KR20210013585A - 돌연변이체 리파아제 및 이의 용도 - Google Patents

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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드와 정렬될 때, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드와 정렬될 때, 적어도 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유 또는 지방을 포함하는 제품의 중간 형태를 본원에 개시된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 제품의 제조 방법, 및 유 또는 지방 중 포화 지방산에 대한 본원에 개시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

돌연변이체 리파아제 및 이의 용도
본 발명은 리파아제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 리파아제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법, 및 상기 리파아제가 사용되는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
어유는 장쇄(LC) 다불포화 오메가-3 지방산, 특히 에이코사펜타엔산(EPA; C20:5) 및 도코사헥사엔산(DHA; C22:6)의 고가치 공급원이다 이러한 장쇄 오메가-3 지방산은 건강한 생활습관에 기여하는 것으로 나타났고, 인간의 어유 섭취가 지난 수십년간 증가해왔음이 나타냈다. 그러나, 어유는 건강한 장쇄 오메가-3 지방산만을 함유하는 것이 아니다. 어유의 일부는 건강에 덜 유익한 지방산, 예컨대 팔미트산(C16:0)으로 이루어진다. 따라서, 팔미트산에 비해 EPA 및 DHA의 농도를 증가시키기 위한 다양한 방법이 개발되어 왔다.
유사하게, 대두유는 리놀레산 및 올레산의 고가치 공급원이다. 그러나, 대두유도 건강에 덜 유익한 지방산, 예컨대 팔미트산을 함유한다.
예컨대, US2016/0229785에는 미정제 어유로부터 오메가-3 지방산-풍부 트라이클리세리드의 직접 추출에 대한 연속식 공정이 개시되어 있는데, 여기서 어유는 용매와 혼합되어, 극 상(polar phase)-촉진된 이동층 흡착 구역을 통과한다. 상기 공정의 단점은 용매가 추출 과정에서 적용된다는 점이다.
CN105349587A에는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)의 동결건조된 균주를 기질로서 어유 및 에틸 에스터 어유와 접촉시킴에 의해 글리세리드형 어유 중 EPA 및 DHA의 함량을 개선하는 방법이 개시되어 있는데, 여기서 에스터 교환은 아스퍼질러스 오리제 리파아제에 의해 촉매된다.
다르게는, 리파아제는 어유 중 EPA 및 DHA의 농도를 증가시키는데 사용된다. 문헌[Fernandez-Lorent et. al. (2011) J. Am Oil Chem Soc 88: 1173-1178]에는 리파아제에 의한 오메가-3 지방산의 방출에 대한 부동화 리파아제를 위한 상이한 소수성 지지체의 영향이 개시되어 있다.
리파아제(트라이글리세롤 아실 가수분해물, EC 3.1.1.3)는 카복시산에 작용하는 가수분해물과의 일부이다. 리파아제는 다양한 미생물에 의해 제조될 수 있다. 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파아제는 산업에 널리 이용되고, 5개의 상이한 리파아제 아미노산 서열이 동정되어 있다. 문헌[Schmitt et al. (2002), Protein Engineering, Vol. 15, no. 7, pp 595-601]에는 상이한 기질 특이성을 갖는 몇몇 칸디다 루고사 리파제 돌연변이가 개시되어 있다.
본 발명은 생성물 중 포화 지방산, 예컨대 팔미트산의 함량을 감소시킬 수 있는 리파아제에 관한 것이다.
리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 본원에 개시되고, 상기 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드와 정렬될 때, 적어도 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 상기 a)에 따른 폴리펩티드;
c) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드; 및
d) 서열번호 2의 서열의 상보 가닥에 대한 저, 중 및/또는 고 긴축성(stringency) 조건하에 교잡화되는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
놀랍게도, 본원에 개시된 팔미트산에 대한 리파아제의 활성 대 폴리펩티드의EPA에 대한 리파아제 활성의 비가 상응하는 야생형 폴리펩티드의 상기 비보다 높음이 밝혀졌다. 바람직하게는, 팔미트산에 대한 리파아제의 활성 대 폴리펩티드의 EPA에 대한 리파아제 활성의 비는 상응하는 야생형 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1을 포함하는 폴리펩티드의 상기 비보다 1.5 내지 2배, 1.5 내지 3배, 1.5 내지 4배, 1.5 내지 5배, 1.5 내지 6배, 1.5 내지 7배, 1.5 내지 8배, 1.5 내지 9배, 1.5 내지 10배, 또는 1.5 내지 20배 더 높다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 리파아제 활성을 갖는 변이 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제시한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 리파아제를 암호화하는 핵산을 제시하되, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2는 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 유 또는 지방을 본원에 개시된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 유 또는 지방을 포함하는 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 지방 또는 유 중 팔미트산의 농도를 감소시키기 위한 본원에 개시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
용어 "상보 가닥"은 용어 "상보체(complement)"와 상호교환가능하게 사용된다. 핵산 가닥의 상보체는 암호 가닥의 상보체 또는 비암호 가닥의 상보체일 수 있다. 이중가닥 핵산을 지칭할 때, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 상보체는 아미노산을 암호화하는 가닥의 상보 가닥 또는 이를 함유하는 임의의 핵산 분자를 지칭한다.
용어 "제어 서열"은 용어 "발현-조절 핵산 서열"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어는 특히 숙주 개체 또는 시험관내에서 작동상 연결된 암호 서열의 발현에 필요하고/거나 이에 영향을 주는 핵산 서열을 지칭한다. 2개의 핵산 서열이 작동상 연결될 때, 이는 통상적으로 동일 배향이거나, 또한, 동일 판독틀 내에 존재할 수 있다. 통상적으로, 이는 본질적으로 인접하지만, 이를 꼭 요하지는 않을 수 있다. 발현-조절 핵산 서열, 예컨대 특히 적절한 전사 개시, 종결, 촉진자, 선도, 신호 펩티드, 프로펩티드(propeptide), 프리프로펩티드(prepropeptide) 또는 증폭자 서열; 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열, 억제자 또는 활성자 서열; 효율적인 RNA 가공 서열, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아덴일화 서열; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 강화시키는 서열(예컨대 리보솜 결합 부위); 단백질 안정성을 강화시키는 서열; 및 필요에 따라, 단백질 분비를 강화시키는 서열이 선택된 숙주 개체에서 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 내인성이거나 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수 있다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대해 고유이거나 외래일 수 있다. 필요시, 제어 서열에는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 암호 영역을 갖는 상기 제어 서열의 연결을 용이하게하는 특정 제한 부위를 도입하기 위한 연결자가 제공될 수 있다. 제어 서열은 이의 구체적 목적에 최적화될 수 있다.
용어 "발현"은 비한정적으로 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 비롯한 폴리펩티드의 생성에 관련된 임의의 단계를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 핵산은 모세포(유전자가 과발현되지 않음)에 비해 본 발명의 숙주 세포에서 과발현될 수 있다. 본원에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 과발현은 숙주 세포에서 상기 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성이 숙주 세포 내 폴리펩티드의 활성의 1.1배 이상, 1.25배 이상 또는 1.5배 이상, 바람직하게는 상기 폴리펩티드의 활성이 모세포 내 폴리펩티드 활성의 폴리펩티드 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 10배 이상임을 야기하는 상기 서열 유전자의 발현이다.
"발현 벡터"는 시험관내 또는 숙주 세포에서 발현 및/또는 전사를 위해 적절한 제어 서열(예컨대 촉진자, 및 전사 및 번연 정지 신호)에 작동상 연결된, 폴리펩티드, 예컨대 본 발명에 따른 폴리펩티드를 위한 폴리뉴클레오티드 암호를 포함한다. 발현 벡터는 임의의 벡터(예컨대 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있고, 재조합 DNA 절차를 용이하게 거칠 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 야기할 수 있다. 전형적으로, 벡터의 선택은 벡터가 도입되는 세포와 벡터의 양립성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환형 플라스미드일 수 있다. 벡터는 자가 복제 벡터, 즉 염색체외 실체로서 존재하는 벡터일 수 있는데, 이의 복제는 염색체, 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체의 복제와는 독립적이다. 다르게는, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 게놈에 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 통합 클로닝 벡터는 숙주 세포의 염색체의 무작위 또는 예정된 표적 유전자 부위에서 통합될 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있고, 이는 함께, 숙주 세포의 게놈 또는 전이인자에 도입되는 총 DNA를 함유한다. 본 발명의 벡터는 예컨대 과발현을 위한 1개 또는 2개 이상, 예컨대 3개, 4개 또는 5개의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 위한 핵산 분자 암호의 절편을 지칭하는데, 이는 암호 서열, 예컨대 촉진자, 증폭자 등, 및 개별 암호 절편(엑손)들간의 간섭 서열(인트론)에 선행 및 후행 하는 유전자 조절 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또한, 유전자의 정의가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하지 않고, 오히려 기능적 RNA 분자, 예컨대 tRNA, rRNA 등의 전사를 위한 주형을 제공할 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 정의된 숙주 세포는 유전자 조작에 적합한 개체이고, 표적 생성물, 예컨대 본 발명에 따른 폴리펩티드의 산업적 생산에 유용한 세포 밀도로 배양될 수 있다. 숙주 세포는 자연에서 발견되는 숙주세포, 또는 유전자 조작 또는 통상의 돌연변이생성 후 모숙주 세포로부터 유래된 숙주 세포일 수 있다. 유리하게는, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다. 숙주 세포는 원핵, 고세균 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 원핵 숙주 세포는 비한정적으로 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 진핵 숙주 세포는 비한정적으로 효모, 진균, 아메바, 조류, 식물, 동물 또는 곤충 숙주 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 숙주 세포에서 자연적으로는 발생하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 즉, 상기 핵산 또는 아미노산은 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 것과 동일하지 않다.
용어 "교잡화"는 올리고머 화합물, 예컨대 핵산 화합물의 실질적 상보 가닥의 짝지음을 의미한다. 교잡화는 저, 중 또는 고 긴축성 조건하에 수행될 수 있다. 저 긴축성 교잡화 조건은 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중 약 45℃에서 교잡화함에 이어서, 0.2x SSC, 0.1% SDS 중 50℃ 이상에서 2회의 세척을 포함한다(상기 세척의 온도는 저 긴축성 조건을 위해 55℃로 증가될 수 있음). 중 긴축성 교잡화 조건은 6x SSC 중 약 45℃에서 교잡화에 이어서, 0.2x SSC, 0.1% SDS 중 60℃에서 1회 이상의 세척을 포함하고, 고 긴축성 교잡화 조건은 6x SSC 중 약 45℃에서 교잡화에 이어서, 0.2x SSC, 0.1% SDS 중 65℃에서 1회 이상의 세척을 포함한다.
"단리된 핵산 단편"은 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견될 수 없는 핵산 단편이다.
본원에 사용된 용어 "단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 관련된 하나 이상의 기타 성분, 예컨대 기타 폴리펩티드 물질로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 단리된 폴리펩티드는 임의의 기타 불순물을 미함유할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 SDS-PAGE 또는 본 목적에 적합하고 당업자에게 공지된 임의의 기타 분석법으로 측정시 50% 이상, 예컨대 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 순수할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다.
핵산 또는 폴리뉴크레오티드 서열은 본원에서 5개 이상의 뉴클레오티드 또는 핵산 단위를 포함하는 뉴클레오티드 중합체로서 정의된다. 뉴클레오티드 또는 핵산은 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
또다른 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 다른 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 것이기에, 이는 상기 다른 뉴클레오티드 서열에 교잡화함으로써 안정적인 듀플렉스(duplex)를 형성한다. 용어 "cDNA(상보 DNA)"는 본원에서 mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자로서 정의된다. 원핵 세포에서, mRNA 분자는 세포에 존재하는 유전자의 게놈 DNA의 전사로부터 수득된다. 진핵 세포에서, 유전자는 엑손(즉 암호 서열) 및 인트론(즉 상기 엑손들 사이에 위치하는 간섭 서열) 둘다를 함유한다. 따라서, 진핵 세포에서, 유전자의 게놈 DNA의 전사로부터 수득된 초기의 1차 RNA는 mRNA로서 나타나기 전 일련의 단계들을 거쳐 가공된다. 이러한 단계들은 스플라이싱으로 지칭되는 과정에 의한 인트론 서열의 제거를 포함한다. mRNA로부터 유도된 cDNA는 단지 암호 서열만을 함유하고, 상응하는 폴리펩티드 생성물로 바로 번역될 수 있다.
"펩티드"는 펩티드(이미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 단쇄를 지칭한다. 최단 펩티드, 즉 다이펩티드는 단일 펩티드 결합에 의해 연결된 2개의 아미노산으로 이루어진다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노사 잔기를 포함하고 5개 초과의 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드"와 동의어이고, 또한, 2개 이상의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 따라서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 작용성을 추가하기 위해 임의적으로 개질(예컨대 글리코실화, 인산화, 아실화, 파르네실화, 프레닐화, 설폰화 등)될 수 있다. 특정 조건하에 특정 기질의 존재하에 활성을 나타내는 폴리펩티드는 효소로서 지칭될 수 있다. 유전 암호의 축퇴(degeneracy)의 결과로서, 소정 폴리펩티드를 암호화하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있다.
용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대해 사용될 때, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 고유 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형됨, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유도됨을 나타낸다. 따라서, 예컨대 재조합 세포는 고유(비재조합) 형태의 세포에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 다르게는 비정상 발현, 미달발현 또는 전혀 미발현되는 고유 유전자를 발현한다. 용어 "재조합"은 "유전 변형된" 및 "유전자삽입"과 동의어로 사용된다.
"서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 본원에서 상호교관가능하게 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 서열 상동성 또는 서열 동일성의 %를 측정하기 위해, 상기 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬되는 것으로 정의된다. 2개의 서열들간의 정렬을 최적화하기 위해, 갭(gap)이 비교되는 2개의 서열 중 임의의 것에 도입될 수 있다. 이러한 정렬은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 다르게는, 정렬은 더 짧은 길이, 예컨대 약 20, 약 50, 약 100 또는 그 이상의 핵산/염기 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은 보고되는 정렬 영역에 걸친 2개의 서열간의 동일성 일치의 %이다. 2개의 아미노산 또는 2개의 뉴클레오티드 서열간의 % 서열 동일성은 2개의 서열의 정렬을 위한 니들만 분쉬 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm)을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]). 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 둘다는 상기 알고리즘에 의해 정렬될 수 있다. 니들만 분쉬 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 니들(NEEDLE)에 구축되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 엠보스(EMBOSS) 패키지로부터의 니들 프로그램을 사용하였다(버전 2.8.0 이상, 문헌[EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276―277], http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열에 대해, EBLOSUM62을 대체 행렬(substitution matrix)에 사용하였다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 에드나풀(EDNAFULL)을 사용하였다. 사용된 임의적이 매개변수는 10의 갭-오픈 페널티(penalty) 및 0.5의 갭 확장 페널티를 사용하였다. 당업자는 모든 상기 상이한 매개변수가 미세하게 상이한 결과를 야기하되, 2개의 서열의 전체적인 % 동일성은 상이한 알고리즘을 사용할 때에도 현저히 변경되지는 않음을 이해할 것이다.
전술한 트로그램 니들에 의한 정렬 후, 논의 서열(query sequence)과 본 발명의 서열간의 서열 동일성의 %는 하기와 같이 계산된다: 서열 둘다에서의 동일한 아미노산 또는 동일한 뉴클레오티드를 나타내는 정렬에서 상응하는 위치들의 개수를 상기 정렬에서 갭의 총 개수를 뺀 상기 정렬의 총 길이로 나눔. 본원에 정의된 동일성은 노브리프(NOBRIEF) 옵션을 사용하여 니들로부터 얻어질 수 있고, "최장-동일성"으로서 프로그램의 출력에 표지된다. 또한, 본원에 개시된 핵산 및 단백질 서열은 예컨대 기타 일원 또는 관련 서열을 동정하기 위한 공개 데이터베이스 검색을 수행하기 위한 "논의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 엔블라스트(NBLAST) 및 엑스블라스트(XBLAST) 프로그램(버전 2.0)(문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403―10])을 사용하여 수행될 수 있다. 블라스트 뉴클레오티드 검색은 엔블라스트 프로그램(스코어(score) = 100, 글자 길이 = 12)에 의해 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열이 수득될 수 있다. 블라스트 단백질 검색은 엔블라스트 프로그램(스코어 = 50, 글자 길이 = 3)에 의해 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열이 수득될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭처리된 정렬을 얻기 위해, 갭처리된 블러스트가 이용될 수 있다(문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]). 블라스트 및 갭처리된 블라스트 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 기본값 매개변수(예컨대 엑스블라스트 및 엔블라스트)가 사용된 수 있다. 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/를 참고한다.
폴리펩티드에 관한 용어 "실질적으로 순수한"은 50 중량% 이하의 기타 폴리펩티드 물질을 함유하는 폴리펩티드 제제를 지칭한다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태이다. 특히, 본원에 개시된 폴리펩티드가 "실질적으로 순수한 형태"인 것, 즉 폴리펩티드 제제가 기타 폴리펩티드 물질을 본질적으로 미함유하는 것이 바람직하다. 임의적으로, 폴리펩티드는 비폴리펩티드 물질, 예컨대 핵산, 지질, 배지 성분 등도 실질적으로 미함유할 수 있다. 본원에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 용어 "단리된 폴리펩티드" 및 "단리된 형태의 폴리펩티드"와 동의어이다.
폴리펩티드 또는 핵산과 관련해서 본원에 사용된 "치환"은 폴리펩티드 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 아상의 뉴클레오티드가 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드로 치환됨을 나타내거나, 예컨대 치환은 본원에 개시된 폴리펩티드에서의 위치(서열번호 1에서 상기 제시된 하나 이상의 위치에 상응함)가 모폴리펩티드(예컨대 모서열 서열번호 1)에서 상기 위치에 나타나지 않는 아미노산 서열을 포함함을 나타낸다.
"합성 분자", 예컨대 합성 핵산 또는 합성 폴리펩티드는 시험관내 화학 또는 효소 합성에 의해 생성된다. 이는 비한정적으로 선택된 숙주 개체에 대한 최적 코돈 사용으로 제조된 변이 핵산을 포함한다.
합성 핵산은 코돈 사용(바람직하게는, 본원에 참조로 혼입되는 WO 2006/077258 및/또는 WO 2008000632에 기재된 방법에 따름)에 대해 최적화될 수 있다. 코돈쌍 최적화는 코돈, 특히 사용되는 코돈쌍 사용에 대해 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 향상된 발현 및/또는 암호화되는 폴리펩티드의 향상된 생산을 수득하도록 최적화되는 방법이다. 코돈쌍은 암호 서열에서 2개의 후속 3중체(고돈)의 세트로서 정의된다. 당업자는 서열번호 2와의 현저한 상동성 편차를 갖는 변이체를 야기할 수 있되 여전히 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화되도록, 코돈 사용이 숙주 종에 따라 적응될 필요가 있음을 알 것이다.
본원에 사용된 용어 "변이체", "유도체", "돌연변이체" 또는 "동족체"는 상호교관가능하게 사용될 수 있다. 이는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭할 수 있다. 변이체는 참조 서열에 대한 하나 이상의 위치에서 치환, 삽입, 삭제, 절단(truncation), 교차형 염기전이 및/또는 역위를 포함한다. 변이체는 예컨대 부위-포화 돌연변이생성, 스캐닝(scanning) 돌연변이생성, 삽입적 돌연변이생성, 무작위 돌연변이생성, 위치-유도(site-directed) 돌연변이생성, 및 유도-진화, 예컨대 당업자에게 공지된 다양한 기타 재조합 접근법에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 변이체 유전자는 당업계에 공지된 기법에 의해 인공합성될 수 있다.
도 1은 통합 발현 벡터 pD902-LIP1의 물리적 지도를 도시한 것이다. XhoI 및 NotI 부위를 사용하여 lip1 리파아제 유전자를 도입하였다. SacI에 의한 소화는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 AOX1 부위로의 통합을 표적으로 한다. 형질전환체를 제오신(zeocin)에서 선택하였다.
도 2는 폴리펩티드와 접촉된 대두유 가수분해의 정도에 대해 도식화한 팔미트산 방출의 정도를 나타내는 도식적 표현을 도시한 것이다.
서열
서열번호 1: 칸디다 루고사(Candida rugosa)의 Lip1의 성숙 아미노산 서열.
서열번호 2: 피키아 파스토리스에서 칸디다 루고사의 Lip1의 코돈 최적화된 성숙 암호화 뉴클레오티드 서열.
서열번호 3: 코마카텔라 파피이(Komagataella phaffii) 균주 ATCC 76273로부터의 HIS4 유전자.
서열번호 4: 34 bp FRT 재조합 부위의 뉴클레오티드 서열.
서열번호 5: 글루타민 알라닌 반복.
서열번호 6: Kex2 가공 부위(KR) 및 글루타민 알라닌 반복(서열번호5)이 뒤따르는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 α-교배 인자(α-mating factor).
서열번호 7: 글루타민 알라닌 반복 및 코돈 최적화된 칸디다 루고사 534 야생형 리파아제(LIP1)이 뒤따르는 Kex2 처리 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(5' 및 3' 말단 각각에서 추가적인 XhoI 부위 및 NotI 부위를 가짐).
상세한 설명
하나의 양상에서, 본 발명은 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드와 정렬될 때, 적어도 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 상기 a)에 따른 폴리펩티드;
c) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드; 및
d) 서열번호 2의 서열의 상보 가닥에 대한 저, 중 및/또는 고 긴축성 조건하에 교잡화되는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
서열번호 1에서 상기 제시된 위치에 상응하는 본 발명의 폴리펩티드(재조합, 합성 또는 벤이 폴리펩티드일 수 있음)에서 상기 위치는 예컨대 프로그램 니들을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 서열과 서열번호 1의 서열을 상기 니들 프로그램(상기 프로그램에 대해서는 상기 상술한 바를 참고함)에 의해 발견되는 가장 동족성의 서열을 정렬함으로써 확인될 수 있다. 상기 제시된 서열번호 1에서 위치에 상응하는 본 발명의 폴리펩티드의 위치는 이에 따라 확인될 수 있고 서열번호 1을 참조로 하여 정의된 상기 위치로서 지칭된다. 아미노산 치환의 위치는 서열번호 1과 비교하여 제시되되, 서열번호 1의 위치 1에서 Ala(A)는 숫자 1로서 계수된다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 단리된, 실질적으로 순수, 순수, 재조합, 합성 또는 변이 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 리파아제 활성은 트라이아실글리세롤, 인지질 또는 갈락토지질을 가수분해하는 효소 활성에 관한 것이다. 예컨대, 본원에 개시된 리파아제는 트라이아실글리세롤로부터 지방산, 예컨대 지방산 팔미테이트, 에이코사펜타에노에이트(EPA) 및/또는 도코사헥사에노에이트(DHA)를 가수분해할 수 있다. 본원에 개시된 리파아제는 효소 EC 3.1.1.3에 속할 수 있다.
리파아제 특이성은 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이되, 상기 활성은 지질, 예컨대 측쇄로서 팔미트산, 에이코사펜타에노에이트(EPA) 또는 도코사헥사에노에이트(DHA)를 갖는 지질의 지방산 측쇄에 대해 특이성이 있다. 예컨대, 팔미트산에 대한 리파아제 특이성은 지질에 대한 활성을 갖는 리파아제에 관한 것으로서, 여기서 글리세롤의 하나 이상의 하이드록시 기는 팔미트산에 의해 에스터화된다.
팔미트산, 에이코사펜타에노에이트(EPA) 또는 도코사헥사에노에이트(DHA)는 상기 지방산의 산 형태를 지칭하고 지방산 및 팔미테이트, 에이코사펜타에노에이트 및 도코사헥사에노에이트는 상기 지방산의 염 및에스터 형태를 지칭한다. 본원에서, 상기 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
놀랍게도, 본원에 개시된 폴리펩티드의 팔미트산에 대한 리파아제 활성 대 EPA에 대한 리파아제 활성의 비는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 상기 비보다 높음이 밝혀졌다. 바람직하게는, 본원에 개시된 폴리펩티드의 팔미트산에 대한 리파아제 활성 대 EPA에 대한 리파아제 활성의 비는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 상기 비보다 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 이상 높다.
따라서, 본원에 개시된 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 EPA에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성보다 더 높은 EPA에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성을 가진다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 에이코사펜타노에이트(EPA)에 대한 특이성 대비 미리스테이트, 팔미테이트 및 스테아레이트에 대한 특이성보다 더 높은 에이코사펜타에노에이트에 대한 특이성 대비 미리스테이트, 팔미테이트 및/또는 스테아레이트에 대한 특이성을 갖고/거나 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 올리에이트 및/또는 리놀리에이트에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성보다 더 높은 올리에이트 및/또는 리놀리에이트에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성을 가진다.
또한, 본원에 개시된 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드의 DHA에 대한 특이성보다 낮은 DHA에 대한 특이성을 가진다.
상응하는 야생형 폴리펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드와는 달리 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 포함하지 않는 폴리펩티드인 것으로 이해된다.
바람직한 양태에서, 아미노산 치환 L410X에서 X는 무극성 아미노산, 바람직하게는 A, V, L, I, G, W, F, P 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 표시하고, 보다 바람직하게는 X는 F를 표시한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 포함한다:
-L410F;
-L410F + S365N + G414T
-L410F + S365Q;
-L410F + S365Q + G414T;
-L410F + S365Q + G414S;
-L410F + S365Q + G414V;
-L410F + S365Q + G414T + V534I;
-L410F + S365Q + G414S + V534I;
-L410F + S365Q + G414T + V534L;
-L410F + S365Q + G414S + V534L;
-L410F + S365Q + L413M + G414T;
-L410F + S365Q + L413M + G414A;
- L410F + S365Q + G414V;
-L410F + S365Q + V534I;
-L410F + S365Q + V534L;
-L410F + G414T;
-L410F + G414A;
-L410F + G414S; 또는
-L410F + G414V.
예컨대, 본원에 개시된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 폴리펩티드 변이체 또는 성숙 폴리펩티드일 수 있되, 상기 아미노산 위치의 번호부여는 서열번호 1을 기준으로 정의되고, 상기 아미노산 위치는 서열번호 1을 기준으로 정의되고, 상기 폴리펩티드는 추가로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 추가 아미노산 치환, 삭제 및/또는 삽입을 가지는데, 상기 폴리펩티드는 여전히 본 발명의 폴리펩티드의 활성 또는 기능을 가진다.
당업자는 본 발명의 폴리펩티드에서 이러한 소규모의 아미노산 변화가 단백질 기능 또는 활성의 손실 없이 존재하거나(예컨대 자연 발생 돌연변이) 제조될 수 있음(예컨대 r-DNA 기술을 사용함)을 이해할 것이다. 상기 돌연변이가 폴리펩티드의 결합 도메인, 활성 부위 또는 기타 기능적 도메인에 존재하는 경우, 상기 폴리펩티드는 변화하되 이의 활성은 유지할 수 있다. 돌연변이가 활성 부위, 결합 도메인 또는 기타 기능적 도메인에 인접하여 존재하지 않는 경우, 덜한 효과가 예상될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 임의의 적합한 진핵 또는 원핵 세포로부터 유도될 수 있다. 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 진균 또는 조류 세포일 수 있다. 원핵 세포는 박테리아 세포일 수 있다.
용어 "유도되는" 또는 "~로부터 유도되는"은 본원에 개시된 폴리펩티드의 유래와 관련하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 의한 블라스트 검색을 수행할 때, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 자연적 공급원, 예컨대 미생물 세포(이의 내인성 폴리펩티드는 본원에 개시된 폴리펩티드와 가장 높은 %의 동족성 또는 일치성을 나타냄)로부터 유도된 것일 수 있다.
리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 임의의 적합한 진균, 예컨대 아스퍼질러스(Aspergillus), 라이조뮤커(Rhizomucor), 라이조푸스(Rhizopus) 또는 페니실리움(Penicillium), 예컨대 아스질러스 니제르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 라이조뮤커 마이헤이(Rhizomucor miehei), 라이조푸스 마이크로스포루스(Rhizopus microsporus) 또는 페니실리움 크리소제넘(Penicillium chrysogenum)으로부터 유도될 수 있다. 또한, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 효모, 예컨대 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 예컨대 칸디다 루고사, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스 또는 사카로마이세스 세레비제로부터 유도될 수 있다. 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 칸디다 루고사로부터 유도될 수 있다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드 또는 유전자 변형 또는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 정제될 수 있다. 단백질의 정제는 당업계에 공지되어 있다. 단백질의 정제에 대해 주지된 방법은 고성능 액체 크로마토그래피이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제시한다.
본원에 개시된 조성물은 담체, 부형제, 보조적 효소 또는 기타 화합물을 포함할 수 있다. 전형적으로, 조성물 또는 제형은 리파아제가 제형화될 수 있는 화합물, 예컨대 수분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 부형제는 본원에 개시된 폴리펩티드와 함께 제형화되는 비활성 물질, 예컨대 수크로스 또는 락토스, 글리세롤, 솔비통 또는 염화나트륨이다. 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 액체 조성물 또는 고체 조성물일 수 있다. 통상적으로, 액체 조성물은 수분을 포함한다. 액체 조성물로서 제형화될 때, 통상적으로, 조성물은 수분 활성을 낮추는 성분, 예컨대 글리세롤, 솔비톨 또는 염화나트륨(NaCl)을 포함한다.
본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 고체 조성물은 효소를 포함하는 과립을 포함하거나, 상기 조성물은 액체 기질, 예컨대 리포솜 또는 겔, 예컨대 알기네이트 또는 카라기난에 캡슐화된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 또는 효소를 캠슐화하거나 과립화하는 당업계에 공지된 기법이 다수 존재한다(예컨대 문헌[G.M.H. Meesters, "Encapsulation of Enzymes and Peptides", Chapter 9, in N.J. Zuidam and V.A. Nedovic (eds.) "Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and food processing" 2010)] 참고).
또한, 본원에 개시된 조성물은 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 담체를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 기술에 의해 담체에 결합 또는 부동화될 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 제조 방법에 개시되는데, 이는 상기 폴리펩티드를 포함하는 발효 베지를 분사 건조시키거나, 본원에 개시된 폴리펩티드를 과립화 또는 캡슐화하는 단계, 및 상기 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함하는 포장, 예컨대 캔, 케그(keg) 또는 배럴(barrel)에 관한 것이다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 예컨대 하기와 같은 당업자에게 공지된 몇몇 절차에 의해 수득될 수 있다:
1. 오류 다발성(error prone) PCR로 무작위 돌연변이를 도입한 후, 수득된 (변이) 폴리펩티드를 선별하고 향상된 동역학 특성에 의해 (변이) 폴리펩티드를 단리함.
2. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 관련 변이체의 패밀리 셔플링(family shuffling)에 이어서, 수득된 변이체를 선별하고 향상된 동역학 특성에 의해 변이체를 단리함.
3. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 정보에 안정화 서열을 추가하여 증가된 반감기를 갖는 mRNA 분자를 야기함.
mRNA 또는 단백질의 향상된 촉매적 특성 또는 증가된 수준을 갖는 변이체를 단리하는 방법은 WO 03/010183 및 WO 03/01311에 개시되어 있다. 모 미생물 균주에서 코돈 사용을 최적화하는 방법은 예컨대 WO 2008/000632에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 안정화 요소를 첨가하는 방법은 WO 2005/059149에 개시되어 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 리파아제 활성을 갖는 변이 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제시되되, 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 서열번호 1에 따른 아미노산 사열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 일치성을 포함하는 모폴리펩티드를 선택하는 단계;
- 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 치환하는 단계; 및
- 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 상응하는 야생형 폴리펩티드의 팔미테이트에 대한 특이성 대 EPA에 대한 특이성보다 높은 팔미테이트에 대한 특이성 대 EPA에 대한 특이성을 가지는, 변이체 폴리펩티드를 생성하는 단계.
본원에 개시된 변이 폴리펩티드를 생성하는 단계는 적합한 (재조합) 숙주 세포에서 변이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계, 및 숙주 세포를 배양하여 변이 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 예컨대, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지되, 서열번호 2는 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌변변이를 포함하는 핵산일 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 특히 숙주 세포에서 본원에 개시된 폴리펩티드의 최적 발현에 대해 최적화된 코돈 또는 코돈쌍 최적화된 서열일 수 있다.
하나의 양태에서, 개시되는 핵산은 본원에 개시된 핵산의 단리, 실질적으로 순수, 순수, 재조합, 합성 또는 변이 핵산이다.
또다른 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 역 상보체(reverse complement)인 핵산 분자를 포함하되, 서열번호 2는 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410F 및 S365Q를 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
또한, 중 긴축성, 바람직하게는 고 긴축성 조건하에 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호 서열의 상보 가닥에 교잡화하는 핵산이 개시되되, 서열번호 2는 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 유도하는 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된 본원에 개시된 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
핵산을 핵산 구조물 또는 발현 벡터에 삽입하는 몇몇 방법이 있고, 이는 당업자에게 공지되어 있다(예컨대 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001] 참고). 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 제어 서열, 예컨대 촉진자 및 종결자 서열을 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
촉진자는 진핵 또는 원헥 숙주 세포에 적합한 적절 촉진자 서열일 수 있고, 이는 전사 활성을 나타내고(예컨대 돌연변이, 절단 및 교잡 프로모터), 세포에 대해 내인성(고유) 또는 이종(외래)인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로부터 수득될 수 있다. 촉진자는 구성요소적 또는 유도성 촉진자일 수 있다. 바람직하게는, 촉진자는 유도성, 예컨대 전분 유도성 촉진자이다. 사성성 진균에 적합한 촉진자는 비한정적으로 아스퍼질러스 오리제 타카(TAKA) 아밀라아제, 라이조뮤커 마이헤이 아스파트산 프로티나제, 아스퍼질러스 gpdA 촉진자, 아스퍼질러스 니제르 중성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 니제르 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 니제르 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 아스퍼질러스 니제르 또는 아스퍼질러스 아와모리 엔독실라나제(xlnA) 또는 베타-자일로시다제(xInD), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 셀로바이오하이드롤라아제 I(CBHI), 라이조뮤커 마이헤이 리파아제, 아스퍼질러스 오리제 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오리제 트라이오스 포스페이트 이소머라아제, 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다아제, 푸사리움 베나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900), 푸사리움 베나툼 다니아(Fusarium venenatum Dania)(WO 00/56900), 푸사리움 베나툼 퀸(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900), 푸사리움 옥시포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), 트리코더마 리세이 베타-글루코시다아제, 트리코더마 리세이 셀로바이오하이드롤라아제 I, 트리코더마 리세이 셀로바이오하이드롤라아제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 III, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 IV, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 V, 트리코더마 리세이 자일라나아제 I, 트리코더마 리세이 자일라나아제 II, 트리코더마 리세이 베타-자일로지다아제, NA2-tpi 촉진자(아스퍼질러스 니제를 중성 알파-아밀라아제 및 아스퍼질러스 오라제 트라이오스 포스페이트 이소머라아제를 암호화는 폴리뉴클레오티드로부터의 촉진자의 교잡), 및 이의 돌변변이, 절두 및 교잡 촉진자로부터 수득되는 촉진자를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 촉진자이다.
사성성 진균에 적합한 촉진자는 비한정적으로 아스퍼질러스 오리제 타카(TAKA) 아밀라아제, 라이조뮤커 마이헤이 아스파트산 프로티나제, 아스퍼질러스 gpdA 촉진자, 아스퍼질러스 니제르 중성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 니제르 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스퍼질러스 니제르 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 아스퍼질러스 니제르 또는 아스퍼질러스 아와모리 엔독실라나제(xlnA) 또는 베타-자일로시다제(xInD), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 셀로바이오하이드롤라아제 I(CBHI), 라이조뮤커 마이헤이 리파아제, 아스퍼질러스 오리제 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오리제 트라이오스 포스페이트 이소머라아제, 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다아제, 푸사리움 베나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900), 푸사리움 베나툼 다니아(Fusarium venenatum Dania)(WO 00/56900), 푸사리움 베나툼 퀸(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900), 푸사리움 옥시포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), 트리코더마 리세이 베타-글루코시다아제, 트리코더마 리세이 셀로바이오하이드롤라아제 I, 트리코더마 리세이 셀로바이오하이드롤라아제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 III, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 IV, 트리코더마 리세이 엔도글루카나아제 V, 트리코더마 리세이 자일라나아제 I, 트리코더마 리세이 자일라나아제 II, 트리코더마 리세이 베타-자일로지다아제, NA2-tpi 촉진자(아스퍼질러스 니제를 중성 알파-아밀라아제 및 아스퍼질러스 오라제 트라이오스 포스페이트 이소머라아제를 암호화는 폴리뉴클레오티드로부터의 촉진자의 교잡), 및 이의 돌변변이, 절두 및 교잡 촉진자로부터 수득되는 촉진자를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 촉진자이다.
본원에 개시된 세포에서 기능성인 임의의 종결자가 사용될 수 있고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 사상성 진균에서 적합한 종결자 서열의 예는 사상성 진균 유전자, 예컨대 아스퍼질러스 유전자, 예컨대 아스퍼질러스 유리제 타카 아밀라아제, 아스퍼질러스 니제르 글루코아밀라아제(glaA), 아스퍼질러스 니듈런스 안트라닐레이트 합성효소, 아스퍼질러스 니제르 알파-글루코시다아제, trpC 및/또는 푸사리움 옥시포룸 트립신-유사 프로테아제를 암호화하는 유전자로부터의 사상성 진균 유전자의 종결자 서열을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 적합한 숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 진균 또는 조류 세포, 또는 박테리아 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 진균 세포, 예컨대 속 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스, 크리소스포리움(Chrysosporium), 푸사리움, 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 페니실리움, 라삼소니아(Rasamsonia), 탈라로마이세스(Talaromyces), 티에라비아(Thielavia), 트리콘더마, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 피키아, 예컨대 아스퍼질러스 니제르, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 오리제, 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 탈라로마이세스 에머소니이(Talaromyces emersonii), 라삼소니아 에머소니이(Rasamsonia emersonii), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 옥시포룸, 마이셀리오프토라 터모필라(Myceliophthora thermophila), 티에라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris) 트리코더마 리세이, 또는 사카로마이세스 세레비제, 클루이베로마이세스 락티스 또는 피키아 파스토리스 속으로부터의 진균 세포일 수 있다.
숙조 세포는 재조합 또는 유전자삽입 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 당업게에 공지된 표준 기법, 예컨대 전기천공, 원형질체 변환 또는 접합(예컨대 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]에 개시되어 있음])에 의해 핵산 또는 발현 벡터를 사용하여 유전자 변형될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 폴리펩티드의 생성이 수행되는 조건하에 적합한 발효 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 본원에 개시된 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 당업자는 사용되는 숙주 세포에 따라, 예컨대 pH, 온도 및 발효 배지의 조성에 따라 본원에 개시된 폴리펩티드의 제조 방법을 수행하는 방법을 이해한다. 숙주 세포는 미량정량판(MTP), 진탕 플라스크에서, 또는 0.5 또는 1 L 이상 내지 10 내지 100 m3 이상 부피의 발효기에서 배양될 수 있다. 배양은 숙주 세포의 요건에 따라 호기적 또는 혐기적으로 수행될 수 있다.
유리하게는, 본원에 개시된 폴리펩티드는 발효 배지로부터 회수 또는 단리된다. 발효 배지로부터 폴리펩티드를 회수 또는 단리함은 예컨대 원심분리, 여과 및/또는 한외여과, 또는 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 유 또는 지방을 포함하는 제품의 중간 형태를 폴리펩티드 또는 본원에 개시된 조성물과 접촉시킴 및 제품을 제조함을 포함하는 유 또는 지방을 포함하는 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 방법으로 제조될 수 있는 제품은 식품 또는 사료 제품, 예컨대 어유를 포함하는 식품 또는 사료 제품일 수 있다. 본원에 개시된 식품 또는 사료 제품은 어유일 수 있다. 본원에 개시된 어유는 임의의 적합한 어류, 예컨대 연어, 고등어, 청어 및/또는 정어리로부터 유도된 유일 수 있다. 본원에 개시된 제품 또는 제폼의 중간 형태 중 유 또는 지방, 예컨대 어유는 지질, 예컨대 하나 이상의 팔미테이트를 측쇄로서 포함하는 트라이아실글리세롤을 포함한다. 본원에 개시된 제품 중 유 또는 지방은 EPA 및/또는 DHA를 측쇄로서 포함하는 트라이아실글리세롤을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 유 또는 지방은 팔미테이트, 에이코사펜타에노에이트 및/또는 도코사헥사에노에이트를 포함할 수 있다.
유 또는 지방을 포함하는 제품의 중간 형태를 본원에 개시된 폴리펩티드와 접촉시킴은 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드 상기 유 또는 지방과 혼합 또는 교반함을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 제품의 중간 형태는 수분을 포함할 수 있다.
또한, 상기 접촉시킴은 제품의 중간 형태에 물을 첨가함을 포함할 수 있다. 유 또는 지방을 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드와 접촉시킴은 적합한 온도 및 pH에서 폴리펩티드와 상기 유 또는 지방을 항온처리함을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 온도는 10 내지 70℃, 예컨대 15 내지 65℃, 예컨대 20 내지 60℃, 예컨대 25 내지 50℃일 수 있다. 적합한 pH는 3.5 내지 9, 예컨대 4 내지 8, 예컨대 4.5 내지 7.5일 수 있다. 유 또는 지방을 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드와 접촉시킴은 하나 이상의 팔미테이트를 측쇄로서 포함하는 트라이아실글리세롤을 가수분해함을 포함할 수 있다.
유 또는 지방을 포함하는 제품의 제조 방법은 유 또는 지방을 포함하는 제품으로부터 지방산을 분리함을 추가로 포함할 수 있다. 지방산은 지방산을 포함하는 수성 층을 수 있다. 지방산은 팔미트산일 수 있다. 지방산, 예컨대 지방산을 포함하는 수성 층을 분리함은 원심분리 또는 여과를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법에 의해 수득가능한 유 또는 지방을 포함하는 제품이 개시된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 유 또는 지방 중 포화 지방산 및/또는 단불포화 지방산을 감소시키기 위한 본원에 개시된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 유는 지방산 에스터 유, 트라이글리세리드 유 및 지방산 에틸 에스터 유로부터 선택된다. 바람직하게는, 지방산은 라우르산(C12:0), 미리스트산(C14:0), 미리스트올레산(C14:1), 팔미트산(C16:0), 팔미트올레산(C16:1), 스테아르산(C18:0), 올레산(C18:1), 아리키드산(C20:0), 11-에이코센산 또는 곤도산(C20:1), 도코산산(C22:0) 및 에루크산 또는 브라씨드산(C22:1)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유 또는 지방 중 단불포화 또는 포화 지방산을 감소시킴은 유 또는 지방 중 포화 지방산의 양이 감소함을 의미한다. 본원에 개시된 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 의해 감소되는 포화 지방산의 양은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 의해 감소되는 포화 지방산의 양보다 적다. 본원에 사용된 유는 어유 또는 대두유일 수 있다. 보다 바람직하게는, 유는 어유, 대두유, 해바라기유, 홍화유, 포도씨유, 아마씨유 및 호두유일 수 있다.
따라서, 유 또는 지방과 본원에 개시된 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 항온처리함을 포함하는 유 또는 지방 중 포화 지방산 또는 단불포화 지방산의 양을 감소시키는 방법이 본원에 개시된다. 유 또는 지방과 본원에 개시된 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 항온처리하는 단계는 본원에 상기 개시된 바와 같이 수행될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
균주
피키아 파스토리스(코마카텔라 파피이(Komagataella phaffii))(균주 ATCC 76273/CBS 7435/CECT 11047/NRRL Y-11430/베그너(Wegner) 21-1)를 사용하였다(문헌[Cregg JM, Barringer KJ, Hessler AY and Madden KR (1985). Pichia pastoris as a host system for transformations. Mol.Cell. Biol., 5, 3376-3385]).
분자생물학 기법
분자생물학 기법은 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]에 따라 수행하였다. 중합연쇄반응(PCR)은 예컨대 문헌[Innes et al. (1990) PCR protocols, a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego]에 개시되어 있다. PCR은 열순환기에서 퓨전 하이-피델리티 DNA 중합효소(Phusion High-Fidelity DNA polymerase)(핀란드 아스푸의 핀자임스 OY(High-Fidelity DNA polymerase))를 제조자의 지시에 따라 사용하여 수행하였다.
표준 DNA 절차는 달리 언급이 없는 한 문헌[Sambrook &Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 바와 같이 수행하였다. DNA 서열은 DNA2.0(미국 캘리포니아주)에서 주문하였다.
자유 지방산의 측정
자유지방산(FFA)의 양은 분할 주입기 및 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하여 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 측정하였다. 방법은 문헌[FFA in Milk and Cheese described by C. de Jong, H.T. Badings, (1990), Journal of High Resolution Chromatography, Vol 13, p. 94-98], 및 문헌[the official AOCS method Ce 1h-05, (2009) Determination of cis-, trans-, Saturated, Monounsaturated and Polyunsaturated Fatty Acids in Vegetable or Non-Ruminant Animal oils and Fats by Capillary GLC]의 분석을 기초로 하되, 후술한 바와 같이 적응화하였다.
어질런트(Agilent) 7890 GC에 스펄코 SP(Supelco SP: 상표면) 2560(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 모세관 컬럼(100 m x 0.25 mm, df = 0.2 μm)을 장착하였다. 수소를 담체 기체로서 1.3 mL/분의 일정 유속과 32.5 mL/분의 분할 유동으로 사용하였다. 분석 동안, 오븐 온도는 170℃로 설성하고, 30분 후, 5℃/분의 속도로 240℃로 30분 동안 증가시켰다.
다이클로로포름(2 mg/mL) 중 용해된 펜타데칸산을 내부 표준으로서 사용하였다.
보정선은 FFA의 외부 표준에 의해 생성하였다. 완전한 샘플(4 g 유 및 완충액)을 10 mL의 내부 표준 용액과 혼합하였다. 원심분리 후, 0.25 mL의 클로로포름 층을 아미노 프로필 고체 층 추출(SPE) 컬럼(본드 엘루트(Bond Elut), 500 mg)(10 mL n-헵탄으로 조건화됨)에 도포하였다. SPE를 5 mL의 클로로포름/2-프로판올(1:1)로 헹궜다. 이어서, FFA 분획을 삼불화붕소-메탄올 용액(문헌[W.R. Morrison and L.M. Smith, (1964), Journal of Lipid Research, Vol. 5, pp. 600- 608]에 따름)에 의해 메틸 에스터화하였다. n-헵탄으로 추출 후, 1 μl의 n-헵탄 층을 GC에 주입하였다.
FFA의 피크 면적을 내부 표준의 피크 면적에 의해 정규화하였다. FFA의 양은 정규화된 내부 표준의 보정 곡선에 의한 FFA의 정규화된 피크 면적의 내삽에 의해 계산하였다. FFA의 양을 μg/g 단위로 표시하였다.
실시예 1
1.1 히스티딘 보조영양 피키아 파스토리스(코마가텔라 파피이) 균주의 제조
피키아 파스토리스 균주 ATCC 76273으로부터의 HIS4 유전자(서열번호 3)를 사카로마이세스 세레비제 2 μm 고리로부터 유도된 2개의 비대칭 FLP 재조합 표적 서열(FRT) 및 FLP 재조합효소를 사용하여 삭제하였다(문헌[Som,T., Armstrong,K.A., Volkert,F.C., and Broach,J.R. (1988), Cell 52: p. 27-37], 및 문헌[Broach,J.R. (1981) The yeast plasmid 2 μm circle. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle and inheritance. Strathern,J.N., Jones ,E.W., and Broach,J.R. (eds)., Cold Spring Harbor, pp. 455-470]). 이는 히스티딘 보조영양 균주 DSM101A를 야기하였고, 여기서 2682 bp HIS4 개방 판독틀(서열번호 3)은 34 bp FRT 재조합 부위(서열번호 4)로 대체되었다. HIS4 삭제는 서던(Southern) 분석 및 표현형적으로 확인되었다. 히스티딘 보조영양 균주 DSM101A는 히스티딘이 있는 MD 배지(상기 문헌[Sambrook & Russell])에서는 성장할 수 없었지만, 상기 쥰주는 히스티딘(40 μg/mL)이 있는 MD 배지에서는 잘 성장하였다.
MD는 15 g/L의 한천, 800 mL H2O을 함유하고, 고압멸균 후, 하기 여과 멸균 용액을 첨가하였다: 100 mL 10x YNB(134 g/L 디프코티엠(DifcoTM)의 아미노산 없는 효모 실소 베이스(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids)), 2 mL 500x B(0.02% D-비오틴), 100 mL 10x D(220 g/L α-D(+)-글루코스 1수화물.
1.2 변이 리파아제 DNA 구조물의 제조
피키아 발현 벡터 pD902(미국 캘리포니아주의 DNA2.0)를 성숙 칸디다 루고사 535 리파아제 폴리펩티드 변이체(서열번호 1의 아미노산 1 내지 534의 변이체)의 발현에 사용하였다. 리파아제 암호화 서열을 사카로마이세스 세레비제로부터의 α-교배 인자 후위에 융합하고, 이에 리신, 아르기닌(KR) 및 글루타민 알라닌 반복(EAEA)로 구성된 Kex2 가공 부위(서열번호 5)가 이어졌다. 유전자를 전술한 메탄올 유도성 AOX1 촉진자의 제어하에 위치시켰다(문헌[Brocca S., Schmidt-Dannert C., Lotti M., Alberghina L., Schmid R.D., Protein Sci. 1998(6):1415-1422)] 및 WO 9914338A1). 칸디다 루고사 534 야생형 리파아제 폴리펩티드 서열(서열번호 1)을 사용하여 피키아 파스토리스의 암호 사용과 일치하는 코돈 사용을 갖는 리파아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 설계하였다. 또한, XhoI 부위를 5' 말단에, NotI 부위를 3' 말단에 위치시켰다. 칸디다 루고사 534 야생형 서열(LIP1), 사카로마이세스 세레비제로부터의 α-교배 인자, 이에 이어서 이에 리신, 아르기닌(KR) 및 글루타민 알라닌 반복(EAEA)로 구성된 Kex2 가공 부위, 및 5' 말단의 XhoI 부위 및 3' 말단의 NotI 부위를 암호화하는 코돈 최적화된 유전자 단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있다. 서열번호 7에 의한 pD902 벡터는 도 1에 도시되어 있다.
LIP1 단백질의 변이체(서열번호 1)은 아미노산 치환 L410X, 및 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의한 조합에 의해 제조하였다. 아미노산 치환의 위치는 서열번호 1과 비교 제시된 것이되, 서열번호 1의 위치 1에서 Ala(A)을 1번으로 번호부여한다.
LIP1 암호화 야생형 서열에 대해 전술한 LIP1 절 차 후, 아미노산 치환 L410F 및 S365Q를 함유하는 LIP1 암호화 유전자 변이체를 벡터 pD902에 클로닝하였다. lip1 유전자 변이체를 함유하는 pD902 벡터를 SacI에 의해 소화시키고 피키아 파스토리스 균주 DSM101A로 형질전환하였다. 형질전환 절차를 새로 제조된 용액을 사용하여 압축 전기천공 프로토콜에 따라 수행하였다(문헌[Lin-Cereghino J1, Wong WW, Xiong S, Giang W, Luong LT, Vu J, Johnson SD, Lin-Cereghino GP.Biotechniques. (2005) 38, (1):44-48)]). 형질전환체를 500 μg/mL 제오신을 갖는 YPDS 한천판(YPDS: 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스, 1 M 솔비톨, 2% 한천)에 플레이팅하고 30℃에서 72시간 동안 항온배양하였다.
실시예 2: 리파아제 변이체의 제조
아미노산 치환 L410X와 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의한 LIP1 변이체를 함유하는 히스티딘 보조영양 피키아 파스토리스 클론을 24 딥웰(deep well) 플레이트(미국 캘리포니아주의 악시젠(Axygen))에서 1.5 mL의 BMD 1% 배지(0.2 M 칼륨 포스페이트 완충액, 13.4 g/L 효모 질소 베이스, 0.4 mg/mL 비오틴, 11 g/L 글루코스, 여과 멸균됨) 중 배양하였다. 상기 배양물을 60시간 동안 28℃에서 550 rpm으로 항온배양하였다(마이크로톤(Microton) 항온배양 진탕기(스위스 보트민겐의 인포르스 아게(Infors AG))). 항온배양 60시간 후, 1.25 mL BMM2(0.2 M 칼륨 포스페이트 완충액, 13.4 g/L 효모 질소 베이스, 0.4 mg/mL 비오틴, 1% 메탄올, 여과 멸균됨)를 첨가하여 리파아제 생성을 유도하였다. 250 μL의 BMM10의 첨가를 제1 첨가 24시간, 48시간 및 72시간 후 반복하였다. BMM10의 마지막 첨가 12시간 후, 배양물을 원심분리하고(5분, 1000 g), 상청액을 수확하고 -20℃에서 저장하였다.
실시예 3: p-NP 기질에 대한 리파아제의 활성의 선별
LIP1 변이체의 활성을 색소원 기질(4-니트로페닐 팔미테이트(시그마(Sigma) N2752), 4-니트로페닐 올리에이트(신컴(Syncom)에 의해 맞춤제작됨), 4-니트로페닐 리놀리에이트(신컴에 의해 맞춤제작됨))을 사용하는 분석에서 측정하였다. 2-프로판올 중 색소원 기질의 8.0 mM 용액을 제조하였다. 이어서, 3.5 mL의 상기 용액을 1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 pH 4.5의 46.5 mL의 100 mmol/L 나트륨 아세테이트에 격력한 교반하에 첨가하였다. 효소 반응을 25 μL의 전술한 바와 같이 제조한 적합한 희석의 부용 상청액과 225 μL의 기질 용액(항온배양 동안 기질 농도는 0.5 mM임)을 해밀턴 로봇(Hamilton robot)을 사용하여 미량정량판에서 혼합함으로써 시작하였다. 200 μL의 반응 혼합물을 해밀턴 로봇에 의해 빈 미량정량판으로 옮기고, 이를 테칸 인피니트(TECAN Infinite) M1000 미량정량판 판독기에 넣었다. 25℃에서 항온배양 동안, 혼합물의 흡수를 20 내지 60분 동안 348 nm(4-니트로페놀의 등흡수점)에서 측정하였다. 곡선의 선형 부분의 기울기(ΔOD/분)를 활성에 대한 척도로서 사용한다.
활성은 시험 조건하에 분당 1 마이크로의 p-니트로페놀을 자유화시키는 효소의 양으로서 표현된다. 샘플을 희석하여 항온배양 후 흡수도 증가가 0.7 미만이 되도록 하였다. 보정은 샘플 완충액 충 희석된 4-니트로페놀 표준 용액(시그마 N7660)을 사용하여 수행하였다.
하기 표 1은 LIP1 변이체 및 야생형 LIP1의 리파아제의 기질 pNP-팔미테이트, pNP-올리에이트 및 pNP-리놀리에이트에 대한 활성의 비를 나타내되, 여기서 균주는 진탕 플라스크에서 성장한 것이다. LIP1 변이체의 팔미테이트 가수분해 활성 대 올리에이트와 리놀리에이트 가수분해 활성의 비는 야생형 효소 둘다에 비해 증가함으로써 팔미트산을 가수분해함에 대한 향상된 특이성을 나타냈다. 야생형 LIP1 리파아제에 비해 증가된 P/O 및 P/L의 비는 팔미트산의 가수분해에 대한 향상된 특이성을 나타낸다.
변이체 Pos 365 Pos 410 Pos 413 Pos 414 Pos 534 P/O P/L
CRL_006 　 L410F 　 　 　 5.4 2.7
CRL2_035 S365Q L410F 　 　 　 2.6 5.0
CRL3_001 S365N L410F 　 G414T 　 6.2 4.0
CRL3_007 　 L410F 　 G414A 　 4.5 2.8
CRL3_008 　 L410F 　 G414S 　 > 10 6.2
CRL3_009 　 L410F 　 G414V 　 3.8 2.3
CRL3_011 S365Q L410F 　 G414T 　 > 10 8.3
CRL3_012 S365Q L410F 　 G414A 　 3.0 4.2
CRL3_013 S365Q L410F 　 G414S 　 3.7 2.6
CRL3_016 S365Q L410F L413M G414T 　 > 10 5.3
CRL3_017 S365Q L410F L413M G414A 　 > 10 7.7
CRL3_029 S365Q L410F 　 　 V534I 4.1 4.2
CRL3_030 S365Q L410F 　 　 V534L 9.2 2.5
CRL3_033 S365Q L410F 　 G414T V534I > 10 3.2
CRL3_035 S365Q L410F 　 G414S V534I 9.2 4.1
WT LIP1 　 　 　 　 　 0.9 0.9
실시예 4: 어유에서 리파아제 활성
돌연변이 L410F를 갖는 LIP1의 활성을 어유(반정제 어유, 오션 뉴트리션(Ocean Nutrition), 조성에 대해 하기 표 2 참고)에서의 적용 유형 항온처리에서 야생형 LIP1의 활성과 비교하였다. LIP1 돌연변이 및 야생형 LIP1의 pH 7의 100 mM 포스페이트 완충액 중 희석된 2 mL의 효소 용액을 2 mL 어유에 첨가하였다. 37℃에서 교반(500 rpm)하에 수욕(water bath)에서 항온처리 16시간 후, -18℃에서 반응 혼합물을 저장함으로써 반응을 정지하였다. 전술한 방법에 따른 페임(FAME)을 사용하여 클로로포름에 의한 샘플의 추출 후 방출된 지방산을 분석하였다.

실험에 사용된 어유의 조성
지방산의
유형 		FA
(mg/g 유) 		FFA
(μmol/g) 		mol% MW
(g/mol)
C14:0 82 359.1 12.6 228.4
C16:0 148 577.2 20.2 256.4
C16:1 92 361.6 12.6 254.4
C17:0 4 14.8 0.5 270.5
C18:0 27 94.9 3.3 284.5
C18:1 105 371.7 13 282.5
C18:2 36 128.3 4.5 280.5
C18:3 7 25.1 0.9 278.5
C20:0 2 6.4 0.2 312.5
C20:1 7 22.5 0.8 310.5
C20:3 2 6.5 0.2 306.5
C20:4 9 31.9 1.1 282.5
C20:5 (EPA) 174 575.1 20.1 302.5
C22:2 7 20.8 0.7 336.6
C22:4 0 0 0
C22:6(DHA) 83 251.1 8.8 330.6
C24:1 4 12.2 0.4 328.6
합계 789 2859 100
LIP1 리파아제
야생형 야생형 변이체
CRL2_035 		변이체
CRL2_035
지방산
조성 		C14:0 mol% 14.1 13.7 37.6 38.9
C16:0 mol% 24.0 23.5 17.2 16.4
C16:1 mol% 13.3 12.3 24.6 23.9
C17:0 mol% 0.6 0.6 < d.l. < d.l.
C18:0 mol% 3.7 3.8 1.6 0.8
C18:1 mol% 13.5 12.6 4.9 5.0
C18:2 mol% 1.5 1.5 0.8 0.8
C18:3 mol% 0.9 0.9 0.8 0.8
C20:0 mol% < d.l. < d.l. < d.l. < d.l.
C20:1 mol% 0.3 0.3 < d.l. < d.l.
C20:3 mol% < d.l. < d.l. < d.l. < d.l.
C20:4 mol% 0.0 0.3 < d.l. < d.l.
C20:5(EPA) mol% 15.5 17.5 < d.l. < d.l.
C22:2 mol% 0.3 0.2 < d.l. < d.l.
C22:4 　 0.3 0.2 < d.l. 0.8
C 22:6( DHA ) mol% 0.3 0.2 < d.l. < d.l.
C24:1 mol% < d.l. < d.l. < d.l. < d.l.
미지 mol% 11.8 12.4 12.4 12.5
형성된
지방산의
총량 		μmol/g 1152 1211 431 427
표 3의 데이터는 어유와 LIP1 변이체 L410F 및 S365Q의 항온처리가 야생형 LIP1에 비해 포화 지방산, 예컨대 미리스트산(C14:0), 팔미트산(C16:0) 및 스테아르산(C18:0)의 증가된 방출(mol%) 및 EPA(C25:0)의 감소된 방출(mol%)을 야기함을 나타낸다. 어유와 LIP1 변이체 및 야생형 LIP1의 항온처리 후 DHA(C22:6)의 방출은 유사하였다. < d.l.은 한계치 미만 검출이다.
물질 수지(mass balance)로부터 계산된 효소 처리된 어유의 조성
(DH는 가수분해도임)
함께
항온배양한
것 		DH
(%) 		EPA+DHA (mol%) EPA
(mol%)
DHA (mol%) 		EPA 손실
% 		DHA 손실
% 		EPA (w/w%) DHA (w/w%)
변이체
CRL2_035 		15.1 34.0 23.7 10.3 0.0 0.0 19.5 9.3
변이체
CRL2_035 		15.0 33.9 23.5 10.3 0.6 0.0 19.4 9.3
LIP-WT 40.3 37.8 23.2 14.5 31.0 1.2 17.4 11.9
LIP-WT 42.4 37.1 22.1 15.1 36.8 1.2 16.3 12.2
완충액 0 28.9 20.1 8.8 0.0 0.0 17.4 8.3
표 4는 미처리된 어유와 비교하여, 미정제유의 조성(물질 수지로부터 계삼됨)의 효소 처리의 효과를 나타낸다. 돌연변이 L410F 및 S365Q를 갖는 변이체에 의한 처리는 조성에서 풍부한 DHA 및 EPA 함량과 함께, 야생형 LIP1과 비교시 EPA의 뚜렷이 감소된 방출을 명확히 나타낸다.
실시예 5: 대두유 중 리파아제 활성
대두유(골드썬(Goldsun)으로부터의 샐러드 유, 지방산 조성에 대해 하기 표 5 참고)에서 항온처리 후의 LIP1 변이체의 활성을 야생형 LIP1 리파아제와 비교하였다. LIP1 돌연변이 및 야생형 LIP1의 pH 7의 100 mM 포스페이트 완충액 중 희석된 2 mL의 효소 용액을 2 mL 대두유 기질에 첨가하였다. 37℃에서 교반(500 rpm)하에 수욕에서 항온처리 16시간 후, -18℃에서 반응 혼합물을 저장함으로써 반응을 정지하였다. 전술한 방법에 따른 페임을 사용하여 클로로포름에 의한 샘플의 추출 후 방출된 지방산을 분석하였다.
결과를 하기 표 6 및 도 2에 나타냈다.
대두유의 지방산 조성
지방산 FA
(mg/g 유) 		FA
(mol%) 		FA
(μmol/g) 		MW
(g/mol)
C14:0 1.0 0.1 4.4 228.4
C16:0 106 11.8 413 256.4
C16:1 1.0 0.1 3.9 254.4
C18:0 41.0 4.1 144 284.5
C18:1 233 23.5 825 282.5
C18:2 518 52.5 1847 280.5
C18:3 69.0 7.0 248 278.5
C20:0 3.0 0.3 9.6 312.5
C20:1 2.0 0.2 6.4 310.5
C22:0 3.0 0.25 8.8 340.6
C24:0 4.0 0.31 10.9 368.6
합계 982 100.0 3516
하기 표 6은 진탕 플라스크에서 제조된 샘플에 의한 몇몇 실험의 방출된 팔미트산의 가수분해도(DH) 및 양을 나타낸 것이다. 상이한 유형의 기질을 사용하였다: pH 7의 100 mM 포스페이트 완충액과 혼합된 50% 유, 완충액과 혼합된 1% 유, 또는 동일 완충액과 혼합되어 1% 트리톤 X-100에 의해 유화된 1% 유.
대두유 트라이글리세리드 중 팔미트산 가수분해에 대한 변이체의 향상된 특이성은 방출된 팔미트산의 양 대 가수분해도가 야생형 LIP1 리파아제에 대한 비보다 높을 때 나타낸다. P/O는 pNP-팔미테이트 대 pNP-올리에이트에 대한 활성의 비이다. P/L은 pNP-팔미테이트 대 pNP-리놀리에이트에 대한 활성의 비이다. DH는 mol%의 가수분해도이다. P/DH는 방출된 팔미트산 대 가수분해도의 비이다. 대두유 트라이글리세리드에서 팔미트산에 대한 변이체의 향상된 특이성은 P/DH 비가 LIP1 리파아제에 비해 높을 때 나타난다.
변이체 M1 M2 M3 M4 비 P/O 비
P/L 		기질 팔미트산 방출
(mol%) 		DH
(mol%) 		P/DH
비
CRL3_001 L410F S365N G414T 　 6.2 4 50% 대두유 6.3 1.1 5.8
1% 대두유 0.8 0.2 5.2
CRL3_007 L410F G414A 　 　 4.5 2.8 50% 대두유 4.2 0.8 5.5
1% 대두유 34.2 11.2 3.1
CRL3_008 L410F G414S 　 　 > 10 6.2 50% 대두유 1.1 0.2 4.9
1% 대두유 20.0 4.3 4.6
1% SO/1% 트리톤 38.7 8.7 4.4
CRL3_009 L410F G414V 　 　 3.8 2.3 50% 대두유 5.3 0.7 7.9
1% 대두유 9.8 1.6 6.1
1% SO/1% 트리톤 47.6 8.2 5.8
CRL3_011 L410F S365Q G414T 　 > 10 8.3 50% 대두유 1.1 0.1 9.4
1% SO/1% 트리톤 23.2 5.0 4.7
1% 대두유 3.2 0.8 4.2
CRL3_012 L410F S365Q G414A 　 3 4.2 50% 대두유 1.1 0.4 2.5
1% 대두유 15.4 6.9 2.2
CRL3_013 L410F S365Q G414S 　 3.7 2.6 50% 대두유 1.1 0.2 4.9
1% SO/1% 트리톤 23.2 7.5 3.1
1% 대두유 10.9 3.9 2.8
CRL3_017 L410F S365Q G414A L413M > 10 7.7 50% 대두유 1.1 0.2 4.9
1% 대두유 18.4 6.5 2.8
CRL3_029 L410F S365Q V534I 　 4.1 4.2 50% 대두유 5.3 1.3 4.1
1% 대두유 7.3 3.5 2.1
1% SO/1% 트리톤 44.1 27.6 1.6
CRL3_030 L410F S365Q V534L 　 9.2 2.5 50% 대두유 1.1 0.3 3.3
1% 대두유 2.1 1.0 2.0
1% SO/1% 트리톤 41.9 18.1 2.3
CRL3_033 L410F S365Q G414T V534I > 10 3.2 50% 대두유 1.1 0.2 4.9
1% SO/1% 트리톤 39.7 8.9 4.4
1% 대두유 3.3 1.0 3.4
CRL3_035 L410F S365Q G414S V534I 　 　 1% SO/1% 트리톤 30.8 8.9 3.4
1% 대두유 3.3 1.2 2.8
CRL2_035 L410F S365Q 　 　 2.4 4.2 50% 대두유 13.7 3.7 3.7
50% 대두유 20.3 6.3 3.2
50% 대두유 8.3 2.8 2.9
1% SO/1% 트리톤 35.3 13.5 2.6
50% 대두유 64.1 29.7 2.2
1% 대두유 6.2 3.6 1.7
LIP1-WT 　 　 　 　 0.9 0.9 1% SO/1% 트리톤 25.3 24.9 1.0
1% 대두유 6.0 6.4 0.9
1% 대두유 6.8 6.8 1.0
50% 대두유 9.2 17.0 0.5
1% 대두유 13.4 18.3 0.7
50% 대두유 46.7 62.7 0.7
도 2에서, DH는 방출된 팔미트산의 양에 대해 도식화된다. 향상된 변이체가 팔미트산에 대해 100% 특이성일 때, DH 대 팔미트산 방출은 A 선을 따를 것이다. 비특이적 리파아제의 경우, 이는 C 선에 해당한다. 50% 특이성의 경우, 이는 B 선에 해당한다. WT LIP1의 결과(원 표시) 모두는 C 선 밑에 있는데, 이는 대두유로부터 불포화 지방산을 가수분해함에 대한 바람직함을 나타낸다. 모든 변이체의 경우, B 선과 C 선 사기의 모든 점은 야생형 LIP1과 비교시 팔미트산에 대한 향상된 특이성을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> MUTANT LIPASE AND USE THEREOF <130> 32855-KR-PCT <140> PCT/EP2019/062786 <141> 2019-05-17 <150> EP18173103.5 <151> 2018-05-18 <160> 7 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Candida rugosa <400> 1 Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro 20 25 30 Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln Asn 50 55 60 Pro Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu 65 70 75 80 Val Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu Asp 85 90 95 Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala 100 105 110 Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly 115 120 125 Gly Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile Ala 130 135 140 Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser 145 150 155 160 Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn 165 170 175 Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn 180 185 190 Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu 195 200 205 Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp Gly 210 215 220 Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln 225 230 235 240 Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly Asn 245 250 255 Glu Ile Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser 260 265 270 Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu Asp 275 280 285 Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr 305 310 315 320 Ala Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ile Ile Gly 325 330 335 Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn Val 340 345 350 Thr Thr Asp Ala Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Val His 355 360 365 Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gly Asp 370 375 380 Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr 385 390 395 400 Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Gly Phe Thr 405 410 415 Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr 420 425 430 Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe 435 440 445 His Ser Asn Asp Ile Val Phe Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Leu Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro 465 470 475 480 Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Ser 485 490 495 Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr 500 505 510 Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn 515 520 525 Pro Pro Ser Phe Phe Val 530 <210> 2 <211> 1602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..1602 <223> /organism="Artificial Sequence" /note="Codon optimized nucleotide sequence for expression in Pichia pastoris of the mature coding sequence of Lip1 of Candida rugosa" /mol_type="unassigned DNA" <400> 2 gccccaaccg ccactttggc taacggtgac accatcaccg gtttgaacgc catcatcaac 60 gaagccttct tgggtattcc atttgccgaa ccaccagttg gtaacttgag attcaaggac 120 ccagttccat actccggttc cttggatggt caaaagttca cttcttacgg tccatcttgt 180 atgcaacaaa acccagaagg tacctacgaa gaaaacttgc caaaggcagc tttagatctg 240 gttatgcaat ccaaagtttt cgaagctgtt tctccatctt ctgaagactg tttgaccatt 300 aatgttgtta gaccacccgg gacaaaggct ggtgccaact tgccagttat gttgtggatc 360 tttggtggtg gttttgaagt tggtggtact agtaccttcc ctccagccca aatgattacc 420 aagtctattg ctatgggtaa gccaatcatc cacgtttctg tcaactacag agtctccagc 480 tggggtttct tggctggtga cgaaatcaag gccgaaggtt ctgccaacgc cggtttgaag 540 gaccaaagat tgggtatgca atgggtggct gacaacattg ctgcttttgg tggtgatcca 600 actaaggtta ctatctttgg tgaatctgct ggttctatgt ccgtcatgtg tcacattttg 660 tggaacgacg gtgacaacac ttacaagggt aagccattgt tcagagctgg tatcatgcaa 720 tctggtgcta tggttccatc tgacgccgtc gacggtatct acggtaacga aatttttgac 780 ttgttggctt ccaacgctgg ttgtggttct gcctctgaca agttggcttg tttgagaggt 840 gtttcttctg acactttgga agacgccacc aacaacaccc ctggtttctt ggcttactcc 900 tccttaagat tgtcttactt gccaagacca gacggtgtta acatcaccga cgacatgtac 960 gctttggtta gagaaggtaa gtatgccaac atccctgtta tcatcggtga ccaaaacgac 1020 gaaggtacct tctttggtac ttcttctttg aacgttacca ctgatgccca agccagagaa 1080 tatttcaagc aatcttttgt ccacgctagc gacgctgaaa tcgacacttt gatgactgct 1140 tacccaggtg acatcactca aggttctcca tttgacactg gaattctaaa cgccttgacc 1200 ccacaattca agagaatctc tgctatcttg ggtgacttgg gttttacttt ggctcgtaga 1260 tacttcttga accactacac cggtggtacc aagtactctt tcttgtctaa gcaattgtct 1320 ggtttgccag ttttgggtac tttccactcc aacgatatcg tcttccaaga ctacttgttg 1380 ggttctggtt ccttgatcta caacaacgct ttcattgctt ttgccactga cttggaccca 1440 aacaccgccg gtttgttggt taagtggcca gaatacacct cttcttctca atctggtaac 1500 aacttgatga tgatcaacgc tttgggtttg tacaccggta aggacaactt cagaaccgcc 1560 ggttacgacg ctttgttctc caacccacca tctttctttg tt 1602 <210> 3 <211> 2582 <212> DNA <213> Komagataella phaffii <220> <221> source <222> 1..2582 <223> /organism="Komagataella phaffii" /note="strain ATCC 76273; HIS4 gene" /mol_type="unassigned DNA" <400> 3 aatacggctt cagaatttct caagactaca ctcactgtcc gacttcaagt atgacatttc 60 ccttgctacc tgcatacgca agtgttgcag agtttgataa ttccttgagt ttggtaggaa 120 aagccgtgtt tccctatgct gctgaccagc tgcacaacct gatcaagttc actcaatcga 180 ctgagcttca agttaatgtg caagttgagt catccgttac agaggaccaa tttgaggagc 240 tgatcgacaa cttgctcaag ttgtacaata atggtatcaa tgaagtgatt ttggacctag 300 atttggcaga aagagttgtc caaaggatcc caggcgctag ggttatctat aggaccctgg 360 ttgataaagt tgcatccttg cccgctaatg ctagtatcgc tgtgcctttt tcttctccac 420 tgggcgattt gaaaagtttc actaatggcg gtagtagaac tgtttatgct ttttctgaga 480 ccgcaaagtt ggtagatgtg acttccactg ttgcttctgg tataatcccc attattgatg 540 ctcggcaatt gactactgaa tacgaacttt ctgaagatgt caaaaagttc cctgtcagtg 600 aaattttgtt ggcgtctttg actactgacc gccccgatgg tctattcact actttggtgg 660 ctgactcttc taattactcg ttgggcctgg tgtactcgtc caaaaagtct attccggagg 720 ctataaggac acaaactgga gtctaccaat ctcgtcgtca cggtttgtgg tataaaggtg 780 ctacatctgg agcaactcaa aagttgctgg gtatcgaatt ggattgtgat ggagactgct 840 tgaaatttgt ggttgaacaa acaggtgttg gtttctgtca cttggaacgc acttcctgtt 900 ttggccaatc aaagggtctt agagccatgg aagccacctt gtgggatcgt aagagcaatg 960 ctccagaagg ttcttatacc aaacggttat ttgacgacga agttttgttg aacgctaaaa 1020 ttagggagga agctgatgaa cttgcagaag ctaaatccaa ggaagatata gcctgggaat 1080 gtgctgactt attttatttt gcattagtta gatgtgccaa gtacggtgtg acgttggacg 1140 aggtggagag aaacctggat atgaagtccc taaaggtcac tagaaggaaa ggagatgcca 1200 agccaggata caccaaggaa caacctaaag aagaatccaa acctaaagaa gtcccttctg 1260 aaggtcgtat tgaattgtgc aaaattgacg tttctaaggc ctcctcacaa gaaattgaag 1320 atgcccttcg tcgtcctatc cagaaaacgg aacagattat ggaattagtc aaaccaattg 1380 tcgacaatgt tcgtcaaaat ggtgacaaag cccttttaga actaactgcc aagtttgatg 1440 gagtcgcttt gaagacacct gtgttagaag ctcctttccc agaggaactt atgcaattgc 1500 cagataacgt taagagagcc attgatctct ctatagataa cgtcaggaaa ttccatgaag 1560 ctcaactaac ggagacgttg caagttgaga cttgccctgg tgtagtctgc tctcgttttg 1620 caagacctat tgagaaagtt ggcctctata ttcctggtgg aaccgcaatt ctgccttcca 1680 cttccctgat gctgggtgtt cctgccaaag ttgctggtcg caaagaaatt gtttttgcat 1740 ctccacctaa gaaggatggt acccttaccc cagaagtcat ctacgttgcc cacaaggttg 1800 gtgctaagtg tatcgtgcta gcaggaggcg cccaggcagt agctgctatg gcttacggaa 1860 cagaaactgt tcctaagtgt gacaaaatat ttggtccagg aaaccagttc gttactgctg 1920 ccaagatgat ggttcaaaat gacacatcag ccctgtgtag tattgacatg cctgctgggc 1980 cttctgaagt tctagttatt gctgataaat acgctgatcc agatttcgtt gcctcagacc 2040 ttctgtctca agctgaacat ggtattgatt cccaggtgat tctgttggct gtcgatatga 2100 cagacaagga gcttgccaga attgaagatg ctgttcacaa ccaagctgtg cagttgccaa 2160 gggttgaaat tgtacgcaag tgtattgcac actctacaac cctatcggtt gcaacctacg 2220 agcaggcttt ggaaatgtcc aatcagtacg ctcctgaaca cttgatcctg caaatcgaga 2280 atgcttcttc ttatgttgat caagtacaac acgctggatc tgtgtttgtt ggtgcctact 2340 ctccagagag ttgtggagat tactcctccg gtaccaacca cactttgcca acgtacggat 2400 atgcccgtca atacagcgga gttaacactg caaccttcca gaagttcatc acttcacaag 2460 acgtaactcc tgagggactg aaacatattg gccaagcagt gatggatctg gctgctgttg 2520 aaggtctaga tgctcaccgc aatgctgtta aggttcgtat ggagaaactg ggacttattt 2580 aa 2582 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..34 <223> /organism="Artificial Sequence" /note="Nucleotide sequence of an 34 bp FRT recombination site " /mol_type="unassigned DNA" <400> 4 gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc 34 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glutamine Alanine repeat <400> 5 Glu Ala Glu Ala 1 <210> 6 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> α-mating factor from S. cerevisiae followed by a Kex2 processing site (KR) and Glutamine Alanine repeat <400> 6 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 7 <211> 1650 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..1650 <223> /organism="Artificial Sequence" /note="Nucleotide sequence encoding a Kex2 processing site followed by the Glutamine Alanine repeat and the codon optimized Candida rugosa 534 wild type lipase (LIP1) with an additional XhoI site and NotI site at the 5’ and 3’ ends, respectively" /mol_type="unassigned DNA" <400> 7 ctcgagaaga gagaggccga agctgcccca accgccactt tggctaacgg tgacaccatc 60 accggtttga acgccatcat caacgaagcc ttcttgggta ttccatttgc cgaaccacca 120 gttggtaact tgagattcaa ggacccagtt ccatactccg gttccttgga tggtcaaaag 180 ttcacttctt acggtccatc ttgtatgcaa caaaacccag aaggtaccta cgaagaaaac 240 ttgccaaagg cagctttaga tctggttatg caatccaaag ttttcgaagc tgtttctcca 300 tcttctgaag actgtttgac cattaatgtt gttagaccac ccgggacaaa ggctggtgcc 360 aacttgccag ttatgttgtg gatctttggt ggtggttttg aagttggtgg tactagtacc 420 ttccctccag cccaaatgat taccaagtct attgctatgg gtaagccaat catccacgtt 480 tctgtcaact acagagtctc cagctggggt ttcttggctg gtgacgaaat caaggccgaa 540 ggttctgcca acgccggttt gaaggaccaa agattgggta tgcaatgggt ggctgacaac 600 attgctgctt ttggtggtga tccaactaag gttactatct ttggtgaatc tgctggttct 660 atgtccgtca tgtgtcacat tttgtggaac gacggtgaca acacttacaa gggtaagcca 720 ttgttcagag ctggtatcat gcaatctggt gctatggttc catctgacgc cgtcgacggt 780 atctacggta acgaaatttt tgacttgttg gcttccaacg ctggttgtgg ttctgcctct 840 gacaagttgg cttgtttgag aggtgtttct tctgacactt tggaagacgc caccaacaac 900 acccctggtt tcttggctta ctcctcctta agattgtctt acttgccaag accagacggt 960 gttaacatca ccgacgacat gtacgctttg gttagagaag gtaagtatgc caacatccct 1020 gttatcatcg gtgaccaaaa cgacgaaggt accttctttg gtacttcttc tttgaacgtt 1080 accactgatg cccaagccag agaatatttc aagcaatctt ttgtccacgc tagcgacgct 1140 gaaatcgaca ctttgatgac tgcttaccca ggtgacatca ctcaaggttc tccatttgac 1200 actggaattc taaacgcctt gaccccacaa ttcaagagaa tctctgctat cttgggtgac 1260 ttgggtttta ctttggctcg tagatacttc ttgaaccact acaccggtgg taccaagtac 1320 tctttcttgt ctaagcaatt gtctggtttg ccagttttgg gtactttcca ctccaacgat 1380 atcgtcttcc aagactactt gttgggttct ggttccttga tctacaacaa cgctttcatt 1440 gcttttgcca ctgacttgga cccaaacacc gccggtttgt tggttaagtg gccagaatac 1500 acctcttctt ctcaatctgg taacaacttg atgatgatca acgctttggg tttgtacacc 1560 ggtaaggaca acttcagaac cgccggttac gacgctttgt tctccaaccc accatctttc 1620 tttgtttaat aaggttaaag gggcggccgc 1650

Claims (16)

  1. 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드로서,
    하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드:
    (a) 서열번호 1에 따른 폴리펩티드와 정렬될 때, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 적어도 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 상응하는 위치를 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 상기 (a)에 따른 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드; 및
    (d) 서열번호 2의 서열의 상보 가닥에 대한 저, 중 및/또는 고 긴축성(stringency) 조건하에 교잡화되는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 상기 서열번호 2가 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    X가 무극성 아미노산, 바람직하게는 A, V, L, I, G, W, F, P 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 보다 바람직하게는 F인, 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1항 또는 제2항의 폴리펩티드의 단리, 실질적으로 순수, 순수, 재조합, 합성 또는 변이 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상응하는 야생형 폴리펩티드의 에이코사펜타노에이트(EPA)에 대한 특이성 대비 미리스테이트, 팔미테이트 및 스테아레이트에 대한 특이성보다 더 높은 에이코사펜타에노에이트에 대한 특이성 대비 미리스테이트, 팔미테이트 및 스테아레이트에 대한 특이성을 갖는 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상응하는 야생형 폴리펩티드의 올레산 또는 리놀레산에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성보다 더 높은 올레산 또는 리놀레산에 대한 특이성 대비 팔미테이트에 대한 특이성을 갖는 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  8. 제7항에 있어서,
    서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지되, 서열번호 2는 아미노산 위치의 번호부여를 서열번호 1을 기준으로 정의하여, 서열번호 1에 따른 폴리펩티드의 아미노산 치환 L410X, 및 임의적으로 S365Q, S365N, L413M, G414A, G414S, G414V, G414T, V534L 및 V534I로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 핵산.
  9. 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 유도하는 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된, 제7항 또는 제8항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제7항 또는 제8항에 따른 핵산; 또는
    제9항에 따른 발현 벡터
    를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    상기 폴리펩티드가 발현되게 하는 조건하에 적합한 발효 배지 중 제10항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    임의적으로, 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  12. 유 또는 지방을 포함하는 제품의 제조 방법으로서,
    상기 제품의 중간 형태를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제6항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    상기 제품을 제조하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    제품이 식품 또는 사료 제품인, 제조 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    지방산을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  15. 유 또는 지방 중 포화 지방산 또는 단불포화 지방산을 감소시키기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 유가 어유, 대두유, 해바라기유, 홍화유, 포도씨유, 아마씨유 또는 호두유인, 용도.
  16. 제15항에 있어서,
    지방산이 라우르산(C12:0), 미리스트산(C14:0), 미리스트올레산(C14:1), 팔미트산(C16:0), 팔미트올레산(C16:1), 스테아르산(C18:0), 올레산(C18:1), 아리키드산(C20:0), 11-에이코센산 또는 곤도산(C20:1), 도코산산(C22:0) 및 에루크산 또는 브라씨드산(C22:1)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
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