JP2013055948A - キシロース発酵性真核細胞の代謝工学 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換された酵母又は糸状菌の宿主細胞であって、該宿主細胞を形質転換するとすぐに、該核酸構築物が、キシロースをキシルロースへ直接異性化する能力を該宿主細胞にもたらす、上記宿主細胞。
【選択図】なし
Description
キシロースイソメラーゼ
酵素「キシロースイソメラーゼ」(EC5.3.1.5)は、本明細書では、D−キシロースからD−キシルロースへ、及びその逆の直接異性化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、D−キシロースケトイソメラーゼとして知られている。いくつかのキシロースイソメラーゼはまた、D−グルコースとD−フルクトースとの間の変換を触媒することができ、したがって、時にグルコースイソメラーゼと呼ばれる。キシロースイソメラーゼは、マグネシウム又はマンガンなどの2価陽イオンを補因子として必要とする。本発明のキシロースイソメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。さらに、キシロースイソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、及び本明細書で以下に説明するようなキシロースイソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
キシロースイソメラーゼ活性の単位(U)は、本明細書では、Kuyper他(2003、FEMS Yeast Res.4:69〜78)によって記載されたような条件下で、1分当たりキシルロース1nmolを生成する酵素の量と定義する。
酵素「キシルロースキナーゼ」(EC2.7.1.17)は、本明細書では、ATP+D−キシルロース=ADP+D−キシルロース5リン酸の反応を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、リン酸化を行うキシルロキナーゼ、D−キシルロキナーゼ又はATP:D−キシルロース5−ホスホトランスフェラーゼとして知られている。本発明のキシルロースキナーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。さらに、キシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、及び本明細書で以下に説明するようなキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。キシルロキナーゼ活性の単位を、本明細書では実施例1.13で定義する。
酵素「リブロース5−リン酸エピメラーゼ」(5.1.3.1)は、本明細書では、D−キシルロース5−リン酸からD−リブロース5−リン酸へ、及びその逆のエピマー化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ホスホリブロースエピメラーゼ、エリスロース−4−リン酸イソメラーゼ、ホスホケトペントース3−エピメラーゼ、キシルロースリン酸3−エピメラーゼ、ホスホケトペントースエピメラーゼ、リブロース5−リン酸3−エピメラーゼ、D−リブロースリン酸−3−エピメラーゼ、D−リブロース5−リン酸エピメラーゼ、D−リブロース−5−P 3−エピメラーゼ、D−キシルロース−5−リン酸3−エピメラーゼ、ペントース−5−リン酸3−エピメラーゼ又はD−リブロース−5−リン酸3−エピメラーゼとして知られている。本発明のリブロース5−リン酸エピメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、リブロース5−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなリブロース5−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
酵素「リブロース5−リン酸イソメラーゼ」(EC5.3.1.6)は、本明細書では、D−リボース5−リン酸からD−リブロース5−リン酸へ、及びその逆の直接異性化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ホスホペント−スイソメラーゼ、ホスホリボイソメラーゼ、リボースリン酸イソメラーゼ、5−ホスホリボースイソメラーゼ、D−リボース5−リン酸イソメラーゼ、D−リボース−5−リン酸ケトール−イソメラーゼ、又はD−リボース−5−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとして知られている。本発明のリブロース5−リン酸イソメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、リブロース5−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなリブロース5−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
酵素「トランスケトラーゼ」(EC2.2.1.1)は、本明細書では、
D−リボース5−リン酸+D−キシルロース5−リン酸Κ←→
セドヘプツロース−7−リン酸+D−グリセルアルデヒド−3−リン酸
の反応、及びその逆の反応を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼ又はセドヘプツロース−7−リン酸:D−グリセルアルデヒド−3−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとして知られている。本発明のトランスケトラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、トランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
酵素「トランスアルドラーゼ」(EC2.2.1.2)は、本明細書では、
セドヘプツロース7−リン酸+D−グリセルアルデヒド3−リン酸←→
D−エリスロース−4−リン酸+D−フルクトース−6−リン酸
の反応及びその逆を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ、ジヒドロキシアセトン合成酵素、ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ、又はセドヘプツロース−7−リン酸:D−グリセルアルデヒド−3−リン酸グリセロントランスフェラーゼとして知られている。本発明のトランスアルドラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、トランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
酵素「アルドース還元酵素」(EC1.1.1.21)は、本明細書では、キシロース又はキシルロースをキシリトールに還元することができる任意の酵素と定義する。本発明の場合、アルドース還元酵素は、本発明の宿主細胞に本来備わっており(内在性であり)、キシロース又はキシルロースをキシリトールに還元することができる任意の非特異的アルドース還元酵素であってよい。非特異的アルドース還元酵素は、
アルドース+NAD(P)H+H+←→アルジトール+NAD(P)+
の反応を触媒する。
配列同一性は、本明細書では、配列を比較することによって測定されるような、2種以上のアミノ酸(ポリペプチド又はタンパク質)配列又は2種以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列の間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、このような配列の鎖の間の合致によって決定されるような、アミノ酸又は核酸配列の間の配列関連性の程度を意味する。2種のアミノ酸配列の間の「類似性」は、1本のポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を第2のポリペプチドの配列と比較することによって測定される。「同一性」及び「類似性」は、限定はしないが、(「コンピューターによる分子生物学(Computational Molecular Biology)」、Lesk,A.M編、Oxford University Press、New York、1988;「バイオコンピューティング:インフォマティクス及びゲノムプロジェクト(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)」、Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993;「配列データのコンピューター分析(Computer Analysis of Sequence Data)」、Part I、Griffin,A.M.、及びGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994;「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」、von Heine,G.、Academic Press、1987;及び「配列分析入門(Sequence Analysis Primer)」、Gribskov,M.及びDevereux,J.編、M Stockton Press、New York、1991;及びCarillo,H.及びLipman,D.、SIAM J. Applied Math.、48:1073(1988)に記載されたものを含む既知の方法によって容易に計算することができる。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列はまた、適度な、又は好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号9〜16及び18のヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力によって定義することができる。本明細書では、厳密なハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約25個、好ましくは約50個、75個又は100個のヌクレオチド、最も好ましくは約200個以上のヌクレオチドの核酸配列が、約65℃の温度で、塩約1Mを含む溶液、好ましくは6×SSC又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液中でハイブリダイズするのを可能にして、65℃で、塩約0.1M以下を含む溶液、好ましくは0.2×SSC又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液で洗浄する条件と定義される。ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち、少なくとも10時間実施することが好ましく、洗浄は洗浄溶液を少なくとも2回交換して少なくとも1時間実施することが好ましい。通常、これらの条件は、約90%以上の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする。
本明細書では、「操作可能に結合した」という用語は、機能的関係のポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれると「操作可能に結合」する。たとえば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼすならばコーディング配列に操作可能に結合する。操作可能な結合とは、結合するDNA配列が一般的に近接していて、そこで2種のタンパク質コーディング領域を近接してリーディングフレーム内に結合することが必要であることを意味する。
本明細書では、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、1種又は複数の遺伝子の転写を制御するために機能し、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位、転写開始部位及び、限定はしないが、転写因子結合部位、抑制因子及び活性化因子タンパク質結合部位を含むその他の任意のDNA配列、並びにプロモーターからの転写量を直接的又は間接的に制御するよう作用することが当業者に知られている任意のその他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に同定される核酸断片のことである。「構成的」プロモーターとは、最も環境的及び発生的な条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導的」プロモーターとは、環境的及び発生的制御下で活性のあるプロモーターである。
「相同性」という用語は、所与の(組換え)核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を示すために使用されるとき、自然界ではその核酸又はポリヌクレオチド分子が同じ種の、好ましくは同じ変種又は同じ株の宿主細胞又は生物によって生成されることを意味するものと理解される。宿主細胞が相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、自然の環境におけるよりも、一般的に他のプロモーター配列、又は、適切であるならば、他の分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に操作可能に結合するであろう。2種の核酸配列の関連性を示すために使用する場合、「相同性」という用語は、1種の1本鎖核酸配列が相補的な1本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量並びに後で説明する温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含めた多くの要素に左右され得る。同一領域は約5bpよりも大きいことが好ましく、同一領域は10pbより大きいことがより好ましい。
「異種性」という用語は、核酸(DNA若しくはRNA)又はタンパク質に関して使用するとき、それが存在する生物、細胞、ゲノム又はDNA若しくはRNA配列の一部としては天然に生じない核酸又はタンパク質、或いは自然界で見いだされるものとは異なる細胞又はゲノム又はDNA若しくはRNA配列における1種又は複数の位置に見いだされる核酸又はタンパク質を意味する。異種核酸又はタンパク質は、導入された細胞には内在しないが、他の細胞から得られたか、又は合成若しくは組換えによって得られた。一般的に、必ずしも必要ではないが、このような核酸は、そのDNAが転写されるか、又は発現する細胞によって通常産生されないタンパク質をコードする。同様に、外因性RNAは外因性RNAが存在する細胞において通常発現しないタンパク質をコードする。異種核酸及びタンパク質はまた、外来性核酸又はタンパク質と呼ばれることがあり得る。当業者が、発現する細胞に対して異種又は外来であると認識する任意の核酸又はタンパク質は、本明細書では異種核酸又はタンパク質という用語に包含される。異種性という用語はまた、核酸又はアミノ酸配列の天然にはない組合せ、すなわち、少なくとも2種の組合せ配列が互いに異質である組合せに適用される。
(a)配列番号1及び/又は配列番号2のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、97、98又は99%であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b)配列番号9及び/又は配列番号10のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも40、50、60、70、80、90、95、97、98又は99%であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
(c)(a)又は(b)の核酸分子配列とハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列、
(d)遺伝子コードの縮重によって(c)の核酸分子の配列と異なる配列のヌクレオチド配列からなる群から選択することができる。
前述したような本発明の宿主細胞で酵素を過剰発現させるため、並びに宿主細胞、好ましくは酵母をさらに遺伝子改変するために、宿主細胞を当技術分野で周知の方法によって本発明の様々な核酸構築物で形質転換する。このような方法は、たとえば、Sambrook and Russel(2001)「分子クローニング:研究マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(3版)、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、又はF.Ausubel他編、「分子生物学における現在の方法(Current protocols in molecular biology)」、Green Publishing and Wiley Interscience、New York(1987)などの標準的教科書によって知られている。真菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子改変方法は、たとえば、EP−A−0635574、WO 98/46772、WO 99/60102及びWO 00/37671によって知られている。
1.1.プラスミド構築物
標的遺伝子の前にTPI1プロモーターを組み込むために、いくつかのプラスミドを構築した。最初に、TPI1プロモーターをpYX012−AatからXhoI−EcoRV断片として切断し(A.A.Winkler、pYX012の誘導体(R&D Systems、Minneapoils、MN、USA))、SalI−PvuIIで切断したpUG6[3]に連結した。これによってpUG6PTPIが得られ、これは次にPCR Kanlox−PTPI組込みカセットに使用することができた。
この研究で使用したサッカロミセス セレビシエ株はRWB212(MATA ura3−52 leu2−112 loxP−PTPI::(−266、−1)TAL1 gre3::hphMX pUGPTPI−TKL1 pUGPTPI−RPE1 KanloxP−PTPI::(−?、−1)RKI1)で、これはCEN.PK102−3A(MATA ura3−52 ;leu2−112)から得られる。
TAL1及びRKI1では、オープンリーディングフレームのTPI1プロモーター5’の組込みを、KanMXマーカー及びTPI1プロモーターを有するPCR断片を増幅し、相同末端を介して標的位置に向けることによって実施した。PCRは、TaqDNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia、Piscataway、USA)で、製造元の説明書に従って実施した。鋳型は、プライマーとしてPTALdisA及びPTALdisB又はPRKIdisA及びPRKIdisB(表3)を有するpUG6PTPIであった。
保存培養物は、振盪フラスコ中で、グルコース20gl−1を補給した合成培地[6]で30℃で増殖させた。定常状態に到達したら、滅菌グリセロールを30%(vol/vol)まで添加して、一定量2mlを滅菌バイアル中で−80℃で保存した。
振盪フラスコ培養は、合成培地中で30℃で実施した[6]。滅菌前に培地のpHをKOH 2Mで6.0に調節した。500ml振盪フラスコ中のキシロース20gl−1を含有する培地100mlに凍結保存培養物を接種することによって、予備培養を準備した。オービタル振盪機(200rpm)で30℃で24時間から48時間インキュベートした後、この培養物を振盪フラスコ培養又は発酵槽培養のいずれかに接種するために使用した。嫌気性培養用合成培地にエタノールに溶解したエルゴステロール0.01gl−1及びTween80 0.42gl−1を補給し[10、11]、これによって培地中のエタノールは11〜13mMになった。
嫌気性バッチ培養は、ノルプレンチューブを備えた研究用発酵槽(Applikon、Schiedam、オランダ)2リットルで、操作容量1.5リットル、30℃、pH5.0で実施した。培養物を800rpmで撹拌し、高級窒素(酸素<5ppm)を0.5l分−1で散布した。この合成培地に嫌気的成長因子エルゴステロール及びTween80(それぞれ、0.01及び0.42gl−1)並びにシリコーン消泡剤100μl−1(BDH、Poole、UK)を補給した。
培養試料(10.0ml)を予め重量を測定したニトロセルロースフィルター(孔径0.45μm、Gelman laboratory、Ann Arbor、USA)で濾過した。培地を除去した後、フィルターを脱塩水で洗浄して、電子レンジ(Bosch、Stuttgart、ドイツ)内で360Wで20分間乾燥して、重量を測定した。2連の測定の変動は1%未満であった。
排出ガスを凝縮器(2℃)で冷却して、Permapure乾燥機MD−110−48P−4型(Permapure、Toms River、USA)で乾燥した。O2及びCO2濃度は、NGA2000分析器(Rosemout Analytical、Orrville、USA)で測定した。排出ガス−流速及び特異的酸素消費量及び二酸化炭素生成率は、既に記載されたように測定した[12、13]。これらのバイオマス特異的速度の計算では、培養試料の採取によって生じる体積の変化を修正した。
グルコース、キシロース、キシリトール、有機酸、グリセロール及びエタノールは、Biorad HPX 87Hカラム(Biorad、Hercules、USA)を含有するWaters Alliance 2690HPLC(Waters、Milford、USA)でHPLC分析することによって検出した。このカラムを、60℃で、H2SO4 0.5gl−1によって、流速0.6ml分−1で溶出した。Waters 2410屈折率検出器及びWaters 2487UV検出器によって検出した。キシルロースは、以下の方法で酵素的に測定した。反応混合物は、MgCl2 10mM、NADH 0.30mMを含むTris−HCl緩衝液(pH7.5)及び適切な量の試料(全量1ml)からなり、測定はソルビトール脱水素酵素0.2U(Sigma、St Louis、USA)を添加することによって開始した。キシルロース濃度は、NADHについての吸収係数6.3mM−1cm−1を使用して計算した。
炭素回収率は、形成された生成物中の炭素を消費した糖炭素の全量で除することによって計算し、バイオマスの炭素含量48%に基づいた。発酵中のエタノール蒸発を修正するために、産生したエタノールの量は、測定したCO2累積生成量マイナスバイオマス合成によって生じたCO2生成量(バイオマス1g当たりCO25.85mmol、[14])及び既に記載されたような[2]酢酸形成に関連したCO2に等しいと推定された。
ケモスタットからの細胞採取、プローブ調製及びAffymetrix Genechip(登録商標)マイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、既に記載されたように実施した[15]。各増殖条件の結果は、独立した3回の反復培養から得た。
アレイ画像の取得及び定量並びにデータフィルタリングは、Affymetrixソフトウェアパッケージ:マイクロアレイセット v5.0 MicroDB v3.0及びデータマイニングツール v3.0を使用して実施した。
キシロースイソメラーゼ活性は、50mM リン酸緩衝液(pH7.0)、キシロース10mM、MgCl2 10mM及び適切な量の無細胞抽出液を含有する反応混合物において37℃で測定した。形成したキシロースの量を、システインカルバゾール法によって測定した[9]。或いは、キシロースイソメラーゼ活性は、Kersters−Hildersson他(「D−ソルビトール脱水素酵素を使用した酵素アッセイによるD−キシロースイソメラーゼの動力学的特徴付け(Kinetic characterizaiton of D−xylose isomerases by enzymatic assays using D−sorbitol dehydrogenase)」Enz.Microb.Technol.9(1987)145〜148)によって開発された30℃での酵素アッセイで測定した。形質転換したS.セレビシエ株の無細胞抽出液におけるキシロースイソメラーゼのin vitro活性は、2価陽イオン(Mg2+及びCo2+)に左右される。
2.1 ペントースリン酸経路(PPP)遺伝子の過剰発現
以前に、サッカロミセス セレビシエにおける真菌キシロースイソメラーゼの発現は、十分な選択圧を加えれば、原理上は単一炭素源としてキシロースでのこの酵母の嫌気的増殖を可能にするために十分であることを示した[2]。しかし、選択された株は、産業上の必要条件まではまだ実現していない(表1)。
操作された株の顕著な特徴の1つは、いかなる選択的圧力も必要とせず、キシロースで嫌気的に増殖する能力であった(図1)。無機質培地でのキシロースによる嫌気的増殖は、0.09h−1の高い増殖速度で進行した。キシルロースは蓄積しないが、キシリトール形成は極めて僅かであるが検出可能なバイオマスで(図1)、キシロースによるRWB212種のエタノール及びグリセロールの収率は、進化工学によって得られたRWB202−AFXの収率に匹敵した(表2)。表2から、RWB202−AFXのキシロース345mg/バイオマスg/hと比較すると、キシロース1.0g/バイオマスg/hを上回る特異的キシロース消費速度を算出することができるが(Qs=0,09/0,085=1,059grXyl/grX/h)、グルコースでの収率と少なくとも類似の収率が得られた。
導入で指摘したように、ヘミセルロース加水分解物のエタノールへの経済的変換には、グルコース及びキシロース両方の好ましくは同時の発酵が必要である。混合糖利用に関して、RWB212株の特性を確認するために、酵母をグルコース及びキシロース(それぞれ20gl−1)の混合物で増殖させた。図2に示した結果は、両方の糖は完全に消費されるが、グルコースが好ましい基質であることを示している。グルコースの約80%が消費された後に、キシロース消費が開始した。
B.テタイオタオミクロン(B.thetaiotaomicron)VPI−5482キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列(アクセッション番号AAO75900又はNP809706、配列番号10)を多コピー酵母発現ベクターにクローニングして、p426GPDBtXIを得た。このプラスミドを使用してRWB215(MATαura3−52 leu2−112 loxP−PTPI::(−266、−1)TAL1 gre3::hphMX pUGPTPI−TKL1 pUGPTPI−RPE1 KanloxP−PTPI::(−?、−1)RKI1)を形質転換し、キシルロキナーゼを過剰発現させるためにさらにp415ADHXKSで形質転換した。2種の独立した形質転換体を選択したところ、両者とも単独炭素源としてキシロースを含む最少培地で増殖することができ、この形質転換体の溶解物では、特異的キシロースイソメラーゼ活性を測定すると、ピロミセスキシロースイソメラーゼを発現する株のタンパク質1mg当たり約1300Uと比較して、タンパク質1mg当たり140+/−20Uであった。
RWB212株(前記参照)を、炭素源としてキシロース30g/lを含む嫌気的ケモスタット培地(duplo)で、推定増殖速度0.06h−1で培養することによって選択圧下に置いた。選択方法は、培養乾燥重量及び残存キシロース濃度を測定することによってモニターした。初期残存キシロース濃度は、約30mMであったが、26世代(300時間)後では既に、残存キシロース濃度は15mM未満に減少しており(図3A)、バイオマス濃度の対応する増加も認められた(図3B)。
試験した株は、特許文献及びKuyper他、2005、FEMSYR 5:399〜409に記載されたように構築された。改変遺伝子を以下の表に挙げる。
aグルコース消費段階から測定。bCO2生成から推定したエタノール濃度に基づいて計算、1.10項を参照。cCO2生成から推定、1.10項を参照。d一時的蓄積。この値は、対数期中間部における最高濃度を表す。増殖の最後に、全キシルロースは再度消費され、その他の培養では全て、キシルロース濃度は検出限界を下回ったままであった。
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21.Mumberg,D.、Muller,R.及びFunk,M.(1995)「様々な遺伝的背景において異種タンパク質を制御発現するための酵母Vベクター(Yeast Vvectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.)」Gene 156、119〜122。
(1)キシロースをキシルロースに直接異性化する能力を備えた真核宿主細胞であって、ペントースリン酸経路の流束を増加させる遺伝子改変を含み、キシロース特異的消費速度が少くともキシロース346mg/バイオマスg/hである宿主細胞。
(2)前記遺伝子改変が非酸化的部分のペントースリン酸経路の少なくとも1種の遺伝子の過剰発現を含む(1)に記載の宿主細胞。
(3)前記遺伝子が、リブロース−5−リン酸イソメラーゼ、リブロース−5−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される(2)に記載の宿主細胞。
(4)前記遺伝子改変が少なくともトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む(2)に記載の宿主細胞。
(5)前記宿主細胞がさらに、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む(2)から(4)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(6)前記遺伝子改変がキシルロースキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む(5)に記載の宿主細胞。
(7)過剰発現する遺伝子が前記宿主細胞に内在性である(2)から(6)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(8)前記宿主細胞が、前記宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む(1)から(7)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(9)前記遺伝子改変が非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を減少させるか、又は不活性化させる(8)に記載の宿主細胞。
(10)前記遺伝子が遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、又は遺伝子の破壊によって不活性化される(9)に記載の宿主細胞。
(11)非特異的アルドース還元酵素をコードする宿主細胞中の各遺伝子の発現が、減少しているか、又は不活性化している(8)又は(9)に記載の宿主細胞。
(12)前記宿主細胞が酵母、好ましくはサッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)及びヤロウイア(Yarrowia)の属の1つに属する酵母である(1)〜(11)のいずれかに記載の宿主細胞。
(13)
前記酵母は、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ディアスタティカス(S.diastaticus)、K.ラクティス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)、及びK.フラギリス(K.fragilis)の種の1つに属する(12)に記載の宿主細胞。
(14)前記宿主細胞が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、アクレモニウム(Acremonium)、フサリウム(Fusarium)及びペニシリウム(Penicillium)の属の1つに属する糸状菌である(1)から(11)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(15)前記宿主細胞に、エタノール、乳酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される少なくとも1種の発酵産物を産生する能力を与える1種又は複数の酵素を発現する(1)〜(14)のいずれかに記載の宿主細胞。
(16)以下のステップを含むエタノール生産方法:
(a)(1)から(14)までのいずれかで定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)エタノールを回収するステップ。
(17)前記培地が、グルコース源も含有する(16)に記載の方法。
(18)エタノールの量的生産性が少なくとも1時間当たり1リットル当たりエタノール0.5gである(16)又は(17)に記載の方法。
(19)エタノール収率が少なくとも50%である(16)から(18)までのいずれかに記載の方法。
(20)以下のステップを含む、乳酸、3−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産方法:
(a)(15)で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)発酵産物を回収するステップ。
(21)前記培地がグルコース源も含有する(20)に記載の方法。
(1)キシロースをキシルロースに直接異性化する能力を備えた真核宿主細胞であって、ペントースリン酸経路の流束を増加させる遺伝子改変を含み、キシロース特異的消費速度が少くともキシロース346mg/バイオマスg/hである宿主細胞。
(2)前記遺伝子改変が非酸化的部分のペントースリン酸経路の少なくとも1種の遺伝子の過剰発現を含む(1)に記載の宿主細胞。
(3)前記遺伝子が、リブロース−5−リン酸イソメラーゼ、リブロース−5−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される(2)に記載の宿主細胞。
(4)前記遺伝子改変が少なくともトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む(2)に記載の宿主細胞。
(5)前記宿主細胞がさらに、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む(2)から(4)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(6)前記遺伝子改変がキシルロースキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む(5)に記載の宿主細胞。
(7)過剰発現する遺伝子が前記宿主細胞に内在性である(2)から(6)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(8)前記宿主細胞が、前記宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む(1)から(7)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(9)前記遺伝子改変が非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を減少させるか、又は不活性化させる(8)に記載の宿主細胞。
(10)前記遺伝子が遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、又は遺伝子の破壊によって不活性化される(9)に記載の宿主細胞。
(11)非特異的アルドース還元酵素をコードする宿主細胞中の各遺伝子の発現が、減少しているか、又は不活性化している(8)又は(9)に記載の宿主細胞。
(12)前記宿主細胞が酵母、好ましくはサッカロミセス(Saccharomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ピチア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)及びヤロウイア(Yarrowia)の属の1つに属する酵母である(1)〜(11)のいずれかに記載の宿主細胞。
(13)
前記酵母は、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ディアスタティカス(S.diastaticus)、K.ラクティス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)、及びK.フラギリス(K.fragilis)の種の1つに属する(12)に記載の宿主細胞。
(14)前記宿主細胞が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、アクレモニウム(Acremonium)、フサリウム(Fusarium)及びペニシリウム(Penicillium)の属の1つに属する糸状菌である(1)から(11)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(15)前記宿主細胞に、エタノール、乳酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される少なくとも1種の発酵産物を産生する能力を与える1種又は複数の酵素を発現する(1)〜(14)のいずれかに記載の宿主細胞。
(16)以下のステップを含むエタノール生産方法:
(a)(1)から(14)までのいずれかで定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)エタノールを回収するステップ。
(17)前記培地が、グルコース源も含有する(16)に記載の方法。
(18)エタノールの量的生産性が少なくとも1時間当たり1リットル当たりエタノール0.5gである(16)又は(17)に記載の方法。
(19)エタノール収率が少なくとも50%である(16)から(18)までのいずれかに記載の方法。
(20)以下のステップを含む、乳酸、3−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産方法:
(a)(15)で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)発酵産物を回収するステップ。
(21)前記培地がグルコース源も含有する(20)に記載の方法。
(22)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換された酵母又は糸状菌の宿主細胞であって、該宿主細胞を形質転換するとすぐに、該核酸構築物が、キシロースをキシルロースへ直接異性化する能力を該宿主細胞にもたらす、上記宿主細胞。
(23)前記ヌクレオチド配列がバクテロイデス綱の細菌から得られるキシロースイソメラーゼをコードする、(22)に記載の宿主細胞。
(24)キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン利用が宿主細胞のコドン利用に最適化するように、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を適合させる、(22)又は(23)に記載の宿主細胞。
(25)適合化されたヌクレオチド配列は宿主細胞のコドン利用に対して少なくとも0.6のコドン適合指数を有する、(24)に記載の宿主細胞。
(26)前記宿主細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ピチア属(Pichia)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クロエケラ属(Kloeckera)、シュワニオミセス属(Schwanniomyces)及びヤロウイア属(Yarrowia)の一つに属する酵母である、(22)から(25)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(27)前記酵母が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ジアスタチカス(S.diastaticus)、K.ラクティス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)、及びK.フラギリス(K.gragilis)の種の一つに属する、(26)に記載の宿主細胞。
(28)前記宿主細胞が、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、フミコラ属(Humicola)、アクレモニウム属(Acremonium)、フサリウム属(Fusarium)及びペニシリウム属(Penicillium)の一つに属する糸状菌である、(22)から(25)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(29)流束の増加を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝子的に同一な株における流束と比較して、ペントースリン酸経路の流束を増加する遺伝子改変を含む、(22)から(28)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(30)前記遺伝子改変がペントースリン酸経路の非酸化的部分の少なくとも一つの遺伝子の過剰発現を含む、(29)に記載の宿主細胞。
(31)前記遺伝子がリブロース−5−リン酸イソメラーゼ、リブロース−5−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、(30)に記載の宿主細胞。
(32)前記遺伝子改変が特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変である、(29)に記載の宿主細胞。
(33)前記特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変がキシルロースキナーゼをコードする内在性のまたは異種性の遺伝子の過剰発現を含む、(32)に記載の宿主細胞。
(34)前記宿主細胞が、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む、(22)から(33)までのいずれかに記載の宿主細胞。
(35)前記宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変が、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素をコードする内在性遺伝子を不活性化させる、(34)に記載の宿主細胞。
(36)以下のステップを含むエタノール生産方法:
(a)(22)から(35)までのいずれかで定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)エタノールを回収するステップ。
(37)前記培地が、グルコース源も含有する、(36)に記載の方法。
(38)エタノールの量的生産性が少なくとも1時間当たり1リットル当たりエタノール0.5gである、(36)又は(37)に記載の方法。
(39)エタノール収率が少なくとも50%である、(36)から(38)までのいずれかに記載の方法。
(40)以下のステップを含む、乳酸、3−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産方法:
(a)(22)から(35)までのいずれかで定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)発酵産物を回収するステップ。
(41)前記培地がグルコース源も含有する、(40)に記載の方法。
Claims (20)
- 配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換された酵母又は糸状菌の宿主細胞であって、該宿主細胞を形質転換するとすぐに、該核酸構築物が、キシロースをキシルロースへ直接異性化する能力を該宿主細胞にもたらす、上記宿主細胞。
- 前記ヌクレオチド配列がバクテロイデス綱の細菌から得られるキシロースイソメラーゼをコードする、請求項1に記載の宿主細胞。
- キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン利用が宿主細胞のコドン利用に最適化するように、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を適合させる、請求項1又は2に記載の宿主細胞。
- 適合化されたヌクレオチド配列は宿主細胞のコドン利用に対して少なくとも0.6のコドン適合指数を有する、請求項3に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ピチア属(Pichia)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クロエケラ属(Kloeckera)、シュワニオミセス属(Schwanniomyces)及びヤロウイア属(Yarrowia)の一つに属する酵母である、請求項1から4までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記酵母が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ブルデリ(S.bulderi)、S.バルネッチ(S.barnetti)、S.エクシグウス(S.exiguus)、S.ウバラム(S.uvarum)、S.ジアスタチカス(S.diastaticus)、K.ラクティス(K.lactis)、K.マルキシアヌス(K.marxianus)、及びK.フラギリス(K.gragilis)の種の一つに属する、請求項5に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、フミコラ属(Humicola)、アクレモニウム属(Acremonium)、フサリウム属(Fusarium)及びペニシリウム属(Penicillium)の一つに属する糸状菌である、請求項1から4までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 流束の増加を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝子的に同一な株における流束と比較して、ペントースリン酸経路の流束を増加する遺伝子改変を含む、請求項1から7までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子改変がペントースリン酸経路の非酸化的部分の少なくとも一つの遺伝子の過剰発現を含む、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子がリブロース−5−リン酸イソメラーゼ、リブロース−5−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子改変が特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変である、請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変がキシルロースキナーゼをコードする内在性のまたは異種性の遺伝子の過剰発現を含む、請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む、請求項1から12までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変が、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素をコードする内在性遺伝子を不活性化させる、請求項13に記載の宿主細胞。
- 以下のステップを含むエタノール生産方法:
(a)請求項1から14までのいずれか一項で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)エタノールを回収するステップ。 - 前記培地が、グルコース源も含有する、請求項15に記載の方法。
- エタノールの量的生産性が少なくとも1時間当たり1リットル当たりエタノール0.5gである、請求項15又は16に記載の方法。
- エタノール収率が少なくとも50%である、請求項15から17までのいずれか一項に記載の方法。
- 以下のステップを含む、乳酸、3−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、1,3−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産方法:
(a)請求項1から14までのいずれか一項で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵するステップ;及び、場合によって、
(b)発酵産物を回収するステップ。 - 前記培地がグルコース源も含有する、請求項19に記載の方法。
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