ES2661966T3

ES2661966T3 - Nueva proteína que tiene actividad ß-glucosidasa, y usos de la misma

Info

Publication number: ES2661966T3
Application number: ES10809957.3T
Authority: ES
Inventors: Fumikazu Yokoyama; Kengo Yokoyama; Nobuko MAZUKA
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2030-08-17
Also published as: JP5745411B2; EP2468859B1; US8975057B2; WO2011021616A1; EP2468859A1; JPWO2011021616A1; DK2468859T3; BR112012003609A2; US20150104833A1; US20120148706A1; CN102482665B; US10125355B2; CN102482665A; BR112012003609B1; EP2468859A4

Abstract

Un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes (i) a (v), que codifica una proteína que tiene una actividad ß- glucosidasa: (i) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de las posiciones 1-2439 de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de bases de las posiciones 218- 2847 de SEQ ID NO: 2; (iii) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que 40 o menos aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido; (iv) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (v) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1- 795 de SEQ ID NO: 3.

Description

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DESCRIPCION

Nueva proteína que tiene actividad p-glucosidasa, y usos de la misma Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una nueva proteína que tiene actividad p-glucosidasa y usos de la misma. Específicamente, la presente invención se refiere a una nueva proteína que tiene una actividad p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus, un análogo y una variante de la proteína, los polinucleótidos que codifican estas proteínas, y un método de producción y usos de estas proteínas.

Técnica anterior

La celulosa es un componente constitutivo esencial de células de plantas superiores, y existe ampliamente en la naturaleza. La celulosa es un polímero polisacarídico de unidades de glucosa polimerizadas mediante un enlace p- 1,4-glicosídico. En la naturaleza, la celulosa se encuentra en un estado cristalino o amorfo. Al enlazarse a otros componentes, tales como la lignina, hemicelulosas, y pectinas, de una manera complicada, la celulosa construye tejidos vegetales.

Celulasa es un término genérico de un grupo de enzimas que rompen la celulosa. En general, las celulasas producidas por microorganismos incluyen distintos tipos de componentes de celulasa. De acuerdo con la especificidad de sustrato, los componentes de celulasa se clasifican en tres tipos: celobiohidrolasa, endoglucanasa, y p-glucosidasa. Se cree que el Aspergillus niger que es un hongo filamentoso productor de celulasa, produce 4 tipos de celobiohidrolasas como máximo, 15 tipos de endoglucanasas, y 15 tipos de p-glucosidasas. Presumiblemente, múltiples enzimas de entre estas actúan con modos de reacción distintos compensándose entre ellas para presentar efectos sinérgicos, rompiendo de esta manera la celulosa que es un componente de las paredes de la célula vegetal. Se cree que la p-glucosidasa cataliza una reacción que libera glucosa a partir de los celo- oligosacáridos, celobiosa o glicósidos con aglicona unida a estos mediante un enlace p-D-glucopiranosil. La p-

glucosidasa es una enzima importante en el último estadio de sacarificación de la celulosa y en la liberación de

glucosa a partir de glicósidos.

La conversión en etanol de la biomasa tiene las ventajas de que: la materia prima está disponible más fácilmente, se puede evitar la combustión de la materia prima o perderse en el suelo, y el combustible de etanol es medioambientalmente limpio. La madera, los residuos agrícolas, los cultivos herbáceos los residuos sólidos municipales han atraído la atención como biomasa para la producción de etanol. Estos materiales están compuestos principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa

fermenta fácilmente en etanol mediante levaduras. Por otra parte, la celobiosa no es fácilmente fermentable en

etanol por las levaduras, y en consecuencia la celobiosa remanente produce una reducción del rendimiento de etanol. Lo que es más importante es que la celobiosa es un potente inhibidor de las endoglucanasas y celobiohidrolasas. Por esta razón, la acumulación de celobiosa durante la hidrólisis no es deseable para la producción de etanol. En general, los microorganismos productores de celulasa apenas pueden producir p- glucosidasas. Esto da lugar al principal problema de que la celobiosa producida por la hidrólisis enzimática se acumula.

Con el fin de promover la conversión de celobiosa en glucosa, el rendimiento de las p-glucosidasas aumenta por la sobre-expresión de p-glucosidasas en un huésped. Por lo tanto, es un medio eficaz para promover la sacarificación de biomasa en glucosa. En consecuencia, es deseable el aislamiento de un nuevo gen de p-glucosidasa que se introduzca y se exprese en microorganismos productores de celulasa.

Al mismo tiempo, se ha informado que el hongo filamentoso Acremonium cellulolyticus produce una celulasa que tiene una alta potencia de sacarificación (Bibliografía no Patente 1) y es muy útil para su uso en piensos y ensilaje (Bibliografía de Patentes 1 a 3). Además, también se ha examinado en detalle el componente de celulasa que contiene (Bibliografía de Patentes 4 a 10). Se ha revelado que se secretan distintos tipos de componentes de celulasa como en otros hongos filamentosos. Particularmente, se ha informado, en cuanto a la actividad p- glucosidasa de entre las celulasas del mismo, por ejemplo, que la actividad es significativamente mayor que la de las celulasas de Trichoderma reesei y similares (Bibliografía de Patente 11). Debido a dichas características, se ha enfocado la atención en el Acremonium cellulolyticus como diana para aislar a partir del mismo el gen de p- glucosidasa.

Sin embargo, hasta ahora se han aislado pocos genes de Acremonium cellulolyticus (Bibliografía de Patentes 9, 10). Además, los genes aislados no se han expresado todavía satisfactoriamente en hongos filamentosos distintos de Acremonium cellulolyticus.

El documento B6QHN4 (UniProt 2008) describe una proteína que tiene actividad p-glucosidasa. El documento US 2004/0091469 se refiere a una enzima p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus. El documento US 2007/00911469 A1 describe una p-glucosidasa que tiene una mayor actividad que la del Acremonium cellulolyticus.

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El documento EP 0 927 756 A1 que es idéntico al WO 97/33982 A1 describe una proteína que tiene actividad celulasa obtenida del género Acremonium, el ADN del mismo, y un vector de expresión para transformar un microorganismo. El Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 107 No. 3, 256-261, 2009 describe una cepa mejorada de Acremonium cellulolyticus para la producción de celulasa mediante una mutación.

Listado de citas bibliográficas

[Bibliografía de Patentes]

[PTL 1] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° Hei 7-264994 [PTL 2] Patente Japonesa N° 2531595

[PTL 3] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° Hei 7-236431

[PTL 4] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° 2001-17180

[PTL 5] Publicación Internacional N° WO 97/33982 [PTL 6] Publicación Internacional N° WO 99/011767

[PTL 7] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° 2000/69978

[PTL 8] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° Hei 10-066569

[PTL 9] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa sin examinar N° 2002/101876

[PTL 10] Publicación Internacional N° WO 2002/026979

[PTL 11] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa examinada N° Sho 60-43954 [Bibliografía no Patente]

[NPL 1] "Agricultural and Biological Chemistry," (Japón), 1987, Vol. 51, p. 65 Sumario de la invención Problema técnico

La presente invención se ha producido en vista de dichas circunstancias. Un objetivo de la presente invención es aislar un nuevo gen de p-glucosidasa de Acremonium cellulolyticus. Otro objetivo de la presente invención es aumentar el rendimiento de p-glucosidasa en un huésped que exprese el gen de p-glucosidasa aislado a un alto nivel.

Solución al problema

Para conseguir los objetivos descritos anteriormente, los presentes inventores han estudiado seriamente métodos de separación y purificación de una p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus. Como resultado, finalmente los inventores han identificado satisfactoriamente una nueva p-glucosidasa diferente de la p-glucosidasa que se conocía hasta ahora a partir de Acremonium cellulolyticus. Además, el gen que codifica la p-glucosidasa identificada también se ha aislado satisfactoriamente. El gen de p-glucosidasa descubierto por los presentes inventores no se había aislado a pesar de intentos durante años para aislar el gen a partir de Acremonium cellulolyticus. La razón era presumiblemente que como la hidrofobia de la proteína codificada por el gen es alta, hacía que la separación y purificación de la misma fuera difícil.

Además, los presentes inventores han estudiado seriamente métodos de expresión del gen de p-glucosidasa aislado derivado de Acremonium cellulolyticus a un alto nivel en un huésped, produciendo de esta manera que el huésped produzca una p-glucosidasa que tiene una actividad excelente. Como resultado, introduciendo una modificación de múltiples bases en el gen de p-glucosidasa, se ha conseguido satisfactoriamente, por primera vez en el mundo, un alto nivel de expresión de un gen de p-glucosidasa en hongos filamentosos distintos de Acremonium cellulolyticus, y el producto de expresión presenta una alta actividad p-glucosidasa. Esto hace posible expresar una p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus a alto nivel en un huésped, y aumentar la cantidad de p-glucosidasa producida. Los presentes inventores han descubierto que utilizando la p-glucosidasa o una preparación de celulasas obtenidas a partir del transformante preparado de esta manera, se puede llevar a cabo eficazmente la sacarificación de biomasa en glucosa y varios tratamientos y modificaciones en un sustrato basado en celulosa. Este descubrimiento ha permitido completar de la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a una nueva proteína que tiene actividad p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus, un análogo o variante de la proteína, polinucleótidos que codifican esta proteína y un método de producción y los usos de esta proteína. Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente.

(1) Un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes puntos (i) a (v), que codifican una proteína que tiene actividad p-glucosidasa:

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(i) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

3;

(ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de base de las posiciones 1-2439 de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de las posiciones de bases 218-2847 de SEQ ID NO: 2;

(iii) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que 40 o menos aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido;

(iv) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tienen una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(v) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1-795 de SEQ ID NO: 3.

(2) El polinucleótido de acuerdo con (1) se deriva de un hongo filamentoso.

(3) El polinucleótido de acuerdo con (2), en el que el hongo filamentoso es Acremonium cellulolyticus.

(4) Un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes (i) y (ii), que codifica una proteína que tiene una actividad p-glucosidasa:

(i) un polinucleótido que codifica una proteína que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y

(ii) un polinucleótido que comprende una región codificante de una secuencia de bases de SEQ ID NO: 4.

(5) Un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4 en la que 30 o menos bases se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, codificando el polinucleótido una proteína que tiene actividad p- glucosidasa.

(6) Un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1795 de SEQ ID NO: 5.

(7) Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (6).

(8) Una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con (7).

(9) Una proteína que comprende una actividad p-glucosidasa seleccionada de entre (i) a (iv):

(i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(ii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido 40 o menos aminoácidos;

(iii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(iv) una proteína de uno cualquiera de (i) a (iii) de la cual se ha retirado una secuencia de señal, en la que la secuencia de señal es una secuencia de aminoácidos de las posiciones -18 a -1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

(10) Un método para la producción de la proteína de acuerdo con (9), comprendiendo el método las etapas de: cultivar la célula huésped de acuerdo con (8); y

recolectar una proteína expresada por la célula huésped y/o un cultivo de la misma.

(11) Una preparación de celulasas que comprende la proteína de acuerdo con (9).

(12) Un método para la degradación o conversión de material celulósico, comprendiendo el método las etapas de:

tratar el material celulósico con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de celulasas de acuerdo con (11).

(13) Un método para la producción de un material celulósico, comprendiendo el método las etapas de:

tratar un material celulósico con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de celulasas de acuerdo con (11); y recolectar un material celulósico degradado.

(14) El método de acuerdo con (13), en el que el material celulósico degradado es un azúcar.

(15) Una composición detergente que comprende una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de celulasas de acuerdo con (11).

(16) Un método para el tratamiento de una fibra que contiene celulosa, comprendiendo el método las etapas de:

poner en contacto una cualquiera de entre las proteínas de acuerdo con (9), la preparación de celulasas de acuerdo con (11), y la composición de detergente de acuerdo con (15) con la fibra que contiene celulosa.

(17) Un método para destintar el papel desechado, caracterizándose el método porque una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de celulasas de acuerdo con (11) se utiliza en una etapa de destintado del tratamiento del papel desechado como un agente de decoloración.

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(18) Un método para la producción de pasta de papel que tiene un drenaje mejorado, comprendiendo el método las etapas de:

tratar la pasta de papel con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de la celulasa de acuerdo con (11).

(19) Un método para la producción de un pienso para animales que tiene una digestibilidad mejorada, comprendiendo el método la etapa de:

tratar un pienso para animales con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con (9) y la preparación de celulasas de acuerdo con (11).

[Efectos ventajosos de la invención]

La presente invención proporciona un nuevo gen de p-glucosidasa derivado de Acremonium cellulolyticus, y un análogo y una variante del gen para expresar eficazmente una p-glucosidasa en un huésped. Adicionalmente, la presente invención proporciona un huésped que expresa la p-glucosidasa a un alto nivel, y que muestra una excelente actividad de la p-glucosidasa. Esto hace posible obtener una p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus como una proteína purificada o una preparación de celulasas con un rendimiento alto.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 es un esquema que muestra un mapa de las enzimas de restricción en un plásmido pBGLB. Descripción de las realizaciones

Proteína que tiene actividad p-glucosidasa y polinucleótido que codifica la proteína

La presente invención proporciona una nueva proteína que tiene una actividad p-glucosidasa y un polinucleótido que codifica la proteína. En la presente invención, la “p-glucosidasa” significa una enzima que muestra una actividad p- glucosidasa, es decir la p-D-Glucósido glucohidrolasa EC3.2.1.21. La “actividad p-glucosidasa” significa una actividad de hidrólisis de celo-oligosacáridos, celobiosa, o glicósidos con aglicona unido a los mismos mediante una unión p-D-glucopiranosilo por un exo-mecanismo para producir glucosa.

El “polinucleótido” que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención incluye, por ejemplo, un ADN, un ARN, productos modificados o quimeras de los mismos, y es preferentemente un ADN. El ADN incluye un ADNc, un ADN genómico, y un ADN sintetizado químicamente. La secuencia de bases de un ADNc que han aislado los presentes inventores, y que codifica la nueva p-glucosidasa (a la que se hace referencia de aquí en adelante como “acBGLB”) derivada de Acremonium cellulolyticus, se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de bases del ADN genómico se muestra en la SEQ ID NO: 2. Además, la secuencia de aminoácidos de acBGLB codificada por estos ADN se muestran en la SEQ ID NO: 3.

Una realización preferida del polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que codifica la acBGLB que comprende la secuencia de aminoácidos de sEq ID NO: 3. Un ejemplo de la mima incluye un polinucleótido que comprende una región codificante de la secuencia de bases de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Además, la presente invención comprende un polinucleótido que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la acBGLB. Ejemplos de dicho polinucleótido incluye mutantes, derivados, alelos, variantes y homólogos de la acBGLB. En el presente documento, la frase “funcionalmente equivalente” significa que la proteína diana tiene una actividad p-glucosidasa. Preferentemente, cuando se comparan, la proteína diana tiene un 70 % o más, preferentemente un 80 % o más, más preferentemente un 90 % o más, y más preferentemente un 95 % o más de actividad p-glucosidasa de la acBGLB. La actividad p-glucosidasa de la proteína diana y la acBGLB se pueden evaluar como la actividad de producción de 1 pmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil-p-glucósido en 1 minuto cuando se mide por un método descrito en la bibliografía (Methods in ENZYMOLOGY, vol. 160, Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood ed. p 109-110).

Una realización del polinucleótido que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la acBGLB es un polinucleótido que codifica una proteína que tiene actividad p-glucosidasa, comprendiendo la proteína una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en el que uno o más aminoácidos se han sustituido, eliminado y/o añadido.

El número de restos de aminoácido modificados es preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 20, más preferentemente 1 a 8 y más preferentemente de 1 a 4. La modificación de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora. Una “sustitución conservadora” significa que se sustituye al menos un resto de aminoácido con otro resto de aminoácido químicamente similar de tal manera que la actividad del polipéptido no cambia sustancialmente. Ejemplos de la misma incluye un caso en el que cierto resto de aminoácido hidrófobo se sustituye por otro resto de aminoácido hidrófobo, un caso en el que cierto resto de aminoácido polar se sustituye con otro

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resto de aminoácido polar que tenga la misma carga, y otros casos. Ejemplos específicos de aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina, metionina, y similares. Ejemplos específicos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, cisteína, y similares. Ejemplos específicos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, histidina, lisina, y similares. Ejemplos específicos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico, ácido glutámico, y similares.

El polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención es preferentemente un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una región codificante de una secuencia de bases de SEQ ID NO: 4), particularmente cuando se expresa en Trichoderma viride. En la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4, se ha modificado un 13,2 % o más de bases en comparación con la secuencia de bases (SEQ ID NO: 1) del polinucleótido que codifica acBGLB. Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se codifica, se modificaron 16 tipos de aminoácidos entre los 20 tipos de aminoácidos en la secuencia de bases. Se tuvo en consideración la frecuencia de distribución de codones que se utiliza en un huésped al determinar un codón correspondiente a cada aminoácido. Esto hace posible la expresión en Trichoderma viride, y el producto de expresión presenta satisfactoriamente una alta actividad p-glucosidasa. Una vez que se obtiene dicha secuencia preferida los expertos en la técnica podrían, basándose en esta secuencia, modificar adicionalmente la secuencia de bases para obtener un polinucleótido que se pueda expresar en Trichoderma de la misma manera que el polinucleótido que comprende la región codificante de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4. Por lo tanto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4 en la que se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido una o más bases (preferentemente 30 bases o menos, más preferentemente 20 bases o menos, más preferentemente 10 bases o menos, y más preferentemente 5 bases o menos), codificando el polinucleótido una proteína que tiene una actividad p-glucosidasa y que se puede expresar en Trichoderma viride. Una realización preferida de dicho polinucleótido es un polinucleótido capaz de mejorar la actividad p-glucosidasa cuando se expresa en un transformante de Trichoderma viride 5 veces o más (preferentemente 7 veces o más) en comparación con una actividad p-glucosidasa en una cepa parental de Trichoderma viride (cepa de Trichoderma viride original no deficiente en un gen para biosíntesis de uracilo) (véase el Ejemplo 5).

En la presente invención, otra realización del polinucleótido que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la acBGLB, es un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una actividad p-glucosidasa, comprendiendo la proteína una secuencia de aminoácidos que tiene unas identidad del 90 % o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En el presente documento, la “identidad” es un valor numérico que se calcula utilizando los parámetros por defecto (ajustes iniciales) en FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988),
http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html] que es un programa de búsqueda de homologías conocidos por los expertos en la técnica. La identidad puede ser preferentemente una identidad de un 95 % o más, más preferentemente una identidad de un 98 % o más, y particularmente preferentemente una identidad de un 99 % o más.

En la presente invención, otra realización del polinucleótido que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la acBGLB es un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una actividad p-glucosidasa, hibridándose el polinucleótido en condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 2. En el presente documento “condiciones rigurosas” significa en las que se lleva a cabo un procedimiento de lavado en membrana después de la hibridación a alta temperatura en una solución que tiene una concentración baja en sales, y significa condiciones de lavado, por ejemplo a una concentración de 23 SSC (12 SSC: 15 mmol/l de citrato sódico y 150 mmol/l de cloruro sódico) y en una solución con un 0,5 % de SDS a 60 °C durante 20 minutos.

Además, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la acBGLB o una proteína funcionalmente equivalente a la misma, en cuya secuencia de bases se ha eliminado una secuencia de señal. La secuencia de señal de la acBGLB es una secuencia de aminoácidos de las posiciones -18 a -1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Se puede añadir cualquier polipéptido al extremo N y/o el extremo C de cada secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte de proteína madura de la proteína de la presente invención de manera que no tenga influencia en la actividad p-glucosidasa. Ejemplos de dicha secuencia de polipéptido incluye una secuencia de señal, un marcador de detección (por ejemplo, un marcador FLAG), y un polipéptido de purificación [por ejemplo, glutatión S-transferasa (GST)].

El polinucleótido que codifica la proteína que tiene actividad p-glucosidasa de la presente invención se puede preparar utilizando medios convencionales para los expertos en la técnica. En la preparación de un ADN genómico que codifique la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, por ejemplo, primero, se extrae un ADN genómico de un microorganismo diana tal como Acremonium cellulolyticus, por un método utilizado normalmente. El ADN genómico se digiere con una enzima de restricción apropiada y entonces se liga a un vector apropiado. De esta manera, se prepara una biblioteca de ADN de Acremonium cellulolyticus. Como vector, se

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pueden utilizar distintos vectores como, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector fago, un vector cósmido y un vector BAC. A continuación, se prepara una sonda apropiada basándose en la secuencia de bases (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) del polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente

invención, y se puede aislar un aDn genómico deseado a partir de la biblioteca de ADN genómico mediante

hibridación. De manera alternativa, se prepara un cebador basándose en la secuencia de bases (por ejemplo, la

SEQ ID NO: 2) del polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente

invención, y se lleva a cabo una pCr utilizando el ADN genómico de Acremonium cellulolyticus como matriz. Un fragmento de ADN amplificado de esta manera se liga en un vector apropiado. En consecuencia, se puede aislar un ADN genómico. Entre tanto, se prepara un ADNc que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, por ejemplo, primero, se sintetiza un ADNc basándose en un ARNm extraído de un microorganismo diana tal como Acremonium cellulolyticus. El ADNc se digiere con una enzima de restricción y se liga en un vector apropiado. De esta manera, se prepara una biblioteca de ADNc de Acremonium cellulolyticus. A continuación, se prepara una sonda basándose en la secuencia de bases (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) del polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, y se puede aislar un ADNc deseado de la biblioteca de ADNc mediante hibridación. De manera alternativa, se prepara un cebador basándose en la secuencia de bases (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) del polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, y se lleva a cabo una PCR utilizando el ADNc de Acremonium cellulolyticus como matriz. Un fragmento de ADN amplificado de esta manera se liga en un vector apropiado. En consecuencia, se puede aislar un ADNc deseado. Además, el polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención se puede obtener artificialmente por síntesis química.

La presente invención proporciona un vector de expresión que comprende: el polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, siendo el polinucleótido replicable en un microorganismo huésped; y la proteína codificada a partir de la secuencia de polinucleótido está en un estado expresable. El vector de expresión de la presente invención se puede construir basándose en un vector de auto- replicación, es decir, por ejemplo, un plásmido que existe como un elemento extra-cromosómico, y que se replica independientemente de la replicación del cromosoma del microorganismo huésped. De manera alternativa, el vector de expresión de la presente invención se puede replicar junto con el cromosoma del microorganismo huésped, después de introducirlo en el microorganismo huésped y se incorpora en el genoma del mismo. Como procedimiento y método para construir el vector de expresión de la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento y cualquier método que se utiliza comúnmente en el campo de la modificación genética.

Para expresar la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa después de que el vector de expresión de acuerdo con la presente invención se haya introducido en un microorganismo huésped, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención comprende deseablemente, además del polinucleótido que codifica la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, una secuencia de polinucleótido para regular la expresión, un marcador genético para seleccionar un microorganismo, y similar. Ejemplos de la secuencia de polinucleótido para regular la expresión incluyen secuencias de polinucleótido que codifican un promotor, un terminador y un péptido de señal. El promotor no está limitado particularmente, a condición de que presente actividad transcripcional en el microorganismo huésped. El promotor puede derivarse de un microorganismo homólogo o heterólogo con respecto al microorganismo huésped. Además, el péptido de señal no está limitado particularmente, a condición de que el péptido de señal contribuya a la secreción de la proteína en el microorganismo huésped. El péptido de señal se puede derivar de un microorganismo homólogo o heterólogo del microorganismo huésped. Además, el marcador genético se puede seleccionar según esté de acuerdo al método de selección del transformante. Por ejemplo, se puede utilizar un gen que codifique una resistencia a fármacos o un gen que complemente la auxotrofia.

Además, la presente invención proporciona un microorganismo transformado con el vector de expresión. El microorganismo huésped que se utiliza en la presente invención no está particularmente limitado. Ejemplos de los mismos incluyen hongos filamentosos, levaduras, Escherichia coli, actinomicetos, y similares. Ejemplos de las células de levadura incluyen las que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Hansenula, y Pichia. Un ejemplo preferido de célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae. Adicionalmente, ejemplos de hongos filamentosos incluyen los que pertenecen a los géneros Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, y Acremonium. Ejemplos preferidos de los hongos filamentosos incluyen Humicola insolens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma viride, Fusarium oxisporum, y Acremonium cellulolyticus. La transformación de estos microorganismos con el vector de expresión de la presente invención se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier método utilizado en este campo.

La proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención (o una preparación de celulasas de la presente invención que se va a describir posteriormente) se puede recolectar en un cultivo (por ejemplo, células cultivadas, sobrenadante del cultivo) que se obtiene cultivando los transformantes preparados de esta manera en un medio apropiado. El cultivo del transformante y las condiciones del mismo pueden ser sustancialmente las mismas que las del organismo que se va a utilizar. Además, como método para la recolección de la proteína diana después de cultivar el transformante, se puede utilizar cualquier método que se utilice comúnmente en este campo. Por ejemplo, después del terminar el cultivo del transformante, se puede utilizar un fluido sobrenadante obtenido por retirada desde el cultivo por centrifugación o similar, como una enzima en bruto. Además, este fluido sobrenadante

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se concentra por un método de ultrafiltración o similar, y se añade al mismo un antiséptico o similar. El resultado se puede utilizar como una enzima concentrada. Además, después de la concentración se puede preparar una enzima en polvo mediante un método de secado por pulverización o similar. La proteína que tiene una actividad p- glucosidasa de la presente invención (o la preparación de celulasas de la presente invención) se puede obtener, si fuera necesario, por purificación parcial o alta purificación de la enzima concentrada o la enzima en polvo. Como método de purificación se pueden utilizar métodos convencionales, por ejemplo un método de precipitación proteica por adición de sal con sulfato amónico o similar, un método de precipitación por disolvente orgánico con un alcohol o similar, un método de separación en membrana, y un método de separación cromatográfica utilizando un intercambiador iónico, un vehículo de cromatografía hidrófoba, un vehículo de filtración en gel, o similar, solos o en combinación según sea apropiado. La presente invención proporciona dicho método para la producción de la proteína que tiene actividad p-glucosidasa de la presente invención (o la preparación de celulasas de la presente invención).

Preparación de celulasas

La presente invención proporciona una preparación de celulasas que comprende la proteína descrita anteriormente que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención. La preparación de celulasas de la presente invención puede comprender una proteína diferente a la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención. Como proteínas diferentes, la preparación de celulasas de la presente invención puede comprender, por ejemplo, una p-glucosidasa distinta de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención, una hemicelulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa, aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, quitinasa, cutinasa, ciclodesxtrina glicosiltrasnferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, a- galactosidasa, p-galactosidasa, glucoamilasa, a-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, pectinasa, péptido glutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenol oxidasa, proteasa, ribonucleasa, transglutaminasa, orxilanasa. La proteína diferente de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención comprendida en la preparación de celulasas de la presente invención se puede derivar del transformante que expresa la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención o puede ser una que se añade independientemente.

La preparación de celulasas de la presente invención se puede producir mientras que se mezcla con un vehículo o medio contenido generalmente, por ejemplo, un excipiente (por ejemplo, lactosa, cloruro sódico, sorbitol, o similares), un tensioactivo, un antiséptico, o similar. Además la preparación de celulasas de la presente invención puede producirse de una forma apropiada, por ejemplo, en polvo o líquido.

Usos de la proteína que tiene actividad p-glucosidasa o preparación de celulasas

La presente invención proporciona un método para degradar o convertir un material celulósico, comprendiendo el método: tratar un material celulósico con una cualquiera de entre la proteína que tiene actividad p-glucosidasa de la presente invención y la preparación de celulasas de la presente invención. Además, la presente invención proporciona un método para producir un material celulósico degradado o convertido, comprendiendo el método: tratar un material celulósico; y después recolectar un material celulósico degradado. El material celulósico es normalmente una biomasa. Ejemplos del mismo incluye, pero no se limita a, paja de arroz, bagazo, rastrojo de maíz, hollejos de frutas tales como el coco, desechos de madera, y materiales obtenidos sometiendo estos a un pretratamiento apropiado. La proteína que tiene una actividad p-glucosidasa o la preparación de celulasas que se utiliza para el tratamiento del material celulósico puede estar en forma de un caldo de fermentación en bruto del cual se eliminan o no se eliminan las células, o puede estar en forma de una preparación semi-purificada o purificada. En el proceso de fermentación utilizando la biomasa, el transformante de la presente invención se puede utilizar como fuente de producción de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención. Se pueden introducir en el transformante, distintos genes de celulasa o un gen que codifique otra enzima eficaz en el procesamiento de la biomasa. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para producir un azúcar (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos) como materia prima química o de fermentación a partir de la biomasa, por ejemplo. El azúcar obtenido de esta manera sirve como materia prima para producir, por ejemplo, etanol, plásticos, u otros productos o intermediarios.

Además, la presente invención proporciona una composición detergente que comprende una cualquiera de entre la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención y la preparación de celulasas de la presente invención. La composición detergente de la presente invención también puede comprender un tensioactivo (aniónico, no iónico, catiónico, anfotérico o tensioactivo zwitteriónico, o puede ser una mezcla de estos). Además, la composición detergente también puede comprender otros componentes detergentes conocidos en el campo, por ejemplo, un adyuvante de detergencia, un blanqueante, un activador del blanqueante, un inhibidor de corrosión, un agente secuestrante, un polímero de liberación en el suelo, un saborizante, otras enzimas (proteasas, lipasas, amilasas, y similares), un estabilizante enzimático, un auxiliar de formulación, un abrillantador óptico, y/o un agente espumante, y similares.

Además, la presente invención proporciona un método para tratar la fibra que contiene celulosa, comprendiendo el método las etapas de poner en contacto una cualquiera de entre la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa

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de la presente invención, la preparación de celulasas de la presente invención, y la composición detergente, con la fibra que contiene celulosa. Ejemplos de características de la fibra que contiene celulosa que se van a mejorar con el método de tratamiento de la presente invención incluye: (1) tacto y apariencia de la fibra mejorados por la reducción de peso, (2) variaciones locales del color proporcionado por la fibra que contiene fibra coloreada, es decir, apariencia y textura de lavado a la piedra proporcionadas a la fibra que contiene celulosa coloreada, (3) claridad del color de la fibra que contiene celulosa coloreada, (4) suavidad (tiempo más lento de comienzo de rigidez del material, reducción de la rigidez), y (5) eliminación de pelusa (tiempo más lento del comienzo de la formación de pelusa, reducción de pelusa).

Además, la presente invención proporciona un método para destintar papel desechado, caracterizado el método porque una cualquiera de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención y la preparación de celulasas de la presente invención se utiliza en una etapa de destintado del tratamiento del papel desechado con un agente destintante.

Además, la presente invención proporciona un método para producir pasta de papel que tiene un drenaje mejorado, comprendiendo el método la etapa de: tratar la pasta de papel con una cualquiera de entre la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención y la preparación de celulasas de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el drenaje de la pasta de papel se puede mejorar sin una reducción significativa de la fuerza. Ejemplos de pasta de papel que es diana del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, pasta de papel desechado, pasta de cartón reciclado, pasta de papel de envolver, pasta con sulfito, tratada termo-mecánicamente y otras pastas de alto rendimiento.

Además, la presente invención proporciona un método para producir un pienso para animales que tiene una digestibilidad mejorada, comprendiendo el método la etapa: de tratar un pienso para animales con una cualquiera de entre la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención y la preparación de celulasas de la presente invención. De acuerdo con el método de la presente invención, se puede mejorar la digestibilidad de glucano en el pienso en el cuerpo de un animal, por ejemplo.

Hongos filamentosos que expresan cantidades reducidas de la proteína que tiene actividad p-glucosidasa

La presente invención proporciona un hongo filamentoso que expresa una cantidad reducida de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención. El hongo filamentoso es preferentemente un hongo filamentoso que pertenece al género Acremonium, y más preferentemente Acremonium cellulolyticus. La expresión de la proteína que tiene una actividad p-glucosidasa de la presente invención (proteína endógena) en el hongo filamentoso se puede reducir utilizando técnicas generales, tales como, por ejemplo, un método de ARN de interferencia, método de ARNADN antisentido, y recombinación homóloga. Los métodos para preparar las moléculas de polinucleótido (por ejemplo, un ARNip, un ARN antisentido, un ADN antisentido, un polinucleótido que comprende una secuencia homóloga a un ADN diana para la recombinación, y similares) utilizados en estas técnicas, para preparar vectores que comprenden estos polinucleótidos, e introducir los vectores en huéspedes se conocen por los expertos en la técnica. Cuando la celulosa ampliamente distribuida entre las plantas y demás se degrada utilizando el hongo filamentoso producido de esta manera, no se produce glucosa que es un producto de degradación final en el procedimiento de degradación, sino que se produce selectivamente la celobiosa en la que dos moléculas de glucosa se unen por un enlace p-1,4. La celobiosa tiene un sabor dulce pero no se degrada en el cuerpo humano. En consecuencia, la celobiosa es útil como edulcorante para una alimentación sana y alimentos para pacientes diabéticos, una materia prima cosmética, o una materia prima para medicamentos. Utilizando el hongo filamentoso de la presente invención, se pueden proporcionar las materias primas de estos productos con un coste reducido.

Ejemplos

La presente invención se describirá más específicamente por medio de Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los Ejemplos posteriores mientras esté aún en la esencia de la presente invención.

Ejemplo 1. Purificación de p-glucosidasa de Acremonium cellulolyticus

Se preparó una enzima de celulasa en polvo secada por pulverización a partir de Acremonium cellulolyticus, y se disolvió en un tampón de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,0) que contenía 0,5 M de (NH4)2SÜ4. Se retiraron las impurezas por centrifugación refrigerante de altas prestaciones. Un sobrenadante obtenido de esta manera se purificó como material de partida para la purificación enzimática de acuerdo con un método que se presenta posteriormente.

(a) Cromatografía hidrófoba (Parte 1)

En un tampón Tris-HCl (0,05 M, pH 7,0) que contenía 0,5 M de (NH4)2SÜ4, se adsorbió una proteína contenida en el sobrenadante a una HiTrap Butyl FF (fabricada por GE Healthcare). Después, en un tampón Tris-HCl (0,05 M, pH 7,0) que contenía 0,5 M de (NH4)2SÜ4, la proteína adsorbida se sometió a una elución en gradiente lineal para fraccionar una fracción que indicaba la actividad p-glucosidasa.

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(b) Cromatografía hidrófoba (Parte 2)

Una proteína de la fracción obtenida en (a) se adsorbió de nuevo en una HiTrap Butyl FF (fabricada por GE Healthcare). Después la proteína adsorbida se sometió a una elución en un gradiente lineal por el mismo método que en (a) para fraccionar una fracción que indique la actividad p-glucosidasa.

(c) Cromatografía de intercambio aniónico fuertemente básica

En un tampón Tris-HCl (0,05 M, pH 7,0) se adsorbió una proteína de la fracción obtenida en (b) a una MonoQ (fabricada por GE Healthcare). La proteína adsorbida se sometió a una elución en gradiente lineal en un tampón Tris-HCl (0,05 M, pH 7,0) que contenía 0 M a 1 M de NaCl para fraccionar una fracción que indique actividad p- glucosidasa.

Ejemplo 2. Determinación parcial de secuencias de aminoácidos de la p-glucosidasa purificada

La fracción que tiene una actividad p-glucosidasa fraccionada por la cromatografía de intercambio aniónico fuertemente básica del Ejemplo 1 se separó por electroforesis utilizando un 12 % de gel SDS-PAGE mini (fabricado por TEFCO) y se identificó la p-glucosidasa B (acBGLB) de Acremonium cellulolyticus. Una banda de acBGLB se cortó y entonces se carboximetiló de manera reductora, seguido por el tratamiento con lisil endopeptidasa. Este producto degradado se separó por electroforesis utilizando un 12 % de Gel SDS-PAGE mini (fabricado por TEFCO, y se transfirió a una membrana PVDF (fabricada por Millipore Corporation). Una banda del fragmento peptídico obtenido de esta manera se cortó. La secuencia de aminoácidos del extremo N del fragmento peptídico se determinó utilizando un secuenciador proteico Modelo 492 (fabricado por Applied Biosystems Inc.). Las secuencias de aminoácidos parciales (("BGLB-LE-1" y "BGLB-LE-2") de la acBGLB determinadas de esta manera se presentaron en las SEQ ID NO: 6 y 7, respectivamente.

Ejemplo 3. Clonación de un gen de acBGLB

(1) Aislamiento del ADN genómico

Se cultivó la cepa ACCP-5-1 de Acremonium cellulolyticus en un medio (s) (un 2 % de caldo, un 0,5 % de extracto de levadura y un 2 % de glucosa) a 32 °C durante 2 días, y las células fúngicas se recolectaron por centrifugación. Se aisló un ADN genómico de las mismas a partir de las células fúngicas obtenidas, de acuerdo con el método de Horiuchi et al. (H. Horiuchi et. al., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988)).

(2) Adquisición del fragmento genético de acBGLB

Basándose en las secuencias de aminoácidos parciales de la acBGLB, se prepararon los siguientes cebadores.

BGLB-F: CCNTTYGTNGGNAAYACNGCNGCNCC (SEQ ID NO: 8)

BGLB-R: CATDATRTANCCNGGRAANCC (SEQ ID NO: 9)

Utilizando BGLB-F y BGLB-R como cebadores y el ADN genómico como matriz, se llevó a cabo una PCR. La PCR se llevó a cabo utilizando la polimerasa taq LA (fabricada por Takara Bio Inc.). La PCR se llevó a cabo en 35 ciclos de cada una de “94 °C durante 30 segundos, 53 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 2 minutos”. El fragmento de ADN de 650 pb amplificado de esta manera se insertó en un vector plasmídico pCD2.1-TOPO utilizando el kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen Corporation) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. De esta manera se obtuvo un plásmido "TOPO-pBGLB-partial".

La secuencia del fragmento de ADN insertado clonado en el plásmido "TOPO-pBGLB-partial" se determinó utilizando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (fabricado por Applied Biosystems Inc.) y el Analizador Genético ABI PRISM (fabricado por Applied Biosystems Inc.) de acuerdo con los protocolos adjuntos a los mismos. La secuencia de bases obtenida de esta manera se tradujo en una secuencia de aminoácidos. Se llevó a cabo la búsqueda de homología en la secuencia de aminoácidos. Como resultado, la secuencia de aminoácidos presentaba una homología del 72 % con la p-glucosidasa (XP_001216552) derivada de Aspergillus terreus y una homología del 88 % con la p-glucosidasa (XP_002149046.1) derivada de Penicillium marneffei. De esta manera, se determinó que el fragmento de ADN era parte del gen de la p-glucosidasa (familia de la glucósido hidrolasa 3).

(3) Adquisición del gen de acBGLB de longitud completa por el método de PCR inversa

Se llevó a cabo el método de la PCR inversa de acuerdo con el método de Triglia et al. (T. Triglia et. al., Nucleic Acids Research, 16, 8186, (1988)). El ADN genómico de Acremonium cellulolyticus se digirió con ScaI durante una noche y se preparó un ADN circular a partir del fragmento digerido utilizando Mighty Mix (fabricado por Takara Bio Inc.). La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN circular como matriz y se prepararon los siguientes cebadores basándose en la información de secuencia de bases sobre el fragmento genético de acBGLB. Se obtuvieron una región 5' corriente arriba y una región 3' corriente abajo del gen acBGLB.

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BGLB-inv-F: TAGGCGTTCGTTATGCGAAC (SEQ ID NO: 10)

BGLB-inv-R: AAACGAGATTCCAGATGGCG (SEQ ID NO: 11)

La región corriente arriba 5' y la región 3' corriente abajo se analizó por el método descrito en el Ejemplos 3- (2). Se determinó la secuencia del gen BGLB de longitud completa.

Basándose en la secuencia de bases obtenida por el método de la PCR inversa, se prepararon los siguientes cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando el aDn genómico como matriz, para amplificar el gen BGLB.

pBGLB-F: CTGGACCTATATTCCCCGAT (SEQ ID NO: 12) pBGLB-R: TGGTTTGTCCATACTGCGTC (SEQ ID NO: 13)

El ADN amplificado de esta manera se insertó en un vector plasmídico pCR2.1-TOPO con un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen Corporation) para obtener un plásmido “pGBLB". Una cepa TOP10 de Escherichia coli (fabricada por Invitrogen Corporation) se transformó con el plásmido “pGBLB” obtenido. De esta manera se obtuvo la cepa de “Escherichia coli TOP10/pBGLB”.

(4) Preparación de un ADNc acBGLB y análisis de intrón de ADN genómico acBGLB

Se cultivó una cepa ACCP-5-1 de Acremonium cellulolyticus en un medio de inducción de celulasa a 32 °C durante 2 días, y se recolectaron las células fúngicas por centrifugación. Después de congelarlas con nitrógeno líquido, las células fúngicas resultantes se molieron utilizando un mortero de mano. El ARN total se aisló a partir de las células fúngicas con ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. Además, se purificó un ARNm a partir del ARN total con el kit de purificación de ARNm (Pharmacia Corporation) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo.

Se sintetizó un ADNc a partir del ARNm obtenido de esta manera con el kit de síntesis de ADNc TimeSaver (Pharmacia Corporation) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. Se prepararon los siguientes cebadores que contienen el codón de inicio y el codón de parada a partir de la secuencia genética acBGLB, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc como matriz.

BGLB-N: ATGTATTCCGCATTTCTTTTGCTGC (SEQ ID NO: 14)

BGLB-C: CTATTGTAGGCATTGAGAATACCAT (SEQ ID NO: 15)

La secuencia de bases (SEQ ID NO: 1) del ADNc amplificado de esta manera se analizó por el método descrito en el Ejemplo 3-(2), y se comparó con la secuencia de bases del ADN genómico de pBGLB. De esta manera, se determinaron las posiciones de los intrones en el ADN genómico.

(5) Estimación de la secuencia de aminoácidos de acBGLB

Los exones e intrones del ADN genómico de acBGLB aislados por el método descrito anteriormente se componían de 2630 pb que mostraban las posiciones 218 a 2847 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 2. Además, el ADN genómico de acBGLB contenía tres intrones que se muestran desde la 734a a la 792a, 1665a a 1717a, y 2523a a 2601a de secuencia de bases de SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de la acBGLB prevista a partir de la fase de lectura abierta (ORF) era como se muestra en la SEQ ID NO: 3. Una parte de la secuencia de aminoácidos prevista a partir de la ORF correspondía con la secuencia interna de la acBGLB determinada en el Ejemplo 2. Este hecho revelaba que el ADN genómico aislado codificaba la acBGLB. Nótese que, utilizando el software de predicción de secuencia de señal SignalP 3.0, se estimó que los restos de aminoácidos de -18 a -1 de la acBGLB eran una secuencia de señal.

Ejemplo 4. Expresión del gen acBGLB en Trichoderma viride

(1) Modificación de un codón del gen de acBGLB para la expresión adecuada en Trichoderma viride

Para expresar el gen acBGLB a alto nivel como una proteína activa en Trichoderma viride, se modificó el gen acBGLB. Como resultado de ensayo y error, se descubrió un ADN que comprendía la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4 que se modificó a partir del gen acBGLB un 13,2 % o más de las bases. En el diseño de este gen de acBGLB modificado, se modificaron 16 tipos de aminoácidos entre los 20 tipos de aminoácidos en la secuencia de bases codificante; además, se tuvo en cuenta la frecuencia de distribución de codones utilizada en Trichoderma viride. Este gen acBGLB modificado se sintetizó artificialmente por Gene Design Inc. En la síntesis artificial, se hizo el diseño de manera que XbaI y SnaBI estaban contenidas en una secuencia corriente arriba del codón de inicio, y que SalI y XbaI estaban contenidas corriente abajo del codón de parada. De esta manera, se obtuvo un plásmido “pBHLBkai” en el que el gen acBGLB con el codón modificado se insertó en XbaI de pUC19.

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(2) Construcción del plásmido de expresión de BGLB con el codón modificado BGLBkai-pCB1

El plásmido “BGLBkai” se escindió con SnaBI y SalI, y se obtuvo un fragmento genético “BGLBkai-N” de aproximadamente 2,7 kpb. Entre tanto, para retirar un casete de resistencia a la higromicina B del pCB1-Eg3X (Publicación Internacional N° WO 98/11239), el pCB1-Eg3X se escindió con una enzima de restricción Xbal, y entonces se circularizó de nuevo utilizando el kit de ligadura de ADN TaKaRa Mighty Mix (fabricado por TAKARA SHUZO CO., LTD.). De esta manera se obtuvo un plásmido “pCB1-Eg3X-hphless”. El "pCB1-Eg3X-hphless" se escindió con Stul y Xhol, y se recolectó un fragmento de aproximadamente 7 kpb. Se ligó a este, aproximadamente 2,7 kpb del fragmento genético “BGLBkai-N” utilizando el kit de ligadura de ADN TaKaRa Mighty Mix (fabricado por TAKARA SHUZO CO., LTD.). De esta manera, se preparó un plásmido “BGLBkai-pCB1”. Las condiciones de reacción tales como la enzima seguían las condiciones del protocolo adjunto al kit. El plásmido “BGLBkai-pCB1” se construyó de tal manera que expresara la acBGLB modificada utilizando su propio codón de inicio en el huésped Trichoderma viride.

(3) Preparación de un Trichoderma viride transformante con el plásmido “BGLBkai-pCB1”

Se transformó el Trichoderma viride con el plásmido “BGLBkai-pCB1” obtenido en el Ejemplo 4-(2) de acuerdo con el método descrito en la Publicación Internacional N° WO 2005/056787. Se llevó a cabo la transformación por un método de co-transformación utilizando la cepa 2 de Trichoderma viride deficiente en un gen para la biosíntesis de uracilo (pyr4) como huésped y un gen pyr4 de Neurospora crassa como marcador genético. La cepa 2 de Acremonium cellulolyticus se cultivó en 50 ml de un medio formador de célula fúngicas (un 1 % de extracto de levadura, un 1 % de extracto de malta, un 2 % de polipeptona, un 2,5 % de glucosa, un 0,1 % de fosfato hidrógeno dipotásico, un 0,05 % de sulfato magnésico heptahidrato, un 0,001 % de uridina (pH 7,0)) a 28 °C durante 24 horas, y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos, y se recolectaron las células fúngicas. Las células fúngicas obtenidas se lavaron con 0,5 mol/l de sacarosa, y se suspendió en una solución enzimática formadora de protoplastos (1 mg/ml de p-glucuronidasa, 0,3 mg/ml de quitinasa, 0,3 mg/ml de zimoliasa, 0,5 mol/l de sacarosa) que se había filtrado en algodón. La mezcla se agitó a 30 °C durante 60 minutos, de manera que las hifas se formaron en protoplastos. Esta suspensión se filtró, y después de centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos para recolectar los protoplastos, que se lavaron con tampón SUTC (0,5 mol/l de sacarosa, 10 mmol/l de cloruro cálcico, 10 mmol/l de Tris-HCl (pH 7,5)).

Los protoplastos se suspendieron en 100 pl de un tampón SUTC, al que se añadieron 10 pg de una solución de ADN 10 pl que contenía el plásmido “BGLBkai-pCB1” y 10 pl de una solución de ADN que contiene el gen pyr4. El resultado se dejó en reposo en hielo durante 5 minutos. Después, se añadieron 400 pl de una solución de PEg (un 60 % de PEG4000, 10 mmol/l de cloruro cálcico, 10 mmol/l de Tris-HCl (pH 7,5)), que se dejó en reposo en hielo durante 20 minutos. Después, se añadieron 10 ml de un tampón SUTC, que se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos. Los protoplastos recolectados de esta manera se suspendieron en 1 ml de un tampón SUTC, y cada una de las soluciones de 200 pl de la suspensión de protoplastos se cubrió con agar blando en un medio mínimo que contenía 0,5 mol/l de sacarosa, seguido por el cultivo a 28 °C durante 5 días. Posteriormente, las colonias en crecimiento se trasfirieron de nuevo en un medio mínimo. Las colonias formadas se utilizaron como transformantes.

(4) Cultivo e identificación de transformantes “BGLBkai-pCB1”

El plásmido “BGLBkai-pCB1” se introdujo en cada uno de los medios mínimos. Se seleccionó una línea que crecía en el medio, y se cultivó de acuerdo con el documento WO 98/11239 A. El sobrenadante del cultivo resultante se separó por electroforesis utilizando un 12 % de Gel SDS-PAGE mini (fabricado por TEFCO). Se seleccionó un sobrenadante de cultivo que tiene una banda detectable favorablemente que migraba la misma distancia que la de la acBGLB identificada en el Ejemplo 2.

(5) Identificación de la secuencia de aminoácidos parcial de la acBGLB modificada recombinante

Para confirmar que la proteína expresada en una gran cantidad en el Ejemplo (4)-4 era la acBGLB modificada, se determinó la secuencia de aminoácidos parcial. Primero, la proteína del sobrenadante del cultivo se separó por electroforesis utilizando un 12 % de Gel SDS-PAGE mini (fabricado por TEFCO). Se trató una banda correspondiente con la acBGLB separada de acuerdo con el método del Ejemplo 2 con lisil endopeptidasa. El producto degradado se separó por electroforesis utilizando un 12 % de Gel SDS-PAGE mini (fabricado por TEFCO), y se transfirió en una membrana PVDF (fabricada por Millipore Corporation). Se cortó una banda del fragmento peptídico obtenido de esta manera. El extremo N de la secuencia de aminoácidos del fragmento peptídico se determinó utilizando un secuenciador proteico Modelo 492 (fabricado por Applied Biosystems Inc.). Como resultado, la secuencia de aminoácidos del extremo N se correspondía con la secuencia de aminoácidos parcial (SEQ ID NO: 6) de la acBGLB.

Ejemplo 5. Medición de la actividad enzimática del transformante de Trichoderma viride

La actividad p-glucosidasa se midió utilizando el sobrenadante del cultivo del transformante “BGLBkai-pCB1” obtenido en el Ejemplo 4-(4). El método de medición seguía el método descrito en la bibliografía (Methods in

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ENZYMOLOGY, vol. 160, Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood ed. p 109-110). Nótese que la actividad p-glucosidasa se define como una actividad de producción de 1 pmol de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil- p-glucósido en 1 minuto, y se representó como actividad (U/ml) por ml de sobrenadante del cultivo. El resultado es como se muestra en la Tabla 1. Como es evidente en la Tabla 1, el transformante mostraba una actividad aproximadamente 7,5 veces más alta que una cepa parental (la cepa de Trichoderma viride original no deficiente en un gen de biosíntesis de uracilo).

[Tabla 11

: Actividad p-glucosidasa (U/ml)

Cepa parental: 211

Transformante: 1592

Esto revelaba que un microorganismo productor de celulasa que tiene una baja actividad p-glucosidasa sobreexpresaba p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus, y que era posible de esta manera aumentar la actividad p-glucosidasa del microorganismo.

Aplicabilidad industrial

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención hace posible obtener una p-glucosidasa derivada de Acremonium cellulolyticus como una proteína purificada o una preparación de celulasas con alto rendimiento. Utilizando la p-glucosidasa o preparación de celulasas obtenida de esta manera, se puede promover la sacarificación a partir de biomasa en glucosa, y se pueden llevar a cabo tratamientos y modificaciones en un sustrato basado en celulosa eficazmente. Además, se puede utilizar esta p-glucosidasa y preparación de celulasas con un coste reducido. Además, utilizando un hongo filamentoso que expresa una cantidad reducida de p- glucosidasa de la presente invención, se pueden producir eficazmente la celobiosa útil como edulcorante, una materia prima en cosmética, o una materia prima farmacológica.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Meiji Seika Kaisha, Ltd.

<120> Proteína que tiene actividad beta-glucosidasa y su uso

<130> M0895

<150> JP 2009-190840 <151 > 20-8-2009

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 <211 > 2442 <212> ADNc

<213> Acremonium cellulolyticus <220>

<221> sig_peptide <222> (1)..(54)

<220>

<221> mat_peptide <222> (55)..(2439)

<220>

<221> CDS <222> (1)..(2439)

<400> 1

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido de uno cualquiera de los siguientes (i) a (v), que codifica una proteína que tiene una actividad p- glucosidasa:

(i) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de las posiciones 1-2439 de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de bases de las posiciones 218- 2847 de SEQ ID NO: 2;

(iii) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que 40 o menos aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido;

(iv) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(v) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1795 de SEQ ID NO: 3.
2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que se deriva de un hongo filamentoso.
3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el hongo filamentoso es Acremonium cellulolyticus.
4. Un polinucleótido de cualquiera de los siguientes (i) y (ii), que codifica una proteína que tiene actividad p-glucosidasa:

(i) un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y

(ii) un polinucleótido que comprende una región codificante de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4.
5. Un polinucleótido que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4 en la que 30 o menos bases se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, codificando el polinucleótido una proteína que tiene una actividad p- glucosidasa.
6. Un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las posiciones 1-795 de SEQ ID NO: 5.
7. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una proteína que tiene actividad p-glucosidasa seleccionada de entre (i) a (iv):

(i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(ii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que 40 o menos aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido;

(iii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene un 95 % de identidad secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(iv) una proteína de cualquiera de (i) a (iii) de la que se ha retirado una secuencia de señal, secuencia de señal es una secuencia de aminoácidos de entre las posiciones -18 a -1 de la aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
10. Un método para la producción de la proteína de acuerdo con la reivindicación 9, comprendiendo etapas de:

cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8; y recolectar una proteína expresada por la célula huésped y/o un cultivo de la misma.
11. Una preparación de celulasa que comprende la proteína de acuerdo con la reivindicación 9.
12. Un método para la degradación o la conversión de un material celulósico, comprendiendo el método la etapa de tratar el material celulósico con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Un método para la producción de un material celulósico degradado o convertido, comprendiendo el método las etapas de:

tratar un material celulósico con una cualquiera de la proteína de acuerdo con la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11; y recolectar un material celulósico degradado.

o más con la

en la que la secuencia de

el método las
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el material celulósico degradado es un azúcar.
15. Una composición detergente que comprende una cualquiera de la proteína de acuerdo con la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11.

5
16. Un método para el tratamiento de una fibra que contiene celulosa, comprendiendo el método la etapa de poner una cualquiera de la proteína de acuerdo con la reivindicación 9, la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11 y la composición detergente de acuerdo con la reivindicación 15 en contacto con la fibra que contiene celulosa.

10
17. Un método para el destintado de papel desechado, caracterizado el método por que una cualquiera de entre la proteína de la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11 se utiliza en una etapa de destintado del tratamiento del papel desechado con un agente de destintado.

15 18. Un método para la producción de pasta de papel que tenga un drenaje mejorado, comprendiendo el método la

etapa de tratar la pasta de papel con una cualquiera de entre la proteína de la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11.
19. Un método para la producción de un pienso para animales que tenga una digestibilidad mejorada, 20 comprendiendo el método la etapa de tratar un pienso para animales con una cualquiera de entre la proteína de acuerdo con la reivindicación 9 y la preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 11.

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GEN DE RESISTENCIA A AMPICILINA

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