CN103298921A

CN103298921A - 酿造方法

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Publication number: CN103298921A
Application number: CN201180050125XA
Authority: CN
Inventors: S.克雷茨; L.贝克加德; A.M.B.弗雷德里克森; T.霍夫; P.R.奥斯特加德; O.奥尔森; U.奥尔森
Original assignee: Novo Nordisk AS; Carlsberg Breweries AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2013-09-11
Also published as: BR112013003466A2; EP2606114A1; ZA201300700B; WO2012022745A1; DK2606114T3; PL2606114T3; US20130280375A1; EP2606114B1

Abstract

一种改善啤酒中胶体稳定性的方法，包括在啤酒生产期间使醪液和/或麦芽汁与Snapalysin接触。在此方法中，泡沫稳定性不受影响。

Description

酿造方法

提述序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。计算机可读形式通过提述并入本文。

发明领域

本申请涉及一种酿造方法，其中使用Snapalysin来管理饮料的胶体稳定性。Snapalysin可以自放线菌目(Actinomycetales)可获得。在啤酒生产期间将所述酶添加至醪液和/或麦芽汁。

发明背景

许多饮料，如啤酒、葡萄酒、果汁等在制造期间或储藏后形成沉淀物。此现象描述为浑浊物形成(haze formation)。一般认为一种形式的浑浊物形成是由于饮料中存在的蛋白质与多酚的相互作用所致。此相互作用导致胶粒的不溶性或半可溶性悬浮液的形成。因为浑浊物形成可以类似于由微生物污染产生的混浊，所以一般优选的是，饮料，特别是啤酒即使在长期储藏后也是非常清澈且透明的。因此，已经开发出用于降低此类浑浊物形成的方法。这些方法靶向蛋白质或多酚或这两者。

已经使用硅胶、膨润土、聚(乙烯基聚吡咯烷酮)(PVPP)等来吸附蛋白质和多酚，这降低浑浊物形成并改善胶体稳定性。然而，此类材料在重复使用时导致减少的回报及因此导致增加的成本。此外，它们还从饮料除去其它期望的化合物，这可能影响其质量。

酶(特别是蛋白酶)也在发酵期间使用以改善饮料，特别是啤酒的胶体稳定性。传统上，已经使用蛋白酶，如木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶来降低冷藏浑浊物形成。然而，已经显示了这些蛋白酶通过水解泡沫形成和稳定化中牵涉的蛋白质而影响饮料的泡沫稳定性。此外，这些还引起饮料中的风味变化。已经通过使用主要水解浑浊物形成蛋白且很少水解泡沫形成蛋白的蛋白酶进行另一种办法。例如，发酵期间添加的脯氨酰特异性内切蛋白酶是例如从EP1326957得知的，按照推测其水解浑浊物形成蛋白，如此改善胶体稳定性，并保留泡沫稳定性。在发酵期间使用蛋白酶可以在最终的啤酒中保留其活性，这一般是不想要的。此外，通过巴氏消毒法的失活可以导致啤酒中的焦化(burned)风味。然而，巴氏消毒法一般也是推荐的，以确保微生物稳定性。

US5035902披露了一种来自假丝酵母(Candida)的泡沫稳定化蛋白水解酶制备物。

仍需要用于饮料，特别是啤酒的胶体稳定化的改善方法。

发明概述

在一个方面，本发明涉及一种改善啤酒中胶体稳定性的方法，包括在啤酒生产期间使醪液和/或麦芽汁与Snapalysin接触。

在另一个方面，本发明涉及Snapalysin在酿造中的用途。

在另一个方面，本发明涉及Snapalysin在啤酒酿造中的用途。

在另一个方面，与麦芽汁进行接触。

在另一个方面，将Snapalysin添加至麦芽汁。

在另一个方面，与醪液进行接触。

在另一个方面，Snapalysin自放线菌目可获得。

在另一个方面，放线菌目属于链霉菌属。

在另一个方面，放线菌目属于韩国生工菌属(Kribbella)。

在另一个方面，所述接触进行5分钟至120分钟。

在另一个方面，每kg麦芽使用约0.01至约100mg Snapalysin EP(EnzymeProtein)。

在另一个方面，每升麦芽汁使用约0.0016至约16mg Snapalysin EP。

在另一个方面，使用本发明的方法，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比，胶体稳定性提高至少10%。

在另一个方面，使用本发明的方法，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比，泡沫稳定性是至少80%。

在另一个方面，在与以常规方式酿造的啤酒相比时，所述方法导致加工助剂使用的降低或零使用。

在另一个方面，在没有加工助剂的情况下生产所述啤酒。

在另一个方面，在不用硅胶稳定化的情况下生产所述啤酒。

在另一个方面，在过滤后进行所述接触。

在另一个方面，在淋洗过程中进行所述接触。

在另一个方面，于范围为20-80°C的温度进行所述接触。

在另一个方面，于至少30°C的温度进行接触。

在另一个方面，于至少40°C的温度进行接触。

在另一个方面，于至少50°C的温度进行接触。

在另一个方面，于至少60°C的温度进行接触。

在另一个方面，于至少70°C的温度进行接触。

在另一个方面，于至少75°C的温度进行接触。

发明详述

啤酒酿造方法是本领域技术人员公知的。常规规程可以以如下方式概述：起始物料是发芽的(即弄湿或浸泡，萌发，随后干燥的)大麦和/或未发芽的辅料(称作谷物)。在淀粉糖化(mashing)(其中将谷物研磨，并与水混合，加热，并搅拌)期间，借助于麦芽中天然存在的酶以及还有外源添加的酶(若有的话)降解包含碳水化合物的聚合物。在淀粉糖化后，有必要分开液体提取物(麦芽汁)与固体(酒糟颗粒和附属颗粒)以得到清澈的麦芽汁。此过程描述为过滤。在过滤前，可以将醪液温度提高到约75-78°C(称为出醪(mash-offing))。麦芽汁过滤是重要的，因为所述固体富含大量蛋白质、不良修饰的淀粉、脂质和脂肪酸、硅酸盐和多酚(鞣质)和蛋白质。在收集第一麦芽汁之后留在糟中的提取物亦可通过在滤饼上部添加入热水来洗出。该工艺称作淋洗。热水流经糟，并溶解剩余的提取物。经稀释的麦芽汁称作第二麦芽汁，且其提取物下降至第一麦芽汁起始重量的1-2%。在添加啤酒花之后，将麦芽汁煮沸。由此使多种物质包括几种蛋白质变性，且会发生蛋白质-多酚复合物的沉淀。在冷却并去除沉淀物之后，对制得的啤酒麦芽汁进行通气并添加酵母。在通常持续5-10日的主要发酵(main fermentation)之后，去除大部分酵母，并将所谓生啤酒(green beer)在较低温度，通常为0-5℃储藏1至12周。在此期间，残留的酵母会与蛋白质-多酚复合物和其它不溶性物质一起沉淀或沉积。为了去除残余的过量分散颗粒，进行过滤。经发酵的啤酒此时可在装瓶之前经充气(carbonize)。二氧化碳不仅贡献于感受到的“醇厚(fullness)”和“稠度(body)”，它也影响“麻刺感(tingling)”和“新鲜度(freshness)”。此外，它起到增味剂及起泡潜力增强剂的作用，并在延长产品的储藏期限中起重要作用。

术语“啤酒”用于本文旨在至少涵盖从所有制备自未发芽的谷物的醪液以及所有制备自发芽的谷物的醪液，以及所有制备自未发芽和发芽的谷物的混合物的醪液所制备的啤酒。术语“啤酒”还涵盖用辅料制备的啤酒，以及具有所有可能的乙醇含量的啤酒。

不拘于理论，认为在低温或较长时间储藏的啤酒中多酚类和蛋白质的相互作用导致称为浑浊物的聚集物的产生。由于浑浊物形成影响啤酒的品质参数之一，即胶体稳定性，开发了阻止此种浑浊物形成的方法。在酿造工艺中，大多数蛋白质-多酚复合物通过在啤酒陈化过程中冷却液体而沉淀出来。任何残余的多酚和/或蛋白质使用PVPP、硅胶、膨润土等去除。

啤酒的胶体稳定性可以定义为以EBC单位测量的胶体不稳定性变得大于2之前的温热循环的量。一个温热循环对应于大约25日的储藏期限(MEBAK 2.15.2.1,Fociertmethode,Vorausbestimmung derchemisch-physikalischen

Methodensamlung der

Brautechniche Analysekommission(MEBAK),Selbstverlag der MEBAK,Freising Weihenstephan)。如实施例3中所详述，进行测量。出于本发明的目的，也可以使用如实施例1中详述的方法通过用Brewtan C(没食子鞣质)分析浑浊物灵敏性蛋白质(Analytica-EBC：啤酒-9.40)量来测量胶体稳定性。

浑浊物在本领域中亦称作“混浊(cloudiness)”或“浊度(turbidity)”或“胶体不稳定性”，并因此可互换使用。

另一个减少浑浊物形成的方法是通过使用蛋白酶。

将蛋白酶像木瓜蛋白酶用于剪切蛋白质，可能得到较低和/或更可溶的蛋白质-多酚聚集物。然而这些酶的使用亦影响涉及泡沫形成和泡沫稳定性的蛋白质，这进一步影响最终啤酒的品质。

令人惊讶地，发明人已经发现了在啤酒生产期间使醪液和/或麦芽汁与Snapalysin接触导致改善的胶体稳定性和/或泡沫稳定性。

令人惊讶地，发明人还已经发现了在啤酒生产期间使醪液和/或麦芽汁与Snapalysin接触导致改善的胶体稳定性，而基本上不影响泡沫稳定性。

术语“醪液”和“麦芽汁”具有本领域中的常规含意。

Snapalysin(EC3.4.24.77)是属于M7蛋白酶家族的小的中性金属蛋白酶。依照MEROPS分类(http://merops.sanger.ac.uk/)，它们也称作M7家族肽酶。Snapalysin是本领域中已知的。例如，参见Butler,M.J.Snapalysin于:Barrett,A.J.,Rawlings,N.D.和Woessner,J.F.(编)Handbook of Proteolytic Enzymes,Academic Press,London,1998,1134-1135。

在一个方面，Snapalysin可获自放线菌目。

在一个方面，放线菌目是链霉菌属。

放线菌目是本领域中已知的。它们是属于放线菌门(Actinobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌亚纲(Actinobacteridae)、和放线菌目的生物体。

链霉菌属是放线菌目，属于链霉菌亚目(Streptomycineae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和链霉菌属。

已经鉴定出链霉菌属的各种物种，包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌(S.lividans)、稍白链霉菌(S.albicans)、灰色链霉菌(S.griseus)、S.plicatosporus、紫红链霉菌(S.violaceoruber)等。

在一个优选的方面，Snapalysin可获自紫红链霉菌。

在另一个优选的方面，Snapalysin可获自变铅青链霉菌。

在一个方面，放线菌目是韩国生工菌属。

韩国生工菌属是放线菌目，属于丙酸杆菌亚目(Propionibacterineae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)和韩国生工菌属。

在一个优选的方面，Snapalysin可获自Kribbella flavida。

术语“可获自”本文中与给定来源相连使用意指由核酸序列编码的多肽是由该来源或由其中存在来自所述来源的核酸序列的重组细胞(亦称作宿主细胞)产生的。在一个优选实施方案中，所述多肽分泌至胞外。在另一个优选的实施方案中，多肽是胞内的。根据在重组产生方法中采用的宿主，本发明的Snapalysin可经糖基化或可为非糖基化的。此外，本发明的Snapalysin亦可包含起始的经修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下其为宿主介导的过程的结果。

所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。

可用的宿主细胞为细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞或链霉菌细胞，或乳酸细菌细胞；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)。乳酸细菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的菌种。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、和尿枝原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于碱性杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽胞杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链球菌细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

可以通过原生质体转化(见例如Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受态细胞转化(见例如Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)、电穿孔(见例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)、或接合(见例如Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278)实现DNA对芽孢杆菌细胞的导入。可以通过原生质体转化(见例如Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(见例如Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)实现DNA对大肠杆菌细胞的导入。可以通过原生质体转化、电穿孔(见例如Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(见例如Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或者转导(见例如Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)实现DNA对链霉菌细胞的导入。可以通过电穿孔(见例如Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(见例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)实现DNA对假单胞菌细胞的导入。可以通过天然感受态(见例如Perry and Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(见例如Catt and Jollick,1991,Microbios68:189-207，电穿孔(见例如Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(见例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)实现DNA对链球菌细胞的导入。然而，可以使用本领域中已知的用于将DNA导入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文中所使用的，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第八版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。“酵母”如用于本文中包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，应将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,andDavenport,editors,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)、或解脂西洋蓍霉酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。一般地，丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可通过发酵进行。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以以本质上已知的方式通过牵涉原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的方法转化真菌细胞。适合于转化曲霉和木霉宿主细胞的规程记载于EP238023,Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474,及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422。适合于转化镰孢物种的方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156,及WO96/00787描述。可以使用由Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology,Methods in Enzymology,第194卷,第182页-第187页,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163;及Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920描述的规程转化酵母。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知方法在适合于产生Snapalysin的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果Snapalysin分泌到营养培养基中，它能够从所述培养基中直接回收。如果Snapalysin不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

所得Snapalysin可以使用本领域已知的方法回收。例如，Snapalysin可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的Snapalysin可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备用(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)以获得基本上纯的多肽。在一个备选的方面，不回收Snapalysin，而是使用表达Snapalysin的本发明宿主细胞作为Snapalysin的来源。

优选地，要依照本发明使用的Snapalysin是纯化的。如本文中所使用的，术语“纯化的”涵盖酶蛋白质制备物，其中制备物已经针对所讨论的酶蛋白质进行富集。例如，此类富集可以是：除去生成酶蛋白质的生物体细胞，通过蛋白质特异性沉淀或使用层析方法除去非蛋白质材料，其中将所讨论的酶蛋白质选择性吸附，并自层析基质洗脱。Snapalysin可以已经以如下的程度纯化，使得仅存在少量的其它蛋白质。表述“其它蛋白质”特别指其它酶。要在本发明的方法中使用的Snapalysin可以是“基本上纯的”，即基本上不含来自生成其的生物体的其它组分，所述生物体可以是天然存在的微生物或经遗传修饰的宿主微生物以重组生成Snapalysin。

然而，对于依照本发明的用途，Snapalysin不需要是那样纯的。例如，它可以包含其它酶。

在一个优选的方面，要在本发明的方法中使用的Snapalysin已经纯化为含有占总蛋白质至少20%，优选至少30%，至少40%或至少50%(w/w)的Snapalysin。

在本发明方法的另一个实施方案中，Snapalysin是重组生成的。

在另一个方面，使Snapalysin与醪液或麦芽汁或这两者接触。

在另一个方面，使Snapalysin与醪液或与淀粉糖化水或与谷物接触。

在另一个方面，在淀粉糖化期间与醪液接触。

在另一个方面，在出醪期间与醪液接触。

在另一个方面，在过滤期间接触。

在另一个方面，在淋洗期间接触。

在另一个方面，与麦芽汁接触。

在另一个方面，将Snapalysin添加至麦芽汁。

在另一个方面，在过滤后接触。

在另一个方面，在过滤后但在麦芽汁煮沸前接触。

Snapalysin可以单独或优选地以酶组合物形式使用。此类酶组合物是本领域技术人员已知的。任选地，酶组合物还可以含有其它酶和/或帮助稳定酶的其它稳定剂。本发明的组合物可以为任何适合于所讨论的用途的形式，例如为干燥粉末或颗粒(特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是稳定化液体)、固定化形式或受保护的酶形式。颗粒可以例如如在美国专利No.4,106,991及美国专利No.4,661,452(都是均属于Novo Industri A/S)中披露的那样生成，并且任选地，可以通过本领域中已知的方法包被。例如，可以依照建立的方法通过添加营养上可接受的稳定剂，如糖、糖醇或另一种多元醇、乳酸或另一种有机酸稳定化液体酶制备物。可以依照EP238,216中披露的方法制备受保护的酶。

根据酶的最佳温度和还有酶添加的阶段，于某个温度完成接触。技术人员会知道如何计算酶的最佳温度。出于本发明的目的，一般地，于至少20°C，例如，至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少45°C、至少50°C、至少55°C、优选地如至少60°C、如至少65°C、更优选地如至少70°C，且最优选地如75-80°C的温度完成接触。特别地，于约20-80°C、例如30-80°C，如约40-80°C，优选地如约50-80°C的温度范围完成接触。

在一个方面，接触进行3分钟-5小时，例如5分钟-5小时，优选地5分钟-4小时，更优选地5分钟-180分钟，例如5分钟-120分钟，更优选地10分钟-120分钟，且最优选地30分钟-90分钟的时间段。

一般地，用于接触的酶量取决于多种因素，例如但不限于酶的类型、酶的活性，等等。出于本发明的目的，使用的酶量一般会是约0.01mg至约100mgSnapalysin EP(Enzyme Protein)/kg底物，优选地约0.05至约50mg EP/kg底物，更优选地约0.1至约40mg EP/kg底物。

特别地，使用的酶量一般会是约0.01mg至约100mg Snapalysin EP(Enzyme Protein)/kg麦芽，优选地约0.05至约50mg EP/kg麦芽，更优选地约0.1至约40mg EP/kg麦芽。

也可以将酶添加至液体底物，并且在此类情况中，使用的酶量一般会是约0.0016mg至约16mg Snapalysin EP/升底物，优选地约0.008mg至约8mg EP/升底物，更优选地约0.016mg至约6.4mg EP/升底物。

特别地，使用的酶量一般会是约0.0016mg至约16mg Snapalysin EP/升麦芽汁，优选地约0.008mg至约8mg EP/升麦芽汁，更优选地约0.016mg至约6.4mg EP/升麦芽汁。

可以使用任何蛋白酶测定法来测量Snapalysin活性，其中采用如下的底物，其包含对于所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。同样地，测定法-pH和测定法-温度要适应于所讨论的蛋白酶。测定法-pH值的例子是pH2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12。测定法-温度的例子是30,35,37,40,45,50,55,60,65,70,80,90或95°C。蛋白酶底物的例子包括但不限于酪蛋白，如天青精(Azurine)交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)和Protazyme AK。

在一个方面，使用本发明的方法，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比，胶体稳定性提高至少10%，例如至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、如至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91%、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%、如至少100%、如至少101%、如至少102%、如至少103%、如至少104%、如至少105%、如至少106%、如至少107%、如至少108%、如至少109%、如至少110%。在另一个方面，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比，胶体稳定性升高范围为约10-110%，例如约20-110%、30-110%、40-110%、优选地约50-110%、更优选地范围为60-110%，最优选地范围为70-110%、甚至最优选地范围为80-110%。

例如，可以通过使用如实施例3中描述的方法测量胶体稳定性。

在一个方面，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比时，本发明的方法导致浑浊物减少。

在一个方面，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比时，浑浊物减少至少5%，例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、如至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91%、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%、如至少100%。在另一个方面，与在缺乏Snapalysin的情况下酿造的啤酒相比时，浑浊物减少范围为约5-100%，例如约10-100%、30-100%、40-100%、优选地约50-100%、更优选地范围为60-100%、最优选地范围为70-100%、甚至最优选地范围为80-100%。

在另一个方面，与通过使用加工助剂加工的啤酒相比时，本发明的方法导致浑浊物减少。

在一个方面，与通过使用加工助剂加工的啤酒相比时，浑浊物减少至少5%，例如至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、如至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91%、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%、如至少100%。在另一个方面，与通过使用加工助剂加工的啤酒相比时，浑浊物减少范围为约5-100%，例如约10-100%、约20-100%、30-100%、40-100%、优选地约50-100%、更优选地范围为60-100%、最优选地范围为70-100%、甚至最优选地范围为80-100%。

为了量化啤酒中浑浊物的量，常常使用浊度计亦称浑浊度仪(hazemeter)。在浊度计中，测量在预先描述的相对于入射光线的方向的角度散射的光的量。浊度测量非常适用于测量由于蛋白质-多酚相互作用的结果而形成的浑浊物。

例如，可以通过使用如材料和方法中所描述的方法之一来测量浑浊物。

在另一个方面，本发明的方法导致在酿造和储藏过程中用于减少浑浊物形成的加工助剂使用的减少。

“加工助剂”为在酿造和/或储藏过程中用于减少浑浊物形成的试剂。加工助剂包括但不限于例如硅胶、PVPP、膨润土。

在一个方面，所述减少是100%，意指不使用任何加工助剂。

在另一个方面，在没有用硅土稳定化的情况下，且优选地在没有用硅土和PVPP稳定化的情况下生产啤酒。

在一个方面，使用本发明的方法，与在没有Snapalysin情况下酿造的啤酒相比，泡沫稳定性不受影响。

在一个方面，使用本发明的方法，与使用加工助剂加工的啤酒相比，泡沫稳定性不受影响。

在一个方面，与在没有Snapalysin情况下酿造的啤酒的泡沫稳定性相比，本发明的方法导致具有至少80%泡沫稳定性的啤酒。

在另一个方面，与使用加工助剂加工的啤酒相比，本发明的方法导致具有至少80%泡沫稳定性的啤酒。

泡沫是由因为在分散啤酒过程中压力释放所致而释放的二氧化碳产生的。泡沫由于表面活性剂像泡沫活性蛋白的存在而变得稳定，所述泡沫活性蛋白聚集于泡沫表面，并在气泡周围形成弹性的膜(skin)。

例如，可以通过使用如实施例1中的方法测量啤酒的泡沫稳定性。

在一个方面，与在没有Snapalysin情况下酿造的啤酒相比，啤酒的泡沫稳定性是至少80%，例如81%、82%、83%、84%，如至少85%、例如86%、87%、88%、89%，如至少90%、例如91%、92%、93%、94%，如至少95%、例如96%、97%、98%，如至少99%。在另一个方面，与在没有Snapalysin情况下酿造的啤酒相比，啤酒泡沫稳定性范围为80-99%，例如85-99%、90-99%、95-99%。

在另一个方面，与在没有加工助剂情况下酿造的啤酒相比，啤酒的泡沫稳定性是至少80%，例如81%、82%、83%、84%，如至少85%、例如86%、87%、88%、89%，如至少90%、例如91%、92%、93%、94%，如至少95%，例如96%、97%、98%，如至少99%。在另一个方面，与在没有加工助剂情况下酿造的啤酒相比，啤酒的泡沫稳定性范围为80-99%，例如85-99%、90-99%、95-99%。

在一个方面，本发明涉及Snapalysin在酿造，特别是啤酒酿造中的用途。

在另一个方面，本发明涉及在酿造，特别是啤酒酿造中采用Snapalysin的方法。在另一个方面，本发明涉及采用Snapalysin的酿造方法。

材料和方法：

使用的麦芽及其它酿造材料是商业级的。用作缓冲液和底物的化学品至少是试剂级的商业产品。酶使用标准重组技术内部生成或者自NovozymesA/S(Bagsvaerd,Denmark)商业上可获得。

麦芽汁和啤酒的制备：

2L酿造试验：

在中试规模(pilot scale)中，执行用100%麦芽的淀粉糖化试验。按照表1中的淀粉糖化概况(profile)，使用约50kg麦芽生成200L总麦芽汁体积，并以合适的量添加CaCl₂和ZnCl₂。过滤后将2L麦芽汁分离两次，确保°Plato为13-14，并将温度调节至指定的温度(°C)。在指定时，将pH调节至给定的pH。此后，将一等分试样的麦芽汁与指定量的酶一起温育1小时。对照也在没有酶处理的情况下于相同的温度保持1小时。

表1：淀粉糖化概况

在酶处理后，将麦芽汁煮沸，添加啤酒花(hops)，此后冷却至15°C。然后，使用底部发酵酵母菌株于15°C将它发酵7天。最终，将啤酒过滤。

10L中试酿造物：

生成与具有约13Plato的上文所描述的麦芽汁类似的标准麦芽汁。过滤后将10L麦芽汁分离两次，并将温度和pH两者调节至指定的数值。此后，将一等分试样的麦芽汁与指定量的酶于指定的pH和温度一起温育1小时。对照也在没有酶处理的情况下于相同pH和温度保持1小时。在酶处理后，将啤酒花添加至麦芽汁，随后煮沸60分钟，接着进行标准的发酵。最终，将啤酒过滤。

浑浊物的测量：

2L实验室酿造试验。

使用如下方法测量啤酒的浑浊物。将200微升啤酒(过滤、脱气并调节pH(pH4.0))添加至微量滴定板。进行测量(PolarStar OPTIMA读板仪,A550nm)以测定背景值。然后，添加100微升Brewtan C(200mg/L)以将体积补足至300微升。用读板仪每2分钟分析样品，总共为16分钟。从测量扣除背景值。所得的数值是对啤酒中浑浊物灵敏性蛋白质含量的测量。用一式四份样品进行分析，然后，从四次测量计算平均值。

或者，也可以通过依照由Siebert1997(J.Am.Soc.Brew.Chem.55(2):73-78,1997)发表的方法的修改方法测量啤酒中的浑浊物。在有磁搅拌器的玻璃杯中添加100ml啤酒(脱气并调节pH(pH4.0))和100ml水，并用混浊度仪(Haze-meter)(混浊度仪HZ-013,Lg-automatic APS,Denmark)测定背景浑浊物量的数值。在搅拌过程中将2x3.75ml200mg/L Brewtan C添加至样品，并将样品于室温温育40分钟，之后测定形成的浑浊物。然后，在40分钟后从测量扣除背景值以给出最终发酵啤酒中形成浑浊物的潜力的测量。

10L中试酿造物：

通过强制陈酿化(forced aging)方法(0/40/0°C)(MEBAK II2.15.2.1)测量浑浊物，其中将啤酒分别在0°C和40°C的24小时循环中温育以加速浑浊。以90°散射角测量形成的浑浊物。

泡沫测定：

2L实验室酿造试验。

将200ml啤酒(脱气并调节pH(pH4.0))添加至泡沫塔。将氮气鼓泡到泡沫塔中的玻璃滤器。然后，将通过氮气鼓泡形成的泡沫在管中转运到根据一定规模的分级(ml)收集器漏斗。分级漏斗还使萎缩(collapsed)啤酒体积能够得到测量。漏斗依据的规模使所得泡沫重量能够得到记录。分析给出形成泡沫的重量(g)。在图中相对于时间(分钟)绘出泡沫的总重量(g)。

10L中试酿造物：

依照MEBAK II2.19.2用NIBEM泡沫测试器测量泡沫稳定性。

实施例

实施例1：Snapalysin在啤酒的胶体稳定化和泡沫稳定性中的作用(2L酿造试验)。

目的是调查Snapalysin在啤酒的胶体稳定化中的作用。

在此实施例中使用SEQ ID NO:1的Snapalysin。它使用标准的重组技术生成。

麦芽汁的制备：

在中试规模中，执行用100%麦芽的淀粉糖化试验。按照表1中的淀粉糖化概况，使用约54.7kg麦芽生成200L总麦芽汁体积。过滤后将2L麦芽汁分离两次，并冷却至50°C。此后，将一等分试样的麦芽汁与如下量的Snapalysin一起温育1小时，所述量对应于1.6mg EP(Enzyme Protein)/升。对照也在没有酶处理的情况下于50°C保持1小时。

表1：淀粉糖化概况

在酶处理后，将麦芽汁煮沸，此后冷却至15°C，其中使用酵母于15°C将其发酵7天。最终，将啤酒过滤。

使用下文所描述的方法测量浑浊物。

将200微升麦芽汁(过滤的)或啤酒(脱气并调节pH(pH4.0))添加至微量滴定板。进行测量(PolarStar OPTIMA读板仪,A550nm)以测定背景值。然后，添加100微升Brewtan C(200mg/L)以将体积补足至300微升。用读板仪每2分钟分析样品，总共16分钟。从测量扣除背景值。所得的数值是对啤酒中浑浊物灵敏性蛋白质含量的测量。用一式四份样品进行分析，然后，从四次测量计算平均值。

下表中给出EBC单元中的结果。

还通过依照由Siebert1997(J.Am.Soc.Brew.Chem.55(2):73-78,1997)发表的方法的修改方法测量啤酒中的浑浊物。简言之，在有磁搅拌器的玻璃杯中添加100ml啤酒(脱气并调节pH(pH4.0))和100ml水，并用混浊度仪(混浊度仪HZ-013,Lg-automatic APS)测定背景浑浊物量的数值。在搅拌过程中将2x3.75ml200mg/L Brewtan C添加至样品，并将样品于室温温育40分钟，之后测定形成的浑浊物。然后，在40分钟后从测量扣除背景值以给出最终发酵啤酒中形成浑浊物的潜力的测量。

下表中给出结果。

	对照(无酶)	经Snapalysin处理的
			EBC	9.70	5.03

从上表看，明显的是与未处理的对照相比，Snapalysin具有良好的浑浊物减少。

如下测量泡沫稳定性。

将200ml啤酒(脱气并调节pH(pH4.0)添加至泡沫塔。将氮气鼓泡到泡沫塔中的玻璃滤器。然后，将通过氮气鼓泡形成的泡沫在管中转运到根据一定规模的分级(ml)收集器漏斗。分级漏斗还使萎缩啤酒体积能够得到测量。漏斗依据的规模使所得泡沫重量能够得到记录。分析给出形成泡沫的重量(g)。在图中相对于时间(分钟)绘出泡沫的总重量(g)。

下表中给出结果：

从上表看，明显的是Snapalysin对泡沫稳定性没有影响。

实施例2：浓度增加的SEQ ID NO:1的Snapalysin对胶体稳定性和泡沫稳定性的影响(2L酿造试验)。

重复与实施例1中相同的方法，只是麦芽汁与浓度为3.2mg酶蛋白质(EP)/升麦芽汁的Snapalysin一起温育。下表中给出胶体和泡沫稳定性的结果。

用混浊度仪得到的浑浊物结果：

	对照(无酶)	经Snapalysin(3.2mg/L)处理的
			EBC	7.29	4.23

用读板仪得到的浑浊物结果：

如先前所描述的，分析泡沫，并且下文给出数值：

时间(分钟)	对照(无酶)	经Snapalysin(3.2mg/L)处理的
			0	0.00	0.00
10		3.73
			15		10.60
20		18.71

25	21.62	26.8
			30	29.80	34.40
35		41.81
			40	40.63	48.58
45	45.80	54.07
			50	50.06	58.00
55
			60		61.60
65	56.60	62.20
			70	57.36	62.44
75	57.61

与实施例1类似，Snapalysin再次显示对浑浊物减少的良好影响，而不损害泡沫。

实施例3：Snapalysin对来自10L中试酿造物的啤酒的胶体稳定性和泡沫稳定性的影响。

在2L酿造试验外用Snapalysin生成10L中试酿造物以分别使用用于胶体稳定性和泡沫稳定性的不同方法(参见上述材料和方法)分析Snapalysin对胶体稳定性和泡沫稳定性的影响。将麦芽汁调节至pH6，并调节至50°C。以3.2mg酶蛋白质/升麦芽汁的浓度添加Snapalysin，并温育1小时。

在通过强制陈酿化(0/40/0°C)得到的啤酒中测量胶体稳定性：

	对照(无酶)	经Snapalysin(3.2mg/L)处理的
			强制陈酿化(保温天数)	5	11

通过NIBEM分析泡沫稳定性：

	对照(无酶)	经Snapalysin(3.2mg/L)处理的
			NIBEM(秒)	261	274

通过分析，可以看出通过用Snapalysin处理麦芽汁得到的啤酒产生11个保温天数(warm day)的稳定性(EBC<2)，而对照仅对于5个保温天数是稳定的(EBC<2)。用Snapalysin处理后没有观察到对泡沫稳定性的影响。实际上，酶处理后的泡沫看上去比对照略微更稳定。

我们还通过用Brewtan C的方法及用于测定浑浊物的混浊度仪测量与上文相同的啤酒中的浑浊物。

	对照(无酶)	经Snapalysin(3.2mg/L)处理的
			EBC	8.42	5.83

浑浊物的量在用Snapalysin处理后降低，这进一步支持在用Snapalysin处理后获得的胶体稳定性改善。

实施例4：来自Kribbella flavida的Snapalysin对啤酒的胶体稳定性和泡沫稳定性的影响(2L酿造试验)。

使用重组方法生成具有SEQ ID NO:2的来自Kribbella flavida的Snapalysin。

使用上文所描述的方法制备麦芽和啤酒，并如所描述的，分析啤酒浑浊物。使用3.2mg Snapalysin酶蛋白质(EP)/升麦芽汁。温育温度是50C，且pH为6。下表中给出了结果。

用混浊度仪得到的浑浊物结果：

用读板仪得到的浑浊物结果：

如先前所描述的，分析泡沫，并在下文给出数值：

从浑浊物和泡沫分析结果看，显而易见的是Kribbella flavida Snapalysin减少浑浊物，由此改善胶体稳定性，并且它对泡沫稳定性没有显著影响。

实施例5：一些商品化的蛋白酶对啤酒(2L酿造试验)的胶体和泡沫稳定性的影响。

Novoren^TM、Esperase^TM、Everlase^TM、Relase^TM、Neutrase^TM和Savinase^TM是源自Novozymes A/S(Bagsvaerd,Denmark)的商品化蛋白酶。

使用以下浓度的酶和温育温度。

酶	浓度(mg EP/L)	温育温度℃
			Novoren	10.0	70
Esperase	1.6	75
			Everlase	1.6	75

Relase	1.6	75
			Savinase	1.6	75
Neutrase	0.8	50

下文给出了浑浊物测定法的结果。

用混浊度仪得到的浑浊物结果：

用读板仪得到的浑浊物结果：

下文给出了泡沫稳定性测定法的结果。

从上述结果看，显而易见的是Novoren对浑浊物(胶体稳定性)没有影响，而它负面影响泡沫稳定性。Esperase、Relase、Savinase和Neutrase对胶体稳定性具有正面影响，但还负面影响泡沫。蛋白酶Everlase对胶体稳定性仅具有微小影响，而且对泡沫稳定性有负面影响。

实施例6：其它蛋白酶在啤酒稳定性中的效果(2L酿造试验)

使用标准的重组技术合成属于肽酶A1家族且具有SEQ ID NO:3的天冬氨酸内肽蛋白酶和SEQ ID NO:4的来自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的金属蛋白酶。

使用下列酶浓度和温育温度。

酶	浓度(mg EP/L)	温育温度C
			蛋白酶SEQ ID NO:3	10.0	50
蛋白酶SEQ ID NO:4	0.8	70

下文给出了浑浊物测定法的结果。

用混浊度仪得到的浑浊物结果：

用读板仪得到的浑浊物结果：

下文给出了泡沫稳定性测定法的结果。

从上述结果看，显而易见的是SEQ ID NO:3的蛋白酶对胶体稳定性和泡沫稳定性两者没有影响或具有微小的影响，而SEQ ID NO:4的蛋白酶对胶体稳定性具有正面影响(即减少浑浊物)，但是负面影响泡沫。

本文中描述并要求保护的发明的范围不受本文中公开的具体方面限制，因为这些方面意图为例示本发明的几个方面。任何等同方面意图在本发明的范围内。实际上，在本文中所显示及描述的那些外，本发明的各种修改通过前述描述对于本领域技术人员会变得显而易见。此类修改也意图落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，应当以本公开内容(包括定义)为准。