KR101480820B1

KR101480820B1 - 향류크로마토그래피를 이용하여 인삼 추출물로부터 진세노사이드 디올 및 트리올을 일단계로 동시에분리하는 방법

Info

Publication number: KR101480820B1
Application number: KR20120149054A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 쉐자드 오메르
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2015-01-13
Also published as: KR20140079892A

Abstract

본 발명은 향류크로마토그래피를 이용하여 인삼 추출물로부터 진세노사이드를 일단계로 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

향류크로마토그래피를 이용하여 인삼 추출물로부터 진세노사이드 디올 및 트리올을 일단계로 동시에분리하는 방법 {A method for simultaneous separation of ginsenoside diols and triols from ginseng extract in one-step by HSCCC isolation}

본 발명은 향류크로마토그래피를 이용하여 인삼 추출물로부터 진세노사이드 디올 및 트리올 사포닌들을 일단계로 동시에 분리하는 방법에 관한 것이다.

[문헌 1] 박종대, 화학성분에 관한 고찰, 최신고려인삼연구 (고려인삼학회) pp 31~51, 2007

[문헌 2] Christensen, L.P, Ginsenosides: Chemistry, Biosynthesis, Analysis, and Potential health Effects, in Advances in Food Nutritional Reviews, 55, 1-99, 2009

[문헌 3] 대한민국특허공개 1998-0009275호

[문헌 4] Ito Y J. Chromatography, 147, p.221, 1978

[문헌 5] 이창호, 이부용, 한국식품과학회지, 36, 518-521, 2004

[문헌 6] Phytochemical and analytical studies of Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen J. Nat. Med. (2006) 60: 97.106)

[문헌 7] Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng, Journal of Chromatography A, 921 (2001) 335339

[문헌 8] Developments in the application of counter-current chromatography to plant analysis, Journal of Chromatography A, 1112 (2006) 181194

[문헌 9] CCC Review paper, Journal of Chromatography A, 808 (1998) 322

[문헌 10] 미국특허 USP patent. 6,444,233호

[문헌 11] Journal of Liquid Chromatography. & Related Technologies, 18, 1655-1662, 1995

[문헌 12] Du 등, Journal of Chromatography A, 1008, 173-200, 2003

[문헌 13] Liu등, Chromatographia, 71, 267-271, 2010

[문헌 14] Ha 등, J. Chromatography A, 1151, 37-44, 2007

[문헌 15] Qi등, J. Chromatography A, 1217, 1955-2001, 2010

[문헌 16] Cheng 등, Separation and Purification Technology, 77, 347-354, 2011

[문헌 17] Shezad, O 등, J. Separation Science, 34, 1116-1122, 2011

[문헌 18] Journal of Separation Science, 35, 1462-1469, 2012.

본 발명은 인삼 추출물부터 진세노사이드를 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 향류크로마토그래피를 이용하여 인삼 추출물로부터 진세노사이드를 분리하는 방법에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피나무과(Araliaceae) 인삼속에 속하는 다년생 초본류로서 한방에서는 그 뿌리를 주로 이용하고 있는 대표적인 약용작물 중의 하나이다. 수확 후 가공 방식에 따라 4-6년 재배하여 수확한 후 가공하지 않은 생삼을 수삼, 4-6년근 수삼을 껍질을 벗겨내고 그대로 햇볕에서 자연 건조하거나 60℃ 이하의 열풍으로 건조시킨 인삼을 백삼, 4-6년근 수삼을 껍질을 벗기지 않은 상태로 증기로 쪄서 건조시킨 인삼을 홍삼으로 각각 구분한다.

인삼의 주요 생리활성 성분으로는 사포닌을 비롯하여 정유성분, 폴리아세틸렌, 페놀성분, 배당체, 및 산성 펩티드 등이 있다[박종대, 화학성분에 관한 고찰, 최신고려인삼연구 (고려인삼학회) pp 31~51, 2007 ]. 그 중에서도 가장 대표적인 생리활성성분인 사포닌의 경우 1960년대부터 최근까지도 새로운 사포닌 성분 분리 및 사포닌 성분의 생리활성에 관한 많은 연구가 진행되고 있다. 인삼 사포닌은 인삼속(Panax genus) 식물에만 함유된 특이한 모형의 담마란(dammarane)계 트리테르펜(triterpene) 배당체(glycoside)로 인삼의 사포닌은 진세노사이드라고도 부르며 최근까지 약 35종 이상의 구조가 밝혀졌다. 이와 같은 인삼사포닌의 생리활성으로 연구된 내용을 간략히 살펴보면 중추신경계에 대한 작용, 뇌기능 개선작용, 항발암 및 항암작용, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 강화작용, 심혈관 개선작용, 항스트레스 작용, 항피로 작용, 항산화 작용등이 보고 되어 있다 [Christensen, L.P, Ginsenosides: Chemistry, Biosynthesis, Analysis, and Potential health Effects, in Advances in Food Nutritional Reviews, 55, 1-99, 2009].

수삼이나 백삼에서 주요사포닌으로는 Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rb2, Rc, Rd으로서 전체 사포닌의 80-90% 이상이고, 인삼의 진세노사이드에 의한 약리 활성은 위의 8종류의 사포닌에 기인된다고 볼 수 있다.

수증기로 쪄 건조시킨 홍삼은 약효가 우수한 것으로 알려져 있는데, 그 이유는 홍삼을 가공하는 과정에서 인체에 유익한 다양한 홍삼 특이 성분이 생성되기 때문이다. 홍삼 특이 성분 중에서 저극성 진세노사이드인 Rg3,Rg5, Rk1, F4는 항산화작용, 혈관이완작용, 신경세포 보호작용, 항암작용 등의 약리 효능을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 이 외에도 디올 계열로 항암작용을 가진 것으로 알려진 Rh2, compound K와 트리올 계열로 Rg2, Rg6 등이 함유되어있지만 매우 극미량으로 쉽게 분리하기가 매우 어렵다.

종래에 진세노사이드를 개별적으로 고순도로 얻기 위하여 사용한 방법은 고체성 수지를 고정상으로 하고 액체성 용매를 이동상으로 사용하여 분리하는 전통적인 컬럼 크로마토그래피 방법에 기반을 두고 있다. 일례로, 대한민국특허공개 1998-0009275호에서는 실리카젤 및 C18 수지를 고체상의 컬럼에 고정시키고 메탄올 및 클로로포름 등의 적절한 용제를 이동상의 용매로 선택하여 대기압이나 압축된 압력하에서 이동상을 흘려보내는 방법으로 분리하는 전통적인 크로마토그래피를 사용하여 진세노사이드를 분리하는 방법을 사용하고 있다.

그러나, 이러한 종래 방법은 컬럼의 고정상 수지에 용질이 비가역적으로 흡착되어 분리하고자 하는 진세노사이드의 손실이 일어나고, 컬럼의 수명이 제한적이어서 컬럼 구입에 따른 비용 부담이 있으며, 95% 이상의 고순도로 얻기 위해서는 적어도 2~3차례 컬럼 작업을 반복하여야 하기 때문에 시간과 노력이 많이 소요되고, 용매도 많이 소모되어야 한다는 등의 문제점이 있다. 즉, 기존의 방법으로 일정량 이상의 고순도 진세노사이드를 얻기 위해서는 복잡하고 번거로운 과정을 거쳐야만 한다.

최근에 대량 분리를 위한 고속액체크로마토그라피도 많이 사용하고 있다. 높은 해상도와 빠른 시간에 분리할 수 있는 장점이 있지만 주입할 수 있는 시료의 양에도 칼럼의 용량에 달려 있고 상당히 고가인 상태이다. 예를 들어 2.5 x 30cm의 역상 HPLC에 주입할 수 있는 양은 최대 100~200 mg이다. 장비의 가격과 고체 정지상의 주기적인 교체의 이유로 분리 양에 비해 비용이 많이 들어 대량분리/생산 방식의 공업화에 어려움이 있다. 또한 고체 정지상을 사용할 경우 고체 정지상에 대한 시료의 흡착 문제로 시료의 손실이 발생한다. 역상 칼럼에 주로 사용하는 용매는 아세토니트릴과 메탄올 및 물이다. 아세토니트릴은 고가의 용매로 역시 대용량으로 분리시 제한을 가져온다.

이에 반해 본 발명에서 사용한 향류크로마토그라피는 고정상과 이동상으로 모두 액체를 사용하는 액체-액체 분배 크로마토그래피 (liquid-liquid partition chromatography)의 일종으로, 최근 천연 물질을 분리하는데 이용되고 있다. 특히, 이토 등에 의해서 개발된 고속향류크로마토그래피(high-speed counter-current chromatography , 이하 HSCCC라 함)법은 서로 섞이지 않고 혼합 후 2개의 층으로 분리되는 용매시스템을 이용한 것으로서, 분리되는 2개의 층에 한 층을 이동상으로, 또 다른 한 층을 고정상으로 하여 고체 지지체가 없이 물질을 분리 및 정제가능하며(Ito Y J. Chromatography, 147, p.221, 1978), 분배 과정은 한 개의 모세관내에서 연속적으로 일어나도록 고안되어, 칼럼은 PTFE (polytetrafluoroethylene)튜브가 다층으로 감겨 있는 원통형의 홀더 3개가 회전과 공전을 통해 튜브의 꼬임을 방지하는 시스템으로, 정지상을 액체로 사용하여 기존 분리 방법에서 시료의 고체 정지상에 대한 흡착으로 인한 손실, 고체 정지상과의 반응으로 인한 물질의 변형 등을 막을 수 있고, 빠른 시간에 대량의 시료를 분리할 수 있는 점 및 분리 비용의 저렴성 등의 많은 장점을 지니고 있다. 또한, 재사용이 한정되어 있는 값비싼 칼럼을 사용하지 않아도 되며, 용매의 사용량이 대폭 감소하게 된다.

최근에 HSCCC의 응용이 활발해지면서 천연물의 대량 정제에 많이 활용되고 있다. 인삼의 진세노사이드 분리도 발표되었다.

본 발명과 관련된 종래기술은 하기와 같다.

이(Lee) 등은 5년근 인삼으로부터 향류크로마토그라피를 이용하여 인삼사포닌을 분리 농축하였지만 Rc만 순수 분리하였고, Rd, Re, Rg1은 분리되지 않은 상태로 혼합물로 분획을 하였으나, 분리된 Rc의 순도도 확인이 안되었으며, 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다. (이창호, 이부용, 한국식품과학회지, 36, 518-521, 2004).

왕(Chong-Zhi Wang et al., Phytochemical and analytical studies of Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen J. Nat. Med. (2006) 60: 97.106)에는 Notoginseng의 다양한 진세노시드 성분을 분리한 예를 기재하고 있으며(Fig. 2) 가장 강력한 분리 기술의 예로서 HPLC ( High-performance liquid chromatography) 법을 제시하고 있을 뿐, 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

권(Kwon) 등의 문헌 (Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng, Journal of Chromatography A, 921 (2001) 335339)에는 백삼을 가열처리하여 제조된 가공 인삼(선삼)의 신규 구성성분인 저극성 진세노시드 F , Rg4 , Rg3 , Rg5 , Rk6 , Rk1 , Rs3 , Rs3 , 및 Rs5 성분을 역상 액체 크로마토그래피법(C18 -bonded silica column)을 이용하여 (20R) 및 (20S) 입체이성체를 분리할 수 있다는 내용이 개시되어 있으나, 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

마르스톤(Marston, A.) 등의 문헌(Developments in the application of counter-current chromatography to plant analysis, Journal of Chromatography A, 1112 (2006) 181194)에는 CCC를 이용한 천연물의 분리에 관한 총괄적인 내용을 기재하였으나, (a) CHCl3-MeOH-2-BuOH-H2O; (b) EtOAc-1-BuOH-H2O; (c) n-Hexane-1-BuOH-H2O 용매계를 이용하여 인삼으로부터 진세노사이드를 분리하는 내용을 참고로 기재하였으나(p187, Table 1), 본 문헌에도 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

포콜트(A.P. Foucault) 등의 문헌(CCC Review paper, Journal of Chromatography A, 808 (1998) 322)에는 아세토게닌(acetogenins), 10-디아세틸-바카틴(deacetyl-baccatin) III,암포테리신 (amphotericin) B 등의 물질을 분리하는 방법으로서, CCC (counter-current chromatography) 및 CPC (centrifugal partition chromatography )를 채용한 분리시법을 개시하고 있으나, 본 문헌에도 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

아른첸(Arntzen; Charles J.) 등의 미국특허 USP patent. 6,444,233호에는 아카시아(Acacia victoriae) 종 식물로부터 신규 트리테르펜(triterpene)을 분리하는 방법으로 flash chromatography, DCCC, low-pressure liquid chromatography (LPLC), medium-pressure liquid chromatography (MPLC), HPLC, CPC 등의 분리방법을 이용하여 분리에 관한 내용이 기재되어 있으나, 추출대상 원료 및 최종분리 물질면에서 본 발명과 상이하며, 본 문헌에도 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

르 멘-올리비에르 ( Le Men-Olivier) 등은 미국인삼으로부터 포화 부타놀로 추출한 후 투석 후 건조한 잔사를 에틸아세테이트:부타놀:물의 용매계에 녹여서 95:1:4로부터 40:46;1로 구배로 변화시키고, 다음 부타놀의 농도를 점차 감소시키고 물의 비율을 90%까지 증가시키면서 4시간에 걸쳐서 진세노사이드 Rd, Re, Rb1과 지페노시드(Gypenoside) XVII, F11을 순수하게 분리하였다 (Le Men-Olivier등, Journal of Liquid Chromatography. & Related Technologies, 18, 1655-1662, 1995)

두(Du) 등은 중국의 삼칠(Panax notoginseng)로부터 진세노사이드 Rb1, 노토진세노사이드 R1, 진세노사이드 Re 및 진세노사이드 Rg1을 분리하였다 (Du 등, Journal of Chromatography A, 1008, 173-200, 2003). 사용한 용매계는 n-헥산:n-부타놀:물을 기본으로 하여 용매의 비를 (3:4:7)의 비율을 선택하여 분리에 사용하였다. 그러나, 본 문헌에도 인삼으로부터 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

류(Liu) 등은 향류크로마토그라피와 유사한 고속원심분배크로마토그라피를 이용하여 미국인삼 (Panax quinquefolium)으로부터 진세노사이드 Rc, Rb1, Re를 용매 에틸아세테이트:부타놀:물 1:1:2의 비율로 섞은 후 정제하였으나, (Liu등, Chromatographia, 71, 267-271, 2010) 본 문헌에도 인삼으로부터 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다.

하(Ha) 등은 홍삼에서 변형된 진세노사이드로 극성이 약한 Rg3, Rg5, Rk1, F4를 고속향류크로마토그라피를 이용하여 메틸렌클로라이드-메타놀-이소프로파놀-물 6:6:1:4의 비율로 용매상계를 만들어 분리하였다. 용매계의 특징은 에틸아세테이트와 부타놀을 시용하지 않은 점이고 증발광선산란기 (evaporative light scattering detetector)를 검출기로 하여 분리한 점이다. 그러나, 저극성 사포닌에 국한되어 있으며, 본 문헌에도 인삼으로부터 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다. (Ha 등, J. Chromatography A, 1151, 37-44, 2007)

치(Qi)등은 고성능향류크로마토그라피메틸렌클로라이드-메타놀-5 mM 암모니움아세테이트-이소프로파놀 6:2:4;3 용매계를 이용하여 Rf, Re, Rd, Rb1을 분리하였다. 특징은 암모니움아세테이트를 이용하여 분리시간을 단축하였고 유속을 67분까지 20 ml/min, 67-120분까지는 50 mL/min로 유지하여 기존에 분리되지 않았던 Rf를 분리한 점이다. 그러나, 역시 진세노사이드 트리올 두 종류 (Rf, Re)와 디올 두 종류 (Rb1, Rd)에 제한되어 있을 뿐, 본 문헌에도 인삼으로부터 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다. (Qi등, J. Chromatography A, 1217, 1955-2001, 2010)

쳉 (Cheng) 등은 인삼으로부터 Re, Rb1, Rb2, Rc를 고성능향류크로마토그라피의 1단계는 메틸렌클로라이드-메타놀-물-이소프로파놀 6:2:4:3 비율로, 2단계는 n-헥산:n-부타놀:0.1% 개미산 6:2:4;3으로 1단계의 유속은 20 mL/min, 2단계는 50 mL/min 로 유속을 변형시키면서 크로마토그라피를 수행하였으며 마지막에 고정상을 100 mL/min의 유속으로 밀어내어 진세노사이드 Rc가 포함된 분획을 모아 고속액체크로마토그라피로 Rc를 분리하였다. 특히, 이 방법에서는 기존의 고속향류크로마토그라피의 유속보다 10배 이상 빨리 유지함으로써 분리시간을 단축시킨 점이 두드러진다. 이것은 분리 시스템의 장비가 다르기 때문이다. 그러나, 이 방법에서도 위에서 언급한 진세노사이드 트리올 Re와 디올 Rb1, Rb2, Rc에 국한되어 있으며, 본 문헌에도 인삼으로부터 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 향류크로마토그라피를 이용하여 한 번에 분리할 수 있다는 기재내용도 없다. (Cheng 등, Separation and Purification Technology, 77, 347-354, 2011).

이에 따라 본 발명자들은 진세노사이드 디올 및 트리올 진세노사이드 8종류를 한 번에 분리하고자 연구를 지속하여 처음에는 폴리스티렌칼럼을 이용하여 두 개를 나누어 클로로포름/메타놀/물/이소프로파놀 4:3;2;1의 비율로 용매계를 만들어 각각에 대해서 향류크로마토그라피를 이용하여 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rc, Rb2, Rd를 분리하고 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc를 처음으로 분리하였다 (Shezad, O 등, J. Separation Science, 34, 1116-1122, 2011).

그러나, 좀 더 단계를 개선하고 극성이 다른 진세노사이드를 한 번에 분리하고자 분리 용매계를 구배로 일 단계로 클로로포름/메타놀/물/이소프로파놀, 5:6;1:4; 2 단계로 클로로포름/메타놀/물/이소프로파놀 4:3:1:2, 3단계로 클로로포름/메타놀/물/이소프로파놀 3;3:1:2의 다양한 분리용매계를 이용하여 진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb2, Rd뿐만 아니라 진세노사이드 Rh1, Rb2, Rc총 8개의 진세노사이드를 한 번에 분리할 수 있었다. 첫 단계에서 Rh1, Rf, Rd, Rg1을, 둘째 단계에서 Re, 셋째 단계에서 Rb2, Rc, Rb1을 분리하고 유속은 4 ml이었다. 이러한 방법의 특징은 용매계 선택을 좀 더 체계적으로 하였고, 특히 극성이 다른 진세노사이드를 세 종류의 다른 용매를 구배로 하여 분리할 수 있었던 점이다. 그러나, 상기 기술의 문제점은 역시 당을 제거하기 위하여 폴리스티렌 수지를 채운 컬럼크로마토그라피를 사용하였고, 용매계가 독성이 있다고 알려진 클로로포름을 포함하고 있는 점이다. 또한, 진세노사이드 트리올과 디올을 구분해서 분리해야 하는 번거로움이 남아 있었다. (Journal of Separation Science, 35, 1462-1469, 2012).

그러나, 상기 문헌의 어디에도 백삼, 가공인삼, 홍삼 등의 모든 종류의 인삼추출물로부터 진세노사이드의 극성에 관계없이 진세노사이드를 분리하기 위하여 최적의 분리를 위해 용매 선택 등과 같은 특정한 향류크로마토그라피 분리 조건으로 향류크로마토그라피법을 이용한 진세노사이드 분리 방법에 대한 어떠한 내용도 교시되거나 개시된 바는 없다.

이에, 본 발명자는 모든 종류의 인삼 (백삼, 가공인삼, 홍삼) 추출물로부터 진세노사이드의 극성에 관계없이 진세노사이드를 분리하기 위하여 향류크로마토그라피에서 최적의 분리를 위해 (1) 용매 선택에 대한 체계적 방법을 도입하고자 하였고, (2) 백삼의 진세노사이드의 경우 가능한 용매구배 대신 등용매 용리 (iscocratic elution) 방법을 사용하였고, 저극성 진세노사이드를 함유한 시료의 경우 용매의 구배를 단계별에서 일직선으로 하고자 하고 진세노사이드의 성분들의 극성이 다르기 때문에 (3) 분배상수를 근거로 두 종류의 용매계를 선택하여 용매 구배를 이용하여 분리하고자 하였으며 또한 크로마토그래피를 수행하는 과정에서 분리 효율을 향상시키기 위해서 (4) 유속을 조정한 결과, 인삼 추출물의 주요 약리성분으로 알려진 저극성 진세노사이드를 순도가 낮은 조시료 (개별 진세노사이드의 농도가 5% 미만)로부터 특별한 공정을 거치지 않고 한 번의 크로마토그래피 공정을 통하여 일정량 이상의 고순도 14종류의 진세노사이드를 단시간 내 (100~400분)에 1회에 수십 ~ 수백 mg 단위 내에서 얻을 수 있을 뿐만 아니라 재사용이 한정되어 있는 값비싼 칼럼을 사용하지 않아도 되며, 용매의 사용량이 대폭 감소하게 되는 등의 장점을 발견하고, 이에 따른 진세노사이드의 효과적인 분리방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 인삼을 추출하여 물, 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 이를 부탄올로 분획하여 인삼 추출 분획물을 수득하는 1 단계; (2) 특정한 용매 조성의 비율을 갖는 고정상 용매 및 이동상 용매를 이용한 향류크로마토그래피법을 이용하여 특정된 원심 속도로 회전하면서 컬럼에 이동상 용매를 특정된 이동 속도로 주입하는 2 단계; (3) 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점에 상기 1단계의 인삼 추출물을 시료 투입구에 주입하는 3 단계 및 (4) 상기 컬럼의 용리액으로부터 진세노사이드를 검출하는 4 단계를 포함한 인삼 추출물로부터 진세노사이드를 단기간내에 효과적으로 분리하는 분리 방법을 제공한다.

상기 분리 방법의 제 1단계에서,

상기 인삼은 저극성 진세노사이드를 분리하기 위해서는 디올이나, 트리올이 변형된 진세노사이드 (Rg3, Rg5, R1, F4등)가 함유된 것은 어느 것이든지 가능하나, 수삼, 백삼 또는 홍삼 등의 가공인삼을 포함하며, 바람직하게는, 홍삼은 저극성 진세노사이드가 풍부하게 함유되어 있기 때문에 가공인삼, 또는 홍삼을 이용하는 것이 바람직하며, 진세노사이드 디올과 트리올의 분리를 위해서는 백삼을 활용하는 것이 바람직하다. 또한 보다 구체적으로는, 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 죽절삼 (Panax japonicus), 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀나티푸스 (Panax bipinnatifidus), 또는 파낙스 슈도진생 (Panax pseudoginseng)으로부터 선택된 인삼 자체 또는 이의 가공물을 포함함을 특징으로 한다.

또한 상기 인삼추출 분획물은 당해 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 생약재 추출방법, 예를 들어 물, 알콜 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지는 않으나, 보다 구체적으로 예를 들어, 건조된 인삼을 분쇄한 후, 상기 분쇄물 무게의 1배 내지 20배 부피(v(mℓ)/w(g))의, 바람직하게는 1배 내지 15배 부피(v(mℓ)/w(g))의 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매 또는 메탄올, 보다 바람직하게는 30 내지 90%(w/w) 에탄올 농도를 갖는 물 및 에탄올 혼합 용매를 가하여 1시간 내지 1주일, 바람직하게는 2시간 내지 12시간 동안, 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 30℃ 내지 70℃에서 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는, 초음파 추출법을 수행하여 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기에서 얻은 추출물을 여과하고 여과된 추출물에 물을 가하여 부탄올로 분획을 수행하여 부탄올 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 부탄올 분획물을 감압농축하는 제 3단계의 제조공정을 포함하는 공정을 통하여 얻은 인삼 추출 분획물을 사용함이 바람직하다.

본 발명은 향류크로마토그라피에서 백삼의 주요 진세노사이드 (최적의 분리를 위해 용매 선택에 대한 체계적 방법을 도입하고자 하였고, 가능한 용매구배 대신 (1) 등용매 용리 (iscocratic elution) 방법을 적용하고, 용매의 구배를 단계별에서 일직선으로 하고자 하고 진세노사이드의 성분들의 극성이 다르기 때문에 (2) 분배상수를 근거로 두 종류의 용매계를 선택하여 용매 구배를 이용하여 분리하고자 하였으며 또한 크로마토그래피를 수행하는 과정에서 분리 효율을 향상시키기 위해서 (3) 유속을 조정함을 특징으로 한다.

상기 분리 방법의 제 2단계에서,

상기 "고정상 용매" 및 "이동상 용매"는 구체적으로는, 특정 혼합비의 메틸렌클로라이드 : 메탄올 또는 에탄올 : 이소프로판올 또는 프로판올 : 물, 보다 구체적으로는, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 또는 에탄올 : 이소프로판올 또는 프로판올 : 물을 1 내지 6 : 1 내지 6 : 1 내지 3 : 2 내지 5의 부피비로 혼합하여 상온에서 정치시킨 후 생성된 두 층 가운데 하층에 위치하는 용매는 이동상 용매로 이용하고, 상층에 위치하는 용매는 고정상 용매로 이용함을 바람직하며, 보다 더 구체적으로는, 메틸렌클로라이드 : 메탄올 : 이소프로판올 : 물 혼합용매를 1 내지 6 : 1 내지 6 : 1 내지 3 : 2 내지 5의 부피비로 혼합하여 상온에서 정치시킨 후 생성된 두 층 가운데 하층에 위치하는 용매는 이동상 용매로 이용하고, 상층에 위치하는 용매는 고정상 용매로 이용함을 특징으로 한다.

상기 고정상 및 이동상 용매조건을 통하여, 극성이 낮은 Rg6에서 Rg2는 메틸렌클로라이드 : 메탄올 : 이소프로판올 : 물 혼합용매 용매계 (5:4:1:3)를 사용하여 분리가 가능하였고, Rf에서 Rb1은 S3부터 S7까지 용매의 일직선 구배를 이용하여 분리가 가능하였다.

구체적으로, 백삼을 대상으로 분리하는 경우는 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합 부피비가 1 내지 3: 1 내지 3: 1 내지 2:2, 가장 바람직하게는 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합 부피비가 1:1:1:2인 용매를 이용하여 등용리 방법에 의해 200분 내지 240분까지 2 내지 4 mL/분으로 유속을 흘려주며 그 후에는 3 내지 5 ml/분으로 유속을 유지함으로서 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드 Rh1, Rf, Rd, Rg1 및 극성이 높은 진세노사이드 Re, Rc, Rb2, Rb1을 분리함을 특징으로 한다.

가공 인삼인 홍삼의 경우에 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드, Rg₆, Rg₅,Rk₁, Rg3, Rd 를 낮은 유속 (1 ml/분)에서 130 내지 160분 내에 분리한 후에 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 극성이 높은 8종류 진세노사이드를 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합비가 4 내지 6: 3 내지 5: 1 내지 2:3, 가장 바람직하게는 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합비가 5:4:1:3의 저극성 용매계에서 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합비가 1 내지 3: 1 내지 3: 1 내지 2:2, 가장 바람직하게는 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합비가 1:1:1:2인 용매계로 전환하는 용매 구배에 의해서 유속 1.0 내지 1.5 mL/min로 단 시간 내 (200-700분)에 얻음을 특징으로 한다.

상기 특정된 원심 속도의 바람직한 속도는 300 내지 1,500rpm, 보다 바람직하게는 500 내지 1,000rpm으로 함이 바람직하고, 이동상 용매의 바람직한 이동 속도는 0.5 내지 10㎖/분, 보다 바람직하게는 1 내지 5㎖/분 범위로 수행함이 바람직하다.

상기 제 3단계에서, 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점에 인삼 추출물을 시료 투입구에 주입하고 이동상 용매가 컬럼의 배출구에서 빠져 나오는 시점을 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점으로 판단함을 특징으로 한다.

상기 제 4단계에서, 시간이 경과함에 따라 용리액은 이동상의 주입 속도와 동일한 속도로 계속해서 분리 밸브를 통해 칼럼의 출구로 배출되게 된다. 이렇게 분리된 용리액으로부터 진세노사이드를 검출한다. 본 발명에서는 이를 위하여 진세노사이드 검출은 증발광산란검출기 (ELSD)를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 의하면 인삼 추출물의 주요 약리성분으로 알려진 저극성 진세노사이드를 순도가 낮은 조시료 (개별 진세노사이드의 농도가 5% 미만)로부터 특별한 공정을 거치지 않고 한 번의 크로마토그래피 공정을 통하여 일정량 이상의 고순도 14종류의 진세노사이드, 즉, Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rk1, Rg5, Rg6 및 F4 등을 분리가능하다.

백삼을 대상으로 분리하는 경우는 TBE-1000A에서 표 1에 있는 용매계 7번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물 1:1:1:2) 를 이용하여 등용리 방법에 의해 220분까지 3 mL/분으로 유속을 흘려주며 그 후에는 4ml/분으로 유속을 유지한다. 결과적으로, 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드 Rh1, Rf, Rd, Rg1은 유속 3 ml/분에서 분리되고, 극성이 높은 진세노사이드 Re, Rc, Rb2, Rb1은 유속 4 ml/분에서 분리할 수 있다(도 3A).

홍삼의 경우 TBE-300A를 이용하여 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드, Rg₆, Rg₅,Rk₁, Rg3, Rd 를 낮은 유속 (1 ml/분)에서 150분 내에 분리할 수 있었고 이후 극성이 높은 8종류 진세노사이드 (Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd,)는 표 1의 용매계 3번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물5:4:1:3)의 저극성에서 용매계 7번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물 1:1:1:2)의 극성용매계로 전환하는 용매 구배에 의해서 유속 1.2 mL/min로 단 시간 내 (200-700분)에 얻을 수 있다(도 3B).

본 발명은 HSCCC를 이용하여 백삼 또는 홍삼으로부터 진세노사이드를 분리하는 방법과 이의 방법으로 부터 도출된 1단계에 의한 13종류의 진세노사이드의 분리방법을 제공한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 구체적인 구성에 대하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 HCCC를 이용한 인삼으로부터 진세노사이드를 분리하는 분리공정은 인삼 추출물의 주요 약리성분으로 알려진 저극성 진세노사이드를 순도가 낮은 조시료 (개별 진세노사이드의 농도가 5% 미만)로부터 특별한 공정을 거치지 않고 한 번의 크로마토그래피 공정을 통하여 일정량 이상의 고순도 14종류의 진세노사이드를 단시간내 (100-400분)에 얻을 수 있다. 또한, 재사용이 한정되어 있는 값비싼 칼럼을 사용하지 않아도 되며, 용매의 사용량이 대폭 감소하게 되는 등의 유리한 효과나타내 인삼추출물로부터 유효성분의 효율적이고 진세노사이드 성분의 대량생산이 기능한 산업적 분리 방법을 제공한다.

도 1은 용매시스템계의 선정을 위한 실험 과정을 나타낸 도이며;
도 2는 백삼(A) 및 홍삼(B)의 부탄올 분획의 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸 도이며;
도 3은 백삼(A) 및 홍삼(B)의 부탄올 분획의 HSCCC 크로마토그램을 나타낸 도이며;
도 4는 백삼 및 홍삼 시료로부터 분리된 진세노사이드의 HSCCC 크로마토그램의 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시 예 및 실험 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예, 참고 예 및 실험 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참조예 1. 실험 준비

1-1. 실험 기기

2개의 상이한 크기의 HSCCC 기기를 이용하였으며, 분취용 (preparative) TBE-1000A (1 ~ 1.5g 시료 주입, Tauto Biotechinique Co, 중국) 및 semi-preparative TBE-300A(200~300mg 주입, Tauto Biotechinique, Co.중국)을 사용하였다.

상기 preparative TBE-1000A는 1000ml 및 3.0mm 폴리테트라풀루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene) 튜브의 코일(coil)을 이용하고 펌프(TBP-50A constant-flow pump, Tauto Biotechinique, Co.중국)을 이용하였다.

상기 기기의 속도는 0-600rpm 이었다. 상기 semi-preparative TBE-300A는 260ml 및 1.8mm 폴리테트라풀루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene) 튜브의 코일(coil)을 이용하고 펌프(Hitachi L-6200A Intelligent pump)을 이용하였다.

상기 기기의 속도는 0-1000rpm 이었다. 밸브를 통하여 흐르는 용출액(eluent)은 상기 코일화 컬럼을 탐지기(Evaporative Light Scattering Detector, SEDERE, Sedex 5, France)로 연결한 상태에서 연속적으로 검색되었다.

시료는 기기(Hitachi L-6200)을 이용한 HPLC로 분석하였으며, 자동 주입기(Sil-9A, Shimadzu, 일본) 및 컬럼(Zorbax SB-Aq C18 column, Agilent Technologies, USA)을 장착하였다.

GC는 탐지기(Flame ionization detector), 시료기(6000 series auto sampler; YL Instrument LTD, Anyang, Korea) 및 10μL 시린지(syringe, SGE Analytical Science, Australia).가 장착된 YL 6100 GC로 분석을 수행하였다. 또한 상기 기기는 수소, 오일-제거 공기(oil-free air) 및 캐리어 가스(carrier gas)를 담은 실린더에 연결되었다.

1-2. 시약 및 시료

홍삼(한국인삼공사, 서울, 한국) 및 백삼(농협, 서울, 한국)을 시중에서 구입하였고 아세토니트릴 (HPLC 용; J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 메틸렌클로리드, 메탄올, 에탄올 및 이소프로파놀 (분석용)은 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)에서 구입하였고 증류수(NANO pure Diamond, Barnstead, USA)를 모든 용액 준비 및 희석에 사용하였다.

실시예 1. 인삼 추출물 시료의 제조

1-1. 백삼 부탄올 추출 분획물의 조제

백삼에 함유되어 있는 사포닌의 총 함량은 건조 무게에 대해서 약 4~5%이다. 진세노사이드를 추출하기 위한 조건은 백삼 건조분말 50g을 70% 에탄올 150ml을 첨가하여 초음파추출기(Branson 5510, Danbury, CT, USA)를 이용한 초음파추출법으로 3시간 추출하여 상등액을 여과지 (HYUNDAI Micro Co., Ltd.)로 여과 및 감압농축기(EYELA, N-1000S-W Rotary Evaporator)로 감압농축하여 용매를 제거하고 물에 용해시킨 후에 부탄올로 다시 3회 추출을 수행하여 백삼 70% 에탄올 가용 추출물을 수득하고 원심분리기를 이용한 원심분리법를 이용하여 극성물질을 제거하고 동결건조기로(FD5505, 일신, 한국) 동결건조하여 건조 상태의 백삼 부탄올 추출 분획물 5g(이하. WGE라 함)을 얻고 상기 건조물을 후속한 HSCCC 분리법을 위하여 냉동실에 보관하였다.

1-1. 홍삼 부탄올 추출 분획물의 조제

홍삼 건조분말 50g을 70% 에탄올 150ml을 첨가하여 초음파추출기(Branson 5510, Danbury, CT, USA)를 이용한 초음파추출법으로 3시간 추출하여 상등액을 여과지 (HYUNDAI Micro Co., Ltd.)로 여과 및 감압농축기(EYELA, N-1000S-W Rotary Evaporator)로 감압농축하여 용매를 제거하고 물에 용해시킨 후에 부탄올로 다시 3회 추출을 수행하여 홍삼 70% 에탄올 가용 추출물 수득하고 원심분리기를 이용한 원심분리법를 이용하여 극성물질의 제거하고 동결건조기로(FD5505, 일신, 한국) 동결건조하여 건조 상태의 홍삼 부탄올 추출 분획물 3g(이하. RGE라 함)을 얻고 상기 건조물을 후속한 HSCCC 분리법을 위하여 냉동실에 보관하였다.

실시예 2. HSCCC 에 의한 진세노사이드 분리

2-1. HPLC

진세노사이드의 분획은 고속액체크로마토그라피 (HPLC)에 의해 확인하였다. 고속액체크로마토그라피 (HPLC)는 HITACHI L-6200 pump와 Shimadzu SIL-9A autoinjector, ELS 검출기(Sedex 75 ELS detector)를 사용하였으며, 용매 A는 물이고, 용매 B는 아세토니트릴로 구배 방식으로 0-6 min (18-23% B), 6-48.5 min (23-40% B), 48.5-55 min (40-100% B), 마지막 5분간 18% B로 1 mL/min 로 흘려주었다. 역상 Zorbax SB-Aq C₁₈ 칼럼 (150 mm x 4.6 mm, 5 μm 입자크기, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 개별 진세노사이드 분리하였으며 ELS 검출기(SEDERE, Sedex 55, France)의 프로브(probe) 온도는 70℃, 게인(gain) 7.0, 네뷸라이저(nebulizer)의 질소 가스 압력은 2.5 bar에 고정되었다.

2-2. 용매시스템계의 선정

목표물질을 위한 용매 시스템은 분배상수 (K _D )수치하에서 선택하고, 이 수치는 하기와 같이 HPLC로 측정된다.

진세노사이드 부타놀 추출물 3mg을 시험관에 넣고 평형화된 2상계의 각 층 2ml을 첨가한다. 시험관에서 충분히 교반한 후에 두개의 층으로 깨끗하게 나누어지면 각 층을 분리 한 후에 질소가스를 이용하여 건조한다. 각 층의 잔사는 메탄올에 녹여 HPLC과정을 수행한다. 분배상수는 상층액에 포함되어 있는 목표물질의 피크면적을 하층액의 피크면적으로 나눈 값으로 계산한다.(도 1 참조)

본 실험 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 서로 상이한 혼합비를 갖는 혼합용매시스템 (메틸렌클로리드/메타놀/이소프로파놀/물, v/v)이 진세노사이드의 CCC 분리를 위해 적합한 2상 용매 시스템으로 확인하고 이 용매 시스템을 선택하였다. 다양한 용매 경사(solvent gradients; S1 - S7)를 갖는 용매 시스템을 이들의 극성을 토대로 하여 선정하고 목표 분리를 위하여 측정하였고, 분배상수 (K _D )수치는 용매계에서 이소프로판올의 부피비를 증가시켜 감소시켰다. 용매 경사 S1 내지 S4은 증등 극성의 진세노사이드 화합물들 (Rg₆ 내지 Rg₂)에 적합한 K _D 수치를 나타냈다. 반면에 용매 경사 S5 내지 S7는 보다 극성의 진세노사이드 화합물들 (Rf 내지 Rb₁)에 적합한 K _D 수치를 나타냈다. 결론적으로, 용매 경사법은 시료의 14개 진세노사이드 분리를 위한 용매 시스템 조성으로 선택되었다.

용매 (S)	비율	K _D 값
용매 (S)	비율	Rg₆	Rg₅	Rk₁	F₄	Rg₃	Rg₂/Rh₁	Rf	Rd	Rg₁	Re	Rc	Rb₂	Rb₁
S1	6:6:1:4	0.35	0.49	0.78	2.12	2.65	3.5	4.6
S2	5:6:1:4	0.28	0.60	0.69	1.44	2	3.1	4.2
S3	5:4:1:3	0.18	0.35	0.52	0.78	1.56	2.1	3.5
S4	6:6:2:5	0.18	0.29	0.4	0.61	0.96	1.67	3.3	4.45	13.8	19	18.6	25	NA
S5	6:6:3:5	0.06	0.1	0.1	0.14	0.21	0.61	1.2	2.5	2.6	3.9	4	5.7	8
S6	2:2:1:2	0.1	0.16	0.22	0.31	0.54-0.71	1.2	2.1	2.9	3.1	4.6	4.9	6.5	7
S7	1:1:1:2						0.15	0.29	0.6	0.9	1.5	1.9	2.6	3.2

다양한 비의 혼합용매에서의 목표 물질들의 (K _D )수치

Table 1. K _D values of the target compounds in various ratios of CH ₂ Cl ₂ : MeOH: PrOH : DW

2-3. 용매들의 상 구성성분 분석을 위한 GC

2 상(phase) 용매 시스템을 용매들을 예비-포화(pre-saturation) 과정없이 필요시 제조하였다. GC-FID를 선택된 용매 시스템의 상 구성성분을 분석하기 위하여 사용하였다. 상기 분석은 내부표준물질(IS)로 테트라히드로퓨란(THF)을 사용하였다. 실험 조건은 다음과 같다: 컬럼 온도(column temperature) 50℃; 주입기 온도(injector temperature), 190℃; 탐지기 온도(detector temperature), 250℃ 및 개리어 가스(carrier gas, helium)를 사용. 상기 컬럼은 HP-5 (30m×0.32mm×0.25μm)이며 주입량 (injection volume)은 1μL 이었다. 초기에, 검정곡선(calibration curve)을 상기 서로 다른 농도의 IS로 개개 용매에 대하여 구도하였고 이전에 사용된 개개 용매들의 농도들로 상 구성성분 분석을 수행하였다. 최종적으로, 메틸렌클로리드(methylene chloride), 메탄올(methanol) 및 이소프로판올(isopropanol)의 부피 농도(volume concentration)를 각각 V₁, V₂ and V_3, 으로 측정하였다. FID는 DW에 반응하지 않으므로, 상기 상의 모두에서의 부피 농도(volume concentration, V₄) 를 하기 수학식 1로 계산 하였다.

2-4. 2상 용매시스템 및 시료 용액 준비

상이한 혼합비의 혼합용매 (메틸렌클로리드/메타놀/이소프로파놀/물, v/v) 를 HSCCC 분리법을 위한 2상 용매시스템으로 사용하였다. 상기 용매 혼합물을 상온에서 분획 플라스크 내에서 평형화하였고 상기 2상을 사용 전에 분리하였다. 시료용액으로 분리용 조시료 WGE 1000mg을 분리용매계 S6 60mL에 용해시켜 TBE-1000A에 사용하였고, RGE 300mg을 분리용매계 S3 20mL에 용해시켜 TBE-300A에 사용하였다. 그러나, HSCCC의 시스템은 (TBE-1000A, TBE-300A)는 시료에 국한되지 않는다.

2-5. HSCCC를 이용한 분리

앞의 단계에서 선정한 용매계에서 적절한 분배상수를 가지더라도 HSCCC분리 과정에서 정지상이 칼럼에 머무름 비율이 작다면 실패할 확률이 크다. 따라서 정지상의 머무름 비율을 확인할 필요가 있다.

HSCCC분리과정에서 이동상의 흐름속도와 coil형태로 감아져 있는 칼럼의 원심속도는 분리능을 좌우한다고 보고되고 있다. 일반적으로 이동상의 흐름속도는 낮을수록 분리능은 좋아지지만 전체 분리시간이 증가한다. 또한 칼럼의 원심속도는 증가할수록 분리능이 증가한다. 따라서 이런 요인들을 조절함으로서 앞에서 선정한 용매계를 가지고 HSCCC 최적화된 분리능을 찾고자 하는 단계이다.

HSCCC를 이용한 분리조건은 다음과 같다.

본 실시예에서는 내경이 3.0mm이고, 전체 용량이 1000㎖인 폴리테트라플루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene, PTFE) 튜브 컬럼을 구비한 대용량 모델 TBE-1000A (Tauto Biotech, 상하이, 중국)와 내경이 1.8mm이고, 전체 용량이 260㎖인 TBA-300A을 이용하였다. 개개 분리 과정에서, 다층 코일 컬럼(multi-layered coiled column)을 고정상을 형성하는 상층 상으로 충진하였고, 기기를 회전시켜 (TBE-1000A at 500rpm 및 TBE-300A at 850rpm), 하층 유기 이동상(lower organic mobile phase)을 컬럼 끝 방향으로 펌핑(pumping) 하였다(유속: 3mL min^-1- TBE-1000A 및 유속 1mL min^-1- TBE-300 A).

메틸렌클로라이드 : 메탄올 또는 에탄올 : 이소프로판올 또는 프로판올 : 물의 용매는 그 전날 미리 만들어 하층을 고정상으로, 상층을 이동상으로 나누어 사용 전 바로 녹아 있는 가스를 제거한다. 우선 코일형태로 감아져 있는 칼럼에 정지상으로 사용할 용매를 채운 후 500rpm (TBE-1000A) 또는 850rpm (TBE-300A)원심의 속도로 칼럼을 회전시킨다. 칼럼의 회전이 안정화되면 이동상을 3ml/min (TBE-1000A) 또는 1.0ml/min 유속으로 흘린다. 칼럼내에서 정지상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 시료 1000mg, 2상계의 각 용매 1:1 부피비율로 60ml (TBE-1000A)에 녹이거나 같은 조건의 용매 20ml에 (TBE-300A) 녹여 주입하고, 450min간 작동한다. HSCCC의 용리액은 분리 밸브와 ELS 검출기를 이용하여 검출함과 동시에 분획수집기를 사용하여 분획하였다. 조건으로 온도 70℃, 게인(gain)은 6, 기화기(nebulizer) 기체로 질소를 사용하여 2.2 bar로 조정한다.

백삼을 대상으로 분리하는 경우는 TBE-1000A에서 표 1에 있는 용매계 7번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물 1:1:1:2) 를 이용하여 220분까지 3 mL/분으로 유속을 흘려주며 그 후에는 4ml/분으로 유속을 유지하였다.

본 실험 결과, 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드 Rh1, Rf, Rd, Rg1은 유속 3 ml/분에서 분리되었고, 극성이 높은 진세노사이드 Re, Rc, Rb2, Rb1은 유속 4 ml/분에서 분리할 수 있었다. (도 3A)

또한, 변형된 진세노사이드를 많이 함유하고 있는 홍삼의 경우 TBE-300A의 시스템에 400 mg을 주입하여 극성이 낮으면서 낮은 Kd 값을 갖는 진세노사이드, Rg₆, Rg₅ _, Rk_1,F_4,Rg₃ 를 용매계 3번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물 5:4:1:3)을 이용하여 낮은 유속 (1 ml/분)에서 150분 내에 분리할 수 있었고 이후 극성이 높은 8종류 진세노사이드 (Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd,)는 표 1의 용매계 3번에서 용매계 7번 (메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물 1:1:1:2)를 이용하여 용매 구배에 의해서 유속 1.2 mL/min로 단 시간 내 (200-700분)에 얻을 수 있었다 (도 3B).

2-6. 분리된 진세노사이드의 순도측정과 구조 확인

고순도의 분리된 단일 진세노사이드는 ESI-MS, ESI-MS/MS, ¹H NMR, ¹³ C-NMR과 MS등의 분광학적 분석방법을 이용하여 구조를 확인하고 HSCCC로부터 수집된 각 피크의 분획은 앞의 HPLC방법을 이용하여 순도를 확인한다. 먼저, ESI-MS의 negative, positive mode를 수행하여 분자량을 결정하고, ESI-MS/MS로 구조결정을 수행하였다.

분리후 고정상에 남아 있는 용매를 분석하였을 때 당성분 이외에는 검출이 되지 않아 홍삼으로부터 진세노사이드가 모두 효율적으로 분리되었음을 알 수 있었다. 도 4에서 Rg2와 Rg3는 화학구조상 이성체인 (S)형과 (R)형이 같이 분리된다. 이 경우 주 성분인 (S)형을 정제하기 위하여 소량의 물을 넣어 물에 녹지 않은 (R)형을 원심분리하여 제거하였다. 도 4에서 진세노사이드 Rg5와 F4는 91%이지만 다른 12개의 진세노사이드는 모두 97% 이상이었다. 회수율는 홍삼인 경우 70%이상, 백삼인 경우 80%이었다. 구조는 ESI-MS/MS(Finnigan LCQ ion trap mass spectrometer from Thermo Finnigan, San Jose, CA) equipped with an electrospray (ESI) probe), H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance, Bruker AVANCE 500 NMR spectrometer), 및 C-NMR 통해서 확인하였고, 기존의 발표된 결과와 일치하였다.

본 발명에 의하면 인삼 추출물의 주요 약리성분으로 알려진 저극성 진세노사이드를 순도가 낮은 조시료 (개별 진세노사이드의 농도가 5% 미만)로부터 특별한 공정을 거치지 않고 한번의 크로마토그래피 공정을 통하여 일정량 이상의 고순도 14종류의 진세노사이드를 단시간내 (100-400분)에 얻을 수 있다. 또한, 재사용이 한정되어 있는 값비싼 칼럼을 사용하지 않아도 되며, 용매의 사용량이 대폭 감소하게 된다.

Claims

(1) 건조된 백삼 또는 홍삼을 분쇄한 후, 분쇄물 무게의 1배 내지 20배 부피(v(mℓ)/w(g))의 30 내지 90%(w/w) 에탄올 농도를 갖는 물 및 에탄올 혼합 용매를 가하여 2시간 내지 12시간 동안, 30℃ 내지 70℃에서 초음파 추출법을 수행하여 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기에서 얻은 추출물을 여과하고 여과된 추출물에 물을 가하여 부탄올로 분획을 수행하여 부탄올 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 부탄올 분획물을 감압농축하는 제 3단계의 제조공정을 통하여 백삼 또는 홍삼 추출분획물을 수득하는 3 단계; (2) 백삼을 대상으로 분리하는 경우는 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합 부피비가 1 내지 3: 1 내지 3: 1 내지 2:2인 용매를 이용한 등용리 방법에 의해 200분 내지 240분까지 2 내지 4 mL/분으로 유속을 흘려주며 그 후에는 3 내지 5 ml/분으로 유속을 유지하고, 홍삼의 경우에 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합 부피비가 4 내지 6: 3 내지 5: 1 내지 2:3의 저극성 용매계에서 메틸렌클로라이드-메탄올-이소프로파놀-물의 혼합 부피비가 1 내지 3: 1 내지 3: 1 내지 2:2의 극성용매계로 전환하는 용매 구배에 의해서 유속 1.0 내지 1.5 mL/min로 200분 내지 700분에 얻음을 특징으로 하는 향류크로마토그래피법을 이용하여, 300 내지 1,500rpm 범위의 원심 속도로 회전하면서 컬럼에 이동상 용매를 0.5 내지 10㎖/분 범위의 이동 속도로 주입하는 4 단계; (3) 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점에 상기 제 1단계의 백삼 또는 홍삼 추출물을 시료 투입구에 주입하는 5 단계 및 (4) 상기 컬럼의 용리액으로부터 진세노사이드를 증발광산란검출기 (ELSD)를 이용하여 검출하는 6 단계를 포함한 백삼 또는 홍삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1, Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rk1, Rg5, Rg6 및 F4 을 단기간 내에 효과적으로 분리하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
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제 1항에 있어서,
상기 백삼은 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 죽절삼 (Panax japonicus), 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀나티푸스 (Panax bipinnatifidus), 또는 파낙스 슈도진생 (Panax pseudoginseng)으로부터 선택된 백삼임을 특징으로 하는 분리 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 제 5단계에서, 상기 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점에 백삼 또는 홍삼 추출물을 시료 투입구에 주입하고 이동상 용매가 컬럼의 배출구에서 빠져 나오는 시점을 이동상과 고정상이 평형을 이루는 시점으로 판단함을 특징으로 하는 분리 방법.
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