BR112019013121A2

BR112019013121A2 - tolerância a sulfito em células hospedeiras de levedura recombinante

Info

Publication number: BR112019013121A2
Application number: BR112019013121A
Authority: BR
Inventors: Aaron Argyros; Trisha Barrett; Janet Fisher; Michelle Oeser; Charles F Rice
Original assignee: Lallemand Hungary Liquidity Man Llc
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-12-10
Also published as: CA3047889A1; MX2019007598A; EP3559238A1; US20220090102A1; CN110177879A; WO2018115513A1

Abstract

o presente pedido diz respeito ao uso de modificação(ões) genética(s) específica(s) para aumentar a tolerância a sulfito em células hospedeiras de levedura recombinante. a(s) modificação(ões) genética(s) é (são) desenhadas para permitir a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo ssu1 e/ou a expressão de um polipeptídeo ssu1 heterólogo na(s) célula(s) hospedeira(s) de levedura recombinante.

Description

TOLERÂNCIA A SULFITO EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE LEVEDURA RECOMBINANTE

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS E DOCUMENTOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório US 62/438.391, depositado em 22 de dezembro de 2016 e aqui incorporado em sua totalidade. Este pedido é depositado junto com uma listagem de sequências em formato eletrônico em sua totalidade.

CAMPO TECNOLÓGICO [0002] O presente relatório se refere ao aumento de tolerância a sulfito em células hospedeiras de levedura recombinante de maneira a favorecer seu crescimento e, em última análise, a produção de um ou mais produtos de fermentação, tais como, por exemplo, etanol.

ANTECEDENTES [0003] Saccharomyces cerevisiae é o principal biocatalisador utilizado na produção comercial de etanol combustível. Este organismo é proficiente na fermentação de glicose a etanol, frequentemente a concentrações maiores que 20% p/v. No entanto, na presença de alguns contaminantes, o S. cerevisiae pode exibir cinéticas de fermentação mais lentas, aumento em sua produção de glicerol e, em alguns casos, mesmo falta de capacidade de completar a fermentação completa pelo fato de se tornar inativo (por exemplo, fermentação travada).

[0004] Seria altamente desejável o provimento de uma célula hospedeira de levedura recombinante que seja menos susceptível à fermentação travada pelo aumento de sua tolerância à presença de contaminante(s) no meio de fermentação.

BREVE SUMÁRIO [0005] O presente relatório refere-se à sobre-expressão de bombas de efluxo de sulfito de maneira a aumentar a tolerância a sulfito em células hospedeiras de levedura recombinante. A sobre-expressão de tais bombas de efluxo de sulfito nas células hospedeiras de levedura recombinante pode restaurar/favorecer

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2/47 seu crescimento e, em última análise, a produção de um ou mais produtos de fermentação, tais como, por exemplo, etanol.

[0006] Em um primeiro aspecto, o presente relatório provê uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo: (i) uma primeira modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol e/ou permitir a produção de uma glicoamilase heteróloga; e (ii) uma segunda modificação genética que permite a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo SSU1 e/ou permite a expressão de um polipeptídeo SSU1. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta a segunda modificação genética permitindo a expressão do fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão do polipeptídeo SSU1. Em ainda uma outra realização, o fator de transcrição heterólogo é um polipeptídeo FZF1 ou um polipeptídeo codificado por um gene fzf1 ortólogo. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 ou o polipeptídeo codificado pelo gene fzf1 ortólogo é expresso sob o controle de um promotor constitutivo regulado por glicose (tal como, por exemplo, o promotor de um gene hxt7 (hxt7p)) ou um promotor regulado por sulfito (tal como, por exemplo, o promotor de um gene gpd2 (gpd2p), o promotor de um gene fzf1 (fzflp), o promotor de um gene ssu1 (ssulp) ou o promotor de um gene ssu1-r (ssur1-rp)). Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 é do gênero Saccharomyces sp. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 contém a sequência de aminoácidos de qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22, é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22. Em ainda uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta a segunda modificação genética que permite a expressão do polipeptídeo SSU1 heterólogo. Em uma realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo é um polipeptídeo codificado por um gene ssu1 ortólogo. Em uma realização, o

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3/47 polipeptideo SSU1 heterólogo ou o polipeptideo codificado pelo gene ssu1 ortólogo é expresso sob o controle de um promotor constitutivo regulado por glicose (tal como, por exemplo, o promotor de um gene hxt7 (hxt7p)) ou um promotor regulado por sulfito (tal como, por exemplo, o promotor de um gene gpd2 (gpd2p), o promotor de um gene fzf1 (fzf1 p), o promotor de um gene ssu1 (ssulp) ou o promotor de um gene ssu1-r (ssur1-rp)). Em uma realização adicional, o polipeptideo SSU1 heterólogo é do gênero Saccharomyces sp. Em uma outra realização, o polipeptideo SSU1 apresenta a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 24, é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 24 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 24. Em ainda uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta a primeira modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam na produção de glicerol ou regular a síntese de glicerol. Em ainda uma outra realização, a uma ou mais enzimas nativas que funcionam na produção de glicerol é um polipeptideo GPD2. Em uma realização adicional, a uma ou mais enzimas que funcionam na regulação da síntese de glicerol é um polipeptideo STL1. Em uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta a primeira modificação genética para permitir a produção de uma glicoamilase heteróloga. Em uma realização, a glicoamilase heteróloga é do gênero Saccharomycopsis sp., tal como, por exemplo, da espécie Saccharomycopsis fibuligera. Em uma realização, a glicoamilase heteróloga apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em algumas realizações, a célula hospedeira de levedura recombinante compreende ainda uma terceira modificação genética para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formato. Em ainda uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante não apresenta a

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4/47 capacidade de produzir um polipeptídeo FDH1 e um polipeptídeo FDH2. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp., tal como, por exemplo, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[0007] De acordo com um segundo aspecto, o presente relatório provê um método para aumentar uma propriedade de crescimento de uma célula hospedeira de levedura recombinante. De forma ampla, o método compreende (i) o provimento de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante apresentando a primeira modificação genética tal como definida aqui; e (ii) a introdução da segunda modificação genética tal como definida aqui na primeira célula hospedeira de levedura recombinante de maneira a prover uma segunda célula hospedeira de levedura recombinante. A propriedade de crescimento da segunda célula hospedeira de levedura recombinante é considerada como sendo aumentada em relação à propriedade de crescimento da primeira célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização, a propriedade de crescimento é uma taxa de crescimento e a propriedade de crescimento aumentada é uma taxa de crescimento mais rápida. Em uma outra realização, a propriedade de crescimento é um período de latência e a propriedade de crescimento aumentada é um período de latência reduzido.

[0008] De acordo com um terceiro aspecto, o presente relatório provê uma célula hospedeira de levedura recombinante obtenível ou obtida pelo método descrito aqui.

[0009] De acordo com um quarto aspecto, o presente relatório provê um método para aumentar a produção de um produto de fermentação durante uma fermentação. De forma ampla, o método compreende a fermentação de um meio com pelo menos uma célula hospedeira de levedura recombinante tal como definida aqui. Em tal realização, o aumento na produção de um produto de fermentação pode ser observado quando se compara os resultados obtidos a partir de uma célula hospedeira de levedura recombinante não apresentando a segunda modificação genética descrita aqui. Em uma realização, o produto

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5/47 de fermentação é o etanol. Em ainda uma outra realização, o meio compreende amido (o qual pode estar, por exemplo, em uma forma gelatinizada ou bruta). Em ainda uma outra realização, o meio é derivado de milho. Em ainda uma outra realização, o meio compreende lignocelulose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0010] Tendo, desta forma, descrito genericamente a natureza da invenção, será feita agora referência aos desenhos anexos, que mostram como ilustração, uma realização preferida desta, e nos quais:

[0011] A Figura 1 compara curvas de crescimento de várias cepas de levedura (M2390: Δ; M4080 : X; M10156: O) na presença de 250 ppm de sulfito. Os resultados são mostrados como densidade ótica (medida a 600 nm) em função do tempo (horas). As diferentes cepas estão descritas na Tabela 1.

[0012] A Figura 2 compara as taxas de crescimento de várias cepas de levedura geneticamente engenheiradas para sobre-expressar diferentes polipeptídeos FZF1 e SSU1. Os resultados são providos como (MaxV log) em função das diferentes cepas/isolados testados (da esquerda para a direita M10156, M13565, T3206, T3207, T3208, T3209, T3210, T3211, T3212, T3213, T3214 e T3215). As diferentes cepas/isolados estão descritos na Tabela 1.

[0013] A Figura 3 compara o tempo de latência (tempo de início) expresso como a quantidade de tempo consumido por uma cepa para alcançar uma OD de 0,5 no ensaio. Os resultados são providos como tempo (hh:mm:ss) em função das diferentes cepas/isolados testados (da esquerda para a direita M10156, M13565, T3206, T3207, T3208, T3209, T3210, T3211, T3212, T3213, T3214 e T3215). As diferentes cepas/isolados estão descritos na Tabela 1.

[0014] As Figuras 4A a 4F comparam os perfis de crescimento das cepas (A) M14162, (Β) M14163, (C) M14164, (D) M14165, (E) M14166 e (F) M14167 (todas identificadas como O) com a cepa de referência M2390 (identificada como Δ). Os resultados são providos como a densidade ótica (medida a 600 nm (OD 600 nm)) em função do tempo (horas). As diferentes cepas estão descritas na Tabela 1.

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6/47 [0015] As Figuras 5A a 5F comparam os perfis de crescimento das cepas (A) M14168, (Β) M14169, (C) M14170, (D) M14171, (E) M14172 e (F) M14173 (todas identificadas como O) com a cepa de referência M4080 (identificada como Δ). Os resultados são providos como a densidade ótica (medida a 600 nm (OD 600 nm)) em função do tempo (horas). As diferentes cepas estão descritas na Tabela 1.

[0016] As Figuras 6A a 6F comparam os perfis de crescimento das cepas (A) M14174, (Β) M14175, (C) M14176, (D) M14177, (E) M14178 e (F) M14179 (todas identificadas como O) com a cepa de referência M10156 (identificada como Δ). Os resultados são providos como a densidade ótica (medida a 600 nm (OD 600 nm)) em função do tempo (horas). As diferentes cepas estão descritas na Tabela 1.

[0017] As Figuras 7A a 7D provêm um alinhamento dos aminoácidos de (A) Saccharomyces sp. FZF1 (S. cerevisiae corresponde à SEQ ID NO: 1, S. paradoxus corresponde à SEQ ID NO: 2, S. mikatae corresponde à SEQ ID NO: 3, S. uvarum corresponde à SEQ ID NO: 4, S. kudriazevi corresponde à SEQ ID NO: 5 e S. castelii corresponde à SEQ ID NO: 6); (B) polipeptideos codificado por fzf1 ortólogos (mesmos que no painel A, C. glabratra corresponde à SEQ ID NO: 21 e S. stipitis corresponde à SEQ ID NO: 22); (C) Saccharomyces sp. SSU1 (S. cerevisiae corresponde à SEQ ID NO: 7, S. paradoxus corresponde à SEQ ID NO: 8, S. mikatae corresponde à SEQ ID NO: 9, S. uvarum corresponde à SEQ ID NO: 10, S. kudriazevi corresponde à SEQ ID NO: 11 e S. castelii corresponde à SEQ ID NO: 12) e (D) polipeptideos codificados por ssu1 ortólogos (mesmos que no painel C, C. glabratra corresponde à SEQ ID NO: 24 e Z. bailii corresponde à SEQ ID NO: 25).

[0018] As Figuras 8A a 8D mostram o efeito da sobre-expressão de FZF1 ou SSU1 em um fundo de redução de glicerol. (A) Taxa de crescimentos de cepas M2390, M11240 e isolados A, B, C e D na ausência (barras cinza escuro) ou presença (barras cinza claro) de sulfito. Os resultados são mostrados como o MaxVIog em função da cepa/isolado testado. (B) Tempo de início (como

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7/47 medido como o tempo para alcançar OD 600 nm de 0,5) das cepas M2390, M11240 e isolados A, B, C e D na ausência (barras cinza escuro) ou presença (barras cinza claro) de sulfito. Os resultados são mostrados como tempo (hh:mm:ss) em função da cepa/isolado testado. (C) Curvas de crescimento de cepas M2390 (Δ), M11240 (·) e isolados M16063 (o) e M16064 (A). Os resultados são mostrados como OD a 600 nm em função do tempo (hh:mm:ss) e da cepa/isolado testado. (D) Curvas de crescimento das cepas M2390 (A), M11240 (·) e isolados M16065 (o) e M16066 (Δ). Os resultados são mostrados como OD a 600 nm em função do tempo (hh:mm:ss) e da cepa/isolado testado.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0019] O presente relatório refere-se ao uso de células hospedeiras de levedura recombinante capazes de exibir crescimento aumentado durante a fermentação, mesmo na presença de contaminantes tais como sulfitos. Conforme indicado no presente relatório, leveduras geneticamente modificadas são especialmente sensíveis a contaminação com sulfito (por exemplo, a um nível tão baixo quanto 50 ppm) o que pode reduzir sua velocidade de crescimento e, em algumas realizações, levar à fermentação travada. A célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório apresenta resistência aumentada (ou sensibilidade reduzida) a sulfitos e compreende uma modificação genética que permite a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo SSU1 e/ou uma modificação genética que permite a expressão de um polipeptídeo SSU1 heterólogo. A expressão aumentada do polipeptídeo SSU1 (seja indiretamente por meio de um fator de transcrição ou diretamente pela introdução de cópias do gene que codifica o polipeptídeo SSU1 heterólogo) é especialmente útil em células hospedeiras de levedura recombinante apresentando uma modificação genética para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam no sentido a produzir glicerol ou na regulação da síntese de glicerol e/ou uma modificação genética que permite a produção de uma glicoamilase

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8/47 heteróloga. A expressão amentada do polipeptídeo SSU1 pode, em algumas realizações, restaurar as propriedades de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante mesmo em altos níveis de contaminação com sulfito (por exemplo, 250 ppm).

Contaminação com sulfito durante a fermentação [0020] Sulfito pode ser adicionado, usualmente após a fermentação, a vários alimentos e bebidas fermentados (como vinho) para prevenir a oxidação. Sulfitos podem ser também utilizados como um depurador durante a fermentação para capturar compostos orgânicos voláteis e podem, pela mesma razão, causar contaminação por sulfito durante a fermentação. A contaminação com sulfito durante a fermentação pode retardar ou inibir o crescimento dos organismos fermentadores levando assim à fermentação travada, especialmente quando a fermentação ocorre sob condições anaeróbicas. Como mostrado na Figura 1, três cepas diferentes de S. cerevisiae foram cultivadas em um meio contendo 250 ppm de sulfito. A cepa do tipo selvagem (por exemplo, não geneticamente modificada) M2390 foi capaz de crescer (embora a uma taxa reduzida e com um período de latência maior, quando em comparação com uma cepa do tipo selvagem crescida na ausência de sulfito) e exibe proliferação na fase logarítmica (ver Δ na Figura 1). No entanto, as cepas geneticamente modificadas M4080 (por exemplo, expressando uma glicoamilase heteróloga, identificada como X na Figura 1) e M10156 (por exemplo, geneticamente engenheirada para reduzir sua produção de glicerol e expressando uma glicoamilase heteróloga, identificada como O na Figura 1) mal cresceram durante o período de 48 horas em que foram colocadas no meio contendo sulfito.

[0021] Desta forma, o presente relatório torna claro que pelo menos algumas células de hospedeiras de levedura geneticamente modificadas são particularmente susceptíveis à contaminação com sulfito durante a fermentação (a níveis tão baixos quanto 50 ppm) e que o aumento de suas resistências a sulfitos seria benéfico para restaurar suas propriedades de crescimento (tais

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9/47 como um aumento de suas taxas de crescimento, tempo de latência reduzido, seus crescimentos na fase prolongados, etc.).

Célula hospedeira de levedura recombinante [0022] O presente relatório diz respeito a células hospedeiras de levedura recombinante que foram geneticamente engenheiradas. Quando a modificação genética é direcionada para a redução ou inibição da expressão de um gene alvo específico (o qual é endógeno à célula hospedeira), as modificações genéticas podem ser feitas em uma ou ambas as cópias do(s) gene(s) alvo. Quando a modificação genética é direcionada para o aumento da expressão de um gene alvo específico (o qual é considerado heterólogo à célula hospedeira), a modificação genética pode ser feita em um ou múltiplos locais genéticos. No contexto do presente relatório, quando a célula de levedura recombinante é qualificada como sendo “geneticamente engenheirada”, deve ser entendido que isto significa que foi manipulada ou para se adicionar pelo menos um resíduo de ácido nucleico heterólogo ou exógeno e/ou remover pelo menos um resíduo de ácido nucleico endógeno (ou nativo). Em algumas realizações, o um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da célula hospedeira recombinante em si. Neste último cenário, o(s) resíduo(s) de ácido nucleico é (são) adicionado(s) em um local genômico que é diferente do local genômico nativo. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são os resultados de manipulações in vitro da levedura.

[0023] Quando expressos em células hospedeiras de levedura recombinante, os polipeptídeos descrito aqui são codificados em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogo. O termo “heterólogo” quando utilizado referente a uma molécula de ácido nucleico (tal como um promotor ou uma sequência de codificação) refere-se a uma molécula de ácido nucleico que não é encontrada de forma nativa na célula hospedeira recombinante. “Heterólogo” inclui também uma região de codificação nativa, ou parte desta, que é removida do organismo fonte e subsequentemente reintroduzida no organismo fonte em uma forma que

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10/47 é diferente do correspondente gene nativo, por exemplo, não em seu local natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é propositadamente introduzida na célula hospedeira recombinante. O termo “heterólogo” tal como utilizado aqui refere-se também a um elemento (ácido nucleico ou proteína) que é derivado de uma fonte outra que não a fonte endógena. Desta forma, por exemplo, um elemento heterólogo pode ser derivado de uma cepa diferente da célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo de taxonomia diferente (por exemplo, reino, filo, classe, ordem, família ou espécie diferente, ou qualquer subgrupo dentro de uma destas classificações). O termo heterólogo é também utilizado como sinônimo do termo “exógeno”.

[0024] Quando uma molécula de ácido nucleico heteróloga está presente na célula hospedeira recombinante, esta pode ser integrada no genoma da célula hospedeira. O termo “integrada” tal como utilizado aqui refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a com um vetor tal como um plasmídeo contido na célula hospedeira. Métodos para a integração de elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma de célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independente do genoma da levedura. Em tal realização, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e de auto replicação.

[0025] No contexto do presente relatório, a célula hospedeira recombinante é uma levedura. Células hospedeiras de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. Espécies de levedura adequadas podem incluir,

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11/47 por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas realizações, a levedura é selecionada do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolitica, Hansenula polimorpha, Phaffia rhodozyma, Candida util is, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polimorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma realização particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas realizações, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas realizações alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalga oleaginosa (por exemplo, por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas realizações, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[0026] Em algumas realizações, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células hospedeira recombinantes são otimizadas para códon em relação à célula hospedeira de levedura recombinante receptora pretendida. Conforme utilizado aqui o termo “região de codificação otimizada para códon” significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um dado organismo pela substituição de pelo menos um, ou mais de um, códon com um ou mais códons que são mais frequentemente utilizados nos genes deste organismo. Em geral, genes altamente expressos em um organismo são desviados na direção de códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes neste organismo. Uma medida deste desvio é o “índice de adaptação de códon” ou “CAI,” que mede a extensão na qual os códons

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12/47 utilizados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem mais frequentemente em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI de uma molécula de ácido nucleico heteróloga otimizada para códon descrita aqui corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0.

[0027] As moléculas de ácido nucleico heterólogas do presente relatório compreendem uma região de codificação para o polipeptídeo heterólogo. Uma “região de codificação” de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA que é transcrita e/ou traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. “Regiões reguladoras adequadas” refere-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências 5' não codificantes), dentro de, ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma região de codificação, e que influencia na transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou na tradução da região de codificação associada. Regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação de efetor e estrutura tronco-alça. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de partida no terminal 5' (amino) e um códon de interrupção de tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não está limitada a, regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintético ou moléculas de RNA. Se a região de codificação é destinada para expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e sequência de terminação de transcrição serão usualmente localizados em 3' à região de codificação. Em uma realização, a região de codificação pode ser chamada de um quadro de leitura aberto. “Quadro de leitura aberto é abreviado por ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, tal como uma ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeo.

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13/47 [0028] A molécula de ácido nucleicos descrita aqui pode compreender regiões de controle de transcrição e/ou de tradução. “Regiões de controle de transcrição e tradução” são regiões reguladoras de DNA, tais como promotores, amplificadores, terminadores, e semelhantes, que provêm a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, sinais de poliadenilação são regiões de controle.

[0029] A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser introduzida na célula hospedeira utilizando-se um vetor. Um “vetor,” por exemplo, um “plasmídeo”, “cosmídeo” ou “cromossomo artificial” (tal como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura refere-se a um elemento extra cromossômico e é usualmente na forma de uma molécula de DNA de fita dupla circular. Tais vetores podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração a genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, lineares, circulares, ou superenrolados, de um DNA ou RNA de fita única ou dupla, derivados de qualquer fonte, nos quais um número de sequências de nucleotídeos foi unido ou recombinado em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado juntamente com uma sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula.

[0030] Na molécula de ácido nucleico heteróloga descrita aqui, o promotor e a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo heterólogo são operacionalmente ligados entre si. No contexto do presente relatório, as expressões “operacionalmente ligados” ou ‘Operacionalmente associados” referem-se ao fato do promotor estar fisicamente associado a uma molécula de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo heterólogo de uma maneira que permite, sob certas condições, a expressão da proteína heteróloga a partir da molécula de ácido nucleico. Em uma realização, o promotor pode ser localizado a montante (5’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga. Em ainda uma outra realização, o promotor pode ser localizado a jusante (3’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga. No contexto do presente relatório, um ou mais de um

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14/47 promotor podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor é incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores é operacionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga. Os promotores podem ser localizados, em vista da molécula de ácido nucleico que codifica a proteína heteróloga, a montante, a jusante, bem como tanto a montante quanto a jusante.

[0031] “Promotor” se refere a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo “expressão,” conforme utilizado aqui, refere-se à transcrição senso e ao acúmulo estável (mRNA) da molécula de ácido nucleico heteróloga descrita aqui. Expressão pode se referir também à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou serem compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Deve ser entendido pelos técnicos no assunto que diferentes promotores podem direcionar a expressão em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria das células a um nível substancial similar são comumente chamados de “promotores constitutivos”. É adicionalmente reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem apresentar atividade promotora idêntica. Um promotor é geralmente ligado em seu terminal 3' pelo sítio de iniciação de transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários ao início da transcrição a níveis detectáveis acima do fundo. Dentro do promotor será encontrado um sítio de início de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por mapeamento com

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15/47 nuclease S1), bem como domínios de ligação a proteína (sequências consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.

[0032] O promotor pode ser heterólogo à molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo heterólogo. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa que é do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira recombinante. Em uma realização, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura e o polipeptídeo heterólogo é derivado de um gênero diferente do da célula hospedeira.

Primeira modificação genética [0033] A primeira modificação da célula hospedeira de levedura recombinante pode ser uma modificação genética levando à redução da produção, e em uma realização à inibição da produção, de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol. Conforme utilizado no contexto do presente relatório, a expressão “redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol” refere-se a uma modificação genética que limita ou impede a expressão de genes associados com um ou mais polipeptideos nativos (enzimas em algumas realizações) que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, quando em comparação com uma cepa de levedura correspondente que não contém a primeira modificação genética. Em alguns casos, a primeira modificação genética reduz, mas ainda permite a produção de um ou mais polipeptideos nativos que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol. Em outros casos, a primeira modificação genética inibe a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol. Em algumas realizações, as células hospedeiras de levedura recombinante contêm uma pluralidade de primeiras modificações genéticas, onde pelo menos uma reduz a produção de um ou mais polipeptideos nativos e pelo menos uma outra inibe a produção de um ou mais polipeptideos nativos. Conforme utilizado no contexto do presente relatório, a expressão “polipeptideos nativos que funcionam para

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16/47 produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol” refere-se a polipeptídeos que são encontrados endogenamente na célula hospedeira de levedura recombinante. Enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol incluem, mas não se limitam a, o polipeptídeo GPD1 e o polipeptídeo GPD2 (também chamados de GPD1 e GPD2, respectivamente) bem como os polipeptídeos GPP1 e GPP2 (também chamados de GPP1 e GPP2, respectivamente). Enzimas nativas que funcionam na regulação da síntese de glicerol incluem, mas não se limitam a, o polipeptídeo FPS1, bem como o polipeptídeo STL1. O polipeptídeo FPS1 é um exportador de glicerol e o polipeptídeo STL1 funciona no sentido a importar glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Seja pela redução seja pela inibição da expressão do polipeptídeo FPS1 e/ou aumento da expressão do polipeptídeo STL1, é possível se controlar, em alguma extensão, a síntese de glicerol. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta uma modificação genética em pelo menos um entre o gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1), o gene gpp2 (que codifica os polipeptídeo GPP2), o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou ortólogos destes. Em uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta uma modificação genética em pelo menos dois entre os gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1), o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2), o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou ortólogos destes. Em ainda uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta uma modificação genética em cada um dos gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2) e o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou ortólogos destes. Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinante contendo tal(is) modificação(ões) genética(s) que levam à redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou

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17/47 regular a síntese de glicerol são descritos no documento WO 2012/138942. Preferivelmente, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta uma modificação genética (tal como uma deleção ou inserção genéticas) apenas em uma enzima que funciona ara produzir glicerol, no gene gpd2, o que faria com que a célula hospedeira apresentasse um gene gpd2 inativado (“knocked-out). Em algumas realizações, a célula hospedeira de levedura recombinante pode apresentar uma modificação genética no gene gpd1, no gene gpd2 e no gene fps1 resultando no fato de uma célula hospedeira de levedura recombinante ser inativada para o gene gpd1, o gene gpd2 e o gene fps1. Em ainda uma outra realização (em combinação ou alternativa à “primeira” modificação genética descrita acima), a célula hospedeira de levedura recombinante pode apresentar uma modificação genética no gene stl1 (por exemplo, uma duplicação, por exemplo) para aumentar a expressão do polipeptídeo STL1. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante pode apresentar uma modificação genética nos genes gpd2.

[0034] Alternativamente ou em combinação, a primeira modificação genética pode permitir também a produção de uma glicoamilase heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar amidos extracelulares. Em adição à divagem das últimas ligações a(1- 4) glicosídicas na extremidade não redutora da amilose e amilopectina, produzindo glicose, a γ-amilase irá clivar ligações a(1-6) glicosídicas. A glicoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma realização, a proteína heteróloga é derivada de uma γ-amilase, tal como, por exemplo, a glicoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificada pelo gene glu 0111). O polipeptídeo GLU0111 inclui os seguintes aminoácidos (ou corresponde aos seguintes aminoácidos) os quais são associados com a atividade de glicoamilase e incluem, mas não se limitam a, aminoácidos localizados nas posições 41, 237, 470, 473, 479, 485, 487 da SEQ ID NO: 13. Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinante que apresentam tais primeiras modificações genéticas estão descritos no documento WO 2011/153516, bem como no

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18/47 documento WO/2017/037614, os quais são aqui incorporados em sua totalidade.

[0035] A glicoamilase heteróloga pode ser uma variante de uma glicoamilase conhecida, por exemplo, uma variante da glicoamilase heteróloga apresentando a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19. As variantes de glicoamilase apresentam pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as glicoamilases descritas aqui. Uma variante compreende pelo menos um aminoácido diferente quando em comparação com a sequência de aminoácidos da glicoamilase nativa. O termo “identidade percentual”, tal como conhecido na técnica, é uma relação entra duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, tal como determinado por comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente utilizando-se programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para se determinar a identidade são desenhados para fornecer a melhor combinação entre as sequências testadas. Os métodos para se determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os cálculos de alinhamentos de sequência e percentagem de identidade podem ser realizados utilizando-se o programa Megalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Alinhamentos múltiplos das sequências descritas aqui foram realizados utilizando-se o método de alinhamento Clustal (Higgins e Sharp

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19/47 (1989) CABIOS. 5:151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PEN ALT Y= 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares utilizando-se o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. As glicoamilases heterólogas variantes descritas aqui podem ser (i) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido conservado pode ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte ou (iii) uma na qual o polipeptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma na qual os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo.

[0036] Uma “variante” da glicoamilase pode ser uma variante conservative ou uma variante alélica. Conforme utilizado aqui, uma variante conservative refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas da glicoamilase. Uma substituição, inserção ou deleção é dita afetar adversamente a proteína quando a sequência alterada evita ou rompe uma função biológica associada com a glicoamilase (por exemplo, a hidrólise de amido). Por exemplo, a carga global, estrutura ou propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas da proteína podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas da glicoamilase.

[0037] A glicoamilase heteróloga pode ser um fragmento de uma glicoamilase conhecida ou fragmento de uma variante de uma glicoamilase conhecida (tal como, por exemplo, um fragmento da glicoamilase apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19). Os “fragmentos”

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20/47 de glicoamilase apresentam pelo menos 100, 200, 300, 400, 500 ou mais aminoácidos consecutivos da glicoamilase. UM fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido a menos quando em comparação com a sequência de aminoácidos da glicoamilase e possui ainda a atividade enzimática de glicoamilase completa. Em algumas realizações, os fragmentos das glicoamilases podem ser empregados para a produção da glicoamilase completa correspondente por síntese de peptideo. Desta forma, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de proteínas de comprimento total.

[0038] A molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a glicoamilase heteróloga, variante ou fragmento pode ser integrada no genoma da célula hospedeira de levedura. O termo “integrada”, tal como utilizado aqui, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a por um vetor tal como um plasmídeo contido na célula hospedeira. Os métodos para a integração de elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independente do genoma da levedura. Em tal realização, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e de auto replicação.

[0039] No contexto do presente relatório, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir pelo menos duas “primeiras” modificações genéticas, uma levando à redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol e uma outra levando à expressão de uma glicoamilase heteróloga. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode apresentar uma modificação genética no gene gpd2e expressar uma glicoamilase heteróloga. Está também

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21/47 contemplado o fato da célula hospedeira de levedura recombinante poder incluir uma única primeira modificação genética, ou para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol ou para a expressão de uma glicoamilase heteróloga. Segunda modificação genética [0040] A segunda modificação genética da célula hospedeira de levedura recombinante se destina a aumentar sua resistência (ou reduzir sua sensibilidade) a sulfitos. A contaminação com sulfito pode provocar uma taxa de crescimento reduzida a concentrações tão baixas quanto 50 ppm. Em algumas realizações, a segunda modificação genética da célula hospedeira de levedura recombinante aumenta a resistência (ou reduz sua sensibilidade) em concentrações tão altas quanto 250 ppm de sulfitos. Por exemplo, a segunda modificação genética pode ser feita para permitir a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo SSU1. Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “permitindo a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo SSLH” refere-se a uma modificação genética que aumenta a expressão de um ou mais genes que codificam fatores de transcrição capazes de aumentar a expressão de um polipeptídeo SSLI1 nativo ou heterólogo, quando em comparação com uma cepa de levedura correspondente que não apresenta a segunda modificação genética. Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “fator de transcrição que favorece a expressão de um polipeptídeo SSLH” refere-se a polipeptídeos capazes de se ligarem a (diretamente ou indiretamente) DNA e redirecionar o complexo de transcrição para aumentar a expressão do gene ssu1 (ou seu gene ortólogo) que codifica o polipeptídeo SSLH. Em algumas realizações, o fator de transcrição é capaz de se ligar ao promotor do gene que codifica o polipeptídeo SSLH. O fator de transcrição que favorece a expressão de um polipeptídeo SSLH pode ser, por exemplo, o polipeptídeo FZF1 codificado pelo gene fzf1 ou um gene ortólogo correspondente. A levedura hospedeira recombinante do presente relatório

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22/47 pode ser geneticamente engenheirada para expressar o polipeptídeo FZF1 como polipeptídeo nuclear (por exemplo, um polipeptídeo destinado a ser localizado no núcleo). O polipeptídeo FZF1 pode ser codificado, por exemplo, pelo Gene ID 852638 (S. cerevisiae), Gene ID 2888469 (Candida glabrata), Gene ID 11493991 (Naumovozyma dairenensis), Gene ID 5543723 (Vanderwaltozyma polispora), Gene ID 2896325 (Kluyveromyces lactis) ou Gene ID 396131 (Gallus gallus). Em uma realização, o polipeptídeo FZF1 (ou o gene que o codifica) é derivado do gênero Saccharomyces sp., tal como, por exemplo, S. cerevisae, S. paradoxus, S. mikatea, S. uvarum, S. kudriazeviou S. castelli. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 é derivado de S. paradoxus. Em uma realização, o polipeptídeo heterólogo FZF1 é derivado de Candida sp. (tal como, por exemplo, Candida glabra) ou Scheffersomyces sp. (tal como, por exemplo Scheffersomyces stipitis). Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 21 ou 22. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 2. Em ainda uma realização adicional, o polipeptídeo FZF1 é uma variante ou um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 21 ou

22. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo FZF1 é uma variante ou um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0041] A Figura 7A provê um alinhamento de aminoácido dos polipeptídeos FZF1 a partir de várias Saccharomyces sp. Em uma realização, os polipeptídeos heterólogos FZF1 apresentam a sequência consenso de aminoácidos mostrada na Figura 7A (correspondendo à SEQ ID NO: 20). Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo heterólogo FZF1 apresenta pelo menos uma das seguintes regiões correspondendo aos resíduos de aminoácido da sequência consenso (SEQ ID NO: 20): uma primeira região que vai do resíduo 24 a 115, uma segunda região que vai do resíduo 175 ao 213, uma terceira região que vai do resíduo 245 ao 265 e/ou uma quarta região que vai do resíduo 276 ao 337. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo

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23/47 heterólogo FZF1 apresenta pelo menos uma entre qualquer uma das seguintes regiões correspondendo aos resíduos de aminoácido da sequência consenso (SEQ ID NO: 20): uma primeira região que vai do resíduo 24 ao 115, uma segunda região que vai do resíduo 175 ao 213, uma terceira região que vai do resíduo 245 ao 265 e/ou uma quarta região que vai do resíduo 276 ao 337. Em ainda uma outra realização, o polipeptideo heterólogo FZF1 apresenta pelo menos três regiões entre qualquer uma das seguintes regiões correspondendo ao resíduo de aminoácido da sequência consenso (SEQ ID NO: 20): uma primeira região que vai do resíduo 24 ao 115, uma segunda região que vai do resíduo 175 ao 213, uma terceira região que vai do resíduo 245 ao 265 e/ou uma quarta região que vai do resíduo 276 ao 337. De acordo com ainda uma outra realização, o polipeptideo heterólogo FZF1 apresenta quatro das seguintes regiões correspondendo ao resíduo de aminoácido da sequência consenso (SEQ ID NO: 20): uma primeira região que vai do resíduo 24 ao 115, uma segunda região que vai do resíduo 175 ao 213, uma terceira região que vai do resíduo 245 ao 265 e/ou uma quarta região que vai do resíduo 276 ao 337. [0042] A Figura 7B provê um alinhamento de aminoácidos dos polipeptídeos FZF1 de várias Saccharomyces sp., bem como polipeptídeos codificados pelos fzf1 ortólogos. Em uma realização, o polipeptideo heterólogo FZF1 apresenta um aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7B.

[0043] Em um outro exemplo, a segunda modificação genética pode ser feita para permitir a expressão de um polipeptideo SSU1 heterólogo. Conforme utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “que permite a expressão de um polipeptideo SSU1 heterólogo” refere-se a uma modificação genética que provê ou aumenta a expressão do gene ssu1 (ou seu ortólogo correspondente) que codifica o polipeptideo SSU1, quando em comparação com uma cepa de levedura correspondente que não apresenta a segunda modificação genética. Em adição, o termo “polipeptideo SSU1” (que é também chamado de LPG16) é bomba de sulfito de membrana plasmática envolvida no metabolismo de sulfito. Mais especificamente, o polipeptideo SSU1 é requerido

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24/47 para o efluxo eficiente de sulfito. A levedura hospedeira recombinante do presente relatório pode ser geneticamente engenheirada para expressar o polipeptídeo SSU1 como uma proteína da membrana plasmática. O polipeptídeo SSU1 pode ser codificado, por exemplo, pelo Gene ID 856013 (S. cerevisiae), Gene ID 2894347 (Kluyveromyces lactis), Gene ID 2541392 (Schizosaccharomyces pombe) ou Gene ID 30035373 (Sugiyamaella lignohabitans). O SSU1 heterólogo pode ser derivado do gênero Saccharomyces e, em alguns casos, da espécie S. cerevisae, S. paradoxus, S. mikatea, S. uvarum, S. kudriazevi ou S. castelli. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 pode ser derivado de S. paradoxus. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24 ou 25. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em ainda uma realização adicional, o polipeptídeo SSU1 é uma variante ou um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24 ou 25. Em ainda uma realização adicional, o polipeptídeo SSU1 é uma variante ou um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[0044] A Figura 7C provê um alinhamento de aminoácidos dos polipeptídeos SSLHs de várias Saccharomyces sp. Em uma realização, os polipeptídeos SSU1 heterólogos apresentam a sequência consenso de aminoácidos mostrada na Figura 7C (correspondendo à SEQ ID NO: 23). Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta pelo menos uma das seguintes regiões correspondendo aos resíduos de aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7C (SEQ ID NO: 23): uma primeira região que vai do resíduo 12 ao 114, uma segunda região que vai do resíduo 120 ao 338, uma terceira região que vai do resíduo 346 ao 415, uma quarta região que vai do resíduo 420 ao 431 e/ou uma quinta região que vai do resíduo 439 ao 463. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta pelo menos uma entre qualquer uma das seguintes regiões correspondendo aos

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25/47 resíduos de aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7C (SEQ ID NO: 23): uma primeira região que vai do resíduo 12 ao 114, uma segunda região que vai do resíduo 120 ao 338, uma terceira região que vai do resíduo 346 ao 415, uma quarta região que vai do resíduo 420 ao 431 e/ou uma quinta região que vai do resíduo 439 ao 463. Em ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta pelo menos três regiões de qualquer uma das seguintes regiões correspondendo ao resíduo de aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7C (SEQ ID NO: 23): uma primeira região que vai do resíduo 12 ao 114, uma segunda região que vai do resíduo 120 ao 338, uma terceira região que vai do resíduo 346 ao 415, uma quarta região que vai do resíduo 420 ao 431 e/ou uma quinta região que vai do resíduo 439 ao 463. De acordo com ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta pelo menos quatro regiões de qualquer uma das seguintes regiões correspondendo ao resíduo de aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7C (SEQ ID NO: 23): uma primeira região que vai do resíduo 12 ao 114, uma segunda região que vai do resíduo 120 ao 338, uma terceira região que vai do resíduo 346 ao 415, uma quarta região que vai do resíduo 420 ao 431 e/ou uma quinta região que vai do resíduo 439 ao 463. De acordo com ainda uma outra realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta as cinco seguintes regiões correspondendo aos resíduos de aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7C (SEQ ID NO: 23): uma primeira região que vai do resíduo 12 ao 114, uma segunda região que vai do resíduo 120 ao 338, uma terceira região que vai do resíduo 346 ao 415, uma quarta região que vai do resíduo 420 ao 431 e/ou uma quinta região que vai do resíduo 439 ao 463.

[0045] A Figura 7D provê um alinhamento de aminoácidos dos polipeptídeos SSU1 de várias Saccharomyces sp., bem como de polipeptídeos codificado pelos ssu1 ortólogos. Em uma realização, o polipeptídeo SSU1 heterólogo apresenta o aminoácido da sequência consenso mostrada na Figura 7D.

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26/47 [0046] Os polipeptídeo heterólogos FZF1 e SSU1 que podem ser expressos pela célula hospedeira de levedura recombinante podem ser providos a partir de qualquer organismo heterólogo. O termo “heterólogo”, quando utilizado em referência a uma molécula de ácido nucleico, (tal como um promotor ou uma sequência de codificação), refere-se a um ácido nucleico que não é encontrado de forma nativa na levedura hospedeira. “Heterólogo” inclui também uma região de codificação nativa ou parte desta, que é removida do organismo fonte e subsequentemente reintroduzida no organismo fonte em uma forma que é diferente da do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. No contexto do presente relatório, a molécula de ácido nucleico heteróloga é propositadamente introduzida na levedura. Uma molécula de ácido nucleico “heteróloga” pode ser derivada de qualquer fonte, por exemplo, eucariotos (leveduras, plantas, animais), procariotos (bactérias), vírus, etc. Em uma realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser derivada de um eucarioto (tal como, por exemplo, uma outra levedura) ou um procarioto (tal como, por exemplo, uma bactéria). O termo “heterólogo”, tal como utilizado aqui, refere-se a um elemento (ácido nucleico ou proteína) que é derivado de uma fonte outra que não a fonte endógena. Desta forma, por exemplo, um elemento heterólogo pode ser derivado de uma cepa diferente da célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferentes (por exemplo, reino, filo, classe, ordem, família, gênero ou espécie diferente, ou qualquer subgrupo dentro de uma destas classificações). O termo heterólogo é utilizado também como sinônimo aqui do termo “exógeno”.

[0047] Os polipeptídeos FZF1 e SSU1 heterólogos podem ser uma variante de um polipeptídeo FZF1 ou SSU1 conhecido, por exemplo, uma variante dos polipeptídeos apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 21, 22, 24 ou 25. As variantes de polipeptídeo apresentam pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os polipeptídeo FZF1 e SSU1

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27/47 descritos aqui. Uma variante compreende pelo menos um aminoácido diferente quando em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo FZF1 ou SSU1 nativo. O termo “percentagem de identidade”, tal como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, tal como determinada pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado de forma convencional utilizando-se programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para a determinação da identidade são desenhados para fornecer a melhor combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os alinhamentos de sequência e cálculos da identidade percentual podem ser realizados utilizandose o programa Megalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Alinhamentos múltiplos das sequências descritas aqui foram realizados utilizando-se o método de alinhamento Clustal (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PEN ALT Y= 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares do método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.

[0048] As variantes dos polipeptídeos FZF1 e SSU1 heterólogos descritas aqui podem ser (i) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado

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28/47 (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser codificado pelo código genético, ou (ii) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte, ou (iii) uma na qual o polipeptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma na qual os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo madura para purificação do polipeptídeo.

[0049] Uma “variante” dos polipeptideos FZF1 ou SSU1 pode ser uma variante conservative ou uma variante alélica. Conforme utilizado aqui, uma variante conservative refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas dos polipeptideos FZF1 (fator de transcrição capaz de favorecer a expressão do polipeptídeo SSU1) ou SSU1 (bomba de efluxo de sulfito). Uma substituição, inserção ou deleção é dita afetar adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou rompe uma função biológica associada com o polipeptídeo FZF1 ou SSU1. Por exemplo, a carga global, estrutura ou propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas da proteína podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas do polipeptídeo FZF1 ou SSU1.

[0050] Os polipeptideos FZF1 e SSU1 heterólogos podem ser um fragmento de um polipeptídeo FZF1 ou SSU1 conhecido ou fragmento de uma variante de um polipeptídeo FZF1 ou SSU1 conhecido (tal como, por exemplo, um fragmento do polipeptídeo FZF1 ou SSU1 apresentando a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 21,22, 24 ou 25). Os “fragmentos” de FZF1 apresentam pelo menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 ou 220 ou mais resíduos de aminoácidos consecutivos do polipeptídeo FZF1. Os “fragmentos” de SSU1 apresentam pelo menos 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou mais resíduos de aminoácido consecutivos do polipeptídeo SSU1. Um fragmento

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29/47 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido a menos quando em comparação com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo FZF1 ou SSU1 e ainda possuir a atividade biológica do polipeptídeo FZF1 ou SSU1 completo. Em algumas realizações, os fragmentos dos polipeptideos FZF1 ou SSU1 podem ser empregados para a produção dos correspondentes polipeptideos FZF1 ou SSLHs completos por síntese de peptídeo. Desta forma, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção das proteínas completas.

[0051] A molécula de ácido nucléico heteróloga que codifica o polipeptideos FZF1 e SSU1 heterólogos, variante ou fragmento, pode ser integrada no genoma da célula hospedeira de levedura. O termo “integrado”, tal como utilizado aqui, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados no cromossomo da célula hospedeira em oposição a em um vetor tal como uma plasmídeo contido na célula hospedeira. Os métodos para a integração dos elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucléico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico heteróloga pode ser de replicação independente do genoma da levedura. Em tal realização, a molécula de ácido nucléico pode ser estável e de auto replicação.

[0052] O presente relatório provê também moléculas de ácido nucleicos para a modificação da célula hospedeira de levedura d forma a permitir a expressão dos polipeptideos FZF1 e/ou SSU1 heterólogos, variantes ou fragmentos. O molécula de ácido nucléico pode ser DNA (tal como DNA complementar, DNA sintético ou DNA genômico) ou RNA (que inclui RNA sintético) e pode ser provida em uma forma em fita única (em uma fita senso ou antissenso) ou em uma fita dupla. As moléculas de ácido nucleicos contempladas podem incluir alterações nas regiões de codificação, regiões de não codificação, ou ambas.

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Exemplos são variantes de moléculas de ácido nucleico contendo alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas que não alteram as propriedades ou atividades dos polipeptideos FZF1 e/ou SSU1 codificados, variantes ou fragmentos.

[0053] O presente relatório provê também moléculas de ácido nucleico que são capazes de hibridização às moléculas de ácido nucleico complementares que codificam os polipeptideos heterólogos, bem como variantes ou fragmentos. Uma molécula de ácido nucleico é “capaz de hibridização” a uma outra molécula de ácido nucleico, tal como um cDNA, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma em fita simples da molécula de ácido nucleico pode anelar à outra molécula de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e potencial iônico em solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o Capítulo 11 e Tabela 11,1 neste. As condições de temperatura e potencial iônico determinam o “rigor” da hibridização. As condições de rigor podem ser ajustadas para pesquisar por fragmentos moderadamente similares, tal como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, tal como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos proximamente relacionados. Lavagens após a hibridização determinam as condições de rigor. Um conjunto de condições utiliza uma série de lavagens iniciando com 6X SSC, 0,5% SDS à temperatura ambiente por 15 min, então repetida com 2X SSC, 0,5% SDS a 45°C por 30 min, e então repetida duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50°C por 30 min. Para condições mais rigorosas, as lavagens foram realizadas a temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idênticas às acima exceto para a temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0,2X SSC, 0,5% SDS que foram aumentadas para 60°C. Um outro conjunto de condições rigorosas utiliza duas lavagens finais em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C. Um

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31/47 conjunto adicional de condições altamente rigorosas é definido pela hibridização a 0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C e lavado com 2X SSC, 0,1% SDS seguido de 0,1XSSC, 0,1% SDS.

[0054] A hibridização requer que as duas molécula de ácido nucleico contenham sequência complementares, embora dependendo do rigor da hibridização, não combinações entre bases sejam possíveis. O rigor apropriado para a hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementaridade, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para os híbridos dos ácidos nucleicos apresentando estas sequências. A estabilidade relativa (correspondendo a um Tm mais alto) das hibridizações de ácido nucleico se reduz na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações para o cálculo de Tm. Para hibridizações com menos ácidos nucleicos, isto é, oligonucleotídeos, a posição das não combinações se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade. Em uma realização, o comprimento para um ácido nucleico capaz de hibridização é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preferivelmente um comprimento mínimo para um ácido nucleico capaz de hibridização é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; e o mais preferido sendo o comprimento de pelo menos 30 nucleotídeos. Além disto, o técnico no assunto irá reconhecer que a temperatura e a concentração da solução do sal de lavagem podem ser ajustadas de acordo com fatores tais como comprimento da sonda.

[0055] As moléculas de ácidos nucleicos do presente relatório podem compreender uma região de codificação para os polipeptídeos FZF1 e/ou SSU1 heterólogos, bem como suas variantes e fragmentos. Uma “região de codificação” de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA que é transcrita e/ou traduzida em um polipeptideo em uma célula in vitro ou in vivo quando

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32/47 colocada sob controle de sequências reguladoras apropriadas. “Regiões reguladoras adequadas” refere-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3j de uma região de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da região de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, sítios de processamento de RNA, sítio de ligação a efetor e estrutura tronco-alça. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de partida no terminal 5' (amino) e um códon de interrupção de tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não está limitada a, regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintético, ou moléculas de RNA. Se a região de codificação for destinada para a expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e sequência de terminação de transcrição serão usualmente localizados em 3' em relação à região de codificação. Em uma realização, a região de codificação pode ser chamada de um quadro de leitura aberto. “Quadro de leitura aberto é abreviado por ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeo.

[0056] As moléculas de ácidos nucleicos descritas aqui podem compreender regiões de controle de transcrição e/ou de tradução. “Regiões de controle de transcrição e/ou de tradução” são regiões reguladoras de DNA, tais como promotores, amplificadores, terminadores, e semelhantes, que provêm a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.

[0057] O promotor pode ser heterólogo à molécula de ácido nucleico que codifica a proteína heteróloga. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa que é do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura

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33/47 recombinante. Em uma realização, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura e a proteína heteróloga é derivada de um gênero diferente do da célula hospedeira de levedura.

[0058] No contexto do presente relatório, o promotor que controla a expressão dos polipeptídeos FZF1 e/ou SSU1 heterólogos pode ser um promotor constitutivo (tal como, por exemplo, tef2p (por exemplo, o promotor do gene tef2), cwp2p (por exemplo, o promotor do gene cwp2), ssalp (por exemplo, o promotor do gene ssa1), enolp (por exemplo, o promotor do gene eno1) e pgklp (por exemplo, o promotor do gene pgk1). No entanto, em algumas realizações, é preferível limitar a expressão dos polipeptídeos FZF1 e/ou SSLHs quando ocorre contaminação com sulfito ou é muito provável de estar presente. Como tal, o promotor que controla a expressão dos polipeptídeos FZF1 e/ou SSU1 heterólogos pode ser um promotor induzível tal como, por exemplo, um promotor regulado por glicose (por exemplo, o promotor do gene hxt7 (chamado de hxt7p)) ou um promotor regulado por sulfito (por exemplo, o promotor do gene gpd2 (chamado de gpd2p ou o promotor do gene fzf1 (chamado de fzf1 p)), o promotor do gene ssu1 (chamado de ssulp), o promotor do gene ssu1-r (chamado de ssur1-rp e descrito em Nardi et al., 2010)). Em uma realização, o promotor utilizado para permitir a expressão dos polipeptídeos heterólogos é selecionado do grupo consistindo em gpd2p e ssu1-rp. Um ou mais promotores podem ser utilizados para permitir a expressão de cada um dos polipeptídeo heterólogos na célula hospedeira de levedura recombinante. O(s) promotor(es) que regula(m) a expressão do polipeptídeo heterólogo FZF1 pode(m) ser o(s) mesmo(s) ou diferente(s) do(s) promotor(es) que regula(m) a expressão do polipeptídeo SSU1 heterólogo. Em uma realização, o promotor que pode ser utilizado para permitir a expressão dos polipeptídeos FZF1 e/ou SSU1 exclui promotores regulados anaeróbicos, tal como, por exemplo tdhlp (por exemplo, o promotor do gene tdh1), pau5p (por exemplo, o promotor do gene pau5), hor7p (por exemplo, o promotor do gene hor7), adhlp (por exemplo, o promotor do gene adh1), tdh2p (por

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34/47 exemplo, o promotor do gene tdh2), tdh3p (por exemplo, o promotor do gene tdh3), gpdlp (por exemplo, o promotor do gene gdp1), cdc19p (por exemplo, o promotor do gene cdc19), eno2p (por exemplo, o promotor do gene eno2), pddp (por exemplo, o promotor do gene pdd), hxt3p (por exemplo, o promotor do gene hxt31) e tpilp (por exemplo, o promotor do gene tpi1).

Modificações genéticas adicionais [0059] Em alguns casos, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir uma modificação genética adicional para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar (quebrar) formato. Conforme utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “polipeptídeos nativos que funcionam para catabolizar formato” refere-se a polipeptídeos que são encontrados de forma endógena na célula hospedeira de levedura recombinante. Enzimas nativas que funcionam para catabolizar formato, mas não se limitam a, são os polipeptídeos FDH1 e FDH2 (também chamados de FDH1 e FDH2, respectivamente). Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante contém uma modificação genética em pelo menos um entre o gene fdh1 (que codifica o polipeptídeo FDH1), o gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou ortólogos destes. Em uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante contém modificações genéticas tanto no gene fdh1 (que codifica o polipeptídeo FDH1) quanto no gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou ortólogos destes. Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinante contendo tal(is) modificação(ões) genética(s) que leva(m) à redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formato são descritas no documento WO 2012/138942. Preferivelmente, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta modificações genéticas (tais como uma deleção ou inserção genética) no gene fdh1 e no gene fdh2 o que podería provocar a inativação dos genes fdh1 e fdh2na célula hospedeira.

[0060] Em algumas realizações, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir uma modificação genética adicional para aumentar a produção de

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35/47 uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar (formar) formato. Conforme utilizado no contexto do presente relatório, “uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar formato” refere-se a polipeptídeos que podem ou não ser encontrados de forma endógena na célula hospedeira de levedura recombinante e que são propositalmente introduzidos nas células hospedeiras de levedura recombinante. Em algumas realizações, a enzima heteróloga que funciona para anabolizar formato é uma piruvato formato liase (PFL) heteróloga, uma acetaldeído desidrogenase heterólogo, uma álcool desidrogenase heterólogo, e/ou acetilaldeído/álcool desidrogenases heterólogas (AADH) bifuncionais, tais como as descritas na patente US 8.956.851 e documento WO 2015/023989. Mais especificamente, as enzimas PFL e AADH para uso nas células hospedeiras de levedura recombinante podem ser provenientes de uma fonte bacteriana ou eucariótica. A PFL heteróloga do presente relatório inclui, mas não se limita a, o polipeptídeo PFLA, um polipeptídeo codificado por um gene pfla ortólogo, o polipeptídeo PFLB ou um polipeptídeo codificado por um gene pflb ortólogo. As AADHs heterólogas do presente relatório incluem, mas não se limitam a, os polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um gene adhe ortólogo. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório compreende pelo menos uma das seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório compreende pelo menos duas das seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório compreende as seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e o polipeptídeo ADHE.

[0061] A célula hospedeira de levedura recombinante pode ser adicionalmente geneticamente modificada para permitir a produção de proteínas heterólogas

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36/47 adicionais. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser utilizada para a produção de uma enzima, e especialmente uma enzima envolvida na divagem ou hidrólise de seu substrato (por exemplo, uma enzima lítica e, em algumas realizações, uma enzima sacarolítica). Em ainda uma outra realização, a enzima pode ser uma glicosídeo hidrolase. No contexto do presente relatório, o termo “glicosídeo hidrolase” refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e aminolíticas, inulinases, levanases, trealases, pectinases, e enzimas que utilizam o açúcar pentose. Em uma outra realização, a enzima pode ser uma protease. No contexto do presente relatório, o termo “protease” refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de proteína. Em ainda uma outra realização, a enzima pode ser uma esterase. No contexto do presente relatório, o termo “esterase” refere-se a uma enzima envolvida na hidrólise de um éster de um ácido ou um álcool, incluindo fosfatases tais como fitases.

[0062] A proteína heteróloga adicional pode ser uma “enzima aminolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise por amilase. O termo “amilase” refere-se a uma enzima que quebra amido em açúcar. Todas as amilases são glicosídeo hidrolases e atuam sobre asa ligações a-1,4glicosídicas. Algumas amilases, tal como a γ-amilase (glicoamilase), atuam também sobre ligações a-1,6-glicosídicas. As enzimas amilases incluem aamilase (EC 3,2,1,1), β-amilase (EC 3,2,1,2), e γ-amilase (EC 3,2,1,3). As αamilases são metaloenzimas de cálcio, incapazes de funcionar na ausência de cálcio. Pela ação em locais randômicos ao longo da cadeia de amido, a aamilase quebra cadeias longas de carboidrato, produzindo, em última análise, maltotriose e maltose a partir de amilose, ou maltose, glicose e “dextrina limite” a partir de amilopectina. Tendo em vista que pode agir em qualquer parte no substrato, a α-amilase tende a ser de ação mais rápida que a β-amilase. Em uma realização, a proteína heteróloga é derivada de uma α-amilase tal como, por exemplo, de α-amilase de Bacillus amyloliquefacens. Uma outra forma de

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37/47 amilase, a β-amilase é também sintetizada por bactérias, fungos e plantas. Trabalhando a partir da extremidade não redutora, a β-amilase catalisa a hidrólise da segunda ligação a-1,4 glicosídica, clivando duas unidades de glicose (maltose) ao mesmo tempo. Uma outra enzima aminolítica é a aglicosidase que atua sobre a maltose e outros malto-oligossacarídeos curtos produzidos por α-, β-, e γ-amilases, os convertendo a glicose. Uma outra enzima aminolótica é a pululanase. A pululanase é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima aminolítica, que degrada pululana. A pululana é encarada como uma cadeia de unidades de maltotriose ligadas por ligações alfa-1,6-glicosídicas. A pululanase (EC 3,2,1,41) é também conhecida como pululan-6-glucanoidrolase (enzima de rompimento de ramificação). Uma outra enzima aminolítica, a isopululanase, hidrolisa pululana a isopanose (6-alfamaltosilglicose). A isopululanase (EC 3,2,1,57) é também conhecida como pululan-4-glucanohidrolase. Uma “amilase” pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise por amilase, incluindo aamilase, β-amilase, glicoamilase, pululanase, isopululanase, e alfa-glicosidase. [0063] A proteína heteróloga adicional pode ser uma “enzima celulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de celulose. O termo “celulase” refere-se a uma classe de enzimas que catalisa a celulólise (isto é, a hidrólise) de celulose. Vários tipos diferentes de celulases são conhecidos, os quais diferem estruturalmente e mecanicamente. Existem tipos gerais de celulases baseados no tipo de reação catalisada: a endocelulase quebra ligações internas de maneira a romper a estrutura cristalina da celulose e expor cadeias polissacarídicas individuais; a exocelulase cliva unidades 2-4 das extremidades das cadeias expostas produzidas pela endocelulase, resultando em tetrassacarídeos ou dissacarídeos tais como celobiose. Existem dois tipos principais de exocelulases (ou celobiohidrolases, abreviados como CBH) - um tipo trabalhando processualmente a partir da extremidade redutora, e um tipo trabalhando processualmente a partir da extremidade não redutora da celulose; celobiase ou beta-glicosidase hidrolisa o produto da exocelulase em

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38/47 monossacarídeos individuais; celulases oxidantes que despolimerizam a celulose por reações radicais, como, por exemplo, a celobiose desidrogenase (aceptor); as celulose fosforilases que despolimerizam a celulose utilizando fosfatos em vez de água. No caso mais familiar da atividade da celulase, o complexo enzimático quebra a celulose a beta-glicose. Uma “celulase” pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de celulose, incluindo uma proteína endoglucanase, glicosidase, celobiohidrolase, xilanase, glucanase, xilosidase, xilano esterase, arabinofuranosidase, galactosidase, celobiose fosforilase, celodextrino fosforilase, mananase, manosidase, xiloglucanase, endoxilanase, glucuronidase, acetilxilanesterase, arabinofuranohidrolase, swollenin, glucuronil esterase, expansina, pectinase, e feruoil esterase.

[0064] A proteína heteróloga adicional pode apresentar “atividade hemicelulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de hemicelulose. O termo “hemicelulase” refere-se a uma classe de enzimas que catalisa a hidrólise de celulose. Vários tipos diferentes de enzimas são conhecidos por apresentarem atividade hemicelulolítica incluindo, mas não se limitando a, xilanases e mananases.

[0065] A proteína heteróloga adicional pode apresentar “atividade xilanolítica”, uma enzima apresentando a capacidade de hidrolisar ligações glicosídicas em oligopentoses e polipentoses. O termo “xilanase” é o nome dado a uma classe de enzimas que degrada o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, desta forma, quebrando a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares vegetais. As xilanases incluem aquelas enzimas que correspondem à Enzyme Commission Number 3,2,1,8. A proteína heteróloga pode ser também uma “enzima que metaboliza xilose”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de xilose, incluindo uma xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase, e uma xilose transaldolase. Uma “enzima que utiliza o açúcar pentose” pode ser qualquer

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39/47 enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise do açúcar pentose, incluindo xilanase, arabinase, arabinoxilanase, arabinosidase, arabinofuranosidase, arabinoxilanase, arabinosidase e arabinofuranosidase, arabinose isomerase, ribulose-5-fosfato 4-epimerase, xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase e/ou xilose transaldolase.

[0066] A proteína heteróloga adicional pode apresentar “atividade sobre manose”, uma enzima apresentando a capacidade de hidrolisar os resíduos terminais não redutores β-D-manose em β-D-manosídeos. As mananases são capazes de quebrar hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares vegetais. As xilanases incluem aquelas enzimas que correspondem ao Enzyme Commission Number 3,2,25.

[0067] A proteína heteróloga adicional pode ser uma “pectinase”, uma enzima, tal como pectoliase, pectozima e poligalacturonase, comumente referidas em cervejaria como enzimas pécticas. Estas enzimas quebram pectina, um substrato polissacarídico que é encontrado nas paredes celulares de plantas.

[0068] A proteína heteróloga adicional pode apresentar “atividade fitolítica”, uma enzima que catalisa a conversão de ácido fítico em fósforo inorgânico. As fitases (EC 3,2,3) podem pertencer às histidino ácido fosfatases, β-propeler fitases, ácido púrpuro fosfastases ou a família de fitases semelhante à proteína tirosino fosfatase.

[0069] A proteína heteróloga adicional pode apresentar “atividade proteolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de proteína, incluindo serino proteases, treonino proteases, cisteíno proteases, aspartato proteases, ácido glutâmico proteases e metaloproteases.

[0070] Quando a célula hospedeira de levedura recombinante expressa uma proteína heteróloga, pode ser adicionalmente modificada para aumentar a robustez a temperaturas altas. Modificações genéticas para aumentar a robustez de uma célula hospedeira de levedura recombinante geneticamente modificada são descritas no documento WO 2017/037614.

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Métodos de utilização da célula hospedeira de levedura recombinante [0071] As modificações genéticas que permitem a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptídeo SSU1 e/ou permite a expressão de um polipeptídeo SSU1 heterólogo podem ser utilizadas para aumentar uma propriedade de crescimento de uma célula hospedeira de levedura recombinante. Por exemplo, o fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão do polipeptídeo SSU1 e/ou SSU1 heterólogo pode ser utilizado para aumentar a taxa de crescimento (por exemplo, a taxa na qual a célula hospedeira de levedura recombinante completa um ciclo celular) e/ou reduzir o período de latência (por exemplo, o tempo a partir do início da cultura até o início da fase logarítmica de crescimento) do crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante na presença de sulfitos. O fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão do polipeptídeo SSU1 e/ou SSU1 heterólogo pode ser expresso, por exemplo, em uma célula hospedeira de levedura recombinante apresentando a modificação genética pra reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol e/ou uma modificação genética que permite a produção de uma glicoamilase heteróloga.

[0072] Tendo em vista que o fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão do polipeptídeo SSU1 e/ou SSU1 heterólogo aumenta as propriedades de crescimento das células hospedeiras de levedura recombinante na presença de sulfitos, este pode ser utilizado para aumentar a produção de um produto de fermentação (tal como etanol) durante a fermentação. Em tal realização, o meio de fermentação (também chamado de um substrato) é susceptível a ser contaminado com sulfitos ou já compreende sulfitos. O método compreende a combinação de um meio de fermentação com as células hospedeiras de levedura recombinante. Em uma realização, a fermentação é conduzida sob condições anaeróbicas e em ainda realizações adicionais, em condições anaeróbicas totais. Em uma realização, o substrato a ser hidrolisado é uma biomassa lignocelulósica (por exemplo, um meio

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41/47 compreendendo lignocelulose) e, em algumas realizações, compreende amido (em uma forma gelatinizada ou bruta). Em outras realizações, o substrato a ser hidrolisado compreende maltodextrina. Em algumas circunstâncias, pode ser aconselhável suplementar o meio com uma ou mais enzimas sacarolíticas na forma purificada.

[0073] A produção de etanol pode ser realizada a temperaturas de pelo menos cerca de 25°C, cerca de 28°C, cerca de 30°C, cerca de 31 °C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41 °C, cerca de 42°C, ou cerca de 50°C. Em algumas realizações, quando é utilizada uma célula de levedura termotolerante no processo, o processo pode ser conduzido a temperaturas acima de cerca de 30°C, cerca de 31 °C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41 °C, cerca de 42°C, ou cerca de 50°C.

[0074] Em algumas realizações, o processo pode ser utilizado para produzir etanol a uma taxa particular. Por exemplo, em algumas realizações, o etanol é produzido a uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro.

[0075] A produção de etanol pode ser medida utilizando-se qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras da fermentação pode ser avaliada utilizando-se análise HPLC. Muitos kits de

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42/47 ensaio de etanol estão comercialmente disponíveis que utilizam, por exemplo, ensaios a base da enzima álcool oxidase.

[0076] A presente invenção será mais facilmente entendida por referência aos exemplos a seguir os quais são fornecidos para ilustrar a invenção e não para limitar seu escopo.

EXEMPLO I - DESCRIÇÃO DAS CEPAS DE SACCHAROMYCES

CEREVISIAE E METODOLOGIA UTILIZADA

Designação	Gene desativado	Gene sobre-expresso / promotor de S. cerevisiae utilizado
M2390 (tipo selvagem)	Nenhum	Nenhum
M10156	Agpd2 Afdhl Afdh2 Afcyl	gene que codifica MP775 (SEQ ID NO: 17) gene que codifica MP9 (SEQ ID NO: 13) pfla pflb adhe
M4080	Afcyl	gene que codifica MP9 (SEQ ID NO: 13)
M11240	Agpdl Agpd2 Afdhl Afdh2	pfla pflb adhe
M16063	Mesmo de M11240	Mesmo de M11240 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor TDH1 (tdhlp)
M16064	Mesmo de M11240	Mesmo de M11240 e S. paradoxus SSU1 (SEQ ID NO: 8) sob o controle do promotor TDH1 (tdhlp)
M16065	Mesmo de M11240	Mesmo de M11240 e S. cerevisiae FZF1 (SEQ ID NO: 1) sob o controle do promotor TDH1 (tdhlp)
M16066	Mesmo de M11240	Mesmo de M11240 e sob o controle do promotor TDH1 (tdhlp)

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Designação	Gene desativado	Gene sobre-expresso / promotor de S. cerevisiae utilizado
M13565	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. cerevisiae FZF1 (SEQ ID NO: 1) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3206	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3207	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. mikatae FZF1 (SEQ ID NO: 3) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3208	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. uvarum FZF1 (SEQ ID NO: 4) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3209	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. kudrázev/FZF1 (SEQ ID NO: 5) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3210	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. castellii FZF1 (SEQ ID NO: 6) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3211	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus SSU1 (SEQ ID NO: 8) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3212	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. mikatae SSU1 (SEQ ID NO: 9) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3213	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. uvarum SSU1 (SEQ ID NO: 10) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3214	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. kudriazeviSSU1 (SEQ ID NO:11) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
T3215	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 S. castelliiSSU1 (SEQ ID NO: 12) sob o controle do promotor HOR7 (hor7p)
M14162	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob

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Designação	Gene desativado	Gene sobre-expresso / promotor de S. cerevisiae utilizado
		o controle do promotor PAU5 (PAU5p)
M14163	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor FZF1 (fzf11p)
M14164	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1 (ssu1 p)
M14165	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor HXT7 (htx7p)
M14166	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor GPD2 (gpd2p)
M14167	Nenhum	S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1-R (como descrito em Nardi et al.)
M14168	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor PAU5 (pau5p)
M14169	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor FZF1 (fzflp)
M14170	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1 (ssu1 p)
M14171	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor HXT7 (htx7p)
M14172	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do GPD2 promotor (gpd2p)
M14173	Mesmo de M4080	Mesmo de M4080 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1-R (como descrito em Nardi et al.)

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Designação	Gene desativado	Gene sobre-expresso / promotor de S. cerevisiae utilizado
M14174	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor PAU5 (pau5p)
M14175	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor FZF1 (fzf1 p)
M14176	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1 (ssu1 p)
M14177	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor HXT7 (hxt7p)
M14178	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor GPD2 (gpd2p)
M14179	Mesmo de M10156	Mesmo de M10156 e S. paradoxus FZF1 (SEQ ID NO: 2) sob o controle do promotor SSU1-R (como descrito em Nardi et al.)

[0077] Ensaios de crescimento foram realizados utilizando-se uma leitora de placa BioTek de maneira a monitorar cineticamente a OD 600 nm. As células foram cultivadas durante uma noite em YPD e diluídas para aproximadamente 1:1000 em meio fresco para se obter uma OD inicial de of 0,01. As células foram crescidas em meio YPD (pH 4,5) suplementado (quando necessário) com 50 mM de citrato com 250 ppm de metabissulfito de sódio (SMBS). A taxa de crescimento foi determinada medindo-se a absorbância a um comprimento de onda de 600 nm. O tempo de início (ensaio de latência) foi medido de maneira similar até ser obtida a leitura de OD de 0,5.

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EXEMPLO II - TOXICIDADE DE SULFITO AUMENTADA [0078] A sensibilidade/tolerância de várias cepas da levedura S. cerevisiae foi medida na presença de 250 ppm de sulfito. Como mostrado na Figura 1, o crescimento de cepas de levedura geneticamente modificadas (M4080 e M10156) foi fortemente inibido na presença de sulfito, quando em comparação com suas contrapartes do tipo selvagem (M2390).

EXEMPLO III - ENSAIOS DE CRESCIMENTO [0079] De maneira a aumentar a tolerância a sulfito, cassetes de expressão para vários genes SSU1 ou FZF1 de Saccharomyces foram fundidos ao promotor HOR7 de Saccharomyces cerevisiae e expressos em S. cerevisiae (ver Tabela 1 para a descrição das cepas). Estas cepas foram crescidas em um meio definido contendo sulfitos (ver o Exemplo I para as condições). A taxa de crescimento e o tempo de latência foram medidos para cada cepa testada. Como mostrado nas Figuras 2 e 3, a sobre-expressão de FZF1 ou SSU1 derivados da espécie doadora do gene de Saccharomyces aumentou a taxa de crescimento e encurtou o tempo de latência das cepas derivadas de M10156 crescidas na presença de sulfitos.

[0080] Como mostrado nas Figuras 2 e 3, o gene fzf1 de S. paradoxus foi identificado como aumentando a tolerância a sulfito nas cepas hospedeiras de levedura quando expresso constitutivamente (sob a expressão do promotor HOR7 (hor7p)). De maneira a adicionalmente otimizar a expressão e, desta forma, aumentar a tolerância a sulfito, o gene fzf1 de S. paradoxus foi fundido a um número de promotores nativos de S. cerevisiae. Como mostrado nas Figuras 4 a 6, os promotores gpd2p e ssu1-rp proveram, sob as condições testadas, o maior aumento na tolerância a sulfito quando em comparação com a cepa parental.

EXEMPLO IV -SOBRE-EXPRESSÃO de FZF1 E SSU1 NA REDUÇÃO DE FUNDO DE GLICEROL [0081] Duas cópias de cassetes de sobre-expressão dos genes FZF1 ou SSU1 de S. paradoxus ou S. cerevisiae foram transformadas na cepa M11240 como

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47/47 descrito na tabela 1. Oito colônias únicas juntamente com uma cepa do tipo selvagem de controle M2390 e a cepa parental M11240 foram submetidas a estudos de leitura em placa em YPD ou YPD contendo 250 ppm de metabissulfito de sódio (SMBS) a pH 4,5. A taxa de crescimentos (MaxV log) e os tempos de latência (tempo de início OD 0,5) foram calculados para cada isolado e os dados abaixo representam o melhor desempenho (cada uma chamada de M16063, M16064, M16065 e M16066 conforme indicado na tabela 1). Ambos os genes FZF1 e SSU1 de S. paradoxus e S. cerevisiae aumentaram a taxa de crescimentos (Figura 8A) e os tempos de latência (Figura 8B) em M11240 na presença de YPD contendo 250 ppm de SMBS. Os perfis de crescimento destes isolados são também mostrados nas Figuras 8C e 8D.

[0082] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com suas realizações específicas, deve ser entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas referidas realizações apresentadas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

REFERÊNCIAS

Patente US 8.956.851

WO/2015/023989

W0/2017/037614

WO 2012/138942 WO 2011/153516

Tiziana Nardi, Viviana Corich, Alessio Giacomini e Bruno Blondin, A sulphiteinducible form of the sulphite efflux gene SSU1 in a Saccharomyces cerevisiae wine yeast, Microbiology (2010), 156, 1686-1696.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira de levedura recombinante caracterizada pelo fato de compreender:

(i) uma primeira modificação genética para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol e/ou permitir a produção de uma glicoamilase heteróloga; e (ii) uma segunda modificação genética que permite a expressão de um fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão de um polipeptideo SSU1 e/ou permite a expressão de um polipeptideo SSU1 heterólogo.
2. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de apresentar uma segunda modificação genética que permite a expressão do fator de transcrição heterólogo que favorece a expressão do polipeptideo SSU1.
3. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato do fator de transcrição heterólogo ser um polipeptideo FZF1 ou um polipeptideo codificado por um gene fzf1 ortólogo.
4. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do polipeptideo FZF1 ou do polipeptideo codificado pelo gene fzf1 ortólogo ser expresso sob o controle de um promotor constitutivo, regulado por glicose ou regulado por sulfito.
5. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato do promotor ser o promotor regulado por glicose e ser o promotor de um gene hxt7 (hxt7p).
6. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato do promotor ser o promotor

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2/6 regulado por sulfito e ser o promotor de um gene gpd2 (gpd2p), o promotor de um gene fzf1 (fzf1 p), o promotor de um gene ssu1 (ssulp) ou o promotor de um gene ssu1-r (ssur1-rp).
7. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato do polipeptídeo FZF1 ser do gênero Saccharomyces sp.
8. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato do polipeptídeo FZF1 apresentar a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22, ser uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6, 21 ou 22.
9. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de apresentar a segunda modificação genética que permite a expressão do polipeptídeo SSLH heterólogo.
10. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato do polipeptídeo SSLH heterólogo ser um polipeptídeo codificado por um gene ssu1 ortólogo.
11. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato do polipeptídeo SSLH heterólogo ser expresso sob o controle de um promotor constitutivo, regulado por glicose ou regulado por sulfito.
12. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato do promotor ser o promotor regulado por glicose e ser o promotor de um gene hxt7 (hxt7p).
13. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato do promotor ser o promotor regulado por sulfito e ser o promotor de um gene gpd2 (gpd2p), o

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3/6 promotor de um fzf1 (fzflp), o promotor de um ssu1 (ssulp) ou o promotor de um gene ssu1-r (ssur1-rp).
14. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato do polipeptídeo SSU1 heterólogo ser do gênero Saccharomyces sp.
15. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato do polipeptídeo SSU1 apresentar a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 24, ser uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 34 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 12, 23 ou 24.
16. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de apresenta a primeira modificação genética para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol.
17. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato a uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ser um polipeptídeo GPD2.
18. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato da uma ou mais enzimas que funcionam para regular a síntese de glicerol ser um polipeptídeo STL1.
19. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de apresentar a primeira modificação genética para permitir a produção de uma glicoamilase heteróloga.

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20. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato da glicoamilase heteróloga ser do gênero Saccharomycopsis sp.
21. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato da glicoamilase heteróloga ser da espécie Saccharomycopsis fibuligera.
22. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato da glicoamilase heteróloga apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
23. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma terceira modificação genética para a redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formato.
24. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de não apresentar a capacidade de produzir um polipeptídeo FDH1 e um polipeptídeo FDH2.
25. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de ser do gênero Saccharomyces sp.
26. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
27. Método para melhorar uma propriedade de crescimento de uma célula hospedeira de levedura recombinante, caracterizado pelo fato de compreender:

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5/6 (i) o provimento de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante apresentando a primeira modificação genética definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26; e (ii) a introdução da segunda modificação genética definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26 na primeira célula hospedeira de levedura recombinante de maneira a prover uma segunda célula hospedeira de levedura recombinante, onde a propriedade de crescimento da segunda célula hospedeira de levedura recombinante é melhorada em relação à propriedade de crescimento da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato da propriedade de crescimento ser uma taxa de crescimento e da propriedade de crescimento aumentada ser uma taxa de crescimento mais rápida.
29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato da propriedade de crescimento ser um período de latência e da propriedade de crescimento aumentada ser um período de latência reduzido.
30. Célula hospedeira de levedura recombinante caracterizada pelo fato de ser obtenível pelo método de qualquer uma das reivindicações 27 a 29.
31. Método para aumentar a produção de um produto de fermentação durante uma fermentação, caracterizado pelo fato de compreender a fermentação de um meio com pelo menos uma célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26 ou 30.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato do produto de fermentação ser o etanol.
33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato do meio compreender amido.

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34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do amido ser provido em uma forma gelatinizada ou bruta.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato do meio ser derivado de milho.
36. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato do meio compreender lignocelulose.