CN1209833A - 从纤维素织物中除去或漂白污斑或色斑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种除去或漂白存在于纤维素纤维品上的污斑或色斑的方法,其中将纤维品与含改性酶(杂合酶)的水介质接触,该改性酶包含与包含纤维素结合区的氨基酸序列相连的非纤维素水解酶的具催化活生的氨基酸序列。本发明还进一步涉及一种去污剂组合物,其中该组合物包括一种所讨论类型的杂合酶和一种表面活性剂,以及涉及一种洗涤被污染或染色的纤维素纤维品的方法,其中将该纤维品在其中加入了所述去污剂组合物的水介质中洗涤。

Description

从纤维素织物中除去或漂白污斑或色斑的方法
发明领域
本发明涉及一种用于清洁织物或纺织品，主要是纤维素织物或纺织品，尤其是用于除去或漂白存在于纤维素织物上的色斑的改善的酶促方法。
发明背景
许多年来就已知用于洗涤衣服(洗衣房洗涤)和其它类型的织物或纺织品的酶促主法。
常常发现一些类型的污斑或色斑的去除是这些洗涤过程中的一个难点。这些通常是来自淀粉，蛋白质，脂肪，红酒，水果(如茶藨子，樱桃，草莓或西红柿)，蔬菜(如胡萝卜或甜菜根)，茶，咖啡，调味品(如咖喱或胡椒粉)，体液，草或墨水(如来自圆珠笔或自来水笔)的污渍。
本发明的一个目的是通过修饰梅以改变(增加)酶对纤维素织物的亲和性，从而该被修饰的酶能与讨论的污斑或污渍更为紧密地接触，和/或接触时间更长而提高洗涤酶在常规洗涤条件下的效率。
发明概述
目前已惊奇地发现通过一种酶促方法可实现对纤维素织物或纺织品的改善的洗涤，尤其是可实现对存在于其上的色斑的有改进的除去或漂白，其中在该酶促方法中织物或纺织品与已被修饰而具有增加的与纤维素织物或纺织品的结合亲和性(相对于未修饰的酶)的酶接触。
发明详述
因此本发明尤其涉及一种用于除去或漂白存在于纤维素织物或纺织品上的污斑或色斑的方法，其中在水介质中织物或纺织品与一种被修饰的酶(酶杂合体)接触，该被修饰的酶包含与含纤维素结合区的氨基酸序列连接的非纤维素分解酶的催化(酶促)活性氨基酸序列。
污渍
根据本发明可被除去的污斑或色斑包括上面已提及的那些，即来自例如淀粉，蛋白质，脂肪，红酒，水果〔如茶藨子，樱桃，草莓或西红柿(尤其是蕃茄酱或空心粉中的西红柿)〕，蔬菜(如胡萝卜或甜菜根)，茶，咖啡，调味品(如咖喱或胡椒粉)，体液，草，或墨水(如来自圆珠笔或自来水笔)的污斑或色斑。作为根据本发明可被除去或漂白的适宜目标物的其它类型的污斑或色斑包括皮脂，土壤(即泥土)，粘土，油和涂料。
纤维素织物
术语“纤维素织物”意指从含纤维素的材料，如棉花，或从纤维素衍生材料制备(如从木浆或从棉花制备)的任何类型的织物，尤其是机织织物。
在本文中，术语“织物”指包括衣服和其它类型被加工的织物，并与术语“纺织品”可互换使用。
从天然产生的纤维素纤维生产的纤维素织物的实例为棉布，苧麻，黄麻和亚麻(亚麻)织物。从人造纤维素纤维生产的纤维素织物的实例为粘胶纤维(人造丝)和lyocell(如TencelTM)织物，在本发明上下文中还相关的是纤维素纤维(如粘胶，lyocell，棉花，苧麻，黄麻或亚麻)与其它纤维如与动物毛发纤维，如羊毛，羊驼毛或骆驼毛，或与聚合物纤维，如聚酯，聚丙烯酸酯，聚酰胺或聚乙酸酯纤维的所有混纺品。
混合纤维素织物的具体实例为粘胶纤维/棉花混纺品，lyocell/棉花混纺品(如TencelTM/棉花混纺品)，粘胶纤维/羊毛混纺品，lyocell/羊毛混纺品，棉花/羊毛混纺品，棉花/聚酯混纺品，粘胶纤维/棉花/聚酯混纺品，羊毛/棉花/聚酯混纺品和亚麻/棉花混纺品。
纤维素结合区
虽然在专利和科技文献中已描述了许多类型的碳水化合物结合区，但其中大多数-许多来自纤维素分解酶(纤维素酶)-通常被称为“纤维素结构区”；因此通常的纤维素结合区(CBD)将是在纤维素酶中存在并优选与纤维素和/或与其多糖或寡糖片段结合的那些。
纤维素结合区(和其它碳水化合物结合区)是作为由两个或多个多肽氨基酸序列区域组成的大的多肽或蛋白的组成部分，尤其是在水解酶中出现的多肽氨基酸序列，其中水解酶通常包括含有底物水解的活性部位的催化区和用于与讨论的碳水化合物底物结合的碳水化合物结合区。这些酶可包括多于一个的催化区和一，二或三个碳水化合物结合区，并且它们可进一步包括将碳水化合物结合区与催化区连接的一个或多个多肽氨基酸序列区，后一种类型的区域通常被称为“接头”。
包含纤维素结合区的水解酶的实例为纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰基酯酶和壳多糖酶。还在藻类，如红藻紫菜(Porphyra purpurea)中发现了非水解性多糖结合蛋白形式的“纤维素结合区”〔参见P.Tomme等，纤维素结合区-分类和在对不溶性碳水化合物的酶促降解中的性质，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS Symposium Series,No.618(1996)〕。然而，大多数已知的CBD〔P.Tomme等(同上)分类并称为“纤维素结合区”〕来自纤维素酶和木聚糖酶。
在本文中，术语“纤维素结合区”应按如上述文献(P.Tomme等，见上)相同的方式来理解。P.Tomme等的参考文献将多于120种的“纤维素结合区”分类成在底物结合机理方面可能具有不同功能或作用的10个家族(Ⅰ-Ⅹ)。然而，预期在未来将出现新的家族代表和另外的家族，在本发明这一方面事实上已鉴定出了一个这种新的CBD家族的代表(参见本文实施例2)。
在其中出现CBD的蛋白/多肽(如酶，通常为水解酶，如纤维素酶)中，CBD可位于N或C末端或位于中间的位置。
构成CBD本身的多肽或蛋白(如水解酶)的那部分通常由多于约30个少于约250个氨基酸残基组成。例如：根据P.Tomme等(见上)列出的并分类在家族Ⅰ的那些CBD由33-37个氨基酸残基组成，列出并分类在家族Ⅱa的那些由95-108个氨基酸残基组成，列出并分类在家族Ⅵ的那些由85-92个氨基酸残基组成，同时列出并分类在家族Ⅶ的一个CBD(来自热纤梭菌的纤维素酶)由240个氨基酸残基组成。因此，构成CBD本身的氨基酸序列的分子量通常在约4kD-约40kD的范围内，并通常低于约35kD。
酶杂合体
本发明说明书和权利要求书中涉及的酶的分类号(EC号)与生物化学和分子生物学国际联盟命名委员会的推荐(1992),AcademicPress Inc.1992一致。
本发明所使用的被修饰的酶(酶杂合体)包括可用于清洗织物或纺织品(通常为在洗涤过程中从织物或纺织品中除去或漂白污斑或色斑)的非纤维素分解酶的具催化活性(酶促活性)的氨基酸序列(通常为多肽氨基酸序列)(即为非纤维素酶的酶的具催化活性的氨基酸序列)，尤其是与包含纤维素结合区的氨基酸序列融合(连接)的选自下面各种的酶：淀粉酶(如α-淀粉酶，EC3.2.1.1)，蛋白酶(即肽酶EC 3.4)，脂酶(如甘油三酯脂酶，EC3.1.1.3)和氧化还原酶(如过氧化物酶，EC1.11.1，如分类在EC1.11.1.7的那些；或苯酚氧化氧化酶，如漆酶，EC1.10.3.2，或分类在EC1.10.3的其它酶)。讨论的具催化活性的氨基酸序列可包含或全部或基本上全部由讨论的成熟酶的全部氨基酸序列组成，或可由基本上保留了与全序列相同的催化(酶促)性质的全序列的一部分组成。
所述类型的被修饰的酶(酶杂合体)以及其制备和纯化的详细描述在本领域中是已知的〔参见例如WO90/00609,WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwood等生物技术和生物工程44(994)1295-1305页〕。可通过将包含至少一个编码通过或不通过接头与编码感兴趣的酶的DNA序列相连的纤维素结合区的DNA片段的DNA构建物转化至宿主细胞中，并培养转化的宿主细胞以表达融合基因来制备它们。以这种方式可获得的一个相关(但非限制性的)类型的重组产物(酶杂合体)，其在本领域中通常被称为“融合蛋白”，可通过一个下面的通式来描述：
A-CBD-MR-X-B
A-X-MR-CBD-B
在这些通式中，CBD是一个至少包含该纤维素结合区(CBD)本身的氨基酸序列。
MR(中间区；接头)可为一个键或包含1至约100个氨基酸残基，尤其是2-40个氨基酸残基，如2-15个氨基酸残基的连接基团。MR原则上可换为非氨基酸接头。
X为包含上述的由编码感兴趣的非纤维素水解酶的DNA序列所编码的多肽氨基酸序列的催化(酶促)活性序列的氨基酸序列。
A和B部分独立地任选存在或不存在。当其存在时，A或B部分构成了CBD或X部分的末端延伸，并且通常包含一个或多个氨基酸残基。
因此从上面尤其可清楚地看出所述类型的酶杂合体中的CBD可定位于酶杂合体中的C-末端，N-末端或中间。相应地，要讨论类型的酶杂合体中的X部分可定位于酶杂合体的N-末端，C-末端或中间。
本发明中感兴趣的酶杂合体包括1个以上的CBD，如两个或多个CBD直接互相连接，或通过间隔区或接头序列(通常由适宜长度的氨基酸残基序列组成)互相分离。所讨论类型的酶杂合体中的两个CBD还可例如通过如上定义的-MR-X-部分互相分开。
在构建所讨论类型的酶杂合体中非常重要的一点是对蛋白酶解降解的稳定性。两区和多区蛋白尤其在连接这些区的接头区对蛋白水解裂解敏感。导致这种裂解的蛋白酶可例如为枯草杆菌蛋白酶，已知它通常显示出宽的底物特异性〔参见例如：Grφn等，生物化学31(1992),pp.6011-6018；Teplyakov等，蛋白质工程5(1992),pp.413-420〕。
真核生物中接头残基的糖基化为防止蛋白酶降解的一种自然方法。另一种方法是采用更不利于周围蛋白酶的氨基酸。接头的长度在蛋白酶接近性方面也起作用。哪种“方案”最佳取决于酶杂合体在其中起作用的环境。
当构建新的酶杂合体分子时，接头稳定性因而变为一个具重要意义的一点。本发明给出的实施例中描述的各种接头(参见下文)都考虑了这一方面。
可用于制备CBD的纤维素酶(纤维素酶基因)
本领域已熟知适用于分离纤维素酶基因的技术。在本文中，术语“纤维素酶”和“纤维素分解酶”指催化纤维素降解为葡萄糖，纤维二糖，三糖和/或其它纤维寡糖的酶。
本文中优选的纤维素酶(即包含优选的CBD的纤维素酶)为微生物纤维素酶，尤其是细菌或真菌纤维素酶。内切葡聚糖酶，主要是内切-1,4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，尤其是单组分(重组)内切-1,4-β-葡聚糖酶是优选的一类纤维素酶。
有用的细菌纤维素酶的实例为来自或可由选自下面的细菌产生的纤维素酶：假单孢菌属，芽孢杆菌属，纤维单孢菌属，梭状芽孢杆菌属，微孢菌属，栖热袍菌属，Caldocellum和放线菌纲，如链霉菌属，高温单孢菌属和热酸菌属，尤其是来自解纤维假单孢菌，灿烂芽孢杆菌，类肥纤维单孢菌，热纤维梭状芽孢杆菌，双孢微孢菌，褐色高温单孢菌，解纤维高温单孢菌和解纤维热酸菌。
该纤维素酶可为酸性，中性或碱性纤维素酶，即分别在酸性，中性或碱性范围内显示出最大的纤维素分解活性。
有用的纤维素酶为酸性纤维素酶，优选真菌酸性纤维素酶，它来自或可由选自木霉属，漆斑菌属，曲霉属，Phanaerochaete，脉孢菌菌，Neocallimastix和葡萄孢属的真菌产生。
优选的有用的酸性纤维素酶为来自或可由选自绿色木霉，木霉T.reesei，木霉T.longibrachiatum，疣孢漆斑霉，黑曲霉，米曲霉，Phanaerochaete chrysosporium，粗糙脉孢霉、Neocallimastix partriciarum和灰色葡萄孢霉的真菌产生。
另外有用的纤维素酶为中性或碱性纤维素酶，优选为真菌中性或碱性纤维素酶，它来自或可由选自曲霉属，青霉属，毁丝霉属，腐质霉属、耙霉属、镰孢霉属、葡萄穗霉属、帚霉属、毛壳菌属、疣孢霉属、轮枝孢菌属、漆斑菌属、丝葚霉属，粘帚霉属，头孢属和枝顶孢属的真菌产生。
优选的碱性纤维素酶为来自或可用选自鞋垫腐质霉(Humicola insolens)，尖镰孢、嗜热毁丝霉，微紫青霉和头孢菌的真菌种，优选来自鞋垫腐质霉DSM 1800、尖镰孢DSM2672、嗜热毁丝霉CBS1176.65，和头孢菌RYM-202的真菌菌种产生。
一种优选的纤维素酶为与针对来自鞋垫腐质霉DSM1800的高度纯化的约43kD内切葡聚糖酶的抗体发生免疫反应的碱性内切葡聚糖酶，或为所述43kD内切葡聚糖酶的衍生物并显示纤维素酶活性。
其它有用的纤维素酶的实例为真菌或细菌来源的亲代纤维素酶的变异体，如可来自于腐质霉属，木霉属或镰孢霉属真菌中的一个种的菌株的亲代纤维素酶的变异体。
纤维素结合区的分离
为了分离例如纤维素酶的纤维素结合区，可使用一些遗传工程方法。一种方法使用限制性酶以除去基因的一部分，接着框内融合剩余基因-载体片段以获得编码(对于特定基因片段)截短的蛋白质的突变基因。另一种方法包括使用外切核酸酶，如Bal31以系统性地在外部从DNA的5′和3′末端或在内部从基因内的限制性缺口除去核苷酸。这些除去基因的方法产生编码缩短的基因分子的突变基因，然后可评价其表达产物的底物结合(如纤维素结合)能力。用于评价结合能力的适宜的底物包括纤维素材料，如AvicelTM和棉花纤维。其它方法包括使用能从所讨论的蛋白质的多肽链的剩余部分裂解CBD(如末端CBD)的选择性或特异性的蛋白酶。
如已说明的(参见上文)，一旦确定了编码底物结合(碳水化合物)区的核苷酸序列，作为DNA或杂色体DNA，它可被以各种方式操作以将其融合在编码感兴趣的酶或具酶活性的氨基酸序列的DNA序列中。接着使用或不使用接头将编码碳水化合物结合性氨基酸序列的DNA片段与编码感兴趣的酶或具酶活性的氨基酸序列的DNA连接起来。接着可将得到的连接DNA以各种方式进行操作以实现表达。优选的微生物表达宿主包括一些曲霉属的种(如黑曲霉或米曲霉)，芽孢杆菌属的种，以及微生物如大肠杆菌或酿酒酵母。
淀粉水解酶
适宜作为在本发明中采用的酶杂合体类型基础的淀粉酶(如α-或β-淀粉酶)包括细菌或真菌来源的那些。本文中包括这些淀粉酶的化学或遗传修饰的突变体。相关的α-淀粉酶包括如可从芽孢杆菌属的种获得的α-淀粉酶，尤其是详细描述在GB1296839中的地衣芽孢杆菌的一个特殊菌株。相关的可购买到的淀粉酶包括DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(均可得自Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd，丹麦)，和RapidaseTM和MaxamylTMP(可得自GistBrocades，荷兰)。
其它有用的淀粉水解酶为CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC2.4.1.19)，如可从芽孢杆菌属，热厌氧杆菌属或热厌氧细菌的种获得的那些。
蛋白质水解酶
适宜作为本发明采用的酶杂合体类型基础的蛋白酶(肽酶)包括动物，植物或微生物来源的那些。优选微生物来源的那些。本发明包括这些蛋白酶的化学或遗传修饰的突变体。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，尤其是来自芽孢杆菌属的那些，如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(如猪或牛来源)和描述在WO89/06270中的镰孢霉属蛋白酶。
相关的可购得的蛋白酶包括AlcalaseTM,SavinaseTM,Primase,DurazymTM和EsperaseTM(均可得自Novo Nordisk A/S,Bagsvaserd，丹麦)，MaxataseTM,MaxacalTM,MaxapemTM和ProperaseTM(可得自Gist-Brocades，荷兰)，PurafectTM和PurafectTMOXP(可得自Genencor International)，和OpticleanTM和OptimaseTM(可得自by Solvay Enzymes)。
脂解酶
适宜作为本发明采用的酶杂合体类型基础的脂解酶(脂酶)包括细菌或真菌来源的那些。本文包括这些脂酶的化学或遗传修饰的突变体。
有用的脂酶的实例包括腐毛状腐质霉H.lanuginosa脂酶，如在EP258068和EP305216中描述的；Rhizomucor miehei脂酶，如在EP238023中描述的；假丝酵母属的脂酶，如南极假丝酵母脂酶，如在EP214761中描述的南极假丝酵母脂酶A或B；假单胞菌属的脂酶，如在EP721981(如可从假单胞菌属的种SD705菌株，其保藏登记号为FERM BP-4772获得的脂酶)，在PCT/JP96/00426、在PCT/JP96/00454(如茄假单胞菌脂酶)，在EP571982或在WO95/14783(如门多萨假单胞菌脂酶)中描述的那些中的一种，产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌脂酶，如在EP218272中描述的，洋葱假单胞菌脂酶，如在EP331376中描述的，施氏假单胞菌脂酶，如在GBl,372034中公开的，或荧光假单胞菌脂酶；芽孢杆菌属的脂酶，如枯草芽孢杆菌脂酶〔Dartois等，生物化学与生物物理学报1137(1993)PP.253-260〕，嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌脂酶(WO91/16422)。
而且，许多克隆脂酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等在《基因103(1991),61-67页中描述的沙门柏干酷青霉脂酶，白地霉脂酶〔Y.Schimada等，生物化学杂志106(1989),383-388页〕，和各种根霉属脂酶，如戴尔根霉(R.delemar)脂酶〔M.J.Hass等，基因109(1991)117-113页〕，雪白根霉脂酶〔Kugimiya等，生物科学生物技术生物化学56(1992),716-719页〕和米根霉脂酶。
其它可能有用的脂酶包括角脂酶，如在WO88/09367中描述的来自门多萨假单胞菌的角脂酶，或来自腐皮镰孢f.pisi的角脂酶(描述在如WO90/09446中)。
适宜的可购得的脂酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(可得自Novo Nordisk A/S),M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(可得自Gist-Brocades)和Lipase P“Amano”(可得自Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
氧化还原酶
适宜于作为本发明中采用的酶杂合体类型基础的氧化还原酶包括过氧化物酶(EC1.11.1)和氧化酶，如漆酶(EC1.10.3.2)和一些相关的酶。
过氧化物酶
过氧化物酶(EC1.11.1)为对作为接受体的过氧化物(如过氧化氢)起作用的酶，非常适宜的过氧化物酶是分类在EC1.11.1.7下的那些，或来源于其中并显示过氧化物酶活性的任何片段。在本发明中，其合成或半合成的衍生物(如具有卟啉环系，或微生物过氧化物酶，参见例如US4077768,EP537381,WO91/05858和WO92/16634)也是有价值的。
非常适宜的过氧化物酶为可从植物(如辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶)或从微生物如真菌或细菌获得的过氧化物酶。在这方面，一些优选的真菌包括属于半知菌亚门，丝孢菌纲，如镰孢霉属，腐植菌属，木霉属，漆斑菌属，轮枝孢属，Arthromyces，卡尔黑霉属，Ulocladium,Embellisia，枝孢属或Dreschlera的菌株，尤其是尖镰孢(DSM2672)，鞋垫腐质霉(Humicola insolens)，木霉T.resii，漆斑菌M.verrucana(IFO6113)，黄萎轮枝孢，大丽花轮枝孢，Arthromyces ramosus(FERM P-7754)，烟色卡尔黑霉，Ulocladium chartarum,Embellisia alli或Dreschlera halodes。
其它优选的真菌包括属于担子菌亚门，担子菌纲，如鬼伞属，Phanerochaete，革盖菌属，或栓菌属的菌株，尤其是灰盖鬼伞f.microsporus(IFO8371)，长根鬼伞，Phanerochaete chrysosporium(如NA-12)或栓菌T.versicolor(如PR4 28-A)。
其它优选的真菌包括属于接合菌亚门，Mycoraceae纲，如根霉属或毛霉属的菌株，尤其是冻土毛霉。
一些优选的细菌包括放线菌目的菌株，如浑球链霉菌(ATTC23965)，嗜热紫链霉菌(IFO12382)或轮枝链霉菌(Streptoverticellum verticillium ssp.verticillium)。
其它优选的细菌包括短小芽孢杆菌(ATCC12905)，嗜热脂肪芽孢杆菌，红色杆菌(Rhodobacter sphaeroides)，红胞藻Rhodomonas palustri，乳链球菌，假单孢菌P.purrocinia)(ATCC15958)或荧光假单孢菌(NRRL B-11)。
其它优选的细菌包括属于粘液球菌属的菌株，如变绿粘球菌。
特别有用的过氧化物酶的其它可能的来源列在B.C.Saunders等，过氧化物酶，伦敦，1964,p.41-43中。
过氧化物酶可进一步为可通过下面方法制备的那一种，该方法包括在允许过氧化物酶表达的条件下，在培养基中培养宿主细胞，并从培养基中回收过氧化物酶，其中该宿主细胞已用携带编码所述过氧化物酶的DNA序列以及编码允许编码过氧化物酶的DNA序列表达的功能元件的DNA序列的重组DNA载体转化。
适宜的重组产生的过氧化物酶为来自鬼伞属菌种的过氧化物酶，尤其是根据WO92/16634的长根鬼伞或灰盖鬼伞或其变异体，如在WO94/12621中描述的变异体。
氧化酶和相关的酶
本发明中的优选的氧化物酶为分类在EC1.10.3中的氧化酶，它们是采用分子氧作为接受体的氧化酶(即催化其中分子氧起氧化剂作用的氧化反应的酶)。
如上所述，漆梅(EC1.10.3.2)是本文中非常适宜的氧化酶。本发明中的其它有用的氧化酶的实例包括儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)和胆红素氧化酶(EC1.3.3.5)。其它有用的相关酶包括单酚单加氧酶(EC1.14.18.1)。
漆酶可从多种植物和微生物来源获得，主要来自细菌和真菌(包括丝状真菌和酵母)，漆酶适宜的实例见于可从真菌获得的那些，包括可从曲霉属、脉孢菌属(如粗糙脉孢霉)、柄孢壳属、葡萄孢属、金钱菌属、层孔菌属、香茹属、侧耳属、栓菌属(如栓菌T.villosa)或栓菌T.versicolor〔栓菌属的一些种类、菌株以各种其它名称为人所和/或以前被分类在其它属；如栓菌T.villosa=T.pinsitus=多孔菌(也称为P pinsitus或P villosus)=筛孔革盖菌〕，多孔菌属，丝核菌属(如立枯丝核菌)、鬼伞属(如褶纹鬼伞或灰盖鬼伞，小脆柄菇属(Psatyrella)，毁丝霉属(如毁丝霉M.thermophila),Schytalidium，射脉菌属(如辐射射脉菌；参见WO92/01046)，革盖菌属(如毛革盖菌；参见JP2-238885),Pyricularia或硬孔菌属。
本发明中优选的漆酶包括可从栓菌属(如栓菌(Trametesvillosa)、毁丝霉属(如毁丝霉(M.thermophila),Schytalidium或多孔菌属的种/菌株获得的漆梅。
其它酶
适宜作为本发明采用的酶杂合体类型基础的其它类型的酶包括果胶酶(聚半乳糖醛酸酶；EC3.2.1.15)。
质粒
本领域熟知可表达具有来自一个以上多肽片段的氨基酸序列之融合蛋白的质粒制备方法(参见如WO90/00609和WO95/16782)。表达盒可包括在适宜细胞宿主游离体中保留的复制系统中或可不提供复制系统，其中它可被整合至宿主基因组中。根据已知方法可将DNA导入宿主中，如转化、显微注射等。
一旦融合基因被导入适宜宿主中，可培养宿主以表达融合基团。通常希望另外加入用于融合基团分泌的信号序列。有用的融合基因的一般实例为：
信号序列--(前肽)--碳水化合物结合区--接头-感兴趣的酶序列，或
信号序列--(前肽)--感兴趣的酶序列--接头--碳水化合物结合区，
其中前肽序列通常包含5-100，如5-25氨基酸残基。
重组产物可为糖基化的或非糖基化的。
去污剂组合物
表面活性剂系统
本发明的去污剂组合物包括表面活性剂系统，其中表面活性剂可选自非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性和/或半极性表面活性剂。
表面活性剂通常以0.1％-60％(重量计)的水平存在。优选的配制表面活性剂使之与存在于组合物中的酶杂合体和酶组分相容。在液体或凝胶组合物中，表面活性剂最优选以促进或至少不降低这些组合物中的酶杂合体或酶的稳定性的方式配制。
本发明使用的适宜系统包括本文描述的作为表面活性剂的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基苯酚的聚环氧乙烷，聚环氧丙烷和聚环氧丁烷缩合物适宜用作本发明表面活性剂系统的非离子表面活性剂，聚环氧乙烷缩合物是优选的。这些化合物包括具有含约6-约14个碳原子，优选约8-约14碳原子的直链或支链构型的烷基的烷基苯酚与环氧化物的缩合产物。在一个优选的具体实例中，环氧化物以等于约2-约25摩尔，较优选约3-约15摩尔环氧化物/mol烷基苯酚的量存在。可购得的这类非离子表面活性剂包括IgepalTMCO-630，由GAF公司出售；及TritonTMX-45,X-114,X-100和X-102，均由Rohm&Haas公司出售。这些表面活性剂统称为烷基苯酚烷氧化物(如烷基苯酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇与约1-约25摩尔环氧乙烷的缩合产物适宜用作本发明非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂、脂族醇的烷基链可为直链或支链，连在第一位或第二位上，并通常含有约8-约22个碳原子。优选的为具有含约8-约20个碳原子，较优选为约10-约18个碳原子的烷基的醇与约2-约10摩尔环氧乙烷/摩尔醇的缩合产物。约2-约7摩尔环氧乙烷，最优选2-5摩尔环氧乙烷/摩尔醇存在于所述缩合产物中。可购得的这类非离子表面活性剂的实例包括TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)，TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)，均由Union Carbide Corporation出售；NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)，NeodolTM23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)，NeodolTM45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)，NeodolTM45-5(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由ShellChemical Company出售，KyroTMEOB(C13-C15醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由Procter&Gamble Company出售，和Genapol LA050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由Hoechst出售。这些产品中的HLB优选范围为8-11，最优选为8-10。
还可用作本发明表面活性剂系统的非离子表面活性剂的为公开在US4565647中的烷基多糖，其具有含约6-约30个碳原子，优选约10-约16个碳原子的疏水基团，及多糖，如聚糖苷，其疏水基团含有约1.3-约10，优选约1.3-约3，最优选为约1.3-约2.7个糖单元。可使用含有5或6个碳原子的任何还原糖，如葡萄糖，半乳糖，半乳糖基可被取代为葡萄糖基(任选在2-,3-,4-等位置连接疏水基团，因此产生与葡萄苷或半乳糖苷相反的葡萄糖或半乳糖)。糖内部的键可在如另外的糖单元的一个位置与前面糖单元的2-,3-,4-和/或6-位之间。
优选的烷基聚糖苷具有通式
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中R2选自烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基和其混合物，其中烷基链包含约10-约18个，优选约12-约14个碳原子；n为2或3，优选2；t为0-约10，优选为0；X为1.3-约10，优选约1.3-约3，更优选约1.3-约2.7。糖基优选来自葡糖。为了制备这些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧基醇，并接着与葡萄糖或葡萄糖源反应以形成葡糖苷(在1-位相连)。接着另外的葡糖基在它们的1-位和前面糖基单元的2-,3-,4-和/或6-位，优选主要在2-位之间连接。
环氧乙烷与由1,2-环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基的缩合产物也适宜于用作本发明的另外的非离子表面活性剂系统。这些化合物的疏水部分优选具有分子量约1500-约1800，并显示水不溶性。向该疏水部分加入聚氧乙烯部分可能从整体上增加分子的水溶性，在其中聚氧乙烯含量达缩合产物总重量的约50％这一点时保留了产物的液体特性，它相当于缩合了高达约40摩尔的环氧乙烷。这类化合物的实例包括一些可购得的PluronicTM表面活性剂，由BASF出售。
还适宜于用作本发明的非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂的是环氧乙烷与1,2-环氧丙烷与1,2-乙二胺反应产生的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由1,2-乙二胺和过量1,2-环氧丙烷的反应产物组成，并通常分子量为约2500-约3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合至缩合产物包含约40％-约80％(重量计)的聚氧乙烯并具有约5,000-约11,000的分子量的程度。这类非离子表面活性剂的实例包括一些可购得的TetronicTM化合物，由BASF出售。
优选用作本发明表面活性剂系统的非离子表面活性剂为烷基苯酚的聚环氧乙烷缩合物，伯和仲脂族醇与约1-约25摩尔环氧乙烷的缩合产物，烷基多糖和其混合物。更优选的是具有3-15个乙氧基的C8-C14烷基苯酚乙氧基化物，和具有2-10个乙氧基的C8-C18醇乙氧基化物(优选平均为C10)，和其混合物。
极其优选的非离子表面活性剂为下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂
Figure A9719193700181
其中R1为H，或R1为C1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混合物，R2为C5-31烃基，Z为具有带至少3个直接与链相连的羟基的直链烃基链的多羟基烃基，或其烷氧基化衍生物。优选的，R1为甲基，R2为直链C11-C15烷基或C16-18烷基或链烯基链，如椰子烷基或其混合物，Z是在还原胺化反应中由还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖产生的。
极其优选的阴离子表面活性剂包括烷氧基化的硫酸烷酯表面活性剂。其实例为式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R为未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基组分的羟基烷基，优选C12-C20烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A为乙氧基或丙氧基单元，m大于0，通常在约0.5-约6之间，较优选约0.5-约3之间，M为H或阳离子，它可为如金属阳离子(如钠，钾，锂，钙，镁等)，铵或取代的铵阳离子。本文包括乙氧基化的硫酸烷酯以及丙氧基化的硫酸烷酯。取代的铵阳离子的具体实例包括甲基-，二甲基-，三甲基铵阳离子和季铵阳离子，如四甲基铵和二甲基吡啶鎓阳离子和由烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺产生的那些，其混合物等。表面活性剂的实例为C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸酯(C12-C18E(1.0)M)，C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸酯(C12-C18(2.25)M和C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸酯(C12-C18E(3.0)M)，和C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。适用的阴离子表面活性剂为烷基酯磺酸表面活性剂，包括根据“美国油化学协会杂志”，52(1975),p.323-329用气态SO3磺酸化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直链酯。适宜的起始材料包括如从动物脂肪棕榈油等产生的天然脂肪物质。
尤其用于洗衣用途的优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂包括具有下面结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂
其中R3为C8-C20烃基，优选烷基或其混合物，R4为C1-C6烃基，优选烷基或其混合物，M为与烷基酯磺酸形成水溶性盐的阳离子。适宜的成盐阳离子包括金属，如钠，钾，锂，和取代或未取代的铵阳离子，如单乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺。优选地，R3为C10-C16烷基，R4为甲基，乙基或异丙基。尤其优选的是甲酯磺酸盐，其中R3为C10-C16烷基。
其它适宜的阴离子表面活性剂包括式ROSO3M的水溶性盐或酸的烷基硫酸盐表面活性剂，其中R优选为C10-C24烃基，优选烷基或具有C10-C20烷基成分的羟基烷基，较优选为C12-C18烷基或羟基烷基，M为H或阳离子，如碱金属阳离子(如钠，钾，锂)，或铵或取代的铵(如甲基-，二甲基-，和三甲基铵阳离子和季铵阳离子，如四甲基铵和二甲基吡啶鎓阳离子和由烷基胺如乙胺，二乙胺、三乙胺产生的季铵阳离子，和其混合物等)。通常，C12-C16烷基链对于低的洗涤温度(如低于约50℃)是优选的，C16-C18烷基链对于较高的洗涤温度(如高于约50℃)是优选的。
可用于洗涤目的的其它阴离子表面活性剂也可被包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些可包括皂盐(例如包括钠、锂、铵和取代铵盐，如单-二-和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲链烷磺酸盐、C8-C24烯属磺酸盐、通过将柠檬酸碱土金属盐的热解产物磺化而制备的磺化的多羧酸盐，如在英国专利说明书号1082179中描述的，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(含高达10摩尔环氧乙烷)，烷基丙三醇磺酸盐、脂酰丙三醇磺酸盐、脂油酰丙三醇硫酸盐、烷基苯酚环氧乙烷醚硫酸盐、链烷烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐，如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰磺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸单酯(尤其是饱和和不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸二酯(尤其是饱和和不饱和C6-C12二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖硫酸酯，如烷基聚葡糖苷(下面描述的非离子非硫酸化化合物)的硫酸盐，支链伯烷基硫酸酯，和烷基多乙氧基羧酸盐，或式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的那些，其中R为C8-C22烷基，k为1-10的整数，M为可溶性成盐阳离子。树脂酸和氢化树脂酸也是适宜的，如松香、氢化松香，和存在于或从浮油产生的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是极其优选的。尤其优选的是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基优选包含10-18个碳原子。
其它实例描述在“表面活性剂和去污剂”(Vol.Ⅰ和Ⅱ，由Schwartz,Perry和Berch编)。各种这些表面活性剂还公开在US3929678(栏23,58行-栏29,23行，其被本文引作参考)。
当被本文包括时，本发明的洗衣去污剂组合物通常包含约1％-约40％，优选约3％-约20％(重量计)的这些阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣去污剂组合物还可包含本文已描述的那些以外的阳离子、两性、兼性离子和半极性表面活性剂，以及非离子和/或阴离子表面活性剂。
适宜用于本发明的洗衣去污剂组合物的阳离子去污表面活性剂为具有1个长链烃基的那些。这些阳离子表面活性剂的实例包括铵表面活性剂，如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活性剂。
            [R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2为烷基或在烷基链中具有约8-约18个碳原子的烷基苄基，各R3选自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、CH2CH2CH2-和其混合物；各R4选自C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、通过连接两个R4基因形成的苄基环结物、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH，其中R6为分子量小于约1000的任何己糖或己糖聚合物，及当y不为0时则为H；R5与R4相同或为烷基链，其中碳原子或R2加上R5的总数不大于约18；各个y为0-约10，y值的总和为0-约15；X为任何相容的阴离子。
极其优选的阳离子表面活性剂为可用于本发明的具有下式的水溶性季铵化合物
              R1R2R3R4N+X-    (ⅰ)
其中R1为C8-C16烷基，各个R2,R3和R4独立地为C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H4O)XH，其中X具有2-5的值，X为阴离子。R2,R3或R4中的最多一个应为苄基。
R1的优选的烷基链长度为C12-C15，尤其是其中烷基为来自椰子或棕榈核脂肪的链长度的混合物或通过烯烃或OXO醇合成而合成产生。
R2R3和R4的优选基团为甲基和羟基乙基，阴离子X可选自卤离子、甲硫酸根、乙酸根和磷酸根离子。
用于本文中的式(Ⅰ)的适宜的季铵化合物的实例为：
椰子基三甲基氯化铵或溴化铵；
椰子基甲基二羟基乙基氯化铵或溴化铵；
癸基三乙基氯化铵；
癸基二甲基羟基乙基氯化铵或羟基乙基溴化铵；
C12-C15二甲基羟基乙基氯化铵或C12-C15二甲基羟基乙基溴化铵；
椰子基二甲基羟基乙基氯化铵或椰子基二甲基羟基乙基溴化铵；
肉豆蔻基三甲基铵甲基硫酸盐；
月桂基二甲基苄基氯化铵或月桂基二甲基苄基溴化铵；
月桂基二甲基(乙氧基)4氯化铵或月桂基二甲基(乙氧基)4溴化铵；
胆碱酯(式(ⅰ)化合物，其中R1为烷基和R2R3R4为甲基)。
二烷基咪唑啉(式(ⅰ)化合物)。
可用于本文的其它阳离子表面活性剂还描述在US4228044和EP000224中。
当包括在本文时，本发明的洗衣去污剂组合物通常包含0.2-约25％，优选约1％-约8％(重量计)的这些阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适宜于用于本发明的洗衣去污剂组合物中。这些表面活性剂可统称为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基可为直链或支链。一个脂族取代基包含至少约8个碳原子，通常约8-约18碳原子，并且其中至少一个包含阴离子水溶性基团，如羧基，磺酸基，硫酸基。对于两性表面活性剂，参见US3929678(栏19,18-35行)。
当包括在本文中时，本发明的洗衣去污剂组合物通常包含0.2-约15％，优选约1％-约10％(重量计)的这些两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适宜于用于洗衣去污剂组合物中。这些表面活性剂可统称为仲和叔胺的衍生物，杂环仲和叔胺的衍生物，或季铵、季鏻或季锍化合物的衍生物。对于两性离子表面活性剂，参见US3929678(栏19，第38行-栏22，第48行)。
当包括在本文中时，本发明的洗衣去污剂组合物通常包含0.2％-约15％，优选约1％-约10％(重量计)的这些两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂为一特殊类型的非离子表面活性剂，它包括包含约10-约18个碳原子的烷基和选自约1-约3个碳原子的烷基和羟基烷基的2个残基的水溶性氧化胺；包含1个约10-约18个碳原子的烷基部分和2个选自含约1-约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性氧化膦；及包含1个约10-约18个碳原子的烷基部分和1个选自约1-约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性亚砜。
半极性非离子去污剂表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：
Figure A9719193700231
其中R3为包含约8-约22个碳原子的烷基、羟基烷基或烷基苯基或其混合物；R4为包含约2-约3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x为0-约3和各R5为包含约1-约3个碳原子的烷基或羟基烷基或包含约1-约3个环氧乙烷基团的聚环氧乙烷。R5基团可互相连接，如通过氧或氮原子形成环结构。
这些氧化铵表面活性剂尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。
当包括在本文中时，本发明的洗衣去污剂组合物通常包含0.2％-约15％，优选约1％-约10％(重量计)的这些半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系
根据本发明的组合物可进一步包括助洗剂体系。任何常规的助洗剂体系适宜于用于本文，包括硅铝酸盐材料，硅酸盐，多羧酸和脂肪酸，如乙二胺四乙酸的材料，金属离子多价螯合剂，如氨基聚膦酸盐，尤其是乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。虽然由于明显的环境原因优选它们，但磷酸盐助洗剂也可用于本发明。
适宜的助洗剂可为无机离子交换材料，通常为无机水合硅铝酸盐材料，较优选的为水合合成沸石，如水合沸石A,X,B,HS或MAP。
另一个适宜的无机助洗剂材料为多层硅酸盐，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6为由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的结晶多层硅酸盐。
适宜的含一个羧基的多羧酸酯包括如公开在比利时专利号831,368,821,369和821,370中的乳酸,乙醇酸和它们的醚衍生物。包含两个羧基的多羧酸酯包括琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸和富马酸的水溶性盐，以及描述在德国专利说明书2,446,686和2,446,487，美国专利3,935,257的醚羧酸和描述在比利时专利号840,623中的亚硫酰基羧酸盐。包含三个羧基的多羧酸酯其包括水溶性柠檬酸，乌头酸和柠康酸以及描述在英国专利号1,379,241中的琥珀酸衍生物，如羧甲氧基琥珀酸，描述在荷兰专利申请号7205873中的乳氧基琥珀酸，及描述在英国专利号1,387,447中的氧聚羧酸材料，如2-氧杂-1,1,3-丙烷三羧酸。
包含四个羧基的多羧酸包括公开在英国专利号1,261,829中的氧二琥珀酸，1,1,2,2-乙烷四羧酸、包含磺基取代基的四羧酸，包括公开在英国专利号1,398,421和1,398,422和美国专利3,936,448中的那些，和描述在英国专利号1,082179中的磺化的热解柠檬酸，以及公开在英国专利号1,439,000中的含膦取代基的多羧酸。
脂环和杂环多羰酸包括环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸、环戊二烯五羧酸，2,3,4,5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸，2,5-四氢呋喃-顺二羧酸2,2,5,5-四氢呋喃四羧酸，1,2,3,4,5,6-己烷-六羧酸和多羟基醇如山梨糖醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳香多羧酸包括公开在英国专利号1,425,343中的苯六甲酸,1,2,4,5-苯四羧酸及苯二甲酸衍生物。
其中，优选的多碳酸为每分子包含高达3个羧基的羟基羧酸，尤其是柠檬酸。
用于本发明的优选的助洗剂体系包括水不溶的硅铝酸盐助洗剂如沸石A或多层硅酸盐(SKS-6)与水溶性的羧酸螯合剂如柠檬酸的混合物。
包含在本发明的去污剂组合物中的适宜的螯合剂为1,2-乙二胺-N,N′-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵的盐，或它们的混合物。优选的EDDS化合物为其游离酸和钠或镁盐。EDDS的这些优选钠盐的实例包括Na2EDDS和Na4EDDS。EDDS的这些优选的镁盐的实例包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐是最优选的包含在本发明的组合物中的盐。
优选的助洗剂体系包括水不溶的铝硅酸酸盐助洗剂。如沸石A与水溶性羧酸螯合剂如柠檬酸的混合物。
可形成用于颗粒组合物中的助洗剂体系的一部分的其它助洗剂材料包括无机材料，如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，及有机材料，如有机膦酸盐、氨多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸。
其它适宜的水溶性有机盐为均聚或共聚物酸或其盐，其中多羧酸包含通过不超过2个碳原子被相互分开的至少两个羧基。
这类聚合物公开在GB-A-1,596,756中。它的盐的实例为MW2000-5000的聚丙烯酸酯和它们与马来酸酐的共聚物，其中共聚物分子量为20,000-70,000，尤其为约40,000。
去污助洗剂盐通常以5％-80％(重量计)的量包含在组合物中。液体去污剂助洗剂的最佳水平为5％-30％。
酶
除所讨论的酶杂合体外，本发明的去污剂组合物可包含产生洗涤性能和/或织物护理效果的其它酶。这些酶包括蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶和氧化酶(如漆酶)。
蛋白酶：可使用例如适用于碱性溶液中的任何蛋白酶。适宜的蛋白酶包括动物，植物或微生物来源的那些。优选微生物起源。包括化学或遗传修饰突变体。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属的那些，如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(如猪或牛来源)及描述在WO89/06270中的镰孢属蛋白酶。
优选的可购得的蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(丹麦)以商品名Alcalase,Savinase,Primase,Durazym和Esperase出售的那些,由Genencor International以商品名Maxatase,Maxacal,Maxapem,Properase,Purafect和Purafect OXP出售的那些，及由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的那些。蛋白酶可以以占组合物0.00001％-2％的酶蛋白(按重量计)的水平，适宜地以占组合物0.0001％-1％的酶蛋白(重量计)的水平，如占组合物0.001％-0.5％的酶蛋白(重量计)的水平，适宜地为占组合物0.01％-0.2％的酶蛋白(重量计)的水平被掺入到本发明的组合物中。
脂酶：可使用例如任何适用于碱性溶液的脂酶。适宜的脂酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。
有用的脂酶的实例包括腐质霉H.lanuginosa脂酶，如在EP258068和EP305216中描述的，Rhizomucor miehei脂酶，如在EP238023中描述的；假丝酵母属的脂酶，如南极假丝酵母脂酶，如在EP214761中描述的南极假丝酵母脂酶A或B，假单胞菌属脂酶，如产碱假单孢菌和类产碱假单胞菌脂酶，如在EP218272中所描述的，洋葱假单胞菌脂酶，如EP331376中所描述的，施氏假单胞菌脂酶，如GB1,372034中所描述的，荧光假单胞菌脂酶，芽孢杆菌属脂酶，如枯草芽孢杆菌脂酶(Dartois等，(1993)，生物化学及生物物理学报1131,253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌脂酶(WO91/16422)。
而且，许多克隆的脂酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等(1991)，基因103,61-67中描述的沙门柏干酪青霉脂酶，白地霉脂酶(Schimada,Y.等(1989)，生物化学杂志，106,383-388)，和各种根霉属脂酶，如戴尔根霉脂酶(Hass,M.J等(1991)，基因109,17-113)，雪白根霉脂酶(Kugimiya等，(1992)，生物科学生物技术生物化学，56,716-779)和米根霉脂酶。
其它类型的脂解酶如角质酶可能也是有用的，如WO88/09367中描述的来自门多萨假单胞菌的角质酶或来自腐皮镰孢f.pisi(如在WO90/03446中描述的)的角质酶。
尤其适宜的脂酶为如M1 LipaseTM,Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor),LipolaseTM和Lipolase UltraTM (NovoNordisk A/S)，和LipaseP“Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd)。
脂酶通常以占组合物0.00001％-2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入去污剂组合物中，如以占组合物0.0001％-1％(重量计)的酶蛋白的水平，如以占组合物0.001％-0.5％(重量计)的酶蛋白质，适宜地以占组合物0.01％-0.2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入。
淀粉酶：可使用如适宜于用于碱性溶液中的任何淀粉酶(如α-和/或β-)。适宜的淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。淀粉酶包括如详细描述在GB1,296,839中的从地衣形芽孢杆菌的特定菌株获得的α淀粉酶。可购得的淀粉酶为DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(可从Novo Nordisk A/S购得)及RapidaseTM和Maxamyl PTM(可从Genencor购得)。
淀粉酶通常以占组合物0.00001％-2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入去污剂组合物中，如以占组合物0.0001-1％(重量计)的酶蛋白的水平，例如以占组合物0.001％-0.5％(重量计)的酶蛋白的水平，适宜地以占组合物0.01％-0.2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入。
纤维素酶：可使用如适宜用于碱性溶液中的任何纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。适宜的纤维素酶公开在US4,435,307中，它公开了从鞋垫腐质霉(Humicola insolens)制备的真菌纤维素酶。尤其适宜的纤维素酶为具有色彩护理效果的纤维素酶。这些纤维素酶的实例为描述在欧洲专利申请号0495257中的纤维素酶。
可购得的纤维素酶包括CelluzymeTM，它由鞋垫腐质霉的一个菌株产生(Novo Nordisk A/S)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。
纤维素酶通常以占组合物0.00001％-2％(重量计)的酶蛋白的水平，加以占组合物0.0001％-1％(重量计)的酶蛋白的水平，例如以占组合物0.001％-0.5％(重量计)的酶蛋白的水平，适宜地以占组合物0.01％-0.2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入去污剂组合物中。
过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶通常与过氧化氢或其来源(如过碳酸盐，过硼酸盐或过硫酸盐)一起结合使用。氧化酶与氧一起结合使用。两种类型的酶用于“溶液漂白”，即防止当所述织物在洗涤液体一起洗涤，优选与如WO94/12621和WO95/01426描述的增强剂一起时，纺织品染料从染色织物转移到另一种织物上。适宜的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。
过氧化物酶和/或氧化酶通常以占组合物0.00001％-2％(重量计)的酶蛋白的水平，如占组合物0.0001％-1％(重量计)的酶蛋白的水平，例如占组合物0.001％-0.5％(重量计)的酶蛋白的水平，适宜地为占组合物0.01％0.2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入去污剂组合物中。
本发明的去污剂组合物也可包括上述酶的混合物。如蛋白酶，淀粉酶、脂酶和/或纤维素酶的混合物。
掺入去污剂组合物中的酶杂合体或任何其它酶通常以占组合物0.00001％-2％(重量计)的酶蛋白的水平，优选以占组合物0.0001％-1％(重量计)的酶蛋白的水平，如占组合物0.001％-0.5％(重量计)的酶蛋白的水平，例如占组合物0.01％-0.2％(重量计)的酶蛋白的水平掺入去污剂组合物中。
漂白剂：
可包含在本发明去污剂组合物中的另外任选的去污成分包括漂白剂，如PB1,PB4和颗粒大小为400-800微米的过碳酸盐。这些漂白剂成分可包含一种或多种氧漂白剂，(取决于所选择的漂白剂)还包含一种或多种漂白活化剂。当存在氧时，漂白成分通常以约1％-约25％的水平存在。通常，漂白成分为非液体制剂如颗粒去污剂中任选被加入的成分。
用于本文的漂白剂成分可为可用于去污剂组合物的任何漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它种类。
适用于本发明的漂白剂可为活化的或未活化的漂白剂。
可使用的一类氧漂白剂包含过羧酸漂白剂和其盐。这类漂白剂适宜的实例包括单过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间氯过苯甲酸镁盐、4-壬基氨基-4-氧代过氧丁酸镁盐和二过氧十二双酸镁盐。这些漂白剂公开在US4,483,781,US740,446,EP0133354和US4,412,934中。极其优选的漂白剂还包括如US4,634,551中描述的6-壬基氨基-6-氧代过氧己酸。
可使用的另一类漂白剂包括卤素漂白剂。次卤酸盐漂白剂的实例包括例如三氯异氰尿酸和二氯并异氰尿酸钠和二氯异氰尿酸钾及N-氯和N-溴烷基氨磺酰钠和钾。这些材料通常以占成品0.5-10％(重量计)，优选1-5％(重量计)的量加入。
过氧化氢释放剂可与漂白活化剂一起结合使用，如四乙酰基乙二胺(TAED)，壬酰氧苯磺酸盐(NOBS，描述在US4,412,934中)、3,5-三甲基-己酰氧苯磺酸盐(ISONOBS，描述在EP120591中)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它们全水解以形成作为活性漂白物的过酸，从而产生增强的漂白效果。此外，极其适宜为漂白活化剂C8(6-辛基酰氨基-己酰基)氧苯磺酸盐，C9(6-壬基酰氨基-己酰基)氧苯磺酸盐和C10(6-癸基酰氨基己酰基)氧苯磺酸盐或它们的混合物。适宜的活化剂还有乙酰化的柠檬酸酯，如欧洲专利申请号91870207.7中公开的。
在申请USSN08/136,626中描述了可用于本发明的洗涤组合物的有用的漂白剂，包括过氧酸和包含漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系的。
通过加入能在洗涤和/或漂洗过程开始或期间产生过氧化氢的酶体系(即酶和它的底物)也可存在过氧化氢。这些酶体系公开在欧洲专利申请号EP0537381中。
本领域也已知氧漂白剂以外的漂白剂，且可被用于本发明。尤其感兴趣的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，如磺化的酞菁锌和/或铝。这些材料在洗涤过程中可沉积在底物上。在光照射时，在存在氧，如将衣服挂在外面以在日光中干燥时，磺化的酞菁锌被活化，因而底物被漂白。优选的酞菁锌和光活化漂白过程描述在US4,033,718中。通常，去污剂组合物包含约0.025％-约1.25％(重量计)的磺化酞菁锌。
漂白剂也可包含锰催化剂。锰催化剂可为如“用于低温漂白的有效的锰催化剂”自然369,1994,P.637-639中描述的一种化合物。
抑泡剂：另一种任选的成分为抑泡剂，实例为聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷通常可用烷基化的聚硅氧烷材料来代表，而硅石通常以各种类型的如硅石气凝胶和干凝胶及疏水硅石的均匀分散形式使用。这些材料可以颗粒物形式掺入，其中抑泡剂有利地可释放性地掺入在水溶性或水可分散的基本上无表面活性去污剂的不透性载体中。另外，抑泡剂可溶于或分散于液体载体中，并通过喷至一种或多种其它成分上来使用。
优选的聚硅氧烷泡沫控制剂公开在US3,933,672中。其它特别有用的抑泡剂为如描述在德国专利申请DTOS2,646,126中的自身乳化的聚硅氧烷抑泡剂。这个化合物的一个实例为DC-544，它可从Dow Corning购得，为聚硅氧烷-甘醇的共聚物。尤其优选的抑泡剂为包含硅氧烷油和2-烷基烷醇混合物的抑泡剂体系。适宜的2-烷基烷醇为2-丁基辛醇，它可以商品名Isofol 12R购得。
这些抑泡剂体系描述在欧洲专利申请EP0593841。
尤其优选的硅氧烷泡沫控制剂描述在欧洲专利申请号92201649.8中。所述组合物可包含硅氧烷/硅石混合物及发烟灭孔硅石，如AerosilR。
上述抑泡剂通常以占组合物0.001％-2％(重量计)的水平采用，优选0.01％-1％(重量计)。
其它成分：用于去污剂组合物中的其它成分可采用如污垢悬浮剂、污垢释放剂、光增亮剂、擦洗剂、灭菌剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或包封或非包封的香料。
尤其适宜的包封材料为如GB1,464,616中描述的由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性胶囊。其它适宜的水溶性包封材料包括如US3,455,838中描述的来自取代的二羧酸的未凝胶化的淀粉酸酯的糊精衍生物。这些酸酯糊精优选从如含蜡质的玉米、含蜡质的高梁、西米、木薯和马铃薯的淀粉制备。所述包封材料的适宜实例包括由National Starch生产的N-Lok。N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖构成。通过加入单官能取代的基团，如辛烯基琥珀酸酐将淀粉改性。
本文适宜的抗再沉淀剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，如甲基纤维素、羧甲基纤维素及羟乙基纤维素，及均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括前面提及作为助洗剂的聚丙烯酸酯和马来酐-丙烯酸共聚物，以及马来酐与乙烯、甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物，其中马来酐占共聚物至少20％(摩尔)。这些材料通常以占组合物0.5％-10％(重量计)，较优选0.75％-8％，最优选1％-6％(重量计)的水平使用。
优选的光增亮剂适宜地为阴离子性质，它的实例为4,4′-双(2-二乙醇胺-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′二磺酸二钠、4,4′-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基-芪-2:2′-二磺酸二钠、4,4′-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2′-二磺酸二钠、4′、4"-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-苯氨基)芪-2-磺酸钠、4,4′-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠、4,4′-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2′-二磺酸二钠、4,4′-双(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2′-二磺酸二钠、2(芪基-4"-(萘并-1′,2′:4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸钠和4,4′-双(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料为聚乙二醇，尤其是分子量为1000-10000，较优选2000-8000，最优选约4000的那些。这些以0.20％-5％(重量计)，较优选0.25％-2.5％(重量计)的水平使用。这些聚合物及前面提到的均聚或共聚聚羧酸盐对于增加白度保持、织物灰沉积及对粘土，蛋白及存在过渡金属污染物时的可氧化污垢的洗涤效率都是有价值的。
用于本发明组合物中的污垢释放剂一般为各种排列的对苯二酸与乙二醇和/或丙二醇单元的共聚物或三元共聚物。这些聚合物的实例公开在US4,116,885和4,711,730和EP0272033中。根据EP0272033的尤其优选的聚合物具有下式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-,PO是(OC3H6O)和T是(pOOC6H4CO)。
非常有用的还有改性的聚酯，如对苯二酸二甲酯、磺基间苯二酸二甲酯、乙二醇与1,2-丙二醇的随机共聚物，其末端基团主要由磺基苯甲酸酯，其次由乙二醇和/或1,2-丙二醇单酯组成。目标是获得在两个末端被磺基苯甲酸酯基团封端的聚合物，“主要地”，在本文中所述的大多数共聚物被磺基苯甲酸酯封端。然而，一些共聚物未被其全部封端，从而它们的末端基团可能由乙二醇和/或1,2-丙二醇单酯组成，从而“次要地”由这些物质组成。
本文选择的聚酯包含约46％(重量计)的对苯二酸二甲酯，约16％(重量计)的1,2-丙二醇，约10％(重量计)的乙二醇，约13％(重量计)的磺基苯甲酸二甲酯及约15％(重量地)的磺基间苯二甲酸，并且分子量为约3,000。聚酯及其制备方法详细描述在EP311342中。
软化剂：也可将织物软化剂掺入本发明的洗衣去污剂组合物中。这些试剂可为无机或有机类型。无机软化剂以公开在GB-A-1400898和US5,019292中的绿土粘土作为实例。有机织物软化剂包括如GB-A1514276和EP0011340中公开的水不溶性叔胺，它们与单C12-C14季铵盐的结合公开在EP-B-0026528中，双长链酰胺公开在EP0 242 919中。织物软化体系的其它有用的有机成分包括如公开在EP 0 299 575和O 313146中的高分子量的聚环氧乙烷。
绿土粘土的水平通常在5％-15％，优选8％-12％(重量计)的范围内，该物质以干燥混合成分的形式被加入到制剂的其它部分中。有机织物软化剂，如水不溶的叔胺或双长链酰胺材料被以0.5％-5％(重量计)，一般为1％-3％(重量计)的水平掺入，同时高分子量的聚环氧乙烷材料和水溶性的阳离子材料被以0.1％-2％，一般为0.15％-1.5％(重量计)的水平加入。虽然在一些情况下可以较方便地以干燥混合的颗粒形式加入，或以熔化液体的形式将它们喷至组合物的其它固体成分上，但这些材料一般被加至组合物的喷雾干燥部分中。
聚合物染料转移抑制剂：根据本发明的去污剂组合物还可包含0.001％-10％，优选0.01％-2％，较优选0.05％-1％(重量计)的聚合物染料转移抑制剂。所述聚合物染料转移抑制剂通常掺入到去污剂组合物中以抑制染料从染色织物转移至在其中被洗涤的织物中。这些聚合物具有在染料有机会与洗涤中的其它物品接触之前复合或吸附从染色织物中洗出的不稳定的染料能力。
尤其适宜的聚合物染料转移抑制剂为聚胺-N氧化物聚合物，N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物，聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它们的混合物。
加入这些聚合物也增加根据本发明的酶的效率。
本发明的去污剂组合物可为液体，膏状，凝胶，条状或粒化形成(即为颗粒形式)。
无粉尘颗粒可按照如US4,106,991和4,661,452(均为NovoIndusti A/S)所公开的来制备，并可任选用本领域已知的方法涂覆。蜡质涂覆材料的实例为平均分子量为1000-20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-52个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇包含12-20个碳原子，并具有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的一-和二-和三酸甘油酯。适宜于通过流化床技术使用的成膜涂覆材料的实例提供在GB1483591中。
本发明的颗粒组合物也可为“压紧形式”，即它们可比常规颗粒去污剂具有相对更高的密度，即550-950g/L；与常规的颗粒去污剂相比，在这种情况下，根据本发明的颗粒去污剂组合物将包含较低量的“无机填料盐”；典型的填料盐为硫酸和盐酸的碱土金属盐，通常为硫酸钠；“压紧”式去污剂通常包含不超过10％的填料盐。根据本发明的液体组合物也可为“浓缩形式”，与常规的液体去污剂相比，在这种情况下，根据本发明的液体去污剂组合物将包含较低量的水。通常，浓缩液体去污剂的水含量小于30％，较优选小于20％，最优选小于去污剂组合物的10％(重量计)。
本发明的组合物可为例如被配制成手洗和机洗去污剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于预处理受污织物的组合物。
下面的实施例用来说明本发明范围内的组合物，而不用来限制或用其它方法限定本发明的范围，在该去污剂组合物中，简写的组分符号下面的含义：
LAS：直链C12烷基苯磺酸钠
TAS：动物脂烷基硫酸钠
XYAS：C1X-C1Y烷基硫酸钠
SS：2-丁基辛酸的二级皂表面活性剂
25EY：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的C12-C15主要为直链的伯醇。
45EY：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的C14-C15主要为直链的伯醇
XYEZS：每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C1X-C1Y烷基硫酸钠
非离子的：平均乙氧基化程度为3.8及平均丙氧基化程度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化的脂肪醇，其由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404出售。
CFAA：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA：C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸盐：非晶形硅酸钠(SiO2∶Na2O比例=2.0)
NaSKS-6：式δ-Na2SiO5的结晶多层硅酸盐，
碳酸盐：无水碳酸钠
磷酸盐：三聚磷酸钠
MA/AA:1∶4马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量为约80,000
聚丙烯酸酯：平均分子量为8,000，由BASF Gmbh以PA30商品名出售的聚丙烯酸酯均聚物
沸石A：主要颗粒大小为1-10微米的式
Na12(AlO2SiO2)1227H2O的水合硅铝酸盐
柠檬酸盐：柠檬酸三钠二水合物
柠檬酸：柠檬酸
过硼酸盐：具有式NaBO2、H2O2的无水过硼酸盐一水合物漂白剂
PB4：无水过硼酸钠四水合物
过碳酸盐：具有式2Na2CO3、3H2O2的无水过碳酸钠漂白剂
TAED：四乙酰基乙二胺
CMC：羧甲基纤维素钠
DETPMP：由Monsanto以Dequest2060商品名出售的二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)
PVP：聚乙烯基吡咯烷酮聚合物
EDDS：亚乙基二胺-N,N′-二琥珀酸〔S,S〕异构体的钠盐形式
泡沫抑制剂：熔点50℃的25％链烷烃蜡，17％疏水硅石，58％石蜡油
颗粒泡沫抑制剂：12％聚硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％淀粉，颗粒形式
硫酸盐：无水硫酸钠
HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷
TAE25：动物脂醇乙氧基化物(25)
在下面的组合物中，“酶”指酶杂合体和任何加入的酶：
去污剂实施例Ⅰ
可如下制备根据本发明的颗粒织物洗涤组合物：直链C12烷基苯磺酸钠     6.5硫酸钠                  15.0沸石A                   26.0次氮基三乙酸钠           5.0酶                      0.1PVP                     0.5TAED                    3.0硼酸                    4.0过硼酸盐                18.0苯酚磺酸盐              0.1次要物质                加至100
去污剂实施例Ⅱ
可如下制备根据本发明的压紧式颗粒织物洗涤组合物(密度为800g/l)：45AS                   8.025E3S                  2.025E5                   3.025E3                   3.0TFAA                   2.5沸石A                  17.0NaSKS-6                12.0柠檬酸                 3.0碳酸盐                 7.0MA/AA                  5.0CMC                    0.4酶                     0.1TAED                   6.0过碳酸盐               22.0EDDS                   0.3颗粒抑泡剂             3.5水/次要物质            加至100％
去污剂实施例Ⅲ
可如下制备可用于洗涤染色织物的本发明的颗粒织物洗涤组合物：LAS          10.7        -TAS          2.4         -TFAA          -         4.045AS         3.1        10.045E7         4.0         -25E3S                        -         3.068E11                       1.8         -25E5                         -         8.0柠檬酸盐                    15.0       7.0碳酸盐                       -         10柠檬酸                      2.5        3.0沸石A                       32.1       25.0Na-SKS-6                     -         9.0MA/AA                       5.0        5.0DETPMP                      0.2        0.8酶                          0.10       0.05硅酸盐                      2.5         -硫酸盐                      5.2        3.0PVP                         0.5         -聚(4-乙烯基吡啶〔-N-氧-                 0.2化物/乙烯基咪唑与乙烯基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐                    1.0         -苯酚磺酸盐                  0.2         -水/次要物质                加0.5至100％
去污剂实施例Ⅳ
可如下制备产生“通过洗涤而软化”能力的本发明的颗粒织物洗涤组合物：45AS                    -        10.0LAS                    7.6         -68AS                   1.3         -45E7                   4.0         -25E3                    -         5.0可可烷基-二甲基羟       1.4        1.0基乙基氯化铵柠檬酸盐        5.0        3.0Na-SKS-6        -         11.0沸石A          15.0       15.0MA/AA          4.0        4.0DETPMP         0.4        0.4过硼酸盐       15.0        -过碳酸盐        -         15.0TAED           5.0        5.0绿土粘土       10.0       10.0HMWPEO          -         0.1酶             0.10       0.05硅酸盐         3.0        5.0碳酸盐         10.0       10.0颗粒抑泡剂     1.0        4.0CMC            0.2        0.1水/次要物质    加至100％
去污剂实施例Ⅴ
可如下制备本发明的重载型液体织物洗涤组合物：
            Ⅰ         Ⅱ酸形式          -         25.0柠檬酸         5.0        2.0酸形式         8.0        -酸形式         3.0        -25AE7          8.0        -CFAA           5          -DETPMP         1.0        1.0脂肪酸         8          -油酸           -          1.0乙醇           4.0        6.0丙二醇         2.0        6.0酶             0.10       0.05可可烷基二-甲基羟-         3.0基乙基氯化铵绿土粘土        -          5.0PVP            2.0         -水/次要物质    加至100％
可以以去污剂中常用的浓度掺入酶杂合体。目前预测在本发明的去污剂组合物中，酶杂合体可适宜地以相当于0.00001-1mg(以纯酶蛋白计算)酶杂合体/升洗涤液的量加入。
反应时间
用于从织物中除去或漂白污斑或色斑的反应时间是可以变化的；可将织物浸泡1或2天，或可在较短的时间内进行洗涤，通常机洗为1-90分钟，优选1-30分钟。
本发明的另一个方面涉及本文公开的编码或包含编码如本说明书所公开的酶杂合体的序列的DNA构建体。
本发明的另一个方面涉及由所述DNA构建体或序列编码的和/或本说明书所公开的多肽(融合蛋白或酶杂合体)。因此，本发明包括一种酶杂合体，它由包含在序列表
                   SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18或SEQ IDNO.19的DNA序列中的编码杂合物的DNA序列所编码，或该酶杂合体具有包含在SEQ ID NO 2,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.6或SEQID NO.8的氨基酸序列中的氨基酸序列。
在下列实施例中将进一步说明本发明，它们决不限制本发明权利要求中所述的范围。
材料和方法
菌株：
芽孢杆菌B.agaradherens NCIMB No.40482：包含下面实施例2的编码内切葡聚糖酶的DNA序列。
大肠杆菌SJ2〔Diderichsen等，细菌学杂志，172(1990),4315-4321页〕。
按T商的推荐使用Bio-Rad GenePulserTM制备和转化电感受态细胞。
枯草芽孢杆菌PL2306：该菌株为在已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单元中被打断的具有被打断的apr和npr基因的杆草芽孢杆菌DN1885〔Diderichsen等，细菌学杂志172(1990)4315-4321页〕，从而产生纤维素酶阴性细胞。打断过程基本上如Sonenshein等(编)枯草芽孢杆菌和其它草兰化阳性菌，美国微生物学会(1993)，第618页中描述的来进行。
质粒：
pDN1528〔Jφrgensen等，细菌学杂志173(1991),p.559-567〕。
pBluescriptKSII-(Stratagene,USA)
pDN1981〔Jφrgensen等，基因96(1990),p.37-41〕。
溶液/培养基
TY和LB琼脂〔如Ausubel等(编)，现代分子生物学方法，John Wiley和Sons(1995)所描述〕。
SB：将32g胰蛋白胨、20g酵母提取物、5g氯化钠和5ml1N氢氧化钠混合在无菌水中至最终体积为1升。121℃下，将溶液通过高压釜20分钟来灭菌。
10％AvicelTM：将100gAvicelTM(FLUKA；瑞士)与无菌水混合至最终体积为1升，121℃下，将得到的10％AvicelTM通过高压釜20分钟来进行灭菌。
缓冲液：0.05M磷酸钾，pH7.5。
常规分子生物学方法
使用标准分子生物学方法进行DNA操作和转化〔Sambrook等，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Lab.,Cold SpringHarbor,NY(1989)；Ausubel等(编)，现代分子生物方法，JohnWiley和Sons(1995)；C.R.Harwood和S.M.Cutting(编)细菌的分子生物学方法，John Wiley和Sons(1990)〕。
根据供应商的说明使用用于DNA操作的酶。
实施例1
部分Termamyl序列的亚克隆
将在pDN1528上编码的α-淀粉酶基因进行PCR扩增以在编码区的3′-末端导入BamHⅠ位点。如下进行PCR和克隆：
在补充有200μM各种dNTP，26单位的HiFidelityTMExpand酶混合物及300pmol各种引物的HiFidelityTMpCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中将约10-20ng的质粒pDN1528进行PCR扩增：
 #5289
 5′-GCT TTA CGC CCG ATT GCT GAC GCT G -3′
 #26748
 5′-GCG ATG AGA CGC GCG GCC GCC TAT CTT TGA ACA TAA ATT GAAACG GAT CCG -3′
(下划线为BamHⅠ限制性位点)。
使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。在94℃,2分钟，60℃,30秒钟和72℃45秒钟的保温之后是使用在94℃下变性30秒，60℃下退火30秒72℃下延伸45秒的循环分布而进行的10次循环和在94℃下变性30秒，60℃30秒，72℃下45秒(在此延伸步骤中，每次循环加20秒)的20次循环。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上，采用ReadyLoadTM100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标记的电泳来分析10μL扩增产物的等分试样。
根据制造商的说明，使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上描述所产生的40μlPCR产物的等分试样。将纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脱。将25μl纯化的PCR片段用BamHⅠ和PstⅠ消化，在1.0％低胶凝温度的琼脂糖(SeaPlaqueTM GTG,FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶上切下相关片段并根据制选商的说明使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化。将分离的DNA片段连接至BamHⅠ-PstⅠ消化的pBluescriptⅡKS-，并用连接混合物转化大肠杆菌SJ2。
将细胞平板接种在含氨苄青霉素(200μg/ml)并补充有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳吡喃糖苷，50μg/ml)的平板上，37℃保温过夜。第二天，将白色菌落再划线至新的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，37℃保温过夜。第三天将单个菌落转移至包含氨苄青霉素(200μg/ml)的液体LB培养基上，37℃，以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen质粒纯化微型试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提取质粒。将5μl质粒样品用PstⅠ和BamHⅠ消化。通过在0.1％琼脂糖凝胶上(NuSieveTM,FMC)的凝胶电泳来检查消化。将包含带部分α-淀粉酶基因的PstⅠ-BamHⅠ片段的一个阳性克隆称为pMB335。接着将该质粒用于构建α-淀粉酶-CBD杂合酶。
基因组DNA的分离
如国家工业和海洋细菌收藏公司(The National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，苏格兰的建议，60℃下，将粪堆梭菌NCIMB11754厌氧培养在特定的培养基中。离心收集细胞。
如Pitcher等，应用微生物学通讯(Lett.Appl.)Microbil.8(1989),151-156页所描述分离基因组DNA。
粪堆梭菌(NCIMB11754)Xyn A的CBD-二聚体的体外扩增
在补充有200μM各种dNTP，2.6单位HiFidelityTM Expand酶混合物和300pmol各种引物的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中将约100-200ng的基因组DNA进行PCR扩增：
#27183
5′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT GGC GGA
CCT GGA ACG CCA AAT AAT GGA AGA GG  -3′
#27182
5′-GCA CTA GCT AGA CGG CCG CTA CCA GTC AAC ATT AAC AGG ACC
TGA G -3′
(下划线为BamHⅠ和EagⅠ限制性位点)
设计的引物用于扩增编码粪堆梭菌NCIMB17754的Xyn A编码基因的纤维素结合区的DNA；DNA序列从数据库GenBank中的登记号D13325中提取。
使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃下2分钟，60℃下30秒，72℃45秒的保温之后是使用94℃下变性30秒，60℃下退火30秒，72℃下延伸45秒的循环方法进行的PCR的十个循环，以及94℃下变性30秒，60℃下30秒和72℃45秒的二十个循环(在此延长步骤中，每个循环加20秒)。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上采用ReadyLoodTM 100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标记的电泳分析扩增产物的10μl等分试样。
通过聚合酶链反应(PCR)的克隆：
PCR片段的亚克隆
根据制造商的说明，使用QIA quickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上所述产生的PCR产物的40μl等分试样。将纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl pH8.5洗脱。将25μl纯化的PCR片段用BamHⅠ和EagⅠ消化，在1.0％低胶凝温度的琼脂糖(SeaPlaqneTMGTG,FMC)凝胶上进行电泳，从凝胶上切下相关片段并根据制造商的说明使用QIAquickTM Gel提取试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化。接着将分离的DNA片段连接至BamHⅠ-NotⅠ消化的pMB335上，连接混合物被用来转化大肠杆菌SJ2。
阳性克隆的鉴定和表征
将细胞平板接种在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃保温过夜。第二天，将菌落再划线至新的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，37℃保温过夜。第三天，将单个菌落转移至含氨苄青霉素(200μg/ml)的液体LB培养基中，37℃下以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen质粒纯化微型试盒(QiagenVSA)从液体培养物中提取质粒。将5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅡ消化。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上凝胶电泳检查消化。与从PCR扩增中看到的相同大小的DNA片段的出现说明为阳性克隆。
一个包含α-淀粉酶基因和粪堆梭菌(NCIMB,11754)XynA的CBD-二聚体的融合构建物的阳性克隆称为MBamyX。
融合构建物克隆至基于芽孢杆菌的表达载体中
pDN1528载体包含地衣型芽孢杆菌的amgL基因；该基因在枯草芽孢杆菌中活跃地表达，导致上清中活性α-淀粉酶的产生。为了表达目的，将如上构建的编码融合蛋白的DNA导入pDN1528中。
这通过将pMbamyX和pDN1528用SalⅠ-NotⅠ消化，纯化片段并将4.7kb pDN1528 SalⅠ-NotⅠ片段与1.0kb pMBamyX SalⅠ-NotⅠ片段连接来完成。这产生了具有TermamylTM(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)的杂交构建物的框内融合。pMB206的融合构建物的DNA序列以及对应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
连接混合物被用来转化枯草芽孢杆菌的感受态细胞。将细胞平板接种在含氯霉素(6μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂平板上，37℃下保温过夜。第二天，将菌落再划线至新的LBPG(LB平板含0.4％葡萄糖和10mM磷酸钾，pH10)氯霉素琼脂平板上，37℃保温过夜。第三天，将各个克隆的单个菌落转移至含氯霉素(6μg/ml)的液体LB培养基中，37℃，以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen粒纯化微型试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提取质粒。然而，在37℃下将细胞裂解5分钟之前，在重悬液中补充以1mg/ml小鸡蛋白溶菌酶(SIGMA,USA)。将5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通过在1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上的凝胶电泳检查消化。与从PCR扩增中看到的相同大小的DNA片段的出现说明为一阳性克隆，阳性克隆称为MB-BSamyx。
融合蛋白的表达，分泌和功能分析
37℃下，将克隆MB-BSamyx(表达与粪堆梭菌XynA二聚体CBD融合的TermamylTM)在SB培养基中以250rpm摇床培养20小时。将1ml无细胞上清与200μl10％AvicelTM混合。0℃下，将混合物保温1小时，接着以5000×g离心5分钟。将沉淀重新悬浮在100μlSDS-PAGE缓冲液中，95℃下，将悬浮液煮沸5分钟，5000×g离心5分钟，将25μl上样至4-20％LaemmliTris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM凝胶上(Novex,USA)。如制造商推荐，在XcellTMMini-Cell(NOVEX,USA)中将样品进行电泳，如制造商所描述地进行所有后面的凝胶处理，包括染色(考马斯)、脱色和干燥。
分子量为约85kDa的蛋白带的出现表明了Termamyl-CBD融合amyx在枯草芽孢杆菌中的表达。
实施例2
代表新的CBD家族的新的CBD的鉴定
通过37℃下在SB培养基中将克隆以250rpm摇床培养20小时表达如下描述的在枯草芽孢杆菌中克隆的碱性纤维素酶。表达的纤维素酶通过其与AvicelTM的特异性结合的能力被表明包含CBD。
当被进一步保温20小时时，纤维素酶被蛋白酶裂解，SDS-PAGE中出现两条特异性蛋白带，一条相当于分子量(MW)为约35kD的纤维素酶的催化部分，另一条相当于约8kD(MW)的所谓接头和CBD。
CBD被发现为纤维素酶的C-末端部分，并且不与以前描述的CBD族系的任何成员匹配〔Tomme等，纤维素结合区：分类和性质，出身J.N.Saddler和M.H.Penner(编)，不溶性碳水化合物的酶促降解，ACS Symposium Series No.618(1996)〕。因此，该CBD看来是新族系的第一个成员。
来自芽孢杆菌B.agaradherens的碱性纤维素酶(内切葡聚糖酶)的克隆及碱性纤维素酶在枯草芽孢杆菌中的表达
通过PCR克隆编码芽孢杆菌B.agaradherens(保藏登记号NCIMB40482)碱性纤维素酶的核苷酸序列以导入表达质粒pDN1981。基本上如上所述用500ng基因组DNA，使用下面两个用于将编码内切葡聚糖酶的DNA序列导入用于表达的pDN1981中的包含NdeⅠ和KpnⅠ限制性位点的引物进行PCR：
#20887
5′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AAT
CAT GAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′
#21318
5 ′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCC
CAC GGA CCG-3′
在PCR循环后，根据制造商的说明，使用QIAquickTMPCR柱盒(Qiagen,USA)纯化PCR片段。将纯化的DNA用50μl10mMTris-HCl,pH8.5洗脱，用NdeⅠ和KpnⅠ消化，纯化并连接至消化的pDN1981中。连接混合物被用来转化枯草芽孢杆菌PL2306。如Yasbin等细菌学杂志121(1975)，296-304页所述制备并转化感受态细胞。
枯草芽孢杆菌转化体的分离和鉴定
将转化细胞平板接种在含卡那霉素(10mg/ml)0.4％葡萄糖，10mM磷酸钾和0.1％AZCL HE-纤维素(Megazyme，澳大利亚)的LB琼脂平板上，并在37℃下保温18小时。内切葡聚糖酶阳性菌落被鉴定为被兰色晕圈围绕的菌落。
将各个阳性转化体接种在含卡那霉素(10mg/ml)的10ml TY培养基中。37℃下以250rpm振荡保温1天后，取出50ml上清。通过将50ml上清加入在含0.1％AZCL HE-纤维素的LB琼脂平板的琼脂上钻的孔中。
37℃下保温16小时后，围绕孔的兰色晕圈表明了内切葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达。一个这样的克隆被称为MB208。内切葡聚糖酶的编码DNA序列及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中。
如下确定DNA序列：根据制造商的说明操作，使用引物#21318和#20887(见上文)，采用Applied Biosystems373A自动测序仪，用Taq脱氧末端循环测序盒(Perkin Elmer,USA)对Qiagen纯化的质粒DNA测序。根据Devereux等，癌的发生(Carcinogenesis)14(1993),pp.795-801进行序列数据的分析。
芽孢杆菌B.agaradherens NCIMB40482内切葡聚糖酶的CBD的体外扩增
在补充有200μM各种dNTP,2.6单位HiFidelityTM Expand酶混合物和300pmol各种引物的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中将约10-20ng质粒pMB208进行PCR扩增：
#27184
5′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT CCT GGA
GAG TAT CCA GCA TGG GAC CCA A-3′
#28495
5′-GC ACA AGC TTG CGG CCG CTA ATT GAG TGG TTC CCA CGG ACC G
3′(下划线处为BamHⅠ和NatⅠ限制位点)。
设计的引物用来扩增芽孢杆菌B.agaradherens NCIMB40482的纤维素酶编码基因的CBD编码DNA。
使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃下2分钟，60℃30秒和72℃45秒的保温之后是使用94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒的循环方式进行的PCR的十次循环及94℃变性30秒，60℃30秒和72℃45秒的二十次循环(在该延长步骤中，每次循环增加20秒)。通过在1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)中，使用ReadyLoadTM 100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标志的电泳分析10μl扩增产物的等分试样。
通过聚合酶链反应(PCR)的克隆
PCR片段的亚克隆
根据制造商的说明使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上所述产生的40μlPCR产物的等分试样。将纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,PH8.5洗脱。将25μl纯化的PCR片段用BamHⅠ和NotⅠ消化，在1.5％低凝胶化温度的琼脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶中切下相关片段，并根据制造商的说明使用QIAquickTM凝胶提取盒(Qiagen,USA)进行纯化。接着将分离的DNA片段与BamHⅠ-NotⅠ消化的pMB335连接，连接混合物被用于转化大肠杆菌SJ2。
阳性克隆的鉴定和表征
将细胞平板接种在包含氨苄青霉素(200μg/ml)的LB琼脂平板中，37℃保温过夜。第二天，将菌落再划线至新的LB-氨苄青霉素琼脂平板上并37℃保温过夜。第三天，将单个菌落转移至含氨苄青霉素(200ug/ml)的液体LB培养基中并以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen质粒纯化微型试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提取质粒。将5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通过在1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上的凝胶电泳检查消化。与从PCR扩增看见的相同大小的DNA片段的出现表明为阳性克隆。
含有TermamylTMα-淀粉酶基因和芽孢杆菌B.agaradherens N CIMB40482碱性纤维素酶Cel5A之CBD的融合构建体的一个阳性克隆被称为MBamyC5A。
将融合构建体克隆至基于芽孢杆菌的表达载体中
如前所述，地衣芽孢杆菌的amyl基因(包含在pDN1528载体中)在枯草芽孢杆菌中活跃地表达，导致上清中的活性α-淀粉酶的产生。为了表达目的，将如上构建的编码融合蛋白的DNA导入pDN1528中。这通过将pMBamyC5A和pDN1528用SalⅠ-NotⅠ消化，纯化这些片段，并将4.7kb pDN1528 SalⅠ-NotⅠ片段与0.5kbpMBamy C5A SalⅠ-NotⅠ片段连接而完成。这产生了带TermamylTM基因的杂合酶构建体的框内融合。pMB378的融合构建体的DNA序列及相对应的氨基酸序列分别示于SEQ ID No.5和SEQ ID NO.6中。
连接混合物被用于转化枯草芽孢杆菌PL2306的感受态细胞。将细胞平板接种在含氯霉素(6μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钠的LB琼脂平板上，并在37℃保温过夜。第二天，将菌落再划线至新的LBPG氯霉素琼脂平板上并37℃保温过夜。第三天，将各个克隆的单个菌落转移至含氯霉素(6μg/ml)的液体LB培养基，并在37℃下以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen质粒纯化微型试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提取质粒。然而，在37℃下将细胞裂解15分钟之前，在重悬缓冲液中补充以1mg/ml小鸡蛋白溶菌梅(SIGMA,USA)。将5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。通过在1.5％琼脂糖凝胶上(NuSieveTM,FMC)的凝胶电泳检查消化。与从PCR扩增中看到的相同大小的DNA片段的出现表明为一阳性克隆。一个阳性克隆被称为MB378。
融合蛋白的表达、分泌和功能分析
37℃下，将克隆MB378(表达与芽孢杆菌B.agaradherensCel5A CBD融合的TermamylTM)在SB培养基中250rpm摇床培养20小时，将1ml无细胞上清与200μl10％AvicelTM混合。0℃下，将混合物保温1小时，并接着以5000×g离心5分钟。将沉淀重新悬浮于100μlSDS-PAGE缓冲液中，95℃下将悬浮液煮沸5分钟，5000×g离心5分钟，并将25μl上样至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM凝胶上(Novex,USA)。如制造商推荐，在XcellTM Minl-Cell(NOVEX,USA)上将样品进行电泳。如制造商所述，进行所有后面的对凝胶的处理，包括染色(考马斯)、脱色和干燥。
分子量约为60kDa的蛋白带的出现表明了编码在质粒pMB378上的TermamylTM CBD融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达。
实施例3
本实施例描述了使用序列重叠延伸(SOE)方法[参见Sambrook等，Ausubel等或C.R.Harwood和S.M.Cutting(同上)]融合TermamylTM和来自纤维单孢菌(C.fimi(ATC C484)cenA基因的CBD。最终构建物如下：TermamylTM启动子-TermamylTM信号肽-cenA CBD-接头-成熟TermamylTM。
用于SOE的TermamylTM片段的扩增
在补充有200μM各种dNTP、2.6单位的HiFidelityTMExpand酶混合物和100pmol各种引物的HiFidelityTM PCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中将约10-20ng的质粒pDN1528进行PCR扩增：
#4576
5′-CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC-3′
#28403
5′-TGC ACT GGT ACA GTT CCT ACA ACT AGT CCT ACA CGT GCA AAT
CTT AAT GGG ACG CTG-3′
组成TermamylTM序列的一个片段的引物#28403的那个部分被下划线。该下划线序列的5′端的序列为编码CBD接头区的序列。
使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。90℃,2分钟，55℃,30秒及72℃,45秒的一次保温之后是使用96℃变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒的循环方式进行的PCR二十次循环。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)，使用ReadyLoadTM100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标记的电泳分析10Ml扩增产物的等分试样。
根据制造商的说明，使用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上所述产生的40μlPCR产物的等分试样。将纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脱。
基因组DNA的分离
30℃下，在TY培养基中，将纤维单孢菌C.fimi ATCC484以250rpm振荡培养24小时。离心收集细胞。
如Pitcher等应用微生物学通讯8(1989),p.151-156中所描述分离基因组DNA。
用于SOE方法的纤维单孢菌C.fimi(ATCC484)cenA基因的CBD的体外扩增。
在补充有200μM各种dNTP、2.6单位HiFidelityTM Expand酶混合物及100pmol各种引物的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中将约100-200ng的基因组DNA进行PCR扩增：
#8828
5′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCC
GGC TGC CGC GTC GAC TAC-3′
#28404
5′-TGT AGG AAC TGT ACC AGT GCA CGT GGT GCC GTT GAG C-3′
(PstⅠ限制性位点下划线)
设计引物以扩增纤维单孢菌C.fimi(ATC C484)的cenA编码基因的编码纤维素结合区的DNA。从数据库GenBank登记号M15823中提取DNA序列。
PCR循环如下进行：94℃,2分钟，55℃,30秒及72℃,45秒的一次保温之后是使用96℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸45秒的循环方式的PCR的三十次循环。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)，使用ReadyLoadTM 100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标记的电泳分析10μl扩增物的等分试样。
根据制造商说明，使用QIAquickTMpCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上描述产生的40μl PCR产物的等分试样。
将纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5洗脱。
来自纤维单孢菌C.fimi(ATCC484)cenA基因的CBD和TermamylTM基因的SOE
使用100-200ngPCR扩增的TermamylTM片段和PCR扩增cenA CBD片段进行第二轮PCR。在补充有200μM各种dNTP、2.6单位HiFidelityTM Expand酶混合物的HiFidelityTM PCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中进行两个片段的SOE。
如下进行触降式(touch-down)PCR循环：96℃,2分钟，60℃,2分钟和72℃,45秒的保温。在每次循环中将复性温度降低1℃将此循环重复十次。
通过加入100pmol两个侧翼引物#8828和#4576(参见上文)来开始第三次PCR反应以扩增杂合DNA。通过将SOE反应混合物在96℃,2分钟，55℃,30秒，72℃,45秒进行保温来进行PCR。此后接着是使用96℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸45秒的循环方式进行PCR的二十次循环。通过在1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上，使用ReadyLoadTM100bp DNA阶梯(GibcoBRL，丹麦)作为大小标记，电泳分析10μl扩增产物的等分试样。
编码CBD-Termamyl杂合酶的SOE片段的亚克隆
根据制造商的说明，使用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化如上所述产生的40μl SOE-PCR产物。将纯化的DNA用50ul 10mM Tris-HCl,pH8.5洗脱。将25μl纯化的PCR片段用PstⅠ和KpnⅠ消化，在1.0％低凝胶化温度的琼脂糖(SeaPlaqueTM GTG,FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶中切837bp片段，根据制造商的说明，使用QIA quickTM凝胶提取盒(Qiagen,USA)纯化，接着将分离的DNA片段连接至PstⅠ和KpnⅠ消化的pDN1981中，连接混合物被用来转化枯草芽孢杆菌PL2306的感受态细胞。将细胞平板接种在含卡那霉素(10μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂平板上，并37℃保温过夜。第二天，将菌落重新划线至新的LBPG卡那霉素琼脂平板并37℃保温过夜。第三天，将各克隆的单个菌落转移至含卡那霉素(10ug/ml)的液体LB培养基中，并在37℃下，以250rpm振荡保温过夜。
根据制造商的说明，使用QIAgen质粒纯化微型试剂盒(Qiagen,USA)，从液体培养物中提取质粒。然而，在37℃下将细胞裂解15分钟之前，在重悬缓冲液中补充以1mg/ml小鸡蛋白溶菌酶(SIGMA,USA)。将5μl质粒样品用PstⅠ和KpnⅠ消化。通过1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)上的凝胶电泳检查消化。与从PCR扩增看到的相同大小的837bp的DNA片段的出现表明为阳性克隆。一个阳性克隆称为MOL1297。
融合蛋白的表达，分泌和功能分析
37℃下，将克隆MOL1297(表达与TermamyTM的N-末端融合的纤维单孢菌C.fimi)cenA CBD)在SB培养基中以250rpm振荡保温20小时。将1ml无细胞上清与200μl10％AvicelTM混合。0℃下，将混合物保温1小时，并接着以5000xg离心5分钟。将沉淀物重新悬浮在100μlSDS-PAGE缓冲液中，95℃煮沸5分钟，5000xg离心5分钟，将25μl上样至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEX凝胶(Novex,USA)上。如制造商所推荐，在XcellTM Mini-Cell(NOVEX,USA)中将样品进行电泳。如制造商所述进行所有后面的对凝胶的处理，包括染色(考马斯)、脱色和干燥。
分子量为约85kDa的蛋白带的出现表明了CBD-TermamylTM融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达。
纤维单孢菌C.fimi cenA CBD-Termamyl杂合酶的编码序列示于SEQ ID NO.7中(其中小写字母表示该序列的CBD编码部分)。杂合酶的相对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO.8中(其中小写字母表示CBD氨基酸序列)。
实施例4
本实施例描述了从脂酶(LipolaseTM；腐质霉H.lanuginosa脂酶)和CBD构建融合蛋白(杂合体)。由于酶的N-端远离活性部位，而C-末端与活性部位相对邻近，则因而择了具有N-末端CBD的构建物。
pIVI450构建物(CBD-接头-脂酶)
为了表达在LipolaseTM的N-末端具有嗜热毁丝霉纤维素酶CBD和接头的蛋白，制备了该构建物。
使用包含嗜热毁丝霉纤维素酶基因的克隆pA2C161(DSM9967)作为模板和下面的寡聚体作为引物产生了一个PCR片段：
#8202
5′ACGTAGTGGCCACGCTAGGCGAGGTGGTGG 3′
#19672
5′CCACACTTCTCTTCCTTCCTC 3′
将该PCR片段用BamHⅠ和BalⅠ切割，并克隆至正好在推测的信号肽加工位点上游也被BamHⅠ和BalⅠ切割的pAHL中。通过测序(参见SEQ ID NO.9)验证克隆。
除去位于CBD和脂酶之间的接头
制备该构建物以便感兴趣的任何接头可被插在CBD和脂酶之间以寻找最佳接头。
通过USE方法(Stratagene商品号200509)将NheⅠ位点导入pIVI450中的CBD和接头区之间，产生pIVI450+NheⅠ位点。将pIVI450+NheⅠ位点用XhoⅠ和NheⅠ切割，分离含CBD部分的载体。
将质粒pIVI392用XhoⅠ和NheⅠ切割，分离含LipolaseTM基因(减去信号肽编码序列)的片段。
连接这些DNA片段，产生在CBD和脂酶基因之间包含NheⅠ的pIVI450 CBD-NheⅠ位点-LipolaseTM。在该NheⅠ位点可导入不同的接头。
非糖基化接头的导入
从本文描述的构建物表达的蛋白包含下述结构：
CBD-非糖基化接头-脂酶。
接头的氨基酸序列如下：
NNNPQQGNPNQGGNNGGGNQGGGNGG
使用下面引物进行PCR：
#29315
5′GATCTAGCTAGCAACAATAACCCCCAGCAGGGCAACCCCAACCAGGGC
GGGAACAACGGC 3′
#29316
5′GATCTAGCTAGCGCCGCCGTTGCCGCCGCCCTGGTTGCCGCCGCCGTT
GTTCCCGCCCTG 3′
将PCR片段用NheⅠ切割，同样将载体pIVI450 CBD-NheⅠ-LipolaseTM用NheⅠ切割，连接两个片段，产生：
pIVI450 CBD-非糖基化的接头-LipolaseTM(SEQ IDNO.10)。
鞋垫腐质霉第54家族纤维素酶接头的导入
从本文描述的构建物表达的蛋白包含如下结构：
CBD-糖基化接头-脂酶
接头的氨基酸序列如下：
VQIPSSSTSSPVNQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPS
使用下述引物进行PCR：
#29313
5′GATACTGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGC 3′
#29314
5′GATACTGCTAGCGCTGGGAGTCGTAGGCTG 3′
将PCR片段用NheⅠ切割，同样将载体pIVI450 CBD-NheⅠ-LipolaseTM用NheⅠ切割，连接两个片段，产生：
pIVI450 CBD-鞋垫腐质霉45家族纤维素酶接头-LipolaseTM(SEQ ID NO.11)。
实施例5
本实施例涉及包含与灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)或与其突变体(mCiP842)相连的CBD的融合蛋白(参见如WO95/10602)。
酵母表达系统
选择PJC106/YNG344宿主/载体系统作为用于使用酵母表达的所有CiP实验的标准表达系统。突变mCiP842与亲本CiP相比含有下面的氨基酸取代：V53A,E239G,Y272F,M242I。使用与用于将CBD与野生型CiP基因融合的相同方法用该质粒进行构建。
CBD-CiP融合载体JC20A或JC20D的构建：CiP信号序列-鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD-鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头-CiP或mCiP842
通过使用PCR扩增四种单独的基因片段构建CBD-CiP融合蛋白。A)CiP5-非翻译区和来自质粒JC106或mCiP842的编码氨基酸1-22的CiP编码序列，B)来自质粒pCaHj418的编码氨基酸248-305的鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD，C)来自质粒pCaHj418的编码氨基酸213-247的鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头区，及D)来自质粒JC106或mCiP842的编码氨基酸21-344的CiP编码序列
鞋垫腐质霉家族45纤维素酶的序列公开在WO91/17244中。
用于A至D扩增中的引物如下：
扩增A
1．CiPpcrdwn:CCCCCTTCCCTGGCGAATTCCGCATGAGG
2．JC20.1:ACCTTGGGGTAGAGCGAGGGCACCGATG
扩增B
3．JC20.2:TGCACTGCTGAGAGGTGGGC
4．JC20.3:CAGGCACTGATGATACCAGT
扩增C
5．JC20.4:CCCTCCAGCAGCACCAGCTCT
6．JC20.5:TCCTCCAGGACCCTGACCGCTCGGAGTCGTAGGCTG
扩增D
7．JC20.6:TACGACTCCGAGCGGTCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGG
8．YES2term:GGGAGGGCGTGAATGTAAG
纯化反应A和B的扩增产物并使用T4多核苷酸激酶磷酸化，室温下互相连接15分钟，并用引物1和4扩增以产生产物AB。纯化并混合反应C)和D)的扩增产物，接着进行PCR扩增以产生产物CD。纯化反应产物AB和CD，并使用T4多核苷酸激酶磷酸化。室温下互相连接15分钟，并使用引物1和8扩增以产生最终产物。纯化得到的产物，与通过用BamHⅠ和XhoⅠ消化除去了CiP基因的质粒JC106混合。质粒JC20A包含野生型CiP基因，而质粒JC20D包含过氧化物稳定的突变mCiP842。在缺乏尿苷的基本培养基上选择转化体。
其它CBD-CiP融合载体JC21、22、23的构建
基本上如对上面质粒JC20A描述的相同方法，使用PCR和重叠延伸构建在鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD与CiP之间包含其他接头的其它质粒。产生的质粒编码具有下面区域结构的融合蛋白：
JC21:CiP信号序列-截短的鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD-鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头-CiP
JC22:CiP信号序列-鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD-来自肺炎克雷白氏杆菌的NifA基因的接头-CiP。
JC23:CiP信号序列-鞋垫腐质霉家族系45纤维素酶CBD-来自大肠杆菌OmpA基因的接头-CiP。
评价转化体过氧化物酶和纤维素结合活性
平板分析：将酵母转化体培养在含2％半乳糖(诱导驱动CBD-CiP表达的GAL1酵母启动子)的覆盖有由位于硝基纤维素顶部的乙酸纤维素组成的双滤纸层的基本培养基平板中。过夜培养后，将滤纸用100ml20mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤5分钟，此后未能检测出菌落碎片。接着通过将其用含50μg/ml二氨基联苯胺和1mM过氧化氢的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)覆盖来分析滤纸上结合的过氧化物酶活性。结合的过氧化物酶活性以在滤纸上的褐色沉淀的形式出现。
液体分析：将在滤纸分析中显示纤维素结合的突变体的液体培养物在含2％半乳糖的基本培养基中培养过夜。将20μl培养液的样品与Avicel结晶纤维素(20g/l)在含0.01％Tween20的0.1M磷酸缓冲液(pH7)中混合，总体积为100μl,22℃下，保温10分钟。接着将混合物离心以沉淀不溶性纤维素成分，使用标准CiP分析(参见如WO95/10602)分析上清的过氧化物酶活性。根据可溶性活性的降低，以与不溶性纤维素成分结合的活性％来评价结合作用。
对CBD-CiP融合蛋白的高pH/热稳定性筛选
本筛选方法使用来自在微量滴定平板上生长的酵母培养液样品。通过如下方法进行96孔板筛选，首先在96孔微量滴定平板中，在50μl体积的URA(-)培养基(pH6.0)中培养突变体库的酵母转化体。通过稀释至培养基中并用移液管(机器或人工自动移液器)吸至96孔平板中来接种培养物。将其放置在30℃、35bRPM培养箱中，并摇床温养约5天。将平板直接从培养箱中放入机器系统中。
将CiP和mCiP842及相关的融合蛋白进行pH-温度-H2O2联合试验：在初始活性分析后，将培养物稀释至约0.06PODU/ml(参见WO95/10602的PODU的定义)，并在50℃下保温于200μM过氧化氢、100mM磷酸盐/硼酸盐缓冲液(pH10.5)中。0.1、0.20和30分钟后，除去样品，使用标准ABTS分析，在pH7.0测定残留活性。改进的突变体为显示比CiP更高的残留活性的那些，并以相对于时间0分析结果的残留活性的百分数来表示。
构建并测序被设计用来制备五个鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD-CiP融合蛋白的酵母表达质粒。这些融合蛋白之间的主要不同在于连接CBD与CiP的接头区的类型。因为它被认为对于使CBD与纤维素底物的结合最大化是很重要的。
所有的构建物编码四个不同区域的融合：CiP信号序列-鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD-接头-CiP。质粒JC20A是与野生型CiP的CBD-CiP融合，而质粒JC20D是与含氨基酸取代V53A、E239G、M242Ⅰ和Y272F的稳定突变体mCiP842的融合。两种JC20构建物都包含天然鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头区。
质粒JC21编码除开它含有缺乏鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头的残基7-23的截短接头之外与JC20产物相同的融合蛋白。质粒JC22具有来自大肠杆菌外膜蛋白(来自OmpA基因)的12个富含脯氨基残基的接头，取代鞋垫腐质霉家族45纤维素酶接头区。最终质粒JC23包含来自肺炎克雷白氏杆菌的NifA基因的第四个接头(称为Q接头)。长度为14个氨基酸的该接头包含3个谷氨酰胺残基(因此称为Q接头)以及3个精氨酸残基，这使得其在中性pH时带正电。
将这些JC20-系列质粒转化至酒酒酵母中以用于表达和检测，转化后，将酵母菌落培养在覆盖有双层滤纸层的选择平板上：乙酸纤维素滤纸位于硝基纤维素上部。由酵母JC106分泌的野生型CiP和稳定的突变体mCiP842通过乙酸纤维素，接着与硝酸纤维素结合，在那里它可使用二氨基联苯胺(DAB)和H2O2而被肉眼观察到。乙酸纤维素滤纸没有结合任何野生型或mCiP842过氧化物酶。相反，由质粒JC20A、JC20D、JC21、JC22和JC23编码的N-末端CBD-CiP融合体均可使用DAB分析在两个滤纸上检测到，这表明融合蛋白具有过氧化物酶和纤维素结合活性。对滤纸的肉眼观测表明NifA接头可能增进结合使其略高于其它，尽管差别有限。在所有情况下，甚至在pH7用缓冲液充分洗涤后与乙酸纤维素滤纸结合的过氧化物酶活性仍然保留。与下面的硝酸纤维滤纸的结合活性表明CBD-CiP的结合可能是不完全的，或该纤维素滤纸达到饱和，使得一些融合蛋白穿过而到达下面的滤纸，或一部分融合蛋白被截短得仅包括过氧化物酶区域。
对相应于构建物的序列识别号说明如下。简写如下：
EGV：鞋垫腐质酶家族45内切葡聚糖酶(纤维素酶)
CiPss:CiP信号序列
CiP842:CiP突变体/变异体mCiP842；
SEQ IDNO.12:JC20.A中的CiPss(+2个氨基酸)-EGV CBD-EGV接头-CiP融合体的核苷酸序列；
SEQ ID NO 13:JC20.D1中的CiPss(+2个氨基酸)-EGVCBD-EGV接头-CiP842融合体的核苷酸序列；
SEQ ID NO 14:JC21中的CiPss(+2个氨基酸)-EGV CBD-截短的EGV接头-CiP融合体的核苷酸序列：
SEQ ID NO 15:JC22中的CiPss(+2个氨基酸)-EGV CBD-大肠杆菌OmpA接头-CiP融合体的核苷酸序列；
SEQ ID NO 16:JC23中的CiPss(+2个氨基酸)-SGV CBD-NifA接头-CiP融合体的核苷酸序列。
实施例6
本实施例涉及包含与嗜热毁丝霉漆酶(MtL)(MtL描述在如WO95/33836中)相连的CBD的融合蛋白
N-末端MtL-CBD融合体pJC24的构建
使用质粒pJC23的两个特定引物，将含有灰盖鬼伞过氧化物酶(CiP)信号序列(22个氨基酸)、鞋垫腐质霉家族45纤维素酶CBD(37个氨基酸)及来自肺炎克雷白氏杆菌的NifA接头区(14个氨基酸)的DNA片段进行PCR扩增。
引物名             序列
CiPpcrdwn    CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATG
JC24.1       AGCGCGTGGACGTTCGATGC
根据制造商的说明，使用提供的缓冲液，采用Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)进行PCR扩增。96℃下，加入聚合酶3分钟后反应开始，并以96℃30秒，60℃30秒及72℃2分钟循环30次。从包含在质粒pJRoC30的毁丝霉漆酶的cDNA克隆，将编码缺乏信号肽和前肽(残基48-620)的成熟MtL肽的第二个PCR片段进行PCR扩增。使用如上所述的相同条件及下面的引物对进行PCR扩增：
引物名               序列
JC24.2      CAGCAGAGCTGCAACACCCCCAG
YES2term    GGGGAGGGCGTGAATGTAAG
扩增后，根据制造商的推荐，使用QiaquickTMSpin纯化试剂盒(Qiagen,Inc.)纯化两个DNA片段。接着连接两个DNA片段，连接混合物的一部分被用作模板使用CiPpcrdwn和YES2term引物，在如上所述的相同条件下进行PCR扩增。将产生的2.3kb嵌合DNA片段进行凝胶纯化，用BamHⅠ和NotⅠ限制性酶切割，并与质粒pJC106的载体骨架相连，获得质粒pJC24。
C-末端MtL-CBD融合pJC25的构建
从质粒pJRoC30，使用下述引物对扩增编码完整MtL肽(残基1-620)及232bp上游序列的PCR片段：
引物名                  序列
CiPpcrdwn    CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATG
JC25.2       CGCCTTGACCAGCCACTCGCCCTCCTCG
从鞋垫腐质酶家族45纤维素酶质粒pCaH；418，使用下述引物扩增编码鞋垫腐质酶家族45纤维素酶接头区135个氨基酸)、鞋垫腐质酶家族45纤维素CBD(37个氨基酸)和20bP的3′-非编码序列的第二个DNA片段：
引物名          序列
JC20.4    CCCTCCAGCAGCACCAGCTCTC
JC25.1NotⅠATAAGAATGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTACCAGT
将两个DNA片段迅速连接，并如上所述，使用引物CiPpcrdwn和JC25.1NotⅠ扩增全长2.3kb融合产物。将该最终PCR产物克隆至质粒pJC106中以获得质粒pJC25。
C-末端MtL-CBD融合pJC26的构建
除开用引物ML-ct替代引物JC25.1外，用几乎与pJC25相同的方式构建质粒pJC26，产生缺乏最终17个密码子的MtL基因的截短的产物
引物名       序列
ML-ct    CAGCAGAGCTGCAACACC
相应于构建物的序列识别号说明如下。简写如下：
EGV：鞋垫腐质酶家族45内切葡聚糖酶(纤维素酶)
CiPss:CiP信号序列
MtLss:MtL信号序列
SEQ ID NO.17:pJC24中的CiPss(+2个氨基酸)-EGVCBD-NifA接头-MtL融合体的核苷酸序列；
SEQ ID NO.18:pJC25中的MtLss-MtL前肽-MtL-EGV接头-EGV CBD融合体的核苷酸序列；
SEQ ID No.19:pJC26中的MtLss-MtL前肽-MtL(减去17个氨基酸)-EGV接头-EGV CBD融合体的核苷酸序列。相应于所述17个氨基酸的密码子用黑体示于SEQ ID NO.18中。
            序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人：(A)名称：NOVO NORDISK A/S(B)街道：Novo Alle(C)城市：Bagsvaerd(E)国家：丹麦(F)邮编(ZIP)：DK-2880(G)电话：+45 44 44 88 88(H)电传：+45 44 49 32 56(ⅱ)发明题目：从纤维素织物中除去或漂白污斑或色斑的方法(ⅲ)序列数目：6(ⅳ)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version# 1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：2253碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:TGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACGAAAGGA 1200GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTG GCGGACCTGG AACGCCAAAT 1560AATGGCAGAG GAATTGGTTA TATTGAAAAT GGTAATACCG TAACTTACAG CAATATAGAT 1620TTTGGTAGTG GTGCAACAGG GTTCTCTGCA ACTGTTGCAA CGGAGGTTAA TACCTCAATT 1680CAAATCCGTT CTGACAGTCC TACCGGAACT CTACTTGGTA CCTTATATGT AAGTTCTACC 1740GGCAGCTGGA ATACATATCA ACCGTATCTA CAAACATCAG CAAAATTACC GGCGTTCATG 1800ATATTGTATT GGTATTCTCA GGTCCAGTCA ATGTGGACAA CTTCATATTT AGCAGAAGTT 1860CACCAGTGCC TGCACCTGGT GATAACACAA GAGACGCATA TTCTATCATT CAGGCCGAGG 1920ATTATGACAG CAGTTATGGT CCCAACCTTC AAATCTTTAG CTTACCAGGT GGTGGCAGCG 1980CTTGGCTATA TTGAAAATGG TTATTCCACT ACCTATAAAA ATATTGATTT TGGTGACGGC 2040GCAACGTCCG TAACAGCAAG AGTAGCTACC CAGAATGCTA CTACCATTCA GGTAAGATTG 2100GGAAGTCCAT CGGGTACATT ACTTGGAACA ATTTACGTGG GGTCCACAGG AAGCTTTGAT 2160ACTTATAGGG ATGTATCCGC TACCATTAGT AATACTGCGG GTGTAAAAGA TATTGTTCTT 2220GTATTCTCAG GTCCTGTTAA TGTTGACTGG TAG                              2253(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：750氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1               5                   10                  15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu
        20                  25                  30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly
    35                  40                  45Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His
50                  55                  60Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln65                  70                  75                  80Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe
            85                  90                  95His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu
        100                 105                 110Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly
    115                 120                 125Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val
130                 135                 140Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly145                 150                 155                 160Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly
            165                 170                 175Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr
        180                 185                 190Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly
    195                 200                 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr
210                 215                 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225                 230                 235                 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly
            245                 250                 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp
        260                 265                 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val
    275                 280                 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn
290                 295                 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305                 310                 315                 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu
            325                 330                 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe
        340                 345                 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val
    355                 360                 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu
370                 375                 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385                 390                 395                 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile
            405                 410                 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe
        420                 425                 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val
    435                 440                 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala
450                 455                         460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465                 470                 475                 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp
            485                 490                 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg
        500                 505                 510Ser Gly Gly Pro Gly Thr Pro Asn Asn Gly Arg Gly Ile Gly Tyr Ile
    515                 520                 525Glu Asn Gly Asn Thr Val Thr Tyr Ser Asn Ile Asp Phe Gly Ser Gly
530                 535                 540Ala Thr Gly Phe Ser Ala Thr Val Ala Thr Glu Val Asn Thr Ser Ile545                 550                 555                 560Gln Ile Arg Ser Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Leu Tyr
            565                 570                 575Val Ser Ser Thr Gly Ser Trp Asn Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Gln Thr
        580                 585                 590Ser Ala Lys Leu Pro Ala Phe Met Ile Leu Tyr Trp Tyr Ser Gln Val
    595                 600                 605Gln Ser Met Trp Thr Thr Ser Tyr Leu Ala Glu Val His Gln Cys Leu
610                 615                 620His Leu Val Ile Thr Gln Glu Thr His Ile Leu Ser Phe Arg Pro Arg625                 630                 635                 640Ile Met Thr Ala Val Met Val Pro Thr Phe Lys Ser Leu Ala Tyr Gln
            645                 650                 655Val Val Ala Ala Leu Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr
        660                 665                 670Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Val Thr Ala Arg Val
    675                 680                 685Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser
690                 695                 700Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp705                 710                 715                 720Thr Tyr Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys
            725                 730                 735Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro Val Asn Val Asp Trp
        740                 745                 750(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：1203碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：基因组(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATGAAAAAGA TAACTACTAT TTTTGTCGTA TTGCTTATGA CAGTGGCGTT GTTCAGTATA 60GGAAACACGA CTGCTGCTGA TAATGATTCA GTTGTAGAAG AACATGGGCA ATTAAGTATT 120AGTAACGGTG AATTAGTCAA TGAACGAGGC GAACAAGTTC AGTTAAAAGG GATGAGTTCC 180CATGGTTTGC AATGGTACGG TCAATTTGTA AACTATGAAA GTATGAAATG GCTAAGAGAT 240GATTGGGGAA TAAATGTATT CCGAGCAGCA ATGTATACCT CTTCAGGAGG ATATATTGAT 300GATCCATCAG TAAAGGAAAA AGTAAAAGAG GCTGTTGAAG CTGCGATAGA CCTTGATATA 360TATGTGATCA TTGATTGGCA TATCCTTTCA GACAATGACC CAAATATATA TAAAGAAGAA 420GCGAAGGATT TCTTTGATGA AATGTCAGAG TTGTATGGAG ACTATCCGAA TGTGATATAC 480GAAATTGCAA ATGAACCGAA TGGTAGTGAT GTTACGTGGG GCAATCAAAT AAAACCGTAT 540GCAGAGGAAG TCATTCCGAT TATTCGTAAC AATGACCCTA ATAACATTAT TATTGTAGGT 600ACAGGTACAT GGAGTCAGGA TGTCCATCAT GCAGCTGATA ATCAGCTTGC AGATCCTAAC 660GTCATGTATG CATTTCATTT TTATGCAGGG ACACATGGTC AAAATTTACG AGACCAAGTA 720GATTATGCAT TAGATCAAGG AGCAGCGATA TTTGTTAGTG AATGGGGAAC AAGTGCAGCT 780ACAGGTGATG GTGGCGTGTT TTTAGATGAA GCACAAGTGT GGATTGACTT TATGGATGAA 840AGAAATTTAA GCTGGGCCAA CTGGTCTCTA ACGCATAAAG ATGAGTCATC TGCAGCGTTA 900ATGCCAGGTG CAAATCCAAC TGGTGGTTGG ACAGAGGCTG AACTATCTCC ATCTGGTACA 960TTTGTGAGGG AAAAAATAAG AGAATCAGCA TCTATTCCGC CAAGCGATCC AACACCGCCA 1020TCTGATCCAG GAGAACCGGA TCCAACGCCC CCAAGTGATC CAGGAGAGTA TCCAGCATGG 1080GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1140AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1200TAA                                                               1203(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：400氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Lys Lys Ile Thr Thr Ile Phe Val Val Leu Leu Met Thr Val Ala1               5                   10                  15Leu Phe Ser Ile Gly Asn Thr Thr Ala Ala Asp Asn Asp Ser Val Val
        20                  25                  30Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu
    35                  40                  45Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln
50                  55                  60Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp65                  70                  75                  80Asp Trp Gly Ile Asn Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly
            85                  90                  95Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu Lys Val Lys Glu Ala Val
        100                 105                 110Glu Ala Ala Ile Asp Leu Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile
    l15                 120                 125Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys Asp Phe
130                 135                 140Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Tyr Pro Asn Val Ile Tyr145                 150                 155                 160Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp Val Thr Trp Gly Asn Gln
            165                 170                 175
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Ile Ile Arg Asn Asn Asp
            180                 185                 190
Pro Asn Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
        195                 200                 205
His His Ala Ala Asp ASn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr Ala
    210                 215                 220
Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg Asp Gln Val
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp Gly
                245                 250                 255
Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp Glu Ala Gln
            260                 265                 270
Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn Trp
        275                 280                 285
Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Sar Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala
    290                 295                 300
Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr
305                 310                 315                 320
Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Ile Pro Pro Ser Asp
                325                 330                 335
Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn
        355                 360                 365
Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr
    370                 375                 380
Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu Pro Leu Asn
385                 390                 395                 400
    (2)SEQ ID NO:5的信息：
    (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：1683碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
    (ⅱ)分子类型：基因组
    (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:
ATGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60
TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120
GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180
TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240
GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300
ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360
TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420
ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480
GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540
GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600
AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660
AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720
ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780
GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840
ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900
AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960
TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020
GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080
GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140
CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACGAAAGGA 1200
GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260
AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320
ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380
CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440
ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500
GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTC CTGGAGAGTA TCCAGCATGG 1560
GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1620
AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1680
TAA                                                               1683
    (2)SEQ ID NO：6的信息：
    (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：560氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
    (ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
    1               5                   10                  15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu
            20                  25                  30
Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly
        35                  40                  45
Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His
    50                  55                  60
Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln
    65                  70                  75              80
Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe
                85                  90                  95
His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu
            100                 105                 110
Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly
        115                 120                 125
Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val
    130                 135                 140
Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly
    145                 150                 155                 160
Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr
            180                 185                 190
Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly
    195                 200                 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr
210                 215                 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225                 230                 235                 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly
            245                 250                 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp
        260                 265                 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val
    275                 280                 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn
290                 295                 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305                 310                 315                 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu
            325                 330                 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe
        340                 345                 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val
    355                 360                 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu
370                 375                 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385                 390                 395                 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile
            405                 410                 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe
        420                 425                 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val
    435                 440                 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala
450                 455                 460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465                 470                 475                 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp
            485                 490                 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg
        500                 505                 510Ser Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn
    515                 520                 525Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr
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 540CGGACCAACAATCTTTGCGGACTGGGGCGACACGATCCAGGTAACGGTCATCAACAACCT 600CGAGACCAACGGCACGTCGATCCACTGGCACGGACTGCACCAGAAGGGCACCAACCTGCA 660CGACGGCGCCAACGGTATCACCGAGTGCCCGATCCCGCCCAAGGGAGGGAGGAAGGTGTA 720CCGGTTCAAGGCTCAGCAGTACGGGACGAGCTGGTACCACTCGCACTTCTCGGCCCAGTA 780CGGCAACGGCGTGGTCGGGGCCATTCAGATCAACGGGCCGGCCTCGCTGCCGTACGACAC 840CGACCTGGGCGTGTTCCCCATCAGCGACTACTACTACAGCTCGGCCGACGAGCTGGTGGA 900ACTCACCAAGAACTCGGGCGCGCCCTTCAGCGACAACGTCCTGTTCAACGGCACGGCCAA 960GCACCCGGAGACGGGCGAGGGCGAGTACGCCAACGTGACGCTCACCCCGGGCCGGCGGCA 1020CCGCCTGCGCCTGATCAACACGTCGGTCGAGAACCACTTCCAGGTCTCGCTCGTCAACCA 1080CACCATGACCATCATCGCCGCCGACATGGTGCCCGTCAACGCCATGACGGTCGACAGCCT 1140CTTCCTCGGCGTCGGCCAGCGCTACGATGTCGTCATCGAAGCCAGCCGAACGCCCGGGAA 1200CTACTGGTTTAACGTCACATTTGGCGGCGGCCTGCTCTGCGGCGGCTCCAGGAATCCCTA 1260CCCGGCCGCCATCTTCCACTACGCCGGCGCCCCCGGCGGCCCGCCCACGGACGAGGGCAA 1320GGCCCCGGTCGACCACAACTGCCTGGACCTCCCCAACCTCAAGCCCGTCGTGGCCCGCGA 1380CGTGCCCCTGAGCGGCTTCGCCAAGCGGCCCGACAACACGCTCGACGTCACCCTCGACAC 1440CACGGGCACGCCCCTGTTCGTCTGGAAGGTCAACGGCAGCGCCATCAACATCGACTGGGG 1500CAGGCCCGTCGTCGACTACGTCCTCACGCAGAACACCAGCTTCCCACCCGGGTACAACAT 1560TGTCGAGGTGAACGGAGCTGATCAGTGGTCGTACTGGTTGATCGAGAATGATCCCGGCGC 1620ACCTTTCACCCTACCGCATCCGATGCACCTGCACGGCCACGACTTTTACGTGCTGGGCCG 1680CTCGCCCGACGAGTCGCCGGCATCCAACGAGCGGCACGTGTTCGATCCGGCGCGGGACGC 1740GGGCCTGCTGAGCGGGGCCAACCCTGTGCGGCGGGACGTGACGATGCTGCCGGCGTTCGG 1800GTGGGTGGTGCTGGCCTTCCGGGCCGACAACCCGGGCGCCTGGCTGTTCCACTGCCACAT 1860CGCCTGGCACGTCTCGGGCGGCCTGGGCGTCGTCTACCTCGAGCGCGCCGACGACCTGCG 1920CGGGGCCGTCTCGGACGCCGACGCCGACGACCTCGACCGCCTCTGCGCCGACTGGCGCCG 1980CTACTGGCCTACCAACCCCTACCCCAAGTCCGAC
                     CCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGTAGGCGGCCGCATTCTTAT

Claims (17)

1．一种除去或漂白存在于纤维素纤维品上的污斑或色斑的方法，其中将纤维品与含有改性酶(杂合酶)的水介质接触，该改性酶包含与包含纤维素结合区的氨基酸序列相连的非纤维素分解酶的具有催化活性的氨基酸序列。
2．根据权利要求1的方法，其中所述污斑或色斑来自淀粉，蛋白质，脂肪，土壤，粘土，水果，蔬菜，咖啡，茶，调味品，红酒，体液，草或墨水。
3．根据权利要求1的方法，其中所述具催化活性的氨基酸序列来自选自淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，果胶酶和氧化还原酶的酶。
4．根据权利要求3的方法，其中所述淀粉酶为可从芽孢杆菌属的种类获得的α-淀粉酶。
5．根据权利要求3或4的方法，其中所述α-淀粉酶可从地衣牙芽孢杆菌获得。
6．根据权利要求3的方法，其中所述蛋白酶可从芽孢杆菌属或镰孢属的种获得。
7．根据权利要求3的方法，其中所述脂肪酶可从腐质霉属，假丝酵母属，假单孢菌属或芽孢杆菌属的种获得。
8．根据权利要求3的方法，其中所述氧化还原酶为过氧化物酶或漆酶。
9．根据权利要求8的方法，其中所述过氧化物酶可从鬼伞属的种获得。
10．根据权利要求8或9的方法，其中所述过氧化物酶可从灰盖鬼伞获得。
11．根据权利要求8的方法，其中所述漆酶可从栓菌属，毁丝霉属，Schytalidium或多孔菌属的种获得。
12．根据权利要求1的方法，其中所述纤维素结合区可从纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶或壳多糖酶获得。
13．根据权利要求1的方法，其中所述杂合酶通过包括培养包含表达盒的转化的宿主细胞的方法而获得，其中该表达盒包含编码所述杂合酶的DNA序列，从而表达所述杂合酶。
14．一种去污剂组合物，包含
一种包含与含纤维素结合区的氨基酸序列相连的非纤维素分解酶的具有催化活性的氨基酸序列的杂合酶，和
表面活性剂。
15．一种洗涤被污染或染色的纤维素纤维品的方法，其中将所述纤维品在其中加入了根据权利要求14的去污剂组合物的水介质中洗涤。
16．一种杂合酶，其由包括在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18或SEQ IDNO.19的DNA序列中的编码杂合物的DNA序列所编码。
17．一种杂合酶，具有包括在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6或SEQ ID NO.8的氨基酸序列中的氨基酸序列。
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