이용하여 길경 사포닌 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 분획물을 고속향류크로마토그래피 (HSCCC)를 이용하여 단일 길경 사포닌 화합물, 특히 단일의 플라티코딘 D만을 대량으로 순수하게 분리하는 제 3단계 공정을 포함하는 길경 사포닌 화합물을 대량으로 분리하는 분리 및 생산 방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 “길경사포닌 화합물”은 플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E, 플라티코딘 D, 디아피오-플라티코딘 D, 플라 티코딘 D3, 또는 디아피오-플라티코딘 D3 , 바람직하게는 플라티코딘 D를 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 제 1단계의 길경 추출물을 수득하는 단계는, 예를 들어, 건조된 길경 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 1 내지 20 시간, 바람직하게는 3 내지 15 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출법으로 약 1 내지 7회, 바람직하게는 2 내지 5회 추출 한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 길경 추출물을 얻을 수 있다.
상기 제 2단계의 길경 사포닌 분획물을 수득하는 단계는, 예를 들어, 상기 1단계에서 얻은 길경 추출물을 고분자 합성수지에 흡착시켜 물 및 알콜 혼합용매, 바람직하게는, 물 및 메탄올 혼합용매를 유출용매로 이용하여 극성 용매로부터 얻은 극성 물질을 제거하고, 비극성 용매로부터 본 발명의 길경 사포닌 분획을 얻을 수 있다.
상기 제 3단계의 단일 길경 사포닌 화합물들을 수득하는 단계를 하기에 상세하게 예시한다.
A. 예를 들어, (1)플라티코사이드 E, (2)디아피오-플라티코사이드 E, (3) 플라티코딘 D 및 디아피오-플라티코딘 D 혼합된 사포닌 소분획 (sub-fraction) I, (4) 플라티코딘 D3, 및 디아피오-플라티코딘 D3 혼합된 사포닌 소분획 (sub-fraction) II 등의 길경 사포닌류 화합물들의 경우에는,
상기 고속향류크로마토그래피(HSCCC)의 용매 시스템은 헥산:부탄올:물 혼합용매(역상), 바람직하게는, 헥산:부탄올:물 (1~10:10~40:1~20, v/v) 용매시스템(역상)를 적용함으로서, 상기 길경 사포닌류 화합물들을 분리가능하다.
B. 또한 추가적으로, (5) 플라티코딘 D3, (6) 플라티코딘 D, (7) 디아피오-플라티코딘 D, 및 (8) 디아피오-플라티코딘 D3 등의 길경 사포닌 화합물들의 경우에는,
상기 고속향류크로마토그래피(HSCCC)의 용매 시스템은 헥산:부탄올:물 혼합 용매(순상), 바람직하게는, 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v) 용매시스템(순상)를 적용함으로서, 상기 길경 사포닌류 화합물들을 분리가능하다.
C, 상기 고속향류크로마토그래피를 이용한 바람직한 분리조건은 하기와 같다.
헥산: 부탄올: 물의 용매는 그 전날 미리 만들어 하층을 고정상으로, 상층을 이동상으로 나누어 사용 전에 바로 초음파로 처리한 후, 우선 코일 형태로 감아져 있는 칼럼에 정지상으로 사용할 용매를 채운 후에 600 내지 1000rpm, 바람직하게는, 약 850rpm 원심의 속도로 칼럼을 회전시키고, 칼럼의 회전이 안정화되면 이동상을 1.0 내지 1.5 ml/mim, 바람직하게는, 약 1.3 ml/min 흐름속도로 흘려서, 컬럼 내에서 정지상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 시료 및 2상계의 각 용매 1:1 부피비율로 용매에 녹여 주입하고, 작동한다.
상기 고속향류크로마토그래피의 용출액은 분리 밸브와 증기화광산란 검출기를 이용하여 검출함과 동시에 분획 수집기를 사용하여 분획하고, 얻어진 각각의 소분획내에 있는 각각의 플라티코딘 D, 디아피오-플라티코딘 D, 플라티코딘 D3, 디아피오-플라티코딘 D3 로 분리하기 위해서 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v) 용매계를 사용하였다.
상기의 분리방법과 동일하게 하여, 상층을 고정상, 하층을 이동상으로 사용하여, 다층 코일에 고정상과 이동상 비율이 70:30으로 채워지게 한 후, 이동상을 1.0 내지 2.0 ml/min, 바람직하게는 약 1.5 ml/min로 흘려준다. ELSD(증기화광산 란검출기) system은 70°, gain은 6, nebulizer gas로 질소를 사용하여 1.0 내지 3.0 바(bar), 바람직하게는 약 2.2 bar로 조정한다.
D. 고속향류크로마토그래피를 이용한 플라티코사이드-고 함유 분획으로부터 플라티코딘 D만을 선택적으로 분리하기 위해서,
적정한 K-value값을 가진 에틸아세테이트: 부탄올: 물, 바람직하게는, 에틸아세테이트: 부탄올: 물(1:1:2, V/V) 용매시스템을 이용하였으며, 고속향류크래마토그래피의 분리방법은 상기와 동일하게, 용매의 상층을 고정상, 하층을 이동상으로 하여 다층코일에 고정상과 이동상비율이 70:30으로 채워지게 한 후 칼럼 내에서 정지상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 이동상에 녹인 길경사포닌을 주입시키고, 이동상 속도를 이동상을 1.0 내지 2.0 ml/min, 바람직하게는 약 1.3 ml/min로 흘려준다.
고속향류크로마토그래피의 용출액은 ELSD로 검출됨을 확인한 후에 리텐션 타임(retention time) 200 내지 350분에서 순수한 플라티코딘(platycodin) D만을 선택적으로 다량 얻을 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 길경 추출물을 대상으로 한 고속향류크로마토그래피를 이용함으로서 길경 사포닌 화합물들, 특히 고순도의 플라티코딘 D를 대량으로 순수하게 분리 및 생산하는데 유용함을 확인하였다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 길경추출물로부터 컬럼을 고속으로 회전시켜 물질의 분리효율을 극대화시킨 고속향류크로마토그래피(HSCCC)를 이용함으로서 다양한 길경 사포닌들, 특히 고순도 플라티코딘 D을 대량으로 분리 및 생산하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. HPLC 실험 준비
길경 사포닌의 성분을 확인하기 위한 HPLC에는 펌프(HITACHI L-6200)와 자동주입기 (autoinjector, Shimadzu SIL-9A), 증기화광산란 검출기 (ELSD, Sedex 75)를 사용하였으며, 물(90%): 아세토니트릴(10%) 경사법 (gradient) 방식으로 리텐션 타임(retention time) 60 min, 1ml/min로 흘려 주고, 역상(reverse-phase) C18 칼럼(Zorbax SB-Aq c18, 150 X 4.6mm, 5μm 입자)을 이용하여 단일 길경 사포닌을 분리하며, 순도측정 시 HPLC로 확인한다.
실시예 1. 길경 추출물의 제조
경동시장에서 구입한 길경 1500g을 깨끗이 세척하여 불순물을 제거하고 건조시킨 후 곱게 분쇄하여 분쇄된 길경을 3L 증류수에 넣고 환류 추출법으로 3시간씩 3회 가열하여 추출한 후 여과하고, 이 여과액을 감압농축기를 이용하여 여과액의 1/10배 부피까지 농축 후 동결 건조하여 분말 형태의 길경 열수 추출물 300g을 얻었다.
실시예 2. 길경 사포닌 분획물의 제조
실시예 1에서 얻은 길경 열수 추출물 300g을 다시 물에 용해시켜서 고분자 합성수지(Diaion HP-20 겔)에 주입하였고 물: 메탄올 용매계를 이용한 크로마토그래피를 실시한 후 40% 메탄올로 세척하여 다당체를 비롯한 극성물질을 제거한 후 다시 100% 메탄올로 흘려서 얻은 분획을 감압 농축하여 길경 조사포닌 2g을 얻었다.
실시예 3. 길경 사포닌 화합물들의 분리
3-1. 용매 시스템계의 선정
본 실험에서 사용되는 길경 추출물에서 분리된 조사포닌중 목표로 하는 개별 사포닌들의 혼합용매에서 나누어지는 상층과 하층에 분배되는 분배상수가 0.5~5 사이의 값을 가지고, 근접한 분배상수를 가지는 다른 물질과 1.5배 이상의 분배 상수 차이를 가지는 클로르포름: 메탄올: 물, 헥산: 에틸아세테이트: 메탄올: 물, 부탄올: 에탄올: 물 등의 용매시스템을 배합하여 K value 값을 측정한 결과, 하기 도 2와 같이, 헥산: 부탄올: 물 (1:40:20, v/v)은 플라티코사이드 E, 디아피오-플라티 코사이드 E 를 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v)은 플라티코딘 D3, 플라티코딘 D, 이들의 디아피오즈(D, D3)폼을 분리하기 위한 최적의 용매배합임을 확인할 수 있었다 (도 2 참조).
상기 참고예에서 선정한 용매계에서 적절한 분배상수를 가지더라도 고속향류 크로마토그래피분리 과정에서 정지상이 칼럼에 머무름 비율이 작으면 실패할 확률이 크므로, 정지상의 머무름 비율을 확인해야 하며, 고속향류크로마토그래피분리 과정에서 이동상의 흐름속도와 코일형태로 감아져 있는 칼럼의 원심속도는 분리능을 좌우하므로, 이동상의 흐름속도는 낮을수록 분리능은 좋아지지만 전체 분리시간이 증가하며, 칼럼의 원심속도는 증가할수록 분리능이 증가한다.
상기 실시예 2에서 얻은 길경 사포닌 분획 3mg을 시험관에 넣고 평형화된 2상계의 각 층 2ml을 첨가한다. 시험관에서 충분히 교반한 후에 두개의 층으로 깨끗하게 나누어지면 각 층을 분리한 후에 질소가스를 이용하여 건조한다. 각 층의 잔사는 메탄올에 녹여 HPLC과정을 수행한다. 분배상수는 상층액에 포함되어 있는 목표물질의 피크면적을 하층액의 피크면적으로 나눈 값으로 계산한다.
3-2 고속향류크로마토그래피를 이용한 분리조건
본 실험에 사용한 고속향류크로마토그래피를 이용한 분리조건은 하기와 같다.
헥산: 부탄올: 물의 용매는 그 전날 미리 만들어 하층을 고정상으로, 상층을 이동상으로 나누어 사용 전에 바로 초음파 처리한 후, 우선 코일 형태로 감아져 있는 칼럼에 정지상으로 사용할 용매를 채운 후에 850rpm 원심의 속도로 칼럼을 회전시키고, 칼럼의 회전이 안정화되면 이동상을 1.3 ml/min 흐름속도로 흘려서, 컬럼 내에서 정지상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 시료 300mg, 2상계의 각 용매 1:1 부피비율로 20 ml에 녹여 주입하고, 450 분간 작동한다.
고속향류크로마토그래피의 용출액은 분리 밸브와 증기화광산란 검출기(ELSD, Sedex 75)를 이용하여 검출함과 동시에 분획수집기(Eyela DC-1200)를 사용하여 분획하고, 얻어진 각각의 소분획내에 있는 각각의 플라티코딘 D, 디아피오-플라티코딘 D, 플라티코딘 D3, 디아피오-플라티코딘 D3 로 분리하기 위해서 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v) 용매계를 사용하였고,
상기의 분리방법과 동일하게 하여, 상층을 고정상, 하층을 이동상으로 사용하여, 다층 코일에 고정상과 이동상 비율이 70:30으로 채워지게 한 후, 이동상을 1.5 ml/min로 흘려준다. ELSD(증기화광산란검출기) 시스템은 70°, gain은 6, nebulizer gas로 질소를 사용하여 2.2 bar로 조정하였다.
3-3. 단일 길경 사포닌류 (1)의 분리
상기 실시예 2에서 얻은 건조 상태의 길경 사포닌 분획물, 즉 플라티코사이드-고 함유분획 (platycoside-enriched fraction) 300mg을 고속향류크로마토그래피(TBE-300 A, Shanghai Tauto Biotech, Shanghai)의 헥산: 부탄올: 물(1:40:20, v/v) 용매시스템(역상)을 이용하여 소분획 (sub-frac tion) I, 소분획 (sub-fraction) II, 플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E으로 나누었다.(도 3-A 참조)
상기에서 수득한 각 소분획 (sub-fraction)들을 다시 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v) 용매시스템(순상)을 이용하여 사포닌 소분획 (sub -fraction) I에서 디아피오-플라티코딘 D, 플라티코딘 D를 분리하였으며(도 3-B 참조), 사포닌 소분획(sub-fraction) II에서 플라티코딘 D3, 디아피오-플라티코딘 D3으로 분리하였다(도 3-C 참조).
3-4. 길경 사포닌 화합물(2)들의 분리
그 실험 결과, 고속향류크로마토그래피 실험방법에 의해 수행되어진 플라티코사이드-고 함유 분획물로부터 얻은 각 단일 길경사포닌의 양은 각각 플라티코사이드 E(21mg), 디아피오-플라티코딘 E(14mg), 플라티코딘 D3(10mg), 디아피오-플라티코딘 D3(6mg), 플라티코딘 D(28mg), 디아피오-플라티코딘 D(6mg)이었다.
3-5. 단일 길경사포닌의 구조 및 고순도 분석실험
상기에서 분리된 단일 길경사포닌들은 ESI-MS, ESI-MS/MS, 1H NMR, 13C NMR과 MS의 분광학적 분석방법으로 구조를 확인하고, 고속향류크로마토그래피로부터 수집 된 각 피크의 분획은 앞의 HPLC방법으로 순도를 확인할 수 있다. 먼저, ESI-MS의 네거티브 모드(negative mode), 포지티브 모드(positive mode)를 수행하여 분자량을 결정하고, ESI-MS/MS로 구조 결정을 수행하였다.
그 실험결과, 하기 도 4에서 나타낸 바와 같이 각 피크 분획물(peak fraction)의 세부 구조결정은 1H-NMR and 13C-NMR data으로 확인하였고 피크의 순도는 HPLC-ELSD에 의해 결정하였으며, 동정 결과는 하기와 같다.
HSCCC 분리 전 길경사포닌 분획물은 (A)이며, HSCCC 분리후 코일에 남아있는 잔기 샘플(B)이다.
피크(peak) 1(디아피오-플라티코사이드 E); 피크 2 (플라티코사이드 E); 피크 3(플라티코딘 D); 피크 4 (디아피오-플라티코딘 D); 피크 5 (플라티코딘 D3); 피크 6 (디아피오-플라티코딘 D3); 플라티코사이드 E(98.4%); 디아피오-플라티코사이드 E (97.3%); 플라티코딘 D3(99 .1%); 디아피오-플라티코딘 D3(98.1%); 플라티코딘 D (96.3%); 디아피오-플라티코딘 D(94.2%) (도 4 참조).
피크 1: 분자량 (1416), MS/MS product ion (1283.2, 1253.2, 1091.2, 1005.3); 피크 2: 분자량 (1548), MS/MS product ion (1415.3, 1385.0, 1283.1, 1223.7); 피크 3: 분자량 (1224), MS/MS product ion (1091.0, 959.1, 681.1); 피크 4: 분자량 (1092), MS/MS product ion (959.3, 681.1); 피크 5: 분자량 (1386), MS/MS product ion (1253.2, 1121.2, 843.1); 피크 6: 분자량 (1253), MS/MS product ion (1121.2, 843.2)
실시예 4 고속향류크로마토그래피를 이용한 고순도 플라티코딘 D의 대량 분리
4-1. 플리티코딘 D의 분리
도 5에서 나타낸 바와 같이, 고속향류크로마토그래피를 이용한 플라티코사이드-고 함유 분획으로부터 플라티코딘 D을 선택적으로 분리하기 위해서,
적정한 K-value값을 가진 에틸아세테이트: 부탄올: 물(1:1:2, V/V) 용매시스템을 이용하였으며, 고속향류크로마토그래피의 분리방법은 상기 실시예 3과 동일하게, 용매의 상층을 고정상, 하층을 이동상으로 하여 다층코일에 고정상과 이동상비율이 70:30으로 채워지게 한 후 칼럼 내에서 정지상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 이동상 20ml에 녹인 길경사포닌 250mg을 주입시키고, 이동상 속도를 1.3 ml/min로 하여 360 분 동안 흘려주었다. 고속향류크로마토그래피의 용출액은 ELSD로 검출됨을 확인한 후에 리텐션 타임(retention time) 250~280분(화살표)에서 순수한 플라티코딘(platycodin) D 25mg 만을 얻을 수 있었다(도 5 참조).
5-2. 플리티코딘 D의 순도 측정
또한, 하기 도 6과 같이, 농축한 플라티코딘 D의 순도를 측정하기 위하여 HPLC-ELSD를 사용하였으며, 이동상으로 물(A)과 아세토니트릴(B)을 이용하여 경사법(gradient)으로 혼합하여 사용하였다. 본 경사법(Gradient)은 물(A)과 아세토니트릴(B)이 각각 0-6 min(10-15% B), 6-50 min(15-25% B), 50-60 min(25-47.5% B)이 되도록 하였으며, 유속 (flow rate)는 1ml/min 이며, ELSD 검출기를 사용하였으며, ELSD system은 70°, gain은 6, nebulizer gas로 질소를 사용하여 2.2 bar로 조정하여 사용하였다 (도 6 참조).
그 실험결과, 고속향류크로마토그래피를 이용한 길경 사포닌으로부터 플라티코딘 D의 순도측정 실험에서 플라티코딘 D는 95%의 고순도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 1는 길경추출물의 조사포닌 및 플라티코딘 D에 대한 화학구조식에 관한 도이고,
도 2는 길경추출물로부터 길경사포닌을 얻기 위한 고속향류크로마토그래피의 K value값에 관한 도이며,
도3-A는 헥산: 부탄올: 물(1:40:20, v/v) 용매시스템(역상)을 이용하여 소분획(sub-fraction) I, 소분획(sub-fraction) II, 플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E으로 나눈 도이고,
도 3-B는 수득한 각 소분획(sub-fraction)들을 다시 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v)용매시스템(순상)을 이용하여 사포닌 소분획(sub-fract ion) I에서 디아피오-플라티코딘 D, 플라티코딘 D를 분리한 도이며,
도 3-C는 수득한 각 소분획 (sub-fraction)들을 다시 헥산: 부탄올: 물(1:10:5, v/v)용매시스템(순상)을 이용하여 사포닌 소분획(sub-fraction) II에서 디아피오-플라티코딘 D3, 및 디아피오-플라티코딘 D3으로 분리한 도이고,
도 4-A는 고속향류크로마토그래피로 분리 전 길경사포닌 분획물에 관한 도이며,
도 4-B는 고속향류크로마토그래피로 분리 후 코일에 남아있는 잔기에 관한 도이고,
도 4-1는 디아피오-플라티코사이드 E에 관한 도이며,
도 4-2는 플라티코사이드 E에 관한 도이고,
도 4-3는 플라티코딘 D에 관한 도이며,
도 4-4는 디아피오-플라티코딘 D에 관한 도이고
도 4-5는 플라티코딘 D3에 관한 도이며,
도 4-6는 디아피오-플라티코딘 D3에 관한 도이고,
도 5는 고속향류크로마토그래피의 한 단계에 의한 길경사포닌으로부터 플라티코딘 D 분리(250-280분, 화살표)에 관한 도이며,
도 6는 고속향류크로마토그래피로부터 분리된 플라티코딘 D의 순도를 HPLC를 이용하여 확인에 관한 도이다.

Claims (7)

  1. 길경을 추출하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 다이아이온계 컬럼을 이용하여 길경 사포닌 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 분획물을 고속향류크로마토그래피 (HSCCC)를 이용하여 단일 길경 사포닌 화합물, 특히 단일의 플라티코딘 D만을 대량으로 순수하게 분리하는 제 3 단계 공정을 포함하는 길경 사포닌 화합물을 대량으로 분리하는 분리 및 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 길경 사포닌 화합물은 플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E, 플라티코딘 D, 디아피오-플라티코딘 D, 플라 티코딘 D3, 또는 디아피오-플라티코딘 D3 인 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 길경 사포닌 화합물은 플라티코딘 D인 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 공정의 제 2단계의 길경 사포닌 분획물을 수득하는 단계는, 상기 1단계에서 얻은 길경 추출물을 고분자 합성수지에 흡착시켜 물 및 알콜 혼합용매를 유출용매로 이용하여 극성 용매로부터 얻은 극성 물질을 제거하고, 비극성 용매로부터 길경 사포닌 분획을 수득함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 공정의 상기 제 3단계에서 (1)플라티코사이드 E, (2)디아피오-플라티코사이드 E, (3) 플라티코딘 D 및 디아피오-플라티코딘 D 혼합된 사포닌 소분획 (sub-fraction) I, (4) 플라티코딘 D3, 및 디아피오-플라티코딘 D3 혼합된 사포닌 소분획 (sub-fraction) II 등의 길경 사포닌류 화합물들의 경우에는, 상기 고속향류크로마토그래피(HSCCC)의 용매 시스템은 헥산:부탄올:물 혼합용매(역상) 용매시스템(역상)을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 공정의 상기 제 3단계에서 (5) 플라티코딘 D3, (6) 플라티코딘 D, (7) 디아피오-플라티코딘 D, 및 (8) 디아피오-플라티코딘 D3 등의 길경 사포닌 화합물들 의 경우에는, 상기 고속향류크로마토그래피(HSCCC)의 용매 시스템은 헥산:부탄올:물 혼합용매(순상) 용매시스템(순상)을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 공정의 상기 제 3단계에서
    D. 고속향류크로마토그래피를 이용한 플라티코사이드-고 함유 분획으로부터 플라티코딘 D를 선택적으로 분리하기 위해서, 상기 고속향류크로마토그래피(HSCCC)의 용매 시스템은 에틸아세테이트: 부탄올: 물 용매시스템을 이용함을 특징으로 하는 방법.
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