CN113614242A - 4-氰基苯甲酸或其盐的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用腈水解酶作为催化剂由对苯二腈产生4‑氰基苯甲酸或其盐的方法以及含有4‑氰基苯甲酸的组合物。

Description

4-氰基苯甲酸或其盐的生产方法

发明领域

本发明涉及使用腈水解酶作为催化剂由对苯二腈生产4-氰基苯甲酸、4-氰基苯甲酸铵或其盐的方法以及含有4-氰基苯甲酸的组合物。

发明描述

腈水解酶是一类催化腈的水合以产生羧酸的酶。在过去的五十年中，描述了各种生产腈水解酶的生物体，包括细菌、丝状真菌、酵母和植物且部分这些微生物细胞工厂用于以工业规模商业生产羧酸。使用腈水解酶的烟酸和(R)-扁桃酸工业生产的成功证明了腈水解酶的巨大经济潜力(Gong等.Microbial Cell Factories 2012，11，142-145)。

4-氰基苯甲酸是合成属于

二唑苯甲酰胺类的不同杀真菌剂的常见构建模块。

现有技术中已经描述了对苯二腈的选择性酶催水合以产生4-氰基苯甲酸(铵)，然而，催化该反应的腈水解酶的量有限，而且通常4-氰基苯甲酸(铵)的生产率和纯度几乎不能满足工业应用。

文献中已经报道了对苯二腈的酶催和化学水解为4-氰基苯甲酸(铵)。腈类的催化水合产生羧酸可以通过腈水解酶或通过生物催化级联(包括腈水合酶，然后是酰胺酶)实现。

玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、马红球菌(Rhodococcus equi)和黑曲霉(Aspergillus niger)已通过腈水合酶-酰胺酶级联用作全细胞生物催化剂(Martinkova等，Biotech.Lett.1995，11，1219-1222；Bengis-Garber等，TetrahedronLett.，1988，29，2589-2590；

等，J.Mol.Cat.B：Enz.2004 29 227–232)。在这些报告中，将非常低浓度的对苯二腈(2-4mM)以高产率(70-95％)转化为4-氰基苯甲酸。提高底物浓度(25mM)的尝试导致产率较低(62％)(Crosby J.Chem.Soc.Perkin Trans.1994，1，1679-1686)。还将来自玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的腈水解酶分离、纯化并用作催化剂而在低浓度(6mM)下直接将腈水解成羧酸(Kobayashi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.1988，29，231-233)。最近公开的专利(CN107641622，2018)声称使用不同的腈水解酶(来自泛菌属(Pantoea sp.)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，敏捷氢单胞菌(Acidovorax facilis)，瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)，甘蓝(Brassicaoleracea)和亚麻荠(Camelina sativa))以高浓度(100g/L)和产率(86-95％)生产4-氰基苯甲酸(铵)。在该专利中，生物转化在磷酸盐缓冲液和DMSO(90:10)的混合物中使用相对高的酶浓度进行。

还可以用氢氧化钠在80℃下，然后用亚硝酸钠、乙酸和乙酸酐加成，进行选择性化学水解对苯二腈。4-氰基苯甲酸可以以72％的产率和95％的纯度分离出来(US6433211)。

本发明提供了催化由对苯二腈至4-苯甲酸(铵)的反应的腈水解酶，特别是在高底物浓度下以高产率和高纯度催化该反应的腈水解酶。

本发明的腈水解酶催化作为主要反应的对苯二腈至4-氰基苯甲酸的转化。第二个腈基的进一步水解会产生作为不需要副产物的对苯二甲酸。应避免过量对苯二甲酸，因为在后续工艺步骤中难以移除对苯二甲酸。因此，减少反应混合物中的对苯二甲酸含量改善方法的经济可行性，因为它导致商品成本的降低和较少工艺操作。

因此，本发明进一步提供具有高4-苯甲酸含量和低对苯二甲酸含量的组合物。

发明详述

本发明的一个目的是提供具有较高活性，优选较高比活性并且在含水介质中在较短时间内产生较高产物浓度的腈水解酶，优选在比现有技术中描述的短的温育时间之后。

因此，本发明的一个实施方案为能够催化包含水、腈水解酶和对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸(铵)的含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸(铵)的反应的分离的腈水解酶，其中温育后含水介质中4-氰基苯甲酸(铵)的浓度是至少5％或5,5％(w/w)，优选至少6％或6,5％，优选至少7％或7,5％，优选至少8％或8,5％，优选至少9％或9,5％，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％并且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。

在本发明的另外实施方案中，分离的腈水解酶包含选自由如下组成的组的序列：

SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸分子，和

与SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸分子具有至少40％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和由SEQ ID NO：1、3、5或7的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由与SEQ ID NO：1、3、5或7具有至少40％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5或7的至少250个碱基的片段杂交，其中如b.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸(铵)的反应，

其中温育后含水介质中4-氰基苯甲酸的浓度是至少9％或9,5％(w/w)，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％并且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。

本发明的又一实施方案是一种用于产生4-氰基苯甲酸或其盐的方法，所述方法包括如下步骤：

i.提供包含水、一种或多种腈水解酶和对苯二腈的含水介质，

ii.温育含水介质，和

iii.任选地从反应混合物分离4-氰基苯甲酸或其盐，

其中一种或多种腈水解酶能够催化包含水、腈水解酶和对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸铵的含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应，其中温育后含水介质中4-氰基苯甲酸的浓度是至少5％或5,5％(w/w)，优选至少6％或6,5％，优选至少7％或7,5％，优选至少8％或8,5％，优选至少9％或9,5％(w/w)，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％并且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。

在本发明的方法的一个实施方案中，腈水解酶包含选自由如下组成的组的序列：

a.SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸分子，和

b.与SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和

c.由SEQ ID NO：1、3、5或7的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由与SEQ ID NO：1、3、5或7具有至少70％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5或7的至少250个碱基的片段杂交，其中如b.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化包含水、腈水解酶和对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸铵的含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应，

其中温育后含水介质中4-氰基苯甲酸的浓度是至少5％或5,5％(w/w)，优选至少6％或6,5％，优选至少7％或7,5％，优选至少8％或8,5％，优选至少9％或9,5％(w/w)，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％并且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。

本发明的一个实施方案是一种用于产生4-氰基苯甲酸(铵)的方法，所述方法包括如下步骤：

提供包含水的含水介质或具有pH 4至9的缓冲液、一种或多种腈水解酶和对苯二腈，

温育含水介质，和

任选地从反应混合物分离4-氰基苯甲酸(铵)，

其中一种或多种腈水解酶选自由如下组成的组：

SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少40％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少40％同一性，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子具有使对苯二腈转化成4-氰基苯甲酸(铵)的活性，和

其中温育后含水介质中4-氰基苯甲酸(铵)的浓度是至少5％或5,5％(w/w)，优选至少6％或6,5％，优选至少7％或7,5％，优选至少8％或8,5％，优选至少9％或9,5％(w/w)，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％并且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。

在表1中列出SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、18、20和22的氨基酸分子的功能性变体的实例，其与相应SEQ ID具有某种同一性。进一步地，列出了相应核酸的SEQ ID，所述核酸编码相应的功能性变体氨基酸分子。

表1

含水介质可以是溶液或悬浮液或溶液和悬浮液，其中所述含水介质中包含的任何物质可以完全或部分溶解和/或部分或完全悬浮。

含水介质优选进一步包含二价阳离子，例如Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺或Co²⁺。优选地，二价阳离子是Mg²⁺或Mn²⁺，最优选地，二价阳离子是Mg²⁺。

二价阳离子的浓度可以是1mM至500mM，例如10mM至450mM。优选地，二价阳离子的浓度在20mM和400mM之间，优选在30mM和300mM之间，更优选在40mM和250mM之间，更优选在40mM和200mM之间，最优选在40mM和150mM之间。

在一个用于产生4-氰基苯甲酸(铵)的方法的优选实施方案中，温育在10℃至50℃，优选15℃至40℃，更优选20℃至40℃，甚至更优选24℃至37℃，甚至更优选28℃至36℃，甚至更优选29℃至24℃，最优选30℃至33℃下进行。

在一个优选的实施方案中，温育进行30分钟至48小时，优选1小时至36小时，更优选2小时至24小时，最优选3小时至15小时。

在一个用于产生4-氰基苯甲酸(铵)的方法的优选实施方案中，使用分批法进行该方法。

在本发明的方法开始时，含水介质可以包含至少0.05％对苯二腈，优选至少0.1％对苯二腈，更优选至少0.5％对苯二腈，最优选至少1.0％对苯二腈(w/w)。在整个温育期间，可以通过连续供入对苯二腈，使对苯二腈的浓度保持在约0.5％至1.5％，优选约1.0％对苯二腈的浓度下。

作为替换，含水介质中对苯二腈的浓度可以在温育开始时在1重量％和30重量％之间(包括1重量％和30重量％)，优选在5重量％和10重量％之间(包括5重量％和10重量％)，甚至更优选在6重量％和9重量％之间(包括6重量％和9重量％)，最优选在7重量％和8.5重量％之间(包括7重量％和8.5重量％)。

含水介质的温育时间可以是至少2小时、至少5小时、至少10小时或至少12小时。优选地，温育时间是至少18小时，例如约24小时或约30小时。更优选地，温育时间是约36小时或约42小时。最优选地，温育时间是约48小时。取决于使用的腈水解酶和所述腈水解酶的反应速率，温育时间还可以超过48小时。

可以将含水介质在至少15℃、至少20℃、至少24℃或至少28℃下温育。优选地，将含水介质在27℃和38℃之间(包括27℃和38℃)温育。最优选地，将含水介质在30℃下温育。也可以将含水介质在31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃下温育。

在一个优选的实施方案中，使用分批法进行该方法。

在一个用于产生4-氰基苯甲酸(铵)的方法的优选实施方案中，在温育之后将酸如HCl、H₂SO₄或H₃PO₄等加入含水介质，从而将所得4-氰基苯甲酸(铵)转移至各酸，这导致酸的沉淀，促进产物的快速和容易分离。

本发明的方法中使用的腈水解酶可以从天然表达所述腈水解酶的生物分离。作为替换，可以通过加入包含腈水解酶的细胞或通过加入包含灭活细胞、例如已破碎细胞的悬浮液，将所述腈水解酶加入含水介质。在本发明的另一实施方案中，可以在从异源构建体表达本发明的腈水解酶的重组生物，优选微生物中产生腈水解酶。可以从重组生物分离如此产生的腈水解酶并加入含水介质，或可以通过使细胞灭活(例如，破坏)并且加入悬浮液，加入腈水解酶。

可以例如通过干燥，至少部分浓缩细胞或包含灭活细胞的悬浮液，然后加入本发明方法中所用的含水介质或加入本发明的组合物。

腈水解酶可以(部分地)固定化，例如包埋于凝胶中或它可以例如作为游离的细胞悬浮液使用。为了固定化，可以应用熟知的标准方法，例如捕集交联如戊二醛-聚乙烯亚胺(GA-PEI)交联、交联于基质和/或载体结合等，包括前述方法的变形和/或组合。作为替换，可以提取腈水解酶并且例如可以直接用于制备铵盐或酸的方法中。当使用灭活或部分灭活的细胞时，可以通过热或化学处理，灭活这类细胞。

本发明的又一实施方案是分离的腈水解酶，其包含选自由如下组成的组的序列：

SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少40％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少40％同一性，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如b.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸(铵)的反应。

本发明的又一实施方案是一种包含腈水解酶的重组构建体，其中腈水解酶选自由如下组成的组：

SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和

与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少40％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少40％同一性，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸(铵)的反应。

所述重组构建体可以整合入用于产生和分离相应腈水解酶的生物的基因组中，或可以从载体如质粒或病毒载体表达腈水解酶，其中将所述载体引入用于产生和分离所述腈水解酶的生物。

重组构建体中的腈水解酶可以功能性连接于异源启动子、异源终止子或任何其他异源遗传元件。

本发明的又一实施方案是一种重组载体，例如包含所述重组构建体的表达载体或病毒载体。

包含所述重组构建体或所述重组载体的重组微生物也是本发明的一个实施方案。

在一些实施方案中，重组微生物是原核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞和革兰氏不定细菌细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞。

因此，可以在本发明中使用的微生物包括但不限于氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、带马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(Achromobacterlacticum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、肿大节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、天牛金杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacter indicus)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄短杆菌(Brevibacterium flavum)、球形短杆菌(Brevibacterium globosum)、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、创伤短杆菌(Brevibacterium helcolum)、极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)、需土短杆菌(Brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、Brevibacteriumimmariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacteriumprotopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、奇异黄杆菌(Flavobacteriumperegrinum)、染色黄杆菌(Flavobacterium fucatum)、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、塞沃尼黄杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜败血黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏变形菌(Morganella morganii)、灰暗诺卡菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌(Proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas jluorescens)、卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)ATCC 15592、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)ATCC19070、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、乳酪弧菌(Vibriotyrogenes)、马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)、紫产色放线菌(Actinomycesviolaceochromogenes)、白丝北里孢菌(Kitasatosporia parulosa)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅黄链霉菌(Streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)、抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、薛氏沙门氏菌(Salmonella schottmulleri)、柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)、集胞藻属物种(Synechocystis sp.)、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、细长热聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)，普通念珠藻(N.commune)、球形念珠藻(N.sphaericum)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)、勃那特螺旋藻(Spirulina platensis)、巨大鞘丝藻(Lyngbyamajuscula)、赖氏鞘丝藻(L.lagerheimii)、纤细席藻(Phormidium tenue)、鱼腥藻属物种(Anabaena sp.)和瘦鞘丝藻属物种(Leptolyngbya sp.)等。

在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，如例如酵母属(Saccharomyces)物种，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；汉逊酵母属(Hansenula)物种，如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；裂殖酵母(Schizosaccharomyces)物种，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；耶罗维亚酵母属(Yarrowia)物种，如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；毕赤酵母属(Pichia)物种，如甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，树干毕赤酵母(Pichia stipites)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；接合酵母属(Zygosaccharomyces)物种，如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、假丝酵母属(Candida)物种，如博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)；产朊假丝酵母(Candida utilis)；Candida freyschussii，光滑假丝酵母(Candida glabrata)和Candida sonorensis、许旺酵母属(Schwanniomyces)物种，如西方许旺酵母属(Schwanniomyces occidentalis)；阿氏酵母属(Arxula)物种，如解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)；Ogataea属物种如Ogataea minuta、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。

表达本发明的腈水解酶中任一个的以下属的微生物是本发明的另外实施方案：睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)、悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、Candidatus Dadabacteria bacterium、Tepidicaulis marinus、维氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)、根瘤菌属(Rhizobium)物种、聚球蓝细菌属(Synechococcussp.)CC9605、Tatumella morbirosei、Flavihumibacter solisilvae或沙班盐水球形菌(Salinisphaera shabanensis)E1L3A。

本发明的又一实施方案是一种用于产生腈水解酶的方法，所述方法包括步骤:

a)提供表达至少一种本发明的腈水解酶的重组微生物或天然表达本发明的腈水解酶的微生物，和

b)在允许所述腈水解酶基因表达的条件下培育所述微生物，和

c)任选地从所述微生物分离本发明的腈水解酶。

本发明的另外实施方案是一种包含水、腈水解酶、对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸(铵)的组合物，其中腈水解酶选自由如下组成的组：

SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少40％同一性的氨基酸分子，和由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少40％同一性，和由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸(铵)的反应。

氨基酸A类似于氨基酸S

氨基酸D类似于氨基酸E；N

氨基酸E类似于氨基酸D；K；Q

氨基酸F类似于氨基酸W；Y

氨基酸H类似于氨基酸N；Y

氨基酸I类似于氨基酸L；M；V

氨基酸K类似于氨基酸E；Q；R

氨基酸L类似于氨基酸I；M；V

氨基酸M类似于氨基酸I；L；V

氨基酸N类似于氨基酸D；H；S

氨基酸Q类似于氨基酸E；K；R

氨基酸R类似于氨基酸K；Q

氨基酸S类似于氨基酸A；N；T

氨基酸T类似于氨基酸S

氨基酸V类似于氨基酸I；L；M

氨基酸W类似于氨基酸F；Y

氨基酸Y类似于氨基酸F；H；W

与SEQ ID NO：1至22的序列中任一个具有某种同一性的氨基酸分子和核酸分子包括与SEQ ID NO：1至22中任一个具有40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的核酸分子和氨基酸分子。

优选地，与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、20和22的腈水解酶具有某种同一性的腈水解酶氨基酸序列包含一些保守性氨基酸置换，优选优势地包含保守性氨基酸置换，更优选仅包含保守性氨基酸置换。保守性置换是其中一个氨基酸与相似氨基酸交换的那些。为了确定相似性％，以下适用，这也根据BLOSUM62矩阵适用，所述矩阵是最常用于数据库检索和序列比对的氨基酸相似性矩阵之一：

保守性氨基酸置换可以出现在功能蛋白质如酶的多肽序列的全长序列范围内。在一个实施方案中，这类突变不涉及酶的功能性域。在一个实施方案中，保守性突变不涉及酶的催化中心。

选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、20和22的氨基酸分子的功能性片段包含至少100个氨基酸，优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，更优选至少250个氨基酸，最优选至少300个氨基酸。

本发明的另一实施方案为由如下组成的组合物：

95,0-99,5重量％，优选95,0-99,25重量％，优选95,0-99,0重量％，更优选96,0-99,5重量％，更优选97,0-99,5重量％，更优选97,25-99,5重量％，更优选97,5-99,5重量％，更优选97,75-99,5重量％，甚至更优选96,0-99,25重量％，更优选97,0-99,0重量％，更优选97,25-99,0重量％，更优选97,5-98,5重量％，甚至更优选97,75-98,25重量％，甚至更优选97,9-98,1重量％，甚至更优选97,0-99,5重量％，最优选97,3-99,25重量％4-氰基苯甲酸，0,0-0,5重量％对苯二甲酸，优选0,0-0,45重量％，更优选0,0-4,0重量％，甚至更优选0,0-0,35重量％，甚至更优选0,0-0,3重量％，甚至更优选0,1-0,5重量％对苯二甲酸，优选0,1-0,45重量％，甚至更优选0,1-0,4重量％，甚至更优选0,1-0,35重量％，甚至更优选0,1-0,3重量％，甚至更优选0,2-0,5重量％对苯二甲酸，甚至更优选0,2-0,45重量％，甚至更优选0,2-0,4重量％，甚至更优选0,2-0,35重量％，甚至更优选0,2-0,3重量％，甚至更优选0,3-0,5重量％，甚至更优选0,3-0,45重量％，甚至更优选0,3-0,4重量％，甚至更优选0,3-0,35重量％，甚至更优选0,3-0,325重量％，最优选0,275-0,325重量％对苯二甲酸，0,2-1,5重量％氯化物，优选0,2-1,25重量％，更优选0,2-1,0重量％，更优选0,3-1,5重量％氯化物，优选0,3-1,25重量％，更优选0,3-1,0重量％，更优选0,25-1,5重量％，优选0,25-1,25重量％，更优选0,25-1,0重量％氯化物，至多0,3重量％水，优选至多0,2重量％水，优选至多0,1重量％水，优选至多0,05重量％水，优选0,05-0,2重量％水，优选0,075-0,2重量％，更优选0,1-0,2重量％，甚至更优选0,05-0,3重量％，优选0,075-0,3重量％，更优选0,1-0,3重量％水，和任选地至多4,8重量％其他组分。其他组分包括例如铵、磷酸盐、对苯二腈或发酵过程中的污染物。总之，各组分的总和为100％。

本发明的另一实施方案为由如下组成的组合物：95,0-97,0重量％4-氰基苯甲酸，优选95,25-97,0重量％，优选95,5-97,0重量％，优选95,75-97,0重量％4-氰基苯甲酸，更优选95,0-96,75重量％，更优选95,0-96,5重量％，更优选95,0-96,25重量％4-氰基苯甲酸，甚至更优选95,25-96,75重量％，更优选95,5-96,5重量％，更优选95,75-96,25重量％4-氰基苯甲酸，0,0-0,5重量％对苯二甲酸，优选0,0-0,45重量％，更优选0,0-4,0重量％，甚至更优选0,0-0,35重量％，甚至更优选0,0-0,3重量％，甚至更优选0,1-0,5重量％对苯二甲酸，优选0,1-0,45重量％，甚至更优选0,1-0,4重量％，甚至更优选0,1-0,35重量％，甚至更优选0,1-0,3重量％，甚至更优选0,2-0,5重量％对苯二甲酸，甚至更优选0,2-0,45重量％，甚至更优选0,2-0,4重量％，甚至更优选0,2-0,35重量％，甚至更优选0,2-0,3重量％，甚至更优选0,3-0,5重量％对苯二甲酸，甚至更优选0,3-0,45重量％，甚至更优选0,3-0,4重量％，甚至更优选0,3-0,35重量％，甚至更优选0,3-0,325重量％，最优选0,275-0,325重量％对苯二甲酸，0,3-1,5重量％铵，优选0,35-1,25重量％，更优选0,4-1,0重量％，甚至更优选0,5-0,75重量％，甚至更优选0,55-0,7重量％，最优选0,55-0,65重量％铵，2,0-0,4重量％硫酸盐，优选2,25-0,375重量％，更优选2,5-3,5重量％，甚至更优选2,75-3,25重量％，最优选2,9-3,2重量％硫酸盐，0,4-1,0重量％钠，优选0,5-0,9重量％，更优选0,6-0,8重量％，甚至更优选0,65-0,75重量％钠，和任选地至多2,3重量％其他组分。其他组分包括例如水、氯化物、磷酸盐、对苯二腈或发酵过程中的污染物。总之，各组分的总和为100％。

本发明的另一实施方案为制备含有如下的水溶液的方法：

至少5％或5,5％(w/w)，优选至少6％或6,5％，优选至少7％或7,5％，优选至少8％或8,5％，优选至少9％或9,5％(w/w)，优选至少10％、10,5％、11％、11,5％、12％、12,5％，更优选至少13％或13,5％，甚至更优选至少14％或14,5％，最优选至少15％4-氰基苯甲酸(铵)且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)，优选低于0,9％、0,8％、0,7％，更优选低于0,6％，最优选低于0,5％。且对苯二甲酸的浓度低于0,5重量％，优选低于0,45重量％，更优选低于0,4重量％，甚至更优选低于0,35重量％，甚至更优选浓度0,29-0,31重量％，

包括如下步骤：

提供包含水、一种或多种腈水解酶和对苯二腈的含水介质，和温育含水介质，

其中腈水解酶能够在含水介质中催化对苯二腈至4-氰基苯甲酸的反应。

在本发明的方法的一个实施方案中，含水介质进一步包含二价阳离子。二价阳离子可例如为Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+或Co2+中的一种或多种。

二价阳离子可具有1-500mM，例如10-450mM的浓度。优选二价阳离子的浓度在20mM和400mM之间，优选在30mM和300mM之间，更优选在40mM和250mM之间，更优选在40mM和200mM之间，最优选在40mM和150mM之间。

在用于产生4-氰基苯甲酸(铵)的方法的一个优选实施方案中，温育在10-50℃下，优选在15℃至40℃下，更优选在20℃至40℃下，甚至更优选在24℃至37℃下，甚至更优选在28℃至36℃下，甚至更优选在29℃至24℃下，最优选在30℃至33℃下进行。

在一个优选实施方案中，温育进行30分钟至48小时，优选1小时至36小时，更优选2小时至24小时，最优选3小时至15小时。

在本发明的方法开始时，含水介质可包含至少0,05％对苯二腈，优选至少0,1％对苯二腈，更优选至少0,5％对苯二腈，最优选至少1,0％对苯二腈(w/w)。在整个温育中，可以通过连续供入对苯二腈，使对苯二腈的浓度保持在约0.5％至1.5％，优选约1.0％对苯二腈的浓度下。

作为替换，温育开始时含水介质中的对苯二腈浓度可在1-30重量％之间(包括1重量％和30重量％)，优选在5-10重量％之间(包括5重量％和10重量％)，甚至更优选在6-9重量％之间(包括6重量％和9重量％)，最优选在7-8,5重量％之间(包括7重量％和8,5重量％)。

含水介质的温育时间可以是至少2小时，至少5小时，至少10小时或至少12小时。更优选温育时间为至少18小时，例如约24小时或约30小时。更优选温育时间为约36小时或约42小时。最优选温育时间为约48小时。取决于所用的腈水解酶和所述腈水解酶的反应速率，温育时间还可超过48小时。

含水介质可以在至少15℃、至少20℃、至少24℃或至少28℃下温育。优选含水介质在27℃至38℃之间(包括27℃和38℃)温育。最优选含水介质在30℃下温育。含水介质还可在31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃下温育。

在本发明的方法的一个实施方案中，通过在温育期间或在温育后向含水介质中加入酸而将含水介质的pH值调节至低于5。

在本发明的方法的一个实施方案中，温育后通过过滤或离心分离产物。

在本发明的方法的一个实施方案中，腈水解酶通过发酵产生。

定义

应当理解，本发明不限于具体的方法或方案。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓。因此，例如，对“一种载体”的称谓是对一种或多种载体的称谓并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语“约”在本文中用来指大约、大致、左右和在……范围内。当术语“约”与一个数字范围联合使用时，它通过扩展界限值高于和低于所述数值而修饰该范围。通常而言，术语“约”在本文中用来通过20％，优选10％之上或之下(更高或更低)波动而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用，词汇“或”意指特定列出的任何一成员并且还包括该列出的成员的任意组合。在本说明书中及以下权利要求中使用时，词汇“包含(comprise，comprising)”、“包括(include，including，includes)”意图指明一个或多个所述特征、整数、组分或步骤的存在，但是它们不排除一个或多个其他特征、整数、组分、步骤或其组的存在或添加。为清晰起见，将本说明书中使用的某些术语如下定义并使用。

编码区：如本文中所用，术语“编码区”在提及结构基因使用时，指编码在作为mRNA分子翻译结果的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5'侧以编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界，原核生物也使用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3'侧，其以指定终止密码子的三种三联体(即TAA、TAG、TGA)之一为界。此外，基因可以包含位于RNA转录物中存在的序列的5'端及3'端二者上的序列。这些序列称作“侧翼”序列或区(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'-侧翼区可以含有控制或影响基因转录的调节序列如启动子和增强子。3'-侧翼区可以含有指导转录终止、转录后剪切和聚腺苷酸化的序列。

互补的：“互补的”或“互补性”指包含反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，其中一旦在反平行核苷酸序列中的互补性碱基残基之间形成氢键，则所述反平行核苷酸序列能够相互配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补性是其中一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则未匹配的情况。核酸分子之间的“全部”或“完全”互补性是其中每个核酸碱基按照碱基配对规则与另一碱基匹配的情况。核酸分子链之间互补性的程度对核酸分子链之间杂交的效率和强度具有明显影响。如本文中所用的核酸序列“互补物”指这样的核苷酸序列，其核酸分子显示与该核酸序列的核酸分子的全部互补性。

内源：“内源”核苷酸序列指存在于野生型微生物的基因组中的核苷酸序列。

增强的表达：“增强”或“增加”核酸分子在微生物中的表达等同地用于本文中，并且意指与参考微生物(例如野生型)相比，核酸分子在微生物中的表达水平更高。如本文中所用的术语“增强”或“增加”意指待表达的核酸分子的更高，优选显著更高的表达。如本文中所用，“增强”或“增加”某物质(如蛋白质、mRNA或RNA)的水平意指相对于基本上相同条件下生长的基本上相同的微生物，该水平增加。如本文中所用，“增强”或“增加”某物质(例如由靶基因表达的前RNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由其编码的蛋白质产物)的水平意指，相对于合适的参考微生物，该水平增加50％或更多，例如100％或更多，优选200％或更多，更优选5倍或更多倍，甚至更优选10倍或更多倍，最优选20倍或更多倍，例如50倍。可以通过技术人员熟悉的方法测定所述增强或增加。因而，可以例如通过蛋白质的免疫学检测法确定核酸或蛋白质数量的增强或增加。另外，可以使用技术如蛋白质测定法、荧光法、RNA杂交法、凝胶中核酸浓度的光密度测量、核酸酶保护测定法、逆转录法(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、蛋白质印迹法、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活的细胞分析(FACS)来测量微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导蛋白质产物的类型，也可以确定其活性或对微生物的表型的影响。用于确定蛋白质数量的方法是技术人员已知的。可以提到的实例是：微量Biuret法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5:218-222)、Folin-Ciocalteau法(Lowry OH等，(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250的吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。

表达：“表达”指基因产物的生物合成，优选指细胞中核苷酸序列例如内源基因或异源基因的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA并且任选地随后mRNA翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅指携带RNA分子的DNA的转录。

外来：术语“外来”指任何核酸分子(例如基因序列)，所述核酸分子通过实验操作引入细胞中并且可以包含该细胞中存在的序列，只要引入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在可选择标记基因等)和因此相对于天然存在序列是不同的。

功能性片段：术语“功能性片段”指分别仅包含全长核酸序列或全长氨基酸序列的一部分，但仍然具有相同或相似活性和/或功能的任何核酸或氨基酸序列。在一个实施方案中，该片段包含至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的原始序列。在一个实施方案中，分别与原始核酸或原始氨基酸序列相比，功能性片段包含连续的核酸或氨基酸。

功能性连接：将术语“功能性连接”或“功能性连接的”等同于术语“有效连接”或“有效地连接”并且应理解为意指例如调节性元件(例如启动子)与待表达的核酸序列并且如果合适，与其他调节性元件(例如终止子)以使得每种调节性元件可以实施其目的功能以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达的方式依次排列。作为同义词，可以使用词汇“有效连接”或“有效连接的”。取决于核酸序列的排列，表达可以产生有义或反义RNA。为此目的，不是必需要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从远离的位置或甚至从其它DNA分子对靶序列产生其作用。优选的排列是其中待表达的核酸序列重组地位于充当启动子的序列之前，使得这两个序列相互共价地连接的那些。在一个优选的实施方案中，待转录的核酸序列以使得转录起点与本发明的嵌合RNA的合乎需要的开端相同的方式位于启动子之前。可以借助如(例如，Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)；Silhavy等，(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等，(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Gelvin等，(编著)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands)所述的惯用重组和克隆技术产生功能性连接和表达构建体。然而，其他序列，例如充当带限制性酶特定切割位点的接头或充当信号肽的序列，也可以位于这两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白表达。优选地，由调节性区域例如启动子和待表达核酸序列的连接组成的表达构建体可以按载体整合的形式存在或可以被插入基因组，例如通过转化插入。

基因：术语“基因”指与能够以某种方式调节基因产物(例如多肽或功能性RNA)表达的适宜调节序列有效连接的区域。基因包括DNA中位于编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的非翻译调节区(例如启动子、增强子、阻抑物等)。如本文中所用的术语“结构基因”意指转录成mRNA的DNA序列，所述mRNA随后翻译成表征特定多肽的氨基酸序列。

基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传信息。所述基因组DNA包含拟核的DNA，还包括自我复制型质粒的DNA。

异源：就核酸分子或DNA而言，术语“异源”指这样的核酸分子，所述核酸分子有效连接于或受到操作以变成有效连接于自然界中不与该核酸分子有效连接或自然界中与该核酸分子在不同位置有效连接的第二种核酸分子。包含核酸分子和与之连接的一个或多个调节性核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是源自实验操作的构建体，在所述构建体中，a)所述核酸分子或b)所述调节性核酸分子或c)二者(即(a)和(b))不位于其天然(原有)遗传环境中或已经因实验操作受到修饰，修饰的实例是一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物中的天然基因组座位或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分地保留该核酸分子的序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp，非常特别优选至少5,000bp序列长度。天然存在的表达构建体例如启动子与相应基因的天然存在组合-在通过非天然的合成性“人工”方法例如诱变法修饰时变成转基因表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，与启动子有效连接的编码蛋白质的核酸分子相对于该启动子视为异源，其中所述的启动子不是该核酸分子的天然启动子。优选地，异源DNA相对于导入该异源DNA的细胞不是内源的或不天然与该细胞相关，但是已经从另一种细胞获得或已经合成。异源DNA还包括含有一些修饰的内源DNA序列、不天然存在的多拷贝内源DNA序列或这样的DNA序列，该DNA序列不与同物理连接于所述DNA序列的另一个DNA序列天然接合。通常地，虽然不必然地，异源DNA编码正常情况下引入所述异源DNA的细胞不编码的RNA或蛋白质。

杂交：如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，将低严格条件选择成在定义的离子强度和pH处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度在Tm以下20℃时，并且高严格条件是当所述温度在Tm以下10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。但是，核酸可以在序列上悖离并且仍然编码基本上相同的多肽，原因在于遗传密码简并性。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。

“Tm”是在确定的离子强度和pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列在所述温度与完美匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件组合物和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高的温度下特异性杂交。最大杂交速率从低于Tm约16℃直至32℃获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且加入50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃取决于杂交分子的类型，Tm可以使用以下等式计算：

DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]–500x[L^c]^-1–0.61x％甲酰胺

DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：

T_m＝79.8℃+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：

对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)

对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)

a或对于其他一价阳离子，而仅在0.01-0.4M范围内是精确的。

b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。

c L＝双链体的长度(以碱基对计)。

^d Oligo，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非相关的探针，可以通过改变以下条件之一进行一系列杂交：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格条件的多种参数。

除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤状态一般在杂交严格性处或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交用核酸的预期长度。当杂交序列已知的核酸时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区域而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5x Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。高严格性条件的另一个实例是在65℃于包含0.1SDS和任选地5xDenhardt试剂、100μg/ml变性片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1xSSC中杂交，随后在65℃于0.3xSSC中的洗涤。

出于定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：alaboratory manua，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。

“同一性”：在比较两个或多个核酸或氨基酸分子使用时，“同一性”意指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。

酶变体可以由它们与亲本酶相比时的序列同一性定义。序列同一性通常作为“序列同一性％”或“同一性％”提供。为了确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数，在第一步骤中，在这两个序列之间生成配对序列比对结果，其中将两个序列在其整个长度范围内比对(即配对的全局比对)。用实施Needlem和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)的程序，优选通过使用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS))，采用程序默认参数(空位开口＝10.0、空位延伸＝0.5和矩阵＝EBLOSUM62)，生成比对结果。用于本发明目的的优选比对是从中可以确定最高序列同一性的比对。

以下实例意在说明两个核苷酸序列，但是相同的计算适用于蛋白质序列：

Seq A：AAGATACTG长度：9个碱基

Seq B：GATCTGA长度：7个碱基

因此，较短序列是序列B。

产生在其整个长度范围内显示两个序列的两两全局比对产生了

比对结果中的“I”符号表示相同的残基(其意指DNA的碱基或蛋白质的氨基酸)。相同残基的数目是6。

比对结果中的“-”符号指示空位。Seq B内部因比对引入的空位数是1。通过比对引入的空位的编号在Seq B的边界处是2，并且在Seq A的边界处为1。

在其整个长度范围内显示比对序列的比对长度是10。

根据本发明产生在其整个长度范围内显示较短序列的两两比对因此产生：

根据本发明产生在其整个长度范围内显示序列A的两两比对因此产生：

根据本发明产生在其整个长度范围内显示序列B的两两比对因此产生：

在其整个长度范围内显示较短序列的比对长度是8(存在一个在较短序列的比对长度中考虑的缺口)。

因此，在其整个长度范围内显示Seq A的比对长度将是9(意指Seq A是本发明的序列)。

因此，在其整个长度范围内显示Seq B的比对长度将是8(意指Seq B是本发明的序列)。

在比对两个序列后，在第二步骤中，从产生的比对测定同一性值。为了本说明书的目的，通过以下方式计算同一性百分数：同一性％＝(相同残基/在其整个长度范围内显示本发明相应序列的比对区域的长度)*100。因此，根据这个实施方案，通过相同残基的数目除以其整个长度范围内显示本发明相应序列的比对区域的长度，计算与比较两个氨基酸序列有关的序列同一性。这个值乘以100以得出“同一性％”。根据上文提供的实例，同一性％：对于作为本发明序列的Seq A(6/9)*100＝66.7％；对于作为本发明序列的SeqB(6/8)*100＝75％。

分离：如本文中所用的术语“分离”意指材料已经通过人工取出并且离开其原来的天然环境存在并且因此不是自然界的产物。分离的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在或可以存在于非天然环境中如例如存在于转基因宿主细胞中。例如，活植细胞中存在的天然存在性核酸分子或多肽不是分离的，然而与该天然系统中一些或全部共存物质分开的相同核酸分子或多肽是分离的。此类核酸分子可以是载体的一部分和/或此类核酸分子或多肽可以是组合物的一部分，并且将是分离的，因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。优选地，术语“分离”相对于核酸分子使用时，如在“分离的核酸序列”指被鉴定并且与该核酸序列天然来源中通常与其接合的至少一种杂质性核酸分子分开的核酸序列。分离的核酸分子是这样的核酸分子，其在与自然界中找到该核酸分子的形式或环境不同的形式或环境下存在。相反，未分离的核酸分子是以其在自然界中存在的状态所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主细胞染色体上相邻基因附近找到给定的DNA序列(例如基因)；作为与编码多种蛋白质的众多其他mRNA的混合物，在细胞中找到RNA序列，如编码特定蛋白质的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括例如在细胞中通常含有SEQ ID NO：1的此类核酸序列，其中所述核酸序列处在与天然细胞的基因组位置或质粒位置相异的基因组位置或质粒位置，或否则侧翼分布有与自然界中存在的核酸序列相异的核酸序列。分离的核酸序列可以按单链或双链形式存在。当分离的核酸序列用来表达蛋白质时，该核酸序列将最少含有有义链或编码链的至少一部分(即该核酸序列可以是单链的)。作为替换，它可以含有有义链和反义链(即该核酸序列可以是双链的)。

腈水解酶：如本文所用的术语“腈水解酶”指催化从对苯二腈至4-氰基苯甲酸的反应和/或从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应的酶。它还涵盖催化除先前所提及那些反应之外的额外反应的酶。

非编码的：术语“非编码的”指核酸分子中不编码所表达蛋白质的部分或全部的序列。非编码序列包括但不限于增强子、启动子区、3'非翻译区和5'非翻译区。

核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括处于单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸类似物和聚合物或杂合体。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“核酸分子”互换地使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，包括但不限于5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、胞嘧啶环外环胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶置换等；和2'-位置糖修饰，包括不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH由选自H、OR、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替换。短发夹RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然碱基，例如，肌苷和黄嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然的磷酸二酯键，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。

核酸序列：短语“核酸序列”指从5'-端至3'-端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制型质粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要发挥结构性作用的DNA或RNA。“核酸序列”也指代表核苷酸的缩写、字母、字符或字的连续串。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，所述探针是相对短的核酸，通常长度小于100个核苷酸。经常地，核酸探针具有约50个核苷酸长度至约10个核苷酸长度。核酸的“靶区域”是核酸中被鉴定为有目标的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，其中置于适宜的调节性序列控制下时，所述部分以序列特异性方式转录和翻译以产生特定的多肽或蛋白质。称该编码区编码这种多肽或蛋白质。

寡核苷酸：术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的低聚物或聚合物，以及具有类似发挥作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增强的细胞摄取、增强的核酸靶亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性而经常优选胜过其天然形式。寡核苷酸优选包括通过键(例如磷酸二酯键)或取代键(substitute linkage)相互共价偶联的两个或多个核苷酸单体(nucleomonomer)。

突出端：“突出端”是双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基端上相对短的单链核苷酸序列(也称作“延伸”、“伸出端”或“粘末端”)。

多肽：术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在文中可互换地使用，用来指连续氨基酸残基的聚合物或低聚物。

启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同物并且如本文中所用的，指与目的核苷酸序列有效连接时能够控制目的核苷酸序列转录成RNA的DNA序列。启动子位于由该启动子控制转录成mRNA的目的核苷酸序列的5'(即上游)，靠近其转录起始位点，并且为RNA聚合酶和用于转录起始的其他转录因子的特异性结合提供位点。启动子不包括编码区或5′非翻译区。启动子可以例如相对于相应细胞为异源或同源。如果某核酸分子序列源自外来物种，或如果来自相同物种，但自其原初形式中受到修饰，则它相对于某生物或第二核酸分子序列为“异源”。例如，与异源编码序列有效连接的启动子指编码序列来自不同于衍生该启动子的物种中，或者，如果来自相同物种，该编码序列与该启动子不天然接合(例如基因修饰的编码序列或来自不同生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以衍生自其中应当出现表达的宿主细胞的基因或衍生自该宿主的病原体。

纯化的：如本文中所用，术语“纯化的”指从其天然环境取出、分离或分开的分子，即核酸序列或氨基酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％没有，优选至少75％没有和更优选至少90％没有与它们天然结合在一起的其他组分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。

明显增加：酶活性、基因表达、某产物的生产率或产率的增加大于测量技术中固有的误差幅度，优选对照酶的活性、表达、生产率或产率或对照细胞中的表达、对照细胞的生产率或产率增加约10％或25％，优选50％或75％，更优选2倍或5倍或更大，甚至更优选增加约10倍或更大。

明显减少：酶活性、基因表达、某产物的生产率或产率的减少大于测量技术中固有的误差幅度，优选减少至少约5％或10％，优选至少约20％或25％，更优选至少约50％或75％，甚至更优选至少约80％或85％，最优选至少约90％、95％、97％、98％或99％。

基本上互补的：在最广意义上，本文中就核苷酸序列相对于参考或目标核苷酸序列而言使用时，术语“基本上互补的”意指这样的核苷酸序列，其具有在基本上互补的核苷酸序列和所述参考或目标核苷酸序列的完全互补序列之间至少60％，更希望地至少70％，更希望地至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，仍更优选至少95％或96％，仍旧更优选至少97％或98％，依旧更优选至少99％或最优选100％的同一性百分数(后者等同于本上下文中的术语“相同”)。优选地，在至少19个核苷酸长度，优选至少50个核苷酸长度、更优选核酸序列的全部长度范围内针对所述参比核苷酸序列评估同一性(如果未另外在下文说明)。使用威斯康辛大学GCG的默认GAP分析，GAP的SEQWEB应用，基于Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443-453；如上文定义)实施序列比较。与参比核苷酸序列“基本上互补的”核苷酸序列与该参比核苷酸序列在低严格性条件，优选中等严格性条件，最优选高严格性条件(如上文定义)下杂交。

转基因：如本文中所用的术语“转基因”指通过实验操作导入细胞的基因组中的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外来DNA”)。术语“内源DNA序列”指这样的核苷酸序列，其天然存在于引入该核苷酸序列的细胞中，只要它相对于天然存在序列不含有一些修饰(例如点突变、存在可选择标记基因等)。

转基因：当指生物时，术语“转基因”意指用至少一个重组核酸分子转化，优选稳定转化。

载体：如本文中所用，术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一个核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体，或“整合的载体”，所述载体可以整合至宿主细胞的基因组DNA中。另一个类型载体是游离型载体，即能够进行染色体外复制的质粒或核酸分子。本文中将能够指导与它们有效连接的基因表达的载体称作“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”互换地使用，除非从上下文并非如此。

野生型：就生物而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源”意指所述生物未经人改变、突变或否则操作过。就某多肽或核酸序列而言，其意指该多肽或核酸序列是在至少一种未经人改变、突变或否则操作过的天然存在生物中天然存在的或可获得的。

微生物的野生型指这样的微生物，其基因组以引入对某基因的基因修饰之前的状态存在。基因修饰可以是例如基因或其部份的缺失或点突变或引入基因。

术语“产量”或“生产率”是本领域认可的并且包括在给定时间和给定发酵体积内形成的发酵产物(例如dsRNA)的浓度(例如kg产物/每小时每升)。术语“生产效率”包括为实现特定生产水平必备的时间(例如细胞耗费多长时间达到精细化学品的特定产出率)。

术语“产率”或“产物/碳产率”是本领域认可的并且包括碳源转化成产物(即精细化学品)的效率。这通常书写为例如kg产物/kg碳源。通过增加化合物的产率或产量，增加历经给定量的时间在给定量的培养物中的已回收分子数量或这种化合物的有用的已回收分子数量。

术语“重组微生物”包括这样的微生物，所述微生物已经受到基因修饰，从而如与其从中衍生的野生型微生物相比，它们显示出改变或不同的基因型和/或表型(例如当基因修饰影响微生物的编码性核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组核酸分子。

就核酸分子而言，术语“重组”指由人使用重组核酸技术产生的核酸分子。该术语包括本身不存在于自然界中或不存在于衍生该核酸分子的生物中，但经人修饰、改变、突变或否则操作过的核酸分子。优选地，“重组核酸分子”是在序列方面与天然存在的核酸分子有至少一个核酸不同的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”也可以包括“重组构建体”，其包含不天然地以这种顺序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子优选有效地连接。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变法、基因合成或重组技术。

这种重组核酸分子的实例是已经向其中插入异源性DNA序列的质粒或与重组核酸分子衍生自的基因或启动子相比，已经突变的基因或启动子。可以通过本领域已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术如化学诱变、紫外线诱变或X射线诱变技术或定向进化技术引入突变。

本文中术语“定向进化”按照与术语“代谢进化”同义的方式使用并且包括施加有利于具有目的性状的突变体生长的选择压力。选择压力可以基于不同的培养条件、ATP和生长偶联的选择和氧化还原相关的选择。选择压力可以配合采用连续转移接种的分批发酵或采用相同压力的连续培养来实施。

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定基因载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指基因或基因载体构建体转录成mRNA。该过程包括DNA的转录并且可以包括所得RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括翻译mRNA和随后合成所编码的蛋白质，即蛋白质表达。

附图

图1显示了本发明的腈水解酶所催化的反应。

图2：通过异源大肠杆菌细胞表达睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq.ID 2)的腈水解酶的对苯二腈的生物转化。

实施例

实施例1

筛选89种潜在的腈水解酶的对苯二腈至4-氰基苯甲酸的转化活性。表1中列出18种筛选活性腈水解酶和一种非功能腈水解酶的氨基酸序列的供体生物和SEQ ID。优化腈水解酶的编码区，用于在大肠杆菌中表达，将这些序列合成并且克隆于表达载体pDHE(Stueckler等，(2010)Tetrahedron66(3-2))。

用表达载体将大肠杆菌菌株转化，诱导腈水解酶的表达并且收获培养物及如下所述测试。

表1：18种活性腈水解酶的供体生物、SEQ ID和4-氰基苯甲酸形成。

将128mg对苯二腈称入1.5mL Eppendorf管中并与pH 7的50mM磷酸盐缓冲溶液混合。为启动反应，加入50-100μL含有不同腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液并且在37℃下振摇混合物。反应管中最终对苯二腈浓度为1M。在48小时后，将全部反应混合物在DMSO中稀释。将该溶液的样品取出，在水中稀释并经受HPLC分析。各结果以在用DMSO稀释之前1mL反应混合物中存在的4-氰基苯甲酸的浓度报道。

实施例2

将1100mL水和100g对苯二腈置于反应器中。

生物催化剂以含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq.ID 2)的浓缩细胞悬浮液形式使用并且将它加入反应器，由此启动生物转化。将温度保持在37℃并且反应器由顶置搅拌器混合。将混合物搅拌21小时并由反应器中取出样品以分析4-氰基苯甲酸。图2中给出了对苯二腈转化和4-氰基苯甲酸形成的时间过程。

在生物转化后，将反应混合物由反应器中取出且滤过Celite535以移除表达腈水解酶的异源大肠杆菌细胞。加入酸，在该情况下是硫酸，以沉淀4-氰基苯甲酸，通过过滤将其由含水反应混合物中分离。干燥湿产物，直到达到恒定重量。回收111.5g 4-氰基苯甲酸。

实施例3

将128mg对苯二腈称入1.5mL Eppendorf管中并与水或pH为7的50mM磷酸盐缓冲溶液混合。为启动反应，加入50-100μL含有不同腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液并且在37℃下振摇混合物。反应管中最终对苯二腈浓度为1M。在24小时后，将全部反应混合物在DMSO中稀释。将该溶液的样品取出，在水中稀释并经受HPLC分析。各结果以在用DMSO稀释之前1mL反应混合物中存在的4-氰基苯甲酸的浓度报道。

表2：由序列ID为4(未知原核生物)、8(Candidatus Dadabacteria bacteriumCSP1-2)、6(悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi))和2(睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni))的腈水解酶以及CN107641622A中描述的六种腈水解酶Ara Nit(拟南芥(Arabidopsis thaliana))、Bras Nit(甘蓝(Brassica oleracea))、Can Nit(亚麻荠(Camelina sativa))、Panto Nit(泛菌属(Pantoea sp.)AS-PWVM4)、Acid Nit(敏捷氢单胞菌(Acidovorax facilis)72W)、Lepto Nit(瘦鞘丝藻属物种(Leptolyngbya sp.))形成的4-氰基苯甲酸。水或缓冲水溶液(50mM磷酸钾缓冲液，pH7)用作反应介质。4-氰基苯甲酸的形成在温育阶段后分析以mM给出，且还以mM/OD600给出，以在每个反应中产生的量与所施加的异源大肠杆菌生物量标准化。

实施例4

研究了向反应混合物中加入Mg²⁺离子的效果。将128mg对苯二腈称入1.5mLEppendorf管中并与水混合。由1M储备水溶液中加入MgSO₄，得到反应中MgSO₄的不同最终浓度。为启动反应，加入100μL含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq IDNo.2)的腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液并且在37℃下以1000rpm在EppendorfThermomixer中振摇混合物。反应管中最终对苯二腈浓度为1M。在23小时后，将全部反应混合物在DMSO中稀释。将该溶液的样品取出，在水中稀释并经受HPLC分析。各结果以在用DMSO稀释之前1mL反应混合物中存在的4-氰基苯甲酸的浓度报道。

表3：在生物催化反应中使用不同MgSO₄浓度时，由序列ID 2(睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni))的腈水解酶形成4-氰基苯甲酸。

当在反应中加入100mM或更多MgSO4时，4-氰基苯甲酸的浓度达到最高。在这些情况下，观测到对苯二腈的完全转化。

实施例5

与较高对苯二腈浓度组合研究了向反应混合物中加入Mg²⁺离子的效果。将128mg或256mg对苯二腈称入1.5mL Eppendorf管中并与水混合。由1M储备水溶液中加入MgSO₄，分别得到反应混合物中100或200mM MgSO₄。为启动反应，加入100μL含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq ID No.2)的腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液并且在37℃下以1000rpm在Eppendorf Thermomixer中振摇混合物。反应管中最终对苯二腈浓度分别为1M或2M。在以前限定的时间点后，将全部反应混合物在DMSO中稀释。将该溶液的样品取出，在水中稀释并经受HPLC分析。各结果以在用DMSO稀释之前1mL反应混合物中存在的4-氰基苯甲酸的浓度报道。

表4：在生物催化反应中使用不同MgSO₄浓度和不同对苯二腈浓度时，由序列ID 2(睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni))的腈水解酶形成4-氰基苯甲酸。

当反应混合物补充有200mM MgSO₄和2M对苯二腈时，产物浓度达到最高。然而，未实现2M对苯二腈的完全转化。

实施例6

在无MgSO4存在下研究温度对反应性能的影响。将约128mg对苯二腈称入1.5mLEppendorf管中并与水混合。由1M储备水溶液中加入MgSO₄，分别得到反应混合物中0或100mM MgSO₄。为启动反应，加入100μL含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq ID No.2)的腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液并且在不同温度(即20℃、25℃、30℃、37℃)下以1000rpm在Eppendorf Thermomixer中振摇混合物。反应管中最终对苯二腈浓度为约1M。在以前限定的时间点后，将全部反应混合物在DMSO中稀释。将该溶液的样品取出，在水中稀释并经受HPLC分析。各结果以在用DMSO稀释之前1mL反应混合物中存在的4-氰基苯甲酸的浓度报道。

表5：在生物催化反应中在存在或不存在MgSO₄下在不同温度下由序列ID 2(睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni))的腈水解酶形成4-氰基苯甲酸。

在37℃的反应温度下，当反应混合物补充有MgSO₄时，仅实现1M对苯二腈的完全转化。这意指在较高的反应温度下，加入Mg²⁺的有益效果更加明显。

实施例7

所施加的生物催化剂(含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(SeqID No.2)的腈水解酶的大肠杆菌细胞悬浮液)主要催化对苯二腈至4-氰基苯甲酸作为主要反应的转化。

可以调节生物催化转化过程中的反应条件，以使过多对苯二甲酸的形成最少。将8.14g对苯二腈加入100mL工作容积的EasyMax 102反应器(Eppendorf，德国)中的91.36g去离子水。将温度调节至33℃并将搅拌器速度设置为400rpm。混合由叶轮搅拌器来完成。加入0.5g含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq ID No.2)的腈水解酶的磷酸钾缓冲液中的大肠杆菌细胞悬浮液，以启动生物转化。以规则间隔抽取样品分析4-氰基苯甲酸和对苯二甲酸。在10.5小时后，反应结束并通过在Celite535上过滤移除细胞。最终4-氰基苯甲酸含量为93g/kg且最终对苯二甲酸含量为0.2g/kg。这对应于所施加的对苯二腈完全转化为生物催化反应的这两种产物。4-氰基苯甲酸相对于总产物量的分数为99.8％。总产物部分的0.2％是对苯二甲酸。对苯二甲酸分数取决于混合效率、加入反应的生物催化剂的量和温度。

参数	单位	数据
			反应温度	[℃]	33
反应规模	[kg]	0.1
			TDN	[g]	8.136
生物量浓度	[gBDW/kg]	0.183
			初始比活性	[kU/gBDW]	5.2
完全转化	是/否	是
			总反应持续时间	[h]	10.5
最终4-CBA浓度	[g/kg]	93.02
			最终TA浓度	[g/kg]	0.20
总产物中4-CBA的质量分数	[％]	99.79
			比产率Yp/x	[g4-CBA/gBDW]	508
转化率	[％]	100

表6：对苯二腈生物转化的反应条件和反应参数。TDN：对苯二腈，BDW：生物质干重，4-CBA：4-氰基苯甲酸，TA：对苯二甲酸。催化剂的初始比活性在反应的第一小时内测定并以kU给出。1kU对应于每分钟形成1mmol的4-氰基苯甲酸。

实施例8

将3515g水和445g对苯二腈置于反应器中。生物催化剂以含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq.ID 2)的腈水解酶的浓缩细胞悬浮液的形式使用并加入反应器中，由此启动生物转化。温度保持在30℃下且反应器由顶置搅拌器混合。将混合物搅拌23小时。

在生物转化后，用NaOH将pH值调节至pH 9.4，并将反应混合物由反应器移除。在Sartoflow Advance(Sartorius)机器上进行超滤，使用分子量截止值为10kDa的膜来移除表达腈水解酶的异源大肠杆菌细胞。将所得滤液分为两部分。将1748g所得滤液用1500g水稀释并通过用32重量％的盐酸滴定将pH值调至pH 2.2，以沉淀4-氰基苯甲酸。在加入盐酸溶液的过程中，再加入500g水以促进混合。将悬浮液过滤并用1x1500g水洗涤。将湿产物干燥，直到达到恒定的重量。回收193g结晶产物并用HPLC分析氯化物和水的含量(部分1)。将2029g所得滤液用1500g水稀释并通过用32重量％的盐酸滴定将pH值调节至pH 1.89，以沉淀4-氰基苯甲酸。在加入盐酸溶液的过程中，再加入250g水以促进混合。将悬浮液过滤并用2x1500g水洗涤。将湿产物干燥，直到达到恒定的重量。回收223g结晶产物并通过HPLC分析氯化物和水的含量(部分2)。用于洗涤滤饼的水的量决定了所得产物纯度。较大洗涤量降低最终产物中残留氯化物和其他不需要的组分的量。获得100％的总和的缺少的部分包含铵、钠和前述生物转化的污染物如磷酸盐。

化合物	部分1中的含量	部分2中的含量
			4-氰基苯甲酸	97.3[重量％]	99.0[重量％]
对苯二甲酸	0.3[重量％]	0.3[重量％]
			氯化物(IC)	1.0[重量％]	0.3[重量％]
水	0.1[重量％]	0.1[重量％]

表7：当使用盐酸来沉淀4-氰基苯甲酸时的产物的化学组成。IC：离子色谱

实施例9

将881g水和108.9g对苯二腈置于反应器中。生物催化剂以含有睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(Seq.ID 2)的腈水解酶的浓缩细胞悬浮液的形式使用并加入反应器中，由此开始生物转化。温度保持在30℃下且反应器由顶置搅拌器混合。将混合物搅拌24小时。

用1000g水稀释612g滤液并用98％的硫酸滴定而将pH值调节至pH2.1，以使4-氰基苯甲酸沉淀。将悬浮液过滤并用250g水洗涤。将湿产物干燥，直到达到恒定重量。回收56g结晶产物并用HPLC分析4-氰基苯甲酸和铵、硫酸盐和钠的含量。

表8：使用硫酸沉淀4-氰基苯甲酸时的产物的化学组成。IC：离子色谱。

Claims (35)

1.一种能够催化包含水、腈水解酶和对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸铵的含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应的分离的腈水解酶，其中在温育后含水介质中4-氰基苯甲酸铵的浓度是至少5％(w/w)且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)。

2.权利要求1的分离的腈水解酶，其中在温育后含水介质包含低于0,5％(w/w)的对苯二甲酸。

3.权利要求1或2的分离的腈水解酶，包含选自由如下组成的组的序列：

a.SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸分子，和

b.与SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和

c.由SEQ ID NO：1、3、5或7的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由与EQ ID NO：1、3、5或7具有至少70％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5或7的至少250个碱基的片段杂交，其中如b.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应。

4.一种选自由如下组成的组的分离的腈水解酶序列：

a.SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子，和

b.与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和，

c.由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少70％同一性，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如b.、c.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应。

5.一种用于产生4-氰基苯甲酸或其盐的方法，包括如下步骤

i.提供包含水、一种或多种腈水解酶和对苯二腈的含水介质，

ii.温育含水介质，和

iii.任选地从反应混合物分离4-氰基苯甲酸或其盐，

其中一种或多种腈水解酶能够催化包含水、腈水解酶和对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸铵的含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应，其中在温育后含水介质中4-氰基苯甲酸铵的浓度是至少5％(w/w)，且对苯二腈的浓度低于1,0％(w/w)。

6.权利要求5的方法，其中在温育后含水介质包含低于0,5％(w/w)的对苯二甲酸。

7.权利要求5或6的方法，其中腈水解酶包含选自由如下组成的组的序列：

a.SEQ ID NO：2、4、6和8的氨基酸分子，和

b.与SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和

c.由SEQ ID NO：1、3、5或7的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由与SEQ ID NO：1、3、5或7具有至少70％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO：1、3、5或7的至少250个碱基的片段杂交，其中如b.、d.和e.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应。

8.一种用于产生4-氰基苯甲酸或其盐的方法，包括如下步骤

i.提供包含水、一种或多种腈水解酶和对苯二腈的含水介质，

ii.温育含水介质，和

iii.任选地从反应混合物分离4-氰基苯甲酸或其盐，

其中一种或多种腈水解酶选自由如下组成的组：

a.SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和

b.与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和

c.由SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少70％同一性，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子具有使对苯二腈在含水介质中转化成4-氰基苯甲酸铵的活性。

9.权利要求5-8的方法，其中含水介质进一步包含二价阳离子。

10.权利要求9的方法，其中二价阳离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺或Co²⁺。

11.权利要求5-10的方法，其中在温育之前，对苯二腈以1-30％w/w的浓度加入含水介质中。

12.权利要求5-11的方法，其中通过在温育期间或在温育后向含水介质中加入酸而将含水介质的pH值调节至低于5。

13.权利要求5-12的方法，其中温育后通过过滤或离心分离产物。

14.权利要求5-13的方法，其中将含水介质温育至少2h。

15.权利要求5-14的方法，其中将含水介质在15-50℃下温育。

16.权利要求5-15的方法，其中腈水解酶通过发酵产生。

17.一种包含腈水解酶的重组构建体，其中腈水解酶选自由如下组成的组：

a.SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和

b.与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和，

c.由SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少70％同一性，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸的反应。

18.权利要求17的重组构建体，其中腈水解酶与异源启动子功能性连接。

19.一种重组载体，包含权利要求17或18的重组构建体。

20.一种重组微生物，包含权利要求17或18的重组构建体或权利要求19的重组载体。

21.权利要求20的重组微生物，其中微生物是玫瑰红红球菌(Rhodococcusrhodocrous)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、曲霉属(Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

22.表达如权利要求1-4所定义的任一腈水解酶的以下属的微生物：睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、CandidatusDadabacteria bacterium、Tepidicaulis marinus、维氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaswittichii)、根瘤菌属(Rhizobium)物种、聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.)CC9605、Flavihumibacter solisilvae或沙班盐水球形菌(Salinisphaera shabanensis)E1L3A。

23.一种用于产生腈水解酶的方法，包括如下步骤：

a.提供根据权利要求18或19的重组微生物或权利要求20的微生物，和

b.在允许所述腈水解酶基因表达的条件下培育所述微生物。

24.一种组合物，包含水、腈水解酶、对苯二腈和/或4-氰基苯甲酸，其中腈水解酶选自由如下组成的组：

a.SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20和22的氨基酸分子或其功能性片段，和

b.与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、20或22的氨基酸分子具有至少55％同一性的氨基酸分子或其功能性片段，和，

c.由SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，和

d.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、19或21具有至少70％同一性，和

e.由核酸分子编码的氨基酸分子或其功能性片段，所述核酸分子在严格条件下与互补于SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21的至少250个碱基的片段杂交，

其中如ii.、iii.、iv.和v.中所定义的氨基酸分子催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸铵的反应。

25.一种组合物，由如下组成：

a)95-99,5重量％4-氰基苯甲酸，

b)0,0-0,5重量％对苯二甲酸，

c)0,2-1,5重量％氯化物，

d)0,05-0,2重量％水，和

e)任选地至多4,75重量％其他组分。

26.一种组合物，由如下组成：

a)95-97重量％4-氰基苯甲酸，

b)0,0-0,5重量％对苯二甲酸，

c)0,3-1,5重量％铵，

d)2,0-0,4重量％硫酸盐，

e)0,4-1,0重量％钠，和

f)任选地至多2,3重量％其他组分。

27.一种用于制备含有至少5％(w/w)4-氰基苯甲酸铵、低于1,0％(w/w)对苯二腈和低于0,5％(w/w)对苯二甲酸的水溶液的方法，包括如下步骤：

I.提供包含水、一种或多种腈水解酶和对苯二腈的含水介质，和

II.温育含水介质，

其中腈水解酶催化含水介质中从对苯二腈至4-氰基苯甲酸的反应。

28.权利要求27的方法，其中含水介质进一步包含二价阳离子。

29.权利要求28的方法，其中二价阳离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺或Co²⁺。

30.权利要求27-29的方法，其中在温育之前，对苯二腈以1-30％w/w的浓度加入含水介质中。

31.权利要求27-30的方法，其中通过在温育期间或在温育后向含水介质中加入酸而将含水介质的pH值调节至低于5。

32.权利要求27-31的方法，其中温育后通过过滤或离心分离产物。

33.权利要求27-32的方法，其中将含水介质温育至少2h。

34.权利要求27-33的方法，其中将含水介质在15-50℃下温育。

35.权利要求27-34的方法，其中腈水解酶通过发酵产生。

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