JP2012039999A - 酵素の再利用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】セルロースの糖化分解において、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むキメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを併用し、セルロースの糖化分解反応終了時にセルロース系基質を添加し、キメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームをセルロース系基質に吸着させて分離する。
【選択図】図1
Description
化学的糖化処理は、アルカリ、酸を利用するものがあるが、古くより酸糖化がよく用いられている。酸糖化には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがあるが、何れも硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
本発明は、また、セルロースの糖化分解において繰り返し利用することが可能な酵素を提供することを目的とする。
本発明の酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むβ−グルコシダーゼ及びキメラβ−グルコシダーゼである。
本実施形態1は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する方法である。
本実施形態2は、セルロソームとCBMを有するβ−グルコシダーゼとを用いた、両酵素の再利用方法である。実施形態1とは、CBMを有する酵素をセルロソームとCBMを有するβ−グルコシダーゼとを含む2種類の酵素に特定した点で相違する。
すなわち、本実施形態の酵素の再利用方法においては、セルロース系の基質と、CBMを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとを含有する酵素反応液にセルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にセルロソーム及びCBMを有するβ−グルコシダーゼを結合させる第一ステップと、セルロース系の基質に結合したCBMを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを分離する第二ステップと、分離したCBMを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームにセルロース系の基質を加えて反応させる第三ステップとを含み、第一ステップから第三ステップを繰り返すことで、β−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用するものである。
酵素反応系に存在する複数の酵素をセルロース系基質に結合させて、酵素反応液からセルロース系基質に結合した酵素を分離する。セルロース系基質に結合した酵素の糖化効率は低下することなく繰り返し利用することができるので、複数の酵素を再利用することが可能となる。
本実施形態3は、セルロース系の基質がリグニンを含むセルロース系バイオマスである点で、実施形態2と異なる。
本実施形態4は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をタンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される1種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロース系の基質と結合及び/又は反応させる、酵素の再利用方法である。
ブロッキング剤は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素とセルロース系の基質との反応系に存在していればよいが、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる前にブロッキング剤と接触させておくことが好ましい。接触は、例えば、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を含む溶液にブロッキング剤を添加すればよい。
(1)市販のアスペルギルス・ニガー由来酵素(シグマ−アルドリッチ社製)。
(2)好熱嫌気性細菌であるサーモアナエロバクター・ブロッキATCC33075(Thermoanaerobacter brockii)(アメリカンタイプカルチャーコレクション)のβ−グルコシダーゼをもとにした組換えβ−グルコシダーゼ(以下、CglTという)。
サーモアナエロバクター・ブロッキからのゲノムDNAは、以下の手順により抽出した。0.5%セロビオースを含むBM7CO−CB液体培地を用いてサーモアナエロバクター・ブロッキを培養後、4℃にて10,000回転で5分間、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を溶菌させるために、10%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)を最終濃度が0.5%になるように添加するとともに、プロテナーゼK(1mg/ml)溶液が5μg/mlになるように加え、37℃で1時間反応させた。さらに10%臭化セチルトリメチルアンモニウム−0.7M塩化ナトリウム溶液を1%濃度になるように加え、65℃で10分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、15,000回転、5分間遠心分離にて水層を得た。
クロストリジウム・サーモセラムJK−S14株(NITE BP−627)を上記したBM7CO−CB培地の炭素源をセロビオースから微結晶セルロース10g/Lへ変更したBM7CO−CL培地を用いて6日間、60℃にて培養を行った。
このことは、一般的なβ−グルコシダーゼ基質として使用されるp−ニトロフェノールグルコピラノシドではうまく活性を示せないが、セルロース存在下においてはCBMの機能により活性が復帰することが明らかとなった。したがって、CBMをCglTと融合させるデメリットは人工基質を使用した際の活性低下に限定されることになる。
アンモニア浸漬処理稲わらを使用したリサイクル糖化法の工程を図8に示す。基本的に図4と同様のサイクルであるが、基質が1%セルロース量を含むアンモニア浸漬処理稲わらである点で異なる。また加水分解後残存する残渣を系外から除く工程を厳密に行った。残渣を系外から除くことにより、再利用回数を増やすことができる。
Claims (12)
- セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する、酵素の再利用方法。
- 前記セルロースに結合可能なモジュールがセルロソーム由来である、請求項1記載の酵素の再利用方法。
- 前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素である、請求項1記載の酵素の再利用方法。
- 前記酵素が、セルロソーム及びセルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼである、請求項1記載の酵素の再利用方法。
- 前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、セルロース結合モジュールを含むキメラ酵素である、請求項4記載の酵素の再利用方法。
- 前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼとクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロース結合モジュールとのキメラ酵素である、請求項4記載の酵素の再利用方法。
- 前記セルロース系の基質は、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される1種以上のブロッキング剤で処理されたリグニンを含むセルロース系バイオマスである、請求項1〜6のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
- 前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される1種以上のブロッキング剤を含む酵素溶液である、請求項1〜6のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
- セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させる前に、酵素反応後の残渣を除去することを含む、請求項1〜8のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
- タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される1種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる、請求項1〜9のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
- 還元剤の非存在下、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に反応させる、請求項1〜10のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
- 好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロースに結合可能なモジュールとを含む、β−グルコシダーゼ。
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