BR112021014356A2

BR112021014356A2 - Nitrilase isolada, sequência de nitrilase isolada, processos de produção de ácido 4-cianobenzóico, construção recombinante, vetor recombinante, microrganismo recombinante, microrganismo, método de produção de uma nitrilase, composição e método de fabricação de uma solução aquosa

Info

Publication number: BR112021014356A2
Application number: BR112021014356-4A
Authority: BR
Inventors: Diego GHISLIERI; Christian WILLRODT; Christopher Koradin; Stefan Seemayer; Doreen SCHACHTSCHABEL; Kai-Uwe Baldenius; Roland Goetz
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2021-10-05
Also published as: EP3914725A2; US20220017931A1; WO2020152104A3; IL284865A; CN113614242A; MX2021008768A; WO2020152104A2

Abstract

nitrilase isolada, sequência de nitrilase isolada, processos de produção de ácido 4-cianobenzóico, construção recombinante, vetor recombinante, microrganismo recombinante, microrganismo, método de produção de uma nitrilase, composição e método de fabricação de uma solução aquosa. a invenção é direcionada a métodos de produção de ácido 4-cianobenzóico ou seus sais a partir de tereftalonitrila utilizando a nitrilase como catalisador e composições contendo ácido 4-cianobenzóico.

Description

“NITRILASE ISOLADA, SEQUÊNCIA DE NITRILASE ISOLADA, PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 4-CIANOBENZÓICO, CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, VETOR RECOMBINANTE, MICRORGANISMO RECOMBINANTE, MICRORGANISMO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA NITRILASE, COMPOSIÇÃO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção é direcionada a métodos para a produção de ácido 4-cianobenzóico, ácido 4-cianobenzóico de amônio ou sais dos mesmos a partir de tereftalonitrila utilizando nitrilase como catalisador e composições que compreendem ácido 4-cianobenzóico.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[002] As nitrilases são uma classe de enzimas que catalisam a hidratação de uma nitrila para produzir um ácido carboxílico. Nas últimas cinco décadas, vários organismos produtores de nitrilase, incluindo bactérias, fungos filamentosos, leveduras e plantas, foram descritos e algumas dessas células- fábricas microbianas foram utilizadas para a produção comercial de ácidos carboxílicos em escala industrial. O sucesso da produção industrial de ácido nicotínico e ácido (R)-mandélico usando nitrilase mostrou o grande potencial econômico da nitrilase (Gong et al. Microbial Cell Factories 2012, 11, 142-145).

[003] O ácido 4-cianobenzóico é um bloco de construção comum para a síntese de diferentes fungicidas pertencentes à classe das oxadiazol benzamidas.

[004] A hidratação enzimática seletiva de tereftalonitrila para produzir ácido 4-cianobenzóico (amônio) foi descrita na técnica anterior, no entanto, o número de nitrilases que catalisam esta reação é limitado e muitas vezes a taxa de produção e pureza do ácido 4-cianobenzóico (amônio) é dificilmente suficiente para aplicações industriais.

[005] Tanto a hidrólise enzimática quanto a química da tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio) já foram relatadas na literatura. A hidratação enzimática de nitrilas para produzir ácidos carboxílicos pode ser alcançada por uma nitrilase ou por meio de uma cascata biocatalítica envolvendo uma nitrila hidratase seguida por uma amidase.

[006] Os microrganismos Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus equi e Aspergillus niger foram usados como biocatalisador de células inteiras através da cascata de nitrila hidratase-amidase (Martinkova et al. Biotech. Lett. 1995, 11, 1219-1222; Bengis-Garber et al. Tetrahedron Lett., 1988, 29, 2589-2590; Šnajdrová et al. J. Mol. Cat. B: Enz. 2004 29 227–232).

Nestes relatórios, concentrações muito baixas de tereftalonitrila (2-4 mM) foram convertidas em ácido 4-cianobenzóico em altos rendimentos (70-95%). As tentativas de aumentar a concentração de substrato (25 mM) conduziram a rendimentos mais baixos (62%) (Crosby J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1994, 1, 1679-1686). Uma nitrilase de Rhodococcus rhodochrous também foi isolada, purificada e usada como um catalisador para a hidrólise direta de nitrila em ácido carboxílico (Kobayashi et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, 29, 231- 233) em baixa concentração (6 mM). Recentemente uma patente (CN107641622, 2018) foi publicada reivindicando a utilização de diferentes nitrilases (a partir de Pantoea sp., Arabidopsis thaliana, Acidovorax facilis, Leptolyngbya sp., Brassica oleracea e Camelina sativa) para produzir ácido 4- cianobenzóico (amônio) em alta concentração (100 g/L) e rendimento (86- 95%). Nesta patente, a biotransformação é realizada em uma mistura de tampão fosfato e DMSO (90:10), utilizando uma concentração relativamente elevada de enzima.

[007] Também é possível hidrolisar seletivamente tereftalonitrila quimicamente usando hidróxido de sódio a 80ºC seguido por nitrito de sódio, ácido acético e adição de anidrido acético. O ácido 4-cianobenzóico pode ser isolado com 72% de rendimento e 95% de pureza (US6433211).

[008] Esta invenção fornece nitrilases que catalisam a reação de tereftalonitrila de ácido 4-benzóico (amônio), especialmente nitrilases que catalisam esta reação em alta concentração de substrato com elevado rendimento e pureza.

[009] As nitrilases da invenção catalisam a conversão de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico como a reação principal. A hidrólise adicional do segundo grupo nitrila resulta em ácido tereftálico como um subproduto indesejado. Quantidades excessivas de ácido tereftálico devem ser evitadas, pois a remoção do ácido tereftálico em etapas posteriores do processo é difícil. A redução do teor de ácido tereftálico na mistura de reação, portanto, melhora a viabilidade econômica do processo, pois leva a uma redução de custos dos produtos e menos operações do processo.

[010] Portanto, esta invenção fornece ainda composições com alto teor de ácido 4-benzóico e baixo teor de ácido tereftálico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[011] É um objetivo da invenção prover nitrilases com atividade mais elevada, de preferência atividade específica mais elevada e resultando em maior concentração do produto em um tempo mais curto em meio aquoso, de preferência, após o tempo de incubação mais curto do que o descrito na técnica anterior.

[012] Portanto, um exemplo de realização da invenção é uma nitrilase isolada capaz de catalisar a reação de tereftalonitrila em ácido 4- cianobenzóico (amônio) em um meio aquoso composto por água, nitrilase e tereftalonitrila e/ou ácido 4-cianobenzóico (amônio), em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico (amônio) no meio aquoso após incubação é de pelo menos 5% ou 5,5% (p/p), de preferência pelo menos 6% ou 6,5%, de preferência 7% ou 7,5%, de preferência 8% ou 8,5%, de preferência 9% ou

9,5%, de preferência pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, mais de preferência pelo menos 13% ou 13,5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 14% ou 14,5%, de preferência pelo menos 15% e a concentração de tereftalonitrila é inferior a 1,0% (p/p), de preferência inferior a 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais de preferência inferior a 0,6%, de preferência inferior a 0,5%.

[013] Em outro exemplo de realização da invenção, a nitrilase isolada compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste; na molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8, e em uma molécula de aminoácido com pelo menos 40% de identidade com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 ou um fragmento funcional da mesma, e em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes (rigorosas) a um fragmento com pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional desta, em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., d. e e. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio) em um meio aquoso; e em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico no meio aquoso após a incubação é de pelo menos 9% ou 9,5% (p/p), de preferência pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, mais preferencialmente pelo menos 13% ou 13,5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 14% ou 14,5%, mais preferencialmente pelo menos 15% e a concentração de tereftalonitrila é inferior a 1,0% (p/p), de preferência abaixo de 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais preferencialmente abaixo de 0,6%, mais preferencialmente abaixo de 0,5%.

[014] Outro exemplo de realização da invenção é um processo para a produção de ácido 4-cianobenzóico ou sal do mesmo, compreendendo as etapas de i. Fornecer um meio aquoso compreendendo água, uma ou mais nitrilases e tereftalonitrila, ii. Incubar o meio aquoso; e iii. Opcionalmente, isolar o ácido 4-cianobenzóico ou sal do mesmo a partir da mistura de reação, em que a uma ou mais nitrilases são capazes de catalisar a reação de tereftalonitrila para ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso compreendendo água, nitrilase e tereftalonitrila e/ou ácido 4- cianobenzóico de amônio, em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico no meio aquoso após a incubação é de pelo menos 5% ou 5,5% (p/p), de preferência pelo menos 6% ou 6,5%, de preferência pelo menos 7% ou 7,5%, de preferência pelo menos 8% ou 8,5%, de preferência 9% ou 9,5% (p/p), de preferência pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, mais preferencialmente pelo menos 13% ou 13,5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 14% ou 14,5%, mais preferencialmente pelo menos 15% e a concentração de tereftalonitrila está abaixo de 1,0% (p/p), preferencialmente abaixo de 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais preferencialmente abaixo de 0,6%, mais preferencialmente abaixo de 0,5%.

[015] Em um exemplo de realização do processo da invenção, a nitrilase compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste;

a. na molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8, e b. em uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 ou um fragmento funcional da mesma, e c. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e d. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID

NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e e. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes (rigorosas)

a um fragmento com pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO: 1,

3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional desta,

em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., d. e e. está catalisando a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso compreendendo água, nitrilase e tereftalonitrila e/ou ácido 4-cianobenzóico de amônio, em que a concentração de ácido 4-

cianobenzóico no meio aquoso após a incubação é de pelo menos 5% ou 5,5%

(p/p), de preferência pelo menos 6% ou 6,5%, de preferência pelo menos 7%

ou 7,5%, de preferência pelo menos 8% ou 8,5%, de preferência pelo menos

9% ou 9,5% (p/p), preferencialmente pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%,

12%, 12,5%, mais preferencialmente pelo menos 13% ou 13, 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 14% ou 14,5%, mais preferencialmente pelo menos 15% e a concentração de tereftalonitrila está abaixo de 1,0% (p/p), de preferência abaixo de 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais preferencialmente abaixo de

0,6%, mais preferencialmente abaixo de 0,5%.

[016] Um exemplo de realização da invenção é um processo para a produção de ácido 4-cianobenzóico (amônio) compreendendo as etapas de fornecer um meio aquoso que compreende água ou um tampão possuindo um pH de 4 a 9, uma ou mais nitrilases e tetraftalonitrila,

Incubar o meio aquoso; e opcionalmente, isolar o ácido 4-cianobenzóico (amônio) a partir da mistura de reação,

em que uma ou mais nitrilases são selecionadas a partir do grupo que consiste em;

uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12,

14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e uma molécula de aminoácido com pelo menos 40% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12,

14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e,

uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5,

7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,

19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma,

em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iv. e v. têm a atividade de conversão de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio); e em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico (amônio) no meio aquoso após a incubação é de pelo menos 5% ou 5,5% (p/p), de preferência pelo menos 6% ou 6,5%, de preferência pelo menos 7% ou 7,5%, de preferência pelo menos 8% ou 8,5%, de preferência pelo menos 9% ou 9,5% (p/p), de preferência pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, mais preferencialmente pelo menos 13% ou 13,5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 14% ou 14,5%, mais preferencialmente pelo menos 15% e a concentração de tereftalonitrila é inferior a 1, 0% (w/w), de preferência inferior a 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais preferencialmente inferior a 0,6%, mais preferencialmente inferior a 0,5%.

[017] Na tabela 1, os exemplos para variantes funcionais das moléculas de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20 e 22 são listados possuindo uma certa identidade com a respectiva SEQ ID NO.

Além disso, estão listadas as SEQ IDs dos respectivos ácidos nucleicos que codificam a respectiva molécula de aminoácido variante funcional.

TABELA 1 SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID NO Doador Identidade aminoácido ácido nucl. 2 Comamonas testosteroni 29 28 90% 31 30 85% 33 32 80% 4 Organismo procariótico desconhecido 35 34 90% 37 36 85% 39 38 80% 6 Agrobacterium rubi 41 40 90% 43 42 85% 45 44 80% 8 Candidatus Dadabacteria bacterium CSP1-2 47 46 90% 49 48 85% 51 50 80% 10 Tepidicaulis marinus 53 52 90% 55 54 85% 57 56 80% 12 Sphingomonas wittichii RW1 59 58 90%

SEQ ID de SEQ ID de SEQ ID NO Doador Identidade aminoácido ácido nucl. 61 60 85% 63 62 80% 14 Rhizobium sp. YK2 65 64 90% 67 66 85% 69 68 80% 83 70 90% 85 72 85% 87 74 80% 16 Synechococcus sp. CC9605 71 76 90% 73 78 85% 75 80 80% Tatumella morbirosei 77 82 90% 79 84 85% 81 86 80% 20 Flavihumibacter solisilvae 89 88 90% 91 90 85% 93 92 80% 22 Salinisphaera shabanensis E1L3A 95 94 90% 97 96 85% 99 98 80%

[018] O meio aquoso pode ser uma solução ou uma suspensão ou uma solução e uma suspensão, em que qualquer uma das substâncias compreendidas no referido meio aquoso pode ser totalmente ou parcialmente dissolvida e/ou parcialmente ou totalmente suspensa.

[019] O meio aquoso compreende ainda um cátion divalente, por exemplo, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+ ou Co2+. Preferencialmente, o cátion divalente é Mg2+ ou Mn2+, de modo mais preferido o cátion divalente é Mg2+.

[020] O cátion divalente pode ter uma concentração de 1 mM a 500 mM, por exemplo, 10 mM a 450 mM. De preferência, a concentração do cátion divalente está entre 20 mM e 400 mM, de um modo preferido entre 30 mM e 300 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 250 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 200 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 150 mM.

[021] Em um exemplo de realização preferido do processo de produção de ácido 4-cianobenzóico (amônio), a incubação é realizada a 10ºC a 50ºC, de preferência de 15ºC a 40ºC, mais preferencialmente de 20ºC a 40ºC, ainda mais preferencialmente de 24ºC a 37ºC, ainda mais preferencialmente de 28ºC a 36ºC, ainda mais preferencialmente de 29ºC a 24ºC, mais preferencialmente de 30ºC a 33ºC.

[022] Em um exemplo realização preferido, a incubação é realizada durante 30 minutos a 48 horas, preferencialmente durante 1 hora a 36 horas, mais preferencialmente durante 2 horas a 24 horas, mais preferencialmente durante 3 horas a 15 horas.

[023] Em um exemplo realização preferido do processo de produção de ácido 4-cianobenzóico (amônio), o método é realizado utilizando um processo descontínuo (batch).

[024] No início do processo da invenção, o meio aquoso pode compreender pelo menos 0,05% de tereftalonitrila, de preferência pelo menos 0,1% de tereftalonitrila, mais preferencialmente pelo menos 0,5% de tereftalonitrila, mais preferencialmente pelo menos 1,0% tereftalonitrila (p/p).

Durante a incubação, a concentração de tereftalonitrila pode ser mantida em uma concentração de cerca de 0,5% a 1,5%, de preferência cerca de 1,0% de tereftalonitrila por alimentação contínua de tereftalonitrila.

[025] Alternativamente, a concentração de tereftalonitrila no meio aquoso pode estar entre 1% em peso a 30% em peso no início da incubação, de preferência entre (incluindo) 5% em peso a 10% em peso, ainda mais preferencialmente entre (incluindo) 6% em peso a 9% em peso, mais preferivelmente entre (incluindo) 7% em peso a 8,5% em peso.

[026] O tempo de incubação do meio aquoso pode ser de pelo menos 2h, pelo menos 5h, pelo menos 10h ou pelo menos 12h.

Preferencialmente, o tempo de incubação é de pelo menos 18h, por exemplo, cerca de 24h ou cerca de 30h. De modo mais preferido, o tempo de incubação é de cerca de 36h ou cerca de 42h. De modo ainda mais preferido, o tempo de incubação é de cerca de 48h. Dependendo da nitrilase utilizada e da taxa de reação da referida nitrilase, o tempo de incubação também pode exceder 48h.

[027] O meio aquoso pode ser incubado a pelo menos 15ºC, pelo menos 20ºC, pelo menos 24ºC ou pelo menos 28ºC. De preferência, o meio aquoso é incubado entre (incluindo) 27ºC e 38ºC. A de modo mais preferido, o meio aquoso é incubado a 30ºC. O meio aquoso também pode ser incubado a 31ºC, 32ºC, 33ºC, 34ºC, 35ºC, 36ºC, 37ºC, 38ºC, 39ºC, 40ºC, 41ºC, 42ºC, 43ºC, 44ºC, 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC ou 50ºC.

[028] Em um exemplo realização preferido, o método é realizado usando um processo descontínuo.

[029] Em um exemplo realização preferido do processo de produção de ácido 4-cianobenzóico (amônio), um ácido, por exemplo, HCl, H2SO4, H3PO4 ou semelhantes é adicionado ao meio aquoso após a incubação, a fim de transferir o ácido 4-cianobenzóico (amônio) resultante para o respectivo ácido que leva à precipitação do ácido facilitando o isolamento rápido e fácil do produto.

[030] A nitrilase usada no processo da invenção pode ser isolada do organismo que expressa naturalmente a referida nitrilase. Alternativamente, a nitrilase pode ser adicionada ao meio aquoso adicionando células compreendendo a referida nitrilase ou adicionando uma suspensão compreendendo células inativadas, por exemplo, rompidas. Em outro exemplo realização da invenção, a nitrilase pode ser produzida em organismos recombinantes, preferencialmente microrganismos, expressando a nitrilase da invenção a partir de uma construção heteróloga. A nitrilase assim produzida pode ser isolada do organismo recombinante e adicionada ao meio aquoso ou a nitrilase pode ser adicionada por inativação, por exemplo, rompendo as células e adicionando a suspensão.

[031] As células ou suspensão compreendendo células inativadas podem ser, pelo menos, parcialmente concentradas, por exemplo, por secagem antes de serem adicionadas ao meio aquoso usado nos métodos do invenção ou à composição da invenção.

[032] A nitrilase pode ser (parcialmente) imobilizada, por exemplo, aprisionada em um gel ou pode ser usada, por exemplo, como uma suspensão de células livres. Para imobilização, métodos padrão bem conhecidos podem ser aplicados como, por exemplo, aprisionamento por reticulação, como reticulação de glutaraldeído-polietilenoimina (GA-PEI), reticulação a uma matriz e/ou ligação de transportador, etc., incluindo variações e/ou combinações dos métodos mencionados acima. Alternativamente, a enzima nitrilase pode ser extraída e, por exemplo, pode ser usada diretamente no processo de preparação do sal de amônio ou ácido. Ao usar células inativadas ou parcialmente inativadas, tais células podem ser inativadas por tratamento térmico ou químico.

[033] Outro exemplo realização da invenção é uma nitrilase isolada que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em; uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e uma molécula de aminoácido com pelo menos 40% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e, uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., d. e e. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio) em um meio aquoso.

[034] Um exemplo realização adicional da invenção é uma construção recombinante compreendendo uma nitrilase, em que a nitrilase é selecionada a partir do grupo que consiste em; uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e uma molécula de aminoácido com pelo menos 40% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e, uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma,

em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iv., e v. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio) em um meio aquoso.

[035] A referida construção recombinante pode ser integrada ao genoma de um organismo para produzir e isolar a respectiva nitrilase, ou a nitrilase pode ser expressa a partir de um vetor, tal como um plasmídeo ou vetor viral que é introduzido em um organismo para produzir e isolar a referida nitrilase.

[036] A nitrilase na construção recombinante pode estar funcionalmente ligada a um promotor heterólogo, um terminador heterólogo ou qualquer outro elemento genético heterólogo.

[037] Outro exemplo realização da invenção é um vetor recombinante, tal como um vetor de expressão ou um vetor viral compreendendo a referida construção recombinante.

[038] Um microrganismo recombinante compreendendo a referida construção recombinante ou o referido vetor recombinante é também um exemplo realização da invenção.

[039] Em alguns exemplos de realização, o microrganismo recombinante é uma célula procariótica. As células procariotas adequadas incluem células bacterianas gram-positivas, gram-negativas e gram-variáveis, de preferência bactérias gram-negativas.

[040] Assim, os microrganismos que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a; Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas jluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp.

ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri,

Synechocystis sp., Synechococcus elongatus, Thermosynechococcus elongatus, Microcystis aeruginosa, Nostoc sp., N. commune, N.sphaericum, Nostoc punctiforme , Spirulina platensis, Lyngbya majuscula, L. lagerheimii, Phormidium tenue, Anabaena sp., Leptolyngbya sp entre outros.

[041] Em alguns exemplos de realização, o microrganismo é uma célula eucariótica. As células eucarióticas adequadas incluem células de levedura, como, por exemplo, espécies de Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, espécies de Hansenula, como Hansenula polymorpha, espécies de Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, espécies de Kluyveromyces, como Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces marxianus, espécies de Yarrowia, como Yarrowia lipolytica, espécies de Pichia, como Pichia methanolica, Pichia stipites e Pichia pastoris, espécies de Zygosaccharomyces, como Zygosaccharomyces rouxii e Zygosaccharomyces bailii, espécies de Candida, como Candida boidinii, Candida utilis, Candida freyschussii, Candida glabrata e Candida sonorensis, espécies de Schwanniomyces, como Schwanniomyces occidentalis, espécies de Arxula, como Arxula adeninivorans, espécies de Ogataea como Ogataea minuta, espécies de Klebsiella, tal como Klebsiella pneumonia.

[042] Um microrganismo do gênero Comamonas testosteroni, Agrobacterium rubi, bactéria Candidatus dadabacteria, Tepidicaulis marinus, Sphingomonas wittichii, Rhizobium spec., Synechococcus sp. CC9605, Tatumella morbirosei, Flavihumibacter solisilvae ou Salinisphaera shabanensis E1L3A que expressa qualquer uma das nitrilases da invenção é outro exemplo realização da invenção.

[043] Outro exemplo realização da invenção é um método para a produção de uma nitrilase, compreendendo as etapas de; a) fornecer um microrganismo recombinante que expressa pelo menos uma das nitrilases da invenção ou um microrganismo que expressa naturalmente uma nitrilase da invenção, e b) cultivar o referido microrganismo sob condições que permitam a expressão do referido gene da nitrilase, e c) opcionalmente isolar a nitrilase da invenção a partir do referido microrganismo.

[044] Outro exemplo realização da invenção é uma composição que compreende água, uma nitrilase, tereftalonitrila e/ou ácido 4-cianobenzóico (amônio) em que a nitrilase é selecionada a partir do grupo que consiste em; uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e uma molécula de aminoácido com pelo menos 40% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e uma molécula de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à sequência de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iv. e v. está catalisando a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico (amônio) em um meio aquoso. O aminoácido A é similar ao aminoácido S O aminoácido D é similar aos aminoácidos E; N

O aminoácido E é similar aos aminoácidos D; K; Q O aminoácido F é similar aos aminoácidos W; Y O aminoácido H é similar aos aminoácidos N; Y O aminoácido I é similar aos aminoácidos L; M; V O aminoácido K é similar aos aminoácidos E; Q; R O aminoácido L é similar aos aminoácidos I; M; V O aminoácido M é similar aos aminoácidos I; L; V O aminoácido N é similar aos aminoácidos D; H; S O aminoácido Q é similar aos aminoácidos E; K; R O aminoácido R é similar aos aminoácidos K; Q O aminoácido S é similar aos aminoácidos A; N; T O aminoácido T é similar ao aminoácido S O aminoácido V é similar aos aminoácidos I; L; M O aminoácido W é similar aos aminoácidos F; Y O aminoácido Y é similar aos aminoácidos F; H; W

[045] As moléculas de aminoácidos e moléculas de ácidos nucleicos possuindo certa identidade com qualquer uma das sequências de SEQ ID NO 1 a 22 incluem moléculas de ácidos nucleicos e moléculas de aminoácidos que possuem 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 22.

[046] De preferência, as sequências de aminoácidos de nitrilase com certa identidade com as nitrilases de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 20 e 22 compreendem algumas, de preferência predominantemente, mais preferencialmente apenas, substituições de aminoácidos conservadoras. As substituições conservadoras são aquelas em que um aminoácido é trocado por um aminoácido semelhante. Para a determinação da % de similaridade, aplica- se o seguinte, que também está de acordo com a matriz BLOSUM62, que é uma das matrizes de similaridade de aminoácidos mais utilizadas para pesquisa em bancos de dados e alinhamentos de sequência:

[047] As substituições conservadoras de aminoácidos podem ocorrer ao longo do comprimento total da sequência polipeptídica de uma proteína funcional, tal como uma enzima. Em um exemplo realização, tais mutações não pertencem aos domínios funcionais de uma enzima. Em um exemplo realização, as mutações conservadoras não pertencem aos centros catalíticos de uma enzima.

[048] Um fragmento funcional das moléculas de aminoácidos selecionadas de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 20 e 22 compreende pelo menos 100 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 200 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 250 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 300 aminoácidos.

[049] Outro exemplo realização da invenção é uma composição que consiste; de 95,0% em peso a 99,5% em peso de ácido 4-cianobenzóico, preferencialmente de 95,0% em peso a 99,25% em peso, preferencialmente de 95,0% em peso a 99,0% em peso, mais preferencialmente de 96,0% em peso a 99,5% em peso, mais preferencialmente de 97,0% em peso a 99,5% em peso, mais preferencialmente de 97,25% em peso a 99,5% em peso, mais preferencialmente de 97,5% em peso a 99,5% em peso, mais preferencialmente de 97,75% em peso a 99,5% em peso, ainda mais preferencialmente de 96,0% em peso a 99,25% em peso, mais preferencialmente de 97,0% em peso a 99,0% em peso, mais preferencialmente de 97,25% em peso a 99,0% em peso, mais preferencialmente de 97,5% em peso a 98,5% em peso, ainda mais preferencialmente de 97,75% em peso a 98,25% em peso, ainda mais preferencialmente de 97,9% em peso a 98,1% em peso, ainda mais preferencialmente de 97,0% em peso a 99,5% em peso, mais preferencialmente de 97,3% em peso a 99,25% em peso,

de 0,0% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico,

preferencialmente de 0,0% em peso a 0,45% em peso, mais preferencialmente de 0,0% em peso a 4,0% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,0% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,0% em peso a 0,3%

em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, preferencialmente de 0,1% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,3% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,3% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,325% em peso, e mais preferencialmente de 0,275% em peso a 0,325% em peso,

de 0,2% em peso a 1,5% em peso de cloreto, preferencialmente de 0,2% em peso a 1,25% em peso, mais preferencialmente de 0,2% em peso a 1,0% em peso, mais preferencialmente de 0,3% em peso a 1,5% em peso de cloreto, preferencialmente de 0,3% em peso a 1,25% em peso, mais preferencialmente de 0,3% em peso a 1,0% em peso, mais preferencialmente de 0,25% em peso a 1,5% em peso de cloreto, preferencialmente de 0,25% em peso a 1,25% em peso, mais preferencialmente de 0,25% em peso a 1,0% em peso, até 0,3% em peso de água, preferencialmente até 0,2% em peso de água, preferencialmente até 0,1% em peso de água, preferencialmente até 0,05% em peso de água, preferencialmente de 0,05% em peso a 0,2% em peso de água, preferencialmente de 0,075% em peso a 0,2% em peso, mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,2% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,05% em peso a 0,3% em peso de água, preferencialmente de 0,075% em peso a 0,3% em peso, mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,3% em peso, e opcionalmente até 4,8% em peso de outros componentes. Os outros componentes compreendem, por exemplo, amônio, fosfato, tereftalonitrila ou contaminantes do processo de fermentação. No total, os componentes somam 100%.

[050] Outro exemplo realização da invenção é uma composição que consiste; de 95,0% em peso a 97,0% em peso de ácido 4-cianobenzóico, preferencialmente de 95,25% em peso a 97,0% em peso, preferencialmente de 95,5% em peso a 97,0% em peso, preferencialmente de 95,75% em peso a 97,0% em peso de ácido 4-cianobenzóico, mais preferencialmente de 95,0% em peso a 96,75% em peso, mais preferencialmente de 95,0% em peso a 96,5% em peso, mais preferencialmente de 95,0% em peso a 96,25% em peso de ácido 4-cianobenzóico, ainda mais preferencialmente de 95,25% em peso a 96,75% em peso, mais preferencialmente de 95,5% em peso a 96,5% em peso, mais preferencialmente de 95,75% em peso a 96,25% em peso de ácido 4-

cianobenzóico,

de 0,0% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico,

em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, preferencialmente de 0,1% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,1% em peso a 0,3% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,2% em peso a 0,3% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,5% em peso de ácido tereftálico, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,45% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,3% em peso a 0,325% em peso, mais preferencialmente de 0,275% em peso a 0,325% em peso de ácido tereftálico,

de 0,3% em peso a 1,5% em peso de amônio, preferencialmente de 0,35% em peso a 1,25% em peso, mais preferencialmente de 0,4% em peso a 1,0% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,5% em peso a 0,75% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,55% em peso a 0,7% em peso, mais preferencialmente de 0,55% em peso a 0,65% em peso de amônio, de 2,0% em peso a 0,4% em peso de sulfato, preferencialmente de 2,25% em peso a 0,375% em peso, mais preferencialmente de 2,5% em peso a 3,5% em peso, ainda mais preferencialmente de 2,75% em peso a 3,25% em peso, mais preferencialmente de 2,9% em peso a 3,2% em peso de sulfato de 0,4% em peso a 1,0% em peso de sódio, preferencialmente de 0,5% em peso a 0,9% em peso, mais preferencialmente de 0,6% em peso a 0,8% em peso, ainda mais preferencialmente de 0,65% em peso a 0,75% em peso de sódio; e opcionalmente até 2,3% em peso de outros componentes. Os outros componentes compreendem, por exemplo, água, cloreto, fosfato, tereftalonitrila ou contaminantes do processo de fermentação. No total, os componentes somam 100%.

[051] Um exemplo realização adicional da invenção é um método para fazer uma solução aquosa contendo pelo menos 5% ou 5,5% (p/p), de preferência pelo menos 6% ou 6,5%, de preferência pelo menos 7% ou 7,5%, de preferência pelo menos 8% ou 8,5%, de preferência pelo menos 9% ou 9,5% (p/p), de preferência pelo menos 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, mais preferencialmente pelo menos 13% ou 13,5%, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 14% ou 14,5%, mais preferencialmente pelo menos 15% de ácido 4-cianobenzóico (amônio) e uma concentração de tereftalonitrila inferior a 1,0% (p/p), preferencialmente inferior a 0,9%, 0,8%, 0,7%, mais preferencialmente inferior a 0,6%, mais preferencialmente inferior a 0,5%. E a concentração de ácido tereftálico está abaixo de 0,5% em peso, de preferência abaixo de 0,45% em peso, mais preferencialmente abaixo de 0,4% em peso, ainda mais preferencialmente abaixo de 0,35% em peso, ainda mais preferencialmente a concentração é 0,29% em peso a 0,31% em peso, compreendendo as etapas de; - fornecer um meio aquoso compreendendo água, uma ou mais nitrilases e tereftalonitrila, e

- incubar o meio aquoso, em que a nitrilase é capaz de catalisar a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico em um meio aquoso.

[052] Em um exemplo realização do método da invenção, o meio aquoso compreende ainda um cátion divalente. O cátion divalente pode ser, por exemplo, um ou mais dentre Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+ ou Co2+.

[053] O cátion divalente pode ter uma concentração de 1mM a 500mM, por exemplo, 10mM a 450mM. De preferência, a concentração do cátion divalente está entre 20 mM e 400 mM, de um modo preferido entre 30 mM e 300 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 250 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 200 mM, mais preferencialmente entre 40 mM e 150 mM.

[054] Em um exemplo de realização preferido do processo de produção de ácido 4-cianobenzóico (amônio), a incubação é realizada a 10ºC a 50ºC, de preferência de 15ºC a 40ºC, mais preferencialmente de 20ºC a 40ºC, ainda mais preferencialmente de 24ºC a 37ºC, ainda mais preferencialmente de 28ºC a 36ºC, ainda mais preferencialmente de 29ºC a 24ºC, mais preferencialmente de 30ºC a 33ºC.

[055] Em um exemplo realização preferido, a incubação é realizada durante 30 minutos a 48 horas, preferencialmente durante 1 hora a 36 horas, mais preferencialmente durante 2 horas a 24 horas, mais preferencialmente durante 3 horas a 15 horas.

[056] No início do método da invenção, o meio aquoso pode compreender pelo menos 0,05% de tereftalonitrila, de preferência pelo menos 0,1% de tereftalonitrila, mais preferencialmente pelo menos 0,5% de tereftalonitrila, mais preferencialmente pelo menos 1,0% tereftalonitrila (p/p). Durante a incubação, a concentração de tereftalonitrila pode ser mantida em uma concentração de cerca de 0,5% a 1,5%, de preferência cerca de 1,0% de tereftalonitrila por alimentação contínua de tereftalonitrila.

[057] Alternativamente, a concentração de tereftalonitrila no meio aquoso pode estar entre 1% em peso a 30% em peso no início da incubação, de preferência entre (incluindo) 5% em peso a 10% em peso, ainda mais preferencialmente entre (incluindo) 6% em peso a 9% em peso, mais preferivelmente entre (incluindo) 7% em peso a 8,5% em peso.

[058] O tempo de incubação do meio aquoso pode ser de pelo menos 2h, pelo menos 5h, pelo menos 10h ou pelo menos 12h.

[059] O meio aquoso pode ser incubado a pelo menos 15ºC, pelo menos 20ºC, pelo menos 24ºC ou pelo menos 28ºC. Preferencialmente, o meio aquoso é incubado entre (incluindo) 27ºC e 38ºC. A de modo mais preferido, o meio aquoso é incubado a 30ºC. O meio aquoso pode também ser incubado a 31ºC, 32ºC, 33ºC, 34ºC, 35ºC, 36ºC, 37ºC, 38ºC, 39ºC, 40ºC, 41ºC, 42ºC, 43ºC, 44ºC, 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC ou 50ºC.

[060] Em um exemplo realização do método da invenção o valor de pH do meio aquoso é ajustado para menos de 5 pela adição de ácido ao meio aquoso, durante ou após a incubação.

[061] Em um exemplo realização do método da invenção, o produto é isolado por filtração ou centrifugação após a incubação.

[062] Em um exemplo realização do método da invenção, a nitrilase é produzida por fermentação.

DEFINIÇÕES

[063] Deve ser compreendido que a presente invenção não está limitada a metodologia ou protocolos específico. Também é preciso entender que a terminologia utilizada na presente invenção é para o propósito apenas de descrever exemplos de realizações específicas, e não pretende limitar o escopo da presente invenção, que será limitada somente pelas reivindicações anexas. Deve-se notar que conforme utilizado no presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um/uma”, “e” e “o/a” incluem as referências ao plural a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a “um vetor” é uma a referência a um ou mais vetores e inclui equivalentes destes conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, e assim por diante. O termo “cerca” é usado no presente para significar “aproximadamente”, “ao redor de”, ou “na região de”. Quando o termo “cerca” é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica o intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo “cerca de” é usado na presente invenção para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor indicado por uma variância de 20 por cento, preferencialmente de 10 por cento para cima ou para baixo (maior ou menor).

Conforme utilizado no presente, a palavra “ou” significa qualquer membro de uma lista específica e também inclui qualquer combinação dos membros dessa lista. As palavras “compreendem”, “compreendendo”, “incluem”, “incluindo” e “contém” quando usadas no presente relatório descritivo e nas reivindicações a seguir destinam-se a especificar a presença de uma ou mais características, inteiros, componentes ou etapas indicados, mas tais termos não excluem a presença ou a adição de uma ou mais características, inteiros, componentes e etapas diferentes daqueles que foram indicados, ou grupos destes. Para maior clareza, alguns termos usados no relatório descritivo são definidos e utilizados da seguinte forma:

[064] Região codificante: Conforme utilizado no presente, o termo “região codificante”, quando utilizado em referência a um gene estrutural,

refere-se às sequências de nucleotídeos que codificam os aminoácidos encontrados no polipeptídeo nascente como resultado da tradução de uma molécula de mRNA. A região codificante é limitada, nos eucariotas, na extremidade 5' pelo tripleto de nucleotídeos “ATG” que codifica a metionina iniciadora, os procariotas também usam os tripletos “GTG” e “TTG” como códons de início. No lado 3' ela é delimitada por uma dos três tripletos que especificam códons de parada (terminação) (TAA, TAG, TGA). Além disso, um gene pode incluir sequências localizadas em ambas as extremidades, 3'e 5', das sequências que estão presentes no RNA transcrito. Estas sequências são referidas como sequências ou regiões “flanqueadoras” (estas sequências flanqueadoras estão localizadas a 5' ou 3' das sequências não traduzidas presentes no mRNA transcrito). A região flanqueadora 5’ pode conter sequências reguladoras, tais como promotores e intensificadores/facilitadores (enhancers) que controlam ou influenciam a transcrição do gene. A região flanqueadora 3' pode conter sequências que induzem a terminação da transcrição, clivagem pós-transcricional e poliadenilação.

[065] Complementar: “complementar” ou “complementaridade” refere-se a duas sequências de nucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos antiparalelas capazes de parear entre si (pelas regras de pareamento de bases) após a formação de ligações de hidrogênio entre os resíduos de bases complementares nas sequências nucleotídicas antiparalelas.

Por exemplo, a sequência 5'-AGT-3 'é complementar com a sequência 5'-ACT- 3'. A complementaridade pode ser “parcial” ou “total”. A complementaridade “parcial” é quando uma ou mais bases de ácidos nucleicos não estão combinadas de acordo com as regras de pareamento. A complementaridade “total” ou “completa” entre as moléculas de ácido nucleico é quando cada base (ou seja, todas) do ácido nucleico está combinada com a outra base de acordo com as regras de pareamento. O grau de complementaridade entre as fitas de ácido nucleico tem efeitos significativos sobre a eficiência e força de hibridação entre as fitas de ácido nucleico. Um “complemento” de uma sequência de ácido nucleico, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma sequência de nucleotídeos cujas moléculas de ácido nucleico mostram complementaridade total com as moléculas de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico.

[066] Endógena: Uma sequência de nucleotídeos “endógena” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está presente no genoma de um micro-organismo tipo selvagem.

[067] Expressão melhorada/aumentada: “melhorar” ou “aumentar” a expressão de uma molécula de ácido nucleico em um micro- organismo são utilizados de forma equivalente no presente e designam que o nível de expressão de uma molécula de ácido nucleico em um micro-organismo é mais elevada em comparação com um micro-organismo de referência, por exemplo, um tipo selvagem. Os termos “melhorado” ou “aumentado”, conforme utilizado no presente, referem-se a uma expressão da molécula de ácido nucleico significativamente mais elevada, de preferência significativamente maior. Tal como utilizado no presente, “melhora” ou “aumento” do nível de um agente, tal como uma proteína, mRNA ou RNA, significa que o nível é aumentado em relação a um micro-organismo substancialmente idêntico cultivado sob condições substancialmente idênticas. Conforme utilizado na presente invenção, “melhora” ou “aumento” do nível de um agente, tal como, por exemplo, pré-RNA, mRNA, rRNA, tRNA, expresso pelo gene alvo e/ou produto proteico codificado por ele, significa que o nível está aumentado em 50% ou mais, por exemplo, 100% ou mais, de preferência 200% ou mais, mais preferencialmente 5 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 10 vezes ou mais, mais preferivelmente 20 vezes ou mais, por exemplo, 50 vezes em relação a um micro-organismo de referência adequado. A melhora ou o aumento podem ser determinados por métodos com os quais os técnicos no assunto estão familiarizados. Assim, a melhora ou o aumento da quantidade de ácido nucleico ou proteína podem ser determinados, por exemplo, por uma detecção imunológica da proteína. Além disso, técnicas como ensaio de proteína, fluorescência, hibridização Northern, medição densitométrica da concentração de ácido nucleico em um gel, ensaio de proteção da nuclease, transcrição reversa (RT-PCR quantitativa), ELISA (ensaio imunoadsorvente enzima-associado), Western blot, radioimunoensaio (RIA) ou outros imunoensaios e separação de células ativadas por fluorescência (FACS) pode ser utilizadas para mensurar uma proteína ou RNA específico em um microrganismo. Dependendo do tipo de produto proteico induzido, também pode ser determinada a sua atividade ou o efeito no fenótipo do micro- organismo. Os métodos para determinar a quantidade de proteína são conhecidos pelos especialistas na área. Exemplos, que podem ser mencionados, são: método de micro-Biureto (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), o método de Folin-Ciocalteau (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) ou a medição da absorção de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254).

[068] Expressão: “expressão” refere-se à biossíntese de um produto gênico, de um modo preferido para a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, um gene endógeno ou gene heterólogo, em uma célula. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em mRNA e - opcionalmente - a subsequente tradução do mRNA em um ou mais polipeptídeos. Em outros casos, a expressão pode se referir apenas à transcrição do DNA carregando uma molécula de RNA.

[069] Exógeno/externo: O termo “exógeno” ou “externo” refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico (por exemplo, sequência do gene) que é introduzida em uma célula por manipulações experimentais e podem incluir sequências encontradas na célula, desde que a sequência introduzida contenha algumas modificações (por exemplo, uma mutação pontual, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) e é, portanto, diferente em relação à sequência de ocorrência natural.

[070] Fragmento funcional: O termo “fragmento funcional” refere- se a qualquer ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que compreende apenas uma parte do ácido nucleico de comprimento total ou sequência de aminoácidos de comprimento total, respectivamente, mas ainda tem a mesma atividade e/ou função ou atividade e/ou função semelhante. Em um exemplo de realização, o fragmento compreende pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% da sequência original. Em um exemplo realização, o fragmento funcional compreende ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos em comparação com o ácido nucleico original ou sequência de aminoácidos original, respectivamente.

[071] Ligação funcional: O termo “ligação funcional” ou “funcionalmente ligado”, equivalente ao termo “operacionalmente ligado”, deve ser compreendido como, por exemplo, a disposição sequencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma sequência de ácido nucleico a ser expressa e, se apropriado, elementos reguladores adicionais (por exemplo, um terminador) de modo que cada um dos elementos reguladores possa cumprir a sua função e permitir, modificar, facilitar ou de outro modo influenciar a expressão da referida sequência de ácido nucleico. Como um sinônimo as expressões “ligação operável” ou “operacionalmente ligado” podem ser utilizadas. A expressão pode resultar, dependendo do arranjo das sequências de ácidos nucleicos, em RNA sense ou antisense. Para este fim, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente exigida. As sequências de controle genético como, por exemplo, sequências facilitadoras (enhancers), podem também exercer a sua função na sequência alvo a partir de posições que estão mais distantes ou mesmo em outras moléculas de DNA. Os arranjos preferidos são aqueles em que a sequência de ácido nucleico a ser expressa de forma recombinante é posicionada atrás da sequência atuante como promotor, de modo a que as duas sequências ficam ligadas covalentemente umas às outras. Em um exemplo de realização preferido, a sequência de ácido nucleico a ser transcrita está localizada atrás do promotor, de tal forma que o início da transcrição é idêntico com o início desejado do RNA quimérico da invenção. A ligação funcional e uma construção de expressão podem ser geradas por meio de técnicas habituais de recombinação e clonagem, conforme descrito (por exemplo, em Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. & Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Holanda). Entretanto, outras sequências, que, por exemplo, atuam como um agente de ligação específico para sítios de clivagem por enzimas de restrição, ou como um peptídeo sinal, também podem ser posicionadas entre as duas sequências. A inserção de sequências pode também levar a expressão de proteínas de fusão. Preferencialmente, a construção de expressão, consistindo de uma ligação de uma região reguladora, por exemplo, um promotor e a sequência de ácido nucleico a ser expressa, podem existir sob uma forma integrada ao vetor ou pode ser inserida no genoma, por exemplo, por transformação.

[072] Gene: O termo “gene” refere-se a uma região operacionalmente ligada às sequências reguladoras adequadas capazes de algum modo regular a expressão do produto gênico (por exemplo, um polipeptídeo ou RNA funcional). Um gene inclui regiões reguladoras não traduzidas de DNA (por exemplo, promotores, intensificadores/ facilitadores (enhancers), repressores, etc.) que precedem (a montante) e sucedem (a jusante) a região codificante (quadro de leitura aberto, ORF). O termo “gene estrutural”, conforme utilizado na presente invenção, pretende designar uma sequência de DNA que é transcrita em mRNA, que é então traduzida em uma sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

[073] Genoma ou DNA genômico: Os termos “genoma” ou “DNA genômico” referem-se às informações genéticas hereditárias de um organismo hospedeiro. O referido DNA genômico compreende o DNA do nucleotídeo, e também o DNA do plasmídeo de auto-replicação.

[074] Heterólogo: O termo “heterólogo” no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico ou DNA refere-se a uma molécula de ácido nucleico que está operacionalmente ligada a, ou é manipulada para ficar operacionalmente ligada a, uma segunda molécula de ácido nucleico ao qual não está operacionalmente ligada na natureza, ou a qual está operacionalmente ligada, porém em uma localização diferente na natureza.

Uma construção de expressão heteróloga que compreende uma molécula de ácido nucleico e uma ou mais molécula de ácido nucleico reguladora (tal como um promotor ou um sinal de terminação da transcrição) ligada a ela é, por exemplo, um construção originada por manipulações experimentais em que (a) a referida molécula de ácido nucleico, ou (b) a referida molécula de ácido nucleico reguladora ou (c) ambas (ou seja, (a) e (b)), não está(ão) localizada(s) no seu ambiente genético natural (nativo) ou foi(foram) modificada(s) por manipulações experimentais, um exemplo de uma modificação pode ser uma substituição, adição, deleção, inserção ou inversão de um ou mais resíduos de nucleotídeos. Ambiente genético natural refere-se ao locus genômico natural no organismo de origem, ou a presença de uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência da molécula de ácido nucleico é preferencialmente mantido, pelo menos em parte.

O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, muito preferivelmente pelo menos 1.000 bp, muito preferivelmente pelo menos 5.000 bp. Uma construção de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural de um promotor com o gene correspondente - torna-se uma construção de expressão transgênica quando é modificada por métodos não naturais de síntese “artificial”, tal como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (US 5.565.350; WO 00/15815). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificante de proteína operacionalmente ligada a um promotor, que não é o promotor nativo desta molécula, é considerada heteróloga em relação ao promotor. De modo preferido, o DNA heterólogo não é endógeno ou não está naturalmente associado com a célula na qual é introduzido, mas foi obtido a partir de outra célula ou foi sintetizado. DNA heterólogo também inclui uma sequência de DNA endógena que contém algumas modificações, que não ocorrem naturalmente, múltiplas cópias de uma sequência de DNA endógeno, ou uma sequência de DNA que não está naturalmente associada com outra sequência de DNA fisicamente ligada a mesma. De modo geral, embora não necessariamente, o DNA heterólogo codifica RNA ou proteínas que não são normalmente produzidas pela célula na qual é expressa.

[075] Hibridização: O termo “hibridização”, conforme definido no presente, é um processo em que sequências de nucleotídeos substancialmente complementares são pareadas (aneladas) entre si. O processo de hibridização pode ocorrer inteiramente em solução, ou seja, ambos os ácidos nucleicos complementares estão em solução. O processo de hibridação pode também ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em uma matriz, tal como esferas magnéticas, esferas de Sepharose ou qualquer outra resina. O processo de hibridização pode adicionalmente ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em um suporte sólido, tal como uma membrana de nitrocelulose ou de náilon ou imobilizada, por exemplo, por fotolitografia a um suporte de vidro silicoso (este último é conhecido como matrizes de ácidos nucleicos ou microarranjos (microarrays) ou chips de ácidos nucleicos). A fim de permitir que ocorra a hibridização, as moléculas de ácidos nucleicos são geralmente desnaturadas termicamente ou quimicamente para separar uma cadeia dupla em duas cadeias simples e/ou para remover estruturas em grampos (hairpin) ou outras estruturas secundárias a partir de ácidos nucleicos de cadeia simples.

[076] O termo “estringência” refere-se às condições sob as quais a hibridização ocorre. A estringência da hibridização é influenciada por condições como a temperatura, concentração de sais, força iônica e composição do tampão de hibridização. Geralmente, condições de baixa estringência são selecionadas para estarem a cerca de 30 ºC mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em força iônica e pH definidos. Condições de estringência média são condições quando a temperatura está 20ºC abaixo do Tm; e condições de alta estringência quando a temperatura está 10ºC abaixo do Tm. As condições de hibridização de alta estringência são geralmente usadas para o isolamento de sequências de hibridização que possuem similaridade de sequência com a sequência de ácido nucleico alvo. No entanto, os ácidos nucleicos podem desviar na sequência, e ainda codificar um polipeptídeo substancialmente idêntico, devido à degenerescência do código genético. Consequentemente, condições de hibridização de média estringência podem por vezes ser necessárias para identificar tais moléculas de ácido nucleico.

[077] A “Tm” é a temperatura sob força iônica e pH definidos na qual 50% de uma sequência alvo se hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. A Tm é dependente das condições de solução e da composição de base e comprimento da sonda. Por exemplo, as sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais elevadas. A taxa máxima de hibridização é obtida a partir de cerca de 16 ºC até 32 ºC abaixo da T m. A presença de cátions monovalentes na solução de hibridização reduz a repulsão eletrostática entre as duas cadeias de ácidos nucleicos, promovendo assim a formação híbrida, este efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4 M (para concentrações mais elevadas, este efeito pode ser ignorado). A formamida reduz a temperatura de fusão de duplexos de DNA-DNA e DNA- RNA com 0,6 a 0,7 ºC para cada por cento de formamida, e a adição de formamida a 50% permite que a hibridização seja realizada entre 30 a 45 ºC, embora a taxa de hibridização seja reduzida. Os pares de bases não pareados ou discordantes (mismatches) reduzem a taxa de hibridização e a estabilidade térmica dos duplexos. Em sondas médias e grandes, a Tm diminui cerca de 1ºC por % de mismatchs. A Tm pode ser calculada usando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos: - Híbridos DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138: 267- 284, 1984): Tm= 81,5°C + 16,6xlog[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]-1 – 0,61x% formamida.

- Híbridos DNA-RNA ou RNA-RNA: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc - Híbridos oligo-DNA ou oligo-RNAd: Para <20 nucleotídeos: Tm= 2 (ln) Para 20-35 nucleotídeos: Tm= 22 + 1,46 (ln) a ou para outro cátion monovalente, mas preciso apenas na faixa de 0,01 - 0,4 M. b preciso apenas para %GC% na faixa de 30% a 75%. c L = comprimento do duplexo em pares de base. d oligo, oligonucleotídeo, ln, = comprimento efetivo do primer = 2 × (nº de G/C)+(nº de A/T).

[078] A ligação não específica pode ser controlada utilizando qualquer um dentre inúmeras técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, o bloqueio da membrana com soluções que contêm proteínas, adição de RNA, DNA heterólogo, e SDS ao tampão de hibridização, e o tratamento com RNase.

Para sondas não relacionadas, uma série de hibridizações podem ser realizadas pela variação de um dos seguintes itens: (i) diminuindo progressivamente a temperatura de anelamento (por exemplo, de 68 ºC para 42 ºC); ou (ii) reduzindo progressivamente a concentração de formamida (por exemplo, de 50% para 0%). O técnico especialista na área está ciente dos diversos parâmetros que podem ser alterados durante a hibridização e que irá manter ou alterar as condições de estringência.

[079] Além das condições de hibridização, a especificidade de hibridização também depende tipicamente da função de lavagens pós- hibridização. Para remover o fundo resultante da hibridização não específica, as amostras são lavadas com soluções de sal diluídas. Os fatores críticos das lavagens incluem a força iônica e a temperatura da solução da lavagem final: quanto menor concentração de sal e a temperatura de lavagem, mais alta a estringência da lavagem. As condições de lavagem são tipicamente realizadas em uma estringência igual ou menor a da estrigência de hibridização. Uma hibridização positiva dá um sinal que é pelo menos o dobro do sinal de fundo.

Geralmente, as condições de estringência adequadas para ensaios de hibridização de ácidos nucleicos ou procedimentos de detecção de amplificação gênica são como as definidas acima. Condições mais ou menos estringentes também podem ser selecionadas. O técnico especialista na área está ciente dos diversos parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e que irá manter ou alterar as condições de estringência.

[080] Por exemplo, as condições típicas de hibridização em alta estringência para híbridos de DNA com mais de 50 nucleotídeos inclui a hibridização a 65ºC em SSC 1 x, ou a 42ºC em SSC 1 x e formamida 50%, seguido pela lavagem a 65ºC em SSC 0,3 x. Exemplos de condições de hibridização em média estringência para híbridos de DNA maiores que 50 nucleotídeos incluem a hibridização a 50ºC em SSC 4x, ou a 40ºC em SSC 6x e formamida 50%, seguido pela lavagem a 50ºC em SSC 2x. O comprimento do híbrido é o comprimento esperado para o ácido nucleico de hibridização.

Quando os ácidos nucleicos de sequência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado por meio do alinhamento das sequências e identificação das regiões conservadas descritas no presente. 1 x SSC é 0,15 M de NaCl e 15 mM de citrato de sódio; a solução de hibridização e soluções de lavagens podem incluir adicionalmente reagente de Denhardt 5x, 0,5-1,0% de SDS, 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, pirofosfato de sódio a 0,5%. Outro exemplo de realização de condições de alta estringência é uma hibridização a 65ºC em SSC 0,1x contendo SDS 0,1 e, opcionalmente, reagente de Denhardt 5x, 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e fragmentado, pirofosfato de sódio a 0,5%, seguido pela lavagem a 65ºC em SSC 0,3x.

[081] Para os propósitos de definição do nível de estringência, pode ser feita referência a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorque ou ao Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989 e atualizações anuais).

[082] Identidade: “Identidade”, quando utilizado em relação à comparação de duas ou mais moléculas de ácido nucleico ou aminoácidos significa que as sequências das referidas moléculas partilham certo grau de similaridade de sequência, sendo as sequências parcialmente idênticas.

[083] As variantes enzimáticas podem ser definidas por sua identidade de sequência quando comparadas a uma enzima parental. A identidade de sequência geralmente é fornecida como “% de identidade de sequência” ou “% identidade”. Para determinar a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos em uma primeira etapa, um alinhamento de sequência em pares é gerado entre essas duas sequências, em que as duas sequências são alinhadas (pareadas) ao longo de seu comprimento completo (isto é, um alinhamento global de pares). O alinhamento é gerado com um programa que implementa o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453), de preferência usando o programa “NEEDLE” (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) com os parâmetros padrão do programa (gapopen = 10,0, gapextend = 0,5 e matriz = EBLOSUM62). O alinhamento preferido para o propósito da presente invenção é aquele alinhamento a partir do qual a identidade de sequência mais elevada pode ser determinada.

[084] O seguinte exemplo destina-se a ilustrar duas sequências de nucleotídeos, mas os mesmos cálculos aplicam-se a sequências de proteínas: Seq A: comprimento AAGATACTG: 9 bases Seq B: comprimento GATCTGA: 7 bases

[085] Portanto, a sequência mais curta é a sequência B.

[086] Produzir um alinhamento global de pares que mostra ambas as sequências em seus comprimentos completos resulta em Seq A: AAGATACTG- ||| |||

Seq B: --GAT-CTGA

[087] O símbolo “I” no alinhamento indica resíduos idênticos (o que significa bases para DNA ou aminoácidos para proteínas). O número de resíduos idênticos é 6.

[088] O símbolo “-” no alinhamento indica lacunas (gaps). O número de lacunas introduzidas pelo alinhamento dentro da Seq B é 1. O número de lacunas introduzidas pelo alinhamento nas bordas da Seq B é 2, e nas bordas da Seq A é 1.

[089] O comprimento de alinhamento mostrando as sequências alinhadas ao longo de seu comprimento completo é 10.

[090] A produção de um alinhamento de pares que mostra a sequência mais curta ao longo de seu comprimento completo de acordo com a invenção, consequentemente, resulta em: Seq A: GATACTG- ||| ||| Seq B: GAT-CTGA

[091] A produção de um alinhamento de pares que mostra a sequência A ao longo de seu comprimento completo de acordo com a invenção, consequentemente, resulta em: Seq A: AAGATACTG ||| ||| Seq B: --GAT-CTG

[092] A produção de um alinhamento de pares que mostra a sequência B ao longo de seu comprimento completo de acordo com a invenção, consequentemente, resulta em: Seq A: GATACTG- ||| ||| Seq B: GAT-CTGA

[100] O comprimento do alinhamento mostrando a sequência mais curta em todo o seu comprimento é 8 (uma lacuna está presente que é fatorada no comprimento do alinhamento da sequência mais curta).

[101] Consequentemente, o comprimento de alinhamento que mostra a Seq A ao longo de seu comprimento completo seria 9 (significando que a Seq A é a sequência da invenção).

[102] Consequentemente, o comprimento de alinhamento que mostra a Seq B ao longo de seu comprimento completo seria 8 (o que significa que a Seq B é a sequência da invenção).

[103] Após o alinhamento de duas sequências, em uma segunda etapa, um valor de identidade é determinado a partir do alinhamento produzido.

Para os propósitos da presente descrição, a porcentagem de identidade é calculada por % de identidade = (resíduos idênticos/comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção ao longo de seu comprimento completo) * 100. Assim, de identidade de sequência em relação à comparação de duas sequências de aminoácidos de acordo com este exemplo realização é calculado dividindo o número de resíduos idênticos pelo comprimento da região de alinhamento, a qual está mostrando a respectiva sequência da presente invenção ao longo de seu comprimento completo. Este valor é multiplicado por 100 para dar a “% de identidade”. De acordo com o exemplo fornecido acima,% de identidade é: para Seq A sendo a sequência da invenção: (6/9) * 100 = 66,7%; sendo a Seq B a sequência da invenção: (6/8) * 100 = 75%.

[104] Isolado: O termo “isolado”, conforme utilizado na presente invenção, significa um material que foi removido pela mão do homem e existe fora de seu ambiente original, nativo e, consequentemente, não é um produto da natureza. Uma molécula ou material isolado (tal como o DNA ou uma enzima) pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que ocorre naturalmente ou um polipeptídeo presente em uma célula viva não está isolado, mas a mesma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo quando separados de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural são considerados isolados. Tais moléculas de ácido nucleico pode ser parte de um vetor e/ou tais moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos podem fazer parte de uma composição, e seriam considerados isolados se o vetor ou tal composição não faz parte de seu ambiente original. Preferencialmente, o termo “isolado”, quando utilizado em relação a uma molécula de ácido nucleico, como em “sequência de ácido nucleico isolada” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual normalmente está associada em sua fonte natural.

Uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico presente em uma forma ou configuração diferente daquela encontrada na natureza. Em contrapartida, moléculas de ácido nucleico não isoladas são moléculas de ácido nucleico como DNA e RNA que são encontradas no estado em que elas existem na natureza. Por exemplo, uma determinada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira próxima de genes vizinhos; ou sequências de RNA, tal como uma sequência de RNAm que codifica uma proteína específica, presentes na célula na forma de uma mistura com inúmeros RNAm diferentes que codificam uma variedade de proteínas. Entretanto, uma sequência de ácido nucleico isolada que compreende, por exemplo, SEQ ID NO: 1 inclui, a título de exemplo, tais sequências de ácidos nucleicos em células que contêm normalmente a SEQ ID NO: 1, onde a sequência de ácido nucleico está em uma localização genômica ou plasmidial diferente da localização encontrada nas células naturais, ou é de outro modo flanqueada por uma sequência de ácido nucleico diferente da encontrada na natureza. A sequência de ácido nucleico isolada pode estar presente na forma de fita simples ou fita dupla. Quando uma sequência de ácido nucleico isolada deve ser utilizada para expressar uma proteína, a sequência de ácido nucleico irá conter no mínimo, pelo menos, uma parte da fita sense ou codificante (ou seja, a sequência de ácido nucleico pode ser de fita simples). Alternativamente, ela pode conter tanto a fita sense como a fita antisense (ou seja, a sequência de ácido nucleico pode ser de fita dupla).

[105] Nitrilase: O termo “nitrilase” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um enzima catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico e/ou a reação de tereftalonitrila para ácido 4- cianobenzóico de amônio. Também abrange as enzimas que estão catalisando reações adicionais, apesar das mencionadas anteriormente.

[106] Não codificante: O termo “não codificante” refere-se às sequências de moléculas de ácido nucleico que não codificam parte ou a totalidade de uma proteína expressa. Sequências não codificantes incluem, mas não estão limitadas aos intensificadores/ facilitadores (enhancers), regiões promotoras, regiões não traduzidas a 3' e regiões não traduzidas a 5'.

[107] Ácidos nucleicos e nucleotídeos: Os termos “ácidos nucleicos” e “nucleotídeos” referem-se aos ácidos nucleicos ou nucleotídeos que ocorrem naturalmente, sintéticos ou artificiais. Os termos “ácidos nucleicos” e “nucleotídeos” compreendem desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridos dos mesmos na configuração sense ou antisense, de fita simples ou fita dupla.

Salvo quando disposto de outra forma, uma sequência de acido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas deste (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como as sequências explicitamente indicadas. O termo “ácido nucleico” é utilizado de maneira alternada no presente com os termos “gene”, “cDNA”, “mRNA”, “oligonucleotídeo” e “molécula de ácido nucleico”. Análogos de nucleotídeos incluem nucleotídeos que possuem modificações na estrutura química da base, açúcar e/ou fosfato, incluindo, mas não se limitando a, modificações da pirimidina na posição 5, modificações da purina na posição 8, modificações nas aminas exocíclicas da citosina, substituição de 5-bromo da uracila, e similares; e modificações de açúcar na posição 2', incluindo mas não se limitando a, ribonucleotídeos com açúcar modificado na qual o 2'-OH é substituído por um grupo selecionado a partir de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 ou CN. RNA em grampo curto (short hairpin RNA ou shRNAs) também podem compreender elementos não naturais, como bases não naturais, por exemplo, ionosina e xantina, açúcares não naturais, por exemplo, ribose, 2'-metoxi, ou ligações fosfodiéster não naturais, por exemplo, metilfosfonatos, fosforotioatos e peptídeos.

[108] Sequência de ácido nucleico: A frase “sequência de ácido nucleico” refere-se a um polímero de de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo de fita simples ou fita dupla que é lido da extremidade 5' para a extremidade 3'. Este inclui DNA cromossômico, plasmídeos de autorreplicação, polímeros infecciosos de DNA ou RNA e DNA ou RNA que desempenham um papel principalmente estrutural. “Sequência de ácido nucleico” também se refere a uma lista consecutiva de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras, que representam nucleotídeos. Em um exemplo de realização, um ácido nucleico pode ser uma “sonda” que é um ácido nucleico relativamente curto, geralmente com menos de 100 nucleotídeos de comprimento. Muitas vezes, uma sonda de ácido nucleico possui cerca de 50 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Uma “região alvo” de um ácido nucleico é uma porção de um ácido nucleico que é identificado como sendo de interesse. Uma “região codificante” de um ácido nucleico é a porção do ácido nucleico que é transcrita e traduzida de forma específica com a sequência para produzir um polipeptídeo ou proteína particular quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. A região codificante é dita por codificar um polipeptídeo ou proteína.

[109] Oligonucleotídeo: O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um oligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) ou seus miméticos, bem como oligonucleotídeos possuindo porções de ocorrência não natural, que funcionam de forma semelhante. Tais oligonucleotídeos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos em relação às formas nativas devido às propriedades desejáveis, como, por exemplo, captação celular aumentada, afinidade aumentada para o ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases. Um oligonucleotídeo preferencialmente inclui dois ou mais nucleomonômeros covalentemente acoplados entre si (por exemplo, por ligações fosfodiéster) ou ligações substitutas.

[110] Saliência: Uma “saliência” (overhang) é uma sequência relativamente curta de cadeia simples de nucleotídeos na extremidade hidroxila 5' ou 3' de uma molécula de oligonucleotídeo de fita dupla (também referida como “extensão”, “extremidade saliente,” ou “extremidade coesiva (sticky end)”).

[111] Polipeptídeo: Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “oligopeptídeo”, “produto gênico”, “produto da expressão” e “proteína” são utilizados no presente pedido de modo indiferente para se referirem a um polímero ou oligômero de resíduos de aminoácidos consecutivos.

[112] Promotor: Os termos “promotor” ou “sequência promotora” são equivalentes e, conforme utilizado na presente invenção, referem-se a uma sequência de DNA que quando está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse é capaz de controlar a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse em RNA. Um promotor está localizado a 5' (ou seja, a montante), proximal em relação ao local de início da transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse cuja transcrição em mRNA ele controla e fornece um sítio para a ligação específica da RNA polimerase e outros fatores de transcrição para da início a transcrição. O promotor não compreende regiões codificantes ou regiões não traduzidas 5'. O promotor pode, por exemplo, ser heterólogo ou homólogo para a respectiva célula. Uma sequência de ácido nucleico é “heteróloga para” um organismo ou uma segunda sequência de ácido nucleico se ela se origina a partir de uma espécie diferente ou, se a partir da mesma espécie, é modificada de sua forma original. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a uma sequência codificante heterólogas refere-se a uma sequência codificante de uma espécie diferente daquela a partir da qual o promotor foi derivado, ou, se a partir da mesma espécie, uma sequência codificante que não está naturalmente associada com o promotor (por exemplo, uma sequência codificante geneticamente modificada ou um alelo a partir de um ecótipo ou variedade diferente). Os promotores adequados podem ser derivados de genes de células hospedeiras onde deve ocorrer a expressão ou a partir de agentes patogênicos para esta célula hospedeira.

[113] Purificado: Conforme utilizado na presente invenção, o termo “purificado” refere-se a moléculas, sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos que são retirados do seu ambiente natural, isolados ou separados. Moléculas “substancialmente purificadas” são pelo menos 60% livres, de um modo preferido pelo menos 75% livres, e mais preferencialmente pelo menos 90% livres de outros componentes com os quais elas estão naturalmente associadas. Uma sequência de ácido nucleico purificada pode ser uma sequência de ácido nucleico isolada.

[114] Aumento significante: Um aumento, por exemplo, na atividade enzimática, expressão gênica, produtividade ou rendimento de um determinado produto é maior do que a margem de erro inerente à técnica de medição, sendo de preferência um aumento em cerca de 10% ou 25%, de preferência 50% ou 75%, mais preferencialmente de 2 vezes ou 5 vezes ou mais a atividade, expressão, produtividade ou rendimento da enzima de controle ou expressão, produtividade ou rendimento na célula de controle, ainda mais de preferência um aumento em cerca de 10 vezes ou mais.

[115] Diminuição significante: Uma diminuição, por exemplo, na atividade enzimática, expressão gênica, produtividade ou rendimento de um determinado produto, que é maior do que a margem de erro inerente à técnica de medição, preferencialmente uma diminuição de pelo menos cerca de 5% ou 10%, de preferência pelo menos cerca de 20% ou 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% ou 75%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% ou 85%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%.

[116] Substancialmente complementar: No seu sentido mais amplo, o termo “substancialmente complementar”, quando aqui utilizado relacionado a uma sequência de nucleotídeos em relação a uma sequência de nucleotídeos de referência ou alvo, significa uma sequência de nucleotídeos possuindo uma percentagem de identidade entre a sequência de nucleotídeos substancialmente complementar e a sequência complementar exata da referida sequência de nucleotídeos de referência ou alvo de pelo menos 60%, mais desejavelmente pelo menos 70%, mais desejavelmente pelo menos 80% ou 85%, de preferência pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 93%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% ou 96%, ainda mais preferencialmente pelo menos 97% ou 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% ou mais preferencialmente 100% (a posteriormente sendo equivalente ao termo “idêntico” no presente contexto). Preferencialmente, a identidade é avaliada ao longo de um comprimento de pelo menos 19 nucleotídeos, de preferência pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferencialmente de todo o comprimento da sequência de ácido nucleico para a referida sequência de referência (se não especificado de outro modo abaixo).

Comparações de sequências são realizadas usando análise GAP padrão com o University of Wisconsin GCG, a aplicação SEQWEB da GAP, baseado no algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol.

48: 443-453; tal como definido acima). Uma sequência de nucleotídeos “substancialmente complementar” a uma sequência de nucleotídeos de referência se hibridiza com a sequência de nucleotídeos de referência em condições de baixa estringência, média estringência, e mais preferivelmente condições de elevada estringência (conforme definido anteriormente).

[117] Transgene: O termo “transgene” conforme utilizado na presente invenção refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico, que é introduzida no genoma de uma célula por meio de manipulações experimentais. Um transgene pode ser uma “sequência de DNA endógeno,” ou “sequência de DNA heterólogo” (ou seja, “DNA exógeno”). O termo “sequência de DNA endógeno” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida, desde que ela não contenha algumas modificações (por exemplo, mutação pontual, presença de um gene marcador selecionável, etc) em relação à sequência de ocorrência natural.

[118] Transgênico: O termo transgênico quando se refere a um organismo significa transformado/ modificado, de preferência transformado de forma estável, com pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante.

[119] Vetor: Conforme utilizado no presente, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outra molécula de ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um vetor genômico integrado, ou “vetor integrado”, que pode tornar-se integrado ao DNA genômico da célula hospedeira. Outro tipo de vetor é um vetor epissomal, ou seja, um plasmídeo ou molécula de ácido nucleico capaz de replicação extracromossômica. Os vetores capazes de conduzir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados são referidos no presente como “vetores de expressão”. No presente relatório descritivo os termos “plasmídeo” e “vetor” são utilizados de modo indiferente a menos que de outro modo fique evidente pelo contexto.

[120] Tipo selvagem: O termo “tipo selvagem”, “natural” ou “origem natural” significa, com relação a um organismo, que o referido organismo não foi alterado, mutado ou de outro modo manipulado pelo homem.

Com relação a um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, o polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico é de ocorrência natural ou está disponível em pelo menos um organismo de ocorrência natural que não é alterado, mutado ou de outro modo manipulado pelo homem.

[121] Um tipo selvagem de um micro-organismo refere-se a um micro-organismo cujo genoma está presente em um estado como antes da introdução de uma modificação genética de um determinado gene. A modificação genética pode ser, por exemplo, uma deleção de um gene ou uma parte deste gene ou uma mutação pontual ou a introdução de um gene.

[122] Os termos “produção” ou “produtividade” são reconhecidos no estado da técnica e incluem a concentração do produto de fermentação (por exemplo, dsRNA) formada dentro de um determinado tempo e um dado volume de fermentação (por exemplo, kg de produto por hora por litro). O termo “eficiência de produção” inclui o tempo necessário para um determinado nível de produção ser atingido (por exemplo, quanto tempo leva para que a célula alcançar uma determinada taxa de produção de um produto químico fino).

[123] O termo “rendimento” ou “rendimento do produto/carbono” é reconhecido na técnica e inclui a eficiência da conversão da fonte de carbono em produto (ou seja, produto de química fina). Isto é geralmente escrito como, por exemplo, kg de produto por kg de fonte de carbono. Ao aumentar o rendimento ou produção do composto, a quantidade de moléculas recuperadas ou de moléculas recuperadas úteis desse composto em uma determinada quantidade de cultura ao longo de um determinado período de tempo é aumentada.

[124] O termo “micro-organismo recombinante” inclui micro- organismos que foram geneticamente modificados de tal forma que eles apresentam um genótipo e/ou fenótipo alterado ou diferente (por exemplo, quando a modificação genética afeta sequências de ácidos nucleicos codificantes do micro-organismo) em comparação com o micro-organismo tipo selvagem a partir do qual foi derivado. Um microrganismo recombinante compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante.

[125] O termo “recombinante”, em relação às moléculas de ácido nucleico, refere-se a moléculas de ácido nucleico produzidas pelo homem usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes. O termo compreende moléculas de ácidos nucleicos que, como tal, não existem na natureza ou não existem no organismo a partir do qual os ácidos nucleicos são derivados, mas estão modificados, alterados, mutados ou de outro modo manipulados pelo homem. Preferencialmente, uma “molécula de ácido nucleico recombinante” é uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural que difere na sequência de uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural por pelo menos um ácido nucleico. Uma “molécula de ácido nucleico recombinante” também pode compreender uma “construção recombinante”, que compreende uma sequência de moléculas de ácido nucleico, preferencialmente operacionalmente ligada, que não ocorre naturalmente na mesma ordem. Métodos preferidos para produzir a referida molécula de ácido nucleico recombinante podem compreender técnicas de clonagem, técnicas de mutagênese direcionada ou não direcionada, síntese gênica ou recombinação.

[126] Um exemplo de tal molécula de ácido nucleico recombinante é um plasmídeo no qual foi inserido uma sequência de DNA heterólogo ou gene ou promotor que foi mutado em comparação com o gene ou promotor a partir do qual a molécula de ácido nucleico recombinante é derivada. A mutação pode ser introduzida por meio das tecnologias de mutagênese direcionada conhecidas na técnica, ou por tecnologias de mutagênese aleatória como mutagênese química, por luz UV ou raios-X ou tecnologias de evolução direcionada.

[127] O termo “evolução direcionada” é usado como sinônimo do termo “evolução metabólica” no presente pedido e envolve a aplicação de uma pressão de seleção que favorece o crescimento de mutantes com as características de interesse. A pressão de seleção pode ser baseada em diferentes condições de cultura, seleção acoplada de crescimento e ATP e seleção relacionada ao redox. A pressão de seleção pode ser realizada com a fermentação em sistema descontínuo com inoculação por transferência seriada ou em cultura contínua com a mesma pressão.

[128] O termo “expressão” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um(alguns) gene(s) específico(s) ou construção de vetor genético específico. O termo “expressão” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um(alguns) gene(s) ou construção de vetor genético específico em mRNA. O processo inclui a transcrição do DNA e pode incluir o processamento do produto mRNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão gênica” pode também incluir a tradução do mRNA e, desse modo, a síntese da proteína codificada, ou seja, a expressão da proteína.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[129] A Figura 1 mostra a reação catalisada pelas nitrilases da invenção.

[130] A Figura 2 mostra a bioconversão de tereftalonitrila por células heterólogas de E. coli que expressam a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq. ID 2).

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[131] 89 nitrilases potenciais foram rastreadas quanto à atividade de conversão de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico. Organismo doador e as SEQ ID NOs das sequências de aminoácidos de 18 nitrilases ativas no rastreio e uma nitrilase não funcional estão listados na Tabela 1. A região codificante das nitrilases foram otimizadas para a expressão em E. coli, estas sequências foram sintetizadas e clonadas no vetor de expressão pDHE (Stueckler et al. (2010) Tetrahedron 66 (3-2)).

[132] As cepas de E. coli foram transformadas com os vetores de expressão, a expressão das nitrilases foi induzida e a cultura coletada e testada quanto à atividade, tal como descrito abaixo.

TABELA 1 ORGANISMO DOADOR, SEQ ID NO, E FORMAÇÃO DE ÁCIDO 4-CIANOBENZÓICO DE 18 NITRILASES ATIVAS. Ácido 4-cianobenzóico SEQ. ID NO Organismo doador [mM] 10 Tepidicaulis marinus 88 101 Smithella sp. SDB 2 4 Organismo procariótico desconhecido 328 103 Bradyrhizobium diazoefficiens 35 105 Aquimarina atlantica 2 107 Arthrobacter sp. Soil736 7 12 Sphingomonas wittichii RW1 126 111 Pseudomonas sp. RIT357 87 113 Nocardia brasiliensis NBRC 14402 22 109 Pseudomonas mandelii JR-1 14 8 Candidatus Dadabacteria bacterium CSP1-2 268 22 Salinisphaera shabanensis E1L3A 81 16 Synechococcus sp. CC9605 158

Ácido 4-cianobenzóico SEQ. ID NO Organismo doador [mM] 14 Rhizobium sp. YK2 192 6 Agrobacterium rubi 293 20 Flavihumibacter solisilvae 106 115 Defluviimonas alba 60 2 Comamonas testosteroni 704 24 Erythrobacter sp. JL475 0

[133] 128 mg de tereftalonitrila foram pesados em um tubo Eppendorf de 1,5 mL e misturados com solução tampão de fosfato 50 mM em pH 7. Para iniciar a reação, 50-100 µL de suspensão de células de E. coli contendo diferentes nitrilases foram adicionados e a mistura agitada a 37ºC. A concentração final de tereftalonitrila no tubo de reação foi de 1 M. Após 48 horas, toda a mistura de reação foi diluída em DMSO. Uma amostra desta solução foi retirada, diluída em água e submetida à análise por HPLC. Os resultados são relatados como concentração de ácido 4-cianobenzóico presente na mistura de reação de 1 mL antes da diluição com DMSO.

EXEMPLO 2

[134] 1100 mL de água e 100 g de tereftalonitrila foram colocados em um reator.

[135] O biocatalisador foi utilizado na forma de suspensão de células concentradas contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq. ID 2) e foi adicionado ao reator, de modo que a bioconversão foi iniciada. A temperatura foi mantida a 37ºC e o reator foi misturado por um agitador suspenso. A mistura foi agitada durante 21 horas e amostras para a análise do ácido 4-cianobenzóico foram retiradas do reator. O curso de tempo de conversão de tereftalonitrila e formação de ácido 4-cianobenzoico são fornecidos na Figura 2.

[136] Após a bioconversão, a mistura de reação foi removida do reator e filtrada através de Celite535 para remover as células de E. coli heterólogas que expressam a nitrilase. Foi adicionado ácido, neste caso ácido sulfúrico, para precipitar o ácido 4-cianobenzóico, que foi separado da mistura reacional aquosa por filtração. O produto úmido foi seco até atingir um peso constante. 111,5 g de ácido 4-cianobenzóico foram recuperados.

EXEMPLO 3

[137] 128 mg de tereftalonitrila foram pesados em um tubo Eppendorf de 1,5 mL e misturados com água ou solução tampão de fosfato 50 mM em pH 7. Para iniciar a reação, 50-100 µL de suspensão de células de E.

coli contendo diferentes nitrilases foram adicionados e a mistura agitada a 37ºC. A concentração final de tereftalonitrila no tubo de reação foi de 1 M. Após 24 horas, toda a mistura de reação foi diluída em DMSO. Uma amostra desta solução foi retirada, diluída em água e submetida à análise por HPLC. Os resultados são relatados como concentração de ácido 4-cianobenzóico presente na mistura de reação de 1 mL antes da diluição com DMSO.

TABELA 2 Ácido 4-cianobenzóico [mM] Ácido 4-cianobenzóico [mM/OD600] Seq. ID Água Tampão Água Tampão 4 297 341 44 50 8 284 294 24 24 6 275 345 26 32 2 752 655 136 118 Ara Nit 46 56 5 6 Bras Nit 79 82 7 7 Can Nit 50 38 5 4 Panto Nit 198 229 22 26 Acid Nit 105 136 13 17 Lepto Nit 178 222 15 19

[138] Tabela 2: Formação de ácido 4-cianobenzóico a partir das nitrilases com as sequências IDs 4 (organismo procariótico desconhecido), 8

(Candidatus dadabacteria CSP1-2), 6 (Agrobacterium rubi) e 2 (Comamonas testosteroni) e das seis nitrilases descritas na CN107641622A Ara Nit (Arabidopsis thaliana), Bras Nit (Brassica oleracea), Can Nit (Camelia sativa), Panto Nit (Pantoea sp. AS-PWVM4), Acid Nit (Acidovorax facilis 72W), Lepto Nit (Leptolyngbya sp.). Água ou uma solução aquosa tamponada (tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH 7) foi usada como meio de reação. A formação de ácido 4-cianobenzóico é dada em mM conforme analisado após a fase de incubação e também como mM/OD600 para normalização da quantidade produzida de acordo com a biomassa de E. coli heteróloga aplicada em cada reação.

EXEMPLO 4

[139] O efeito da adição de íons Mg2+ à mistura de reação foi investigado. 128 mg de tereftalonitrila foram pesados para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e misturados com água. MgSO4 foi adicionado a partir de uma solução estoque a 1 M em água obtendo-se diferentes concentrações finais de MgSO4 na reação. Para iniciar a reação, foram adicionados 100 µL de uma suspensão de células E. coli contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq ID No. 2) e a mistura foi agitada a 1000 rpm em um Eppendorf Thermomixer a 37ºC. A concentração final de tereftalonitrila no tubo de reação foi de 1 M. Após 23 horas, toda a mistura de reação foi diluída em DMSO. Uma amostra desta solução foi retirada, diluída em água e submetida à análise por HPLC. Os resultados são relatados como concentração de ácido 4- cianobenzóico presente na mistura de reação de 1 mL antes da diluição com DMSO.

TABELA 3 MgSO4 [mM] Ácido 4-cianobenzóico [mM] Tereftalonitrila residual [mM] Soma [mM] 0 855 186 1041 10 931 162 1093 25 958 51 1009

MgSO4 [mM] Ácido 4-cianobenzóico [mM] Tereftalonitrila residual [mM] Soma [mM] 40 1038 66 1104 50 955 19 973 100 1075 0 1075 125 1003 0 1003 150 1026 0 1026 175 1012 0 1012 200 1016 0 1016 250 1042 7 1049

[140] Tabela 3: Formação de ácido 4-cianobenzóico a partir da nitrilase com a sequência de SEQ ID NO: 2 (Comamonas testosteroni) quando diferentes concentrações de MgSO4 são usadas na reação biocatalítica.

[141] A maior concentração de ácido 4-cianobenzóico foi alcançada quando 100 mM ou mais de MgSO4 é adicionado à reação. Nestes casos, a conversão completa do tereftalonitrila foi observada.

EXEMPLO 5

[142] O efeito da adição de íons Mg2+ à mistura de reação foi investigado em combinação com concentrações mais altas de tereftalonitrila.

128 mg ou 256 mg de tereftalonitrila foram pesados para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e misturados com água. MgSO4 foi adicionado a partir de uma solução estoque a 1 M em água obtendo-se 100 ou 200 mM de MgSO4, respectivamente, na mistura de reação. Para iniciar a reação, foram adicionados 100 µL de uma suspensão de células E. coli contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq ID No. 2) e a mistura foi agitada a 1000 rpm em um Eppendorf Thermomixer a 37ºC. A concentração final de tereftalonitrila no tubo de reação foi de 1 M ou 2 M, respectivamente. Após pontos de tempo previamente definidos, toda a mistura de reação foi diluída em DMSO. As amostras desta solução foram retiradas, diluídas em água e submetidas à análise por HPLC. Os resultados são relatados como concentração de ácido 4- cianobenzóico presente na mistura de reação de 1 mL antes da diluição com

DMSO.

TABELA 4 Tempo de Tereftalonitrila Tereftalonitrila MgSO4 Ácido 4-cianobenzóico reação residual [mM] [mM] [mM] [h] [mM] 0,5 392 643 1 651 450 2 1028 99 1000 100 4 1104 6 6 1054 11 23 1072 0 0,5 381 1075 1 649 927 2 932 854 2000 100 4 1015 867 6 1038 894 23 1083 860 0,5 370 711 1 616 445 2 973 70 1000 200 4 1059 3 6 1078 5 23 1080 0 0,5 355 1072 1 569 902 2 1033 877 2000 200 4 1307 783 6 1314 795 23 1355 805

[143] Tabela 4: Formação de ácido 4-cianobenzóico a partir da nitrilase com a sequência de SEQ ID NO: 2 (Comamonas testosteroni) quando diferentes concentrações de MgSO4 e diferentes concentrações de tereftalonitrila são usadas na reação biocatalítica.

[144] A concentração de produto mais elevada foi alcançada quando a mistura de reação é suplementada com 200 mM de MgSO 4 e 2 M de tereftalonitrila. A conversão completa de 2 M de tereftalonitrila, entretanto, não foi alcançada.

EXEMPLO 6

[145] O efeito da temperatura no desempenho da reação foi investigado na presença ou ausência de MgSO4. Aproximadamente, 128 mg de tereftalonitrila foram pesados para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e misturados com água. MgSO4 foi adicionado a partir de uma solução estoque a 1 M em água obtendo-se 0 ou 100 mM de MgSO4, respectivamente, na mistura de reação. Para iniciar a reação, foram adicionados 100 µL de uma suspensão de células E. coli contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq ID No. 2) e a mistura foi agitada a 1000 rpm em um Eppendorf Thermomixer em diferentes temperaturas (ou seja, 20ºC, 25ºC, 30ºC, 37ºC). A concentração final de tereftalonitrila no tubo de reação foi aproximadamente 1 M. Após pontos de tempo previamente definidos, toda a mistura de reação foi diluída em DMSO.

As amostras desta solução foram retiradas, diluídas em água e submetidas à análise por HPLC. Os resultados são relatados como concentração de ácido 4- cianobenzóico presente na mistura de reação de 1 mL antes da diluição com DMSO.

TABELA 5 Temperatura [° MgSO4 Tempo de reação Ácido 4-cianobenzóico Tereftalonitrila residual C] [mM] [h] [mM] [mM] 0,5 118 634 1 256 622 20 0 2 549 520 22 1079 0 0,5 76 680 1 176 752 20 100 2 407 650 22 1034 0 0,5 217 714 1 438 561 25 0 2 761 326 22 1072 0

Temperatura [° MgSO4 Tempo de reação Ácido 4-cianobenzóico Tereftalonitrila residual C] [mM] [h] [mM] [mM] 0,5 182 675 1 364 656 25 100 2 706 350 22 1043 0 0,5 321 701 1 531 520 30 0 2 812 216 22 1045 0 0,5 246 744 1 497 568 30 100 2 897 181 22 1090 0 0,5 611 442 37 0 2 853 245 23 855 186 0,5 480 648 37 100 1 1049 58 2 1075 0

[146] Tabela 5: Formação de ácido 4-cianobenzóico a partir da nitrilase com a sequência de SEQ ID NO: 2 (Comamonas testosteroni) em diferentes temperaturas na presença ou ausência de MgSO 4 na reação biocatalítica.

[147] Em uma temperatura de reação de 37ºC, a conversão completa de 1M de tereftalonitrila só foi alcançada quando a mistura de reação foi suplementada com MgSO4. Isso implica que o efeito benéfico da adição de Mg2+ é mais pronunciado em temperaturas de reação mais altas.

EXEMPLO 7

[148] O biocatalisador aplicado (suspensão de células de E. coli contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 2) catalisa principalmente a conversão de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico como a reação principal.

[149] As condições de reação durante a conversão biocatalítica podem ser ajustadas a fim de minimizar a formação excessiva de ácido tereftálico. 8,14 g de tereftalonitrila foram adicionados a 91,36 g de água deionizada em um reator EasyMax 102 com volume de trabalho de 100 mL (Eppendorf, Alemanha). A temperatura foi ajustada para 33ºC e a velocidade do agitador foi ajustada para 400 rpm. A mistura foi mediada por um agitador impulsor. 0,5 g de uma suspensão de células de E. coli em tampão de fosfato de potássio contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 2) foi adicionado para iniciar a bioconversão. Amostras foram retiradas para análise de ácido 4-cianobenzóico e ácido tereftálico em intervalos regulares. Após 10,5 h, a reação foi terminada e as células foram removidas por filtração em Celite535. O teor final de ácido 4-cianobenzóico foi de 93 g/kg e o teor final de ácido tereftálico foi de 0,2 g/kg. Isto corresponde a uma conversão total do tereftalonitrila aplicada a estes dois produtos da reação biocatalítica. A fração de ácido 4-cianobenzóico em relação à quantidade total do produto foi de 99,8%. 0,2% da fração total do produto era ácido tereftálico. A fração de ácido tereftálico depende da eficiência da mistura, da quantidade de biocatalisador adicionado à reação e da temperatura.

TABELA 6 Parâmetro Unidade Dados Temperatura de reação [°C] 33 Escala de reação [kg] 0,1 TDN [g] 8,136 Concentração de biomassa [gBDW/kg] 0,183 Atividade inicial específica inicial [kU/gBDW] 5,2 Conversão completa SIM/NÃO SIM Duração total da reação [h] 10,5 Concentração final de 4-CBA [g/kg] 93,02 Concentração final de TA [g/kg] 0,20 Fração de massa 4-CBA do produto total [%] 99,79 Rendimento específico Yp/x [g4-CBA/gBDW] 508

Parâmetro Unidade Dados Conversão [%] 100

[150] Tabela 6: Condições de reação e parâmetros de reação para a bioconversão de tereftalonitrila. TDN: tereftalonitrila, BDW: peso seco de biomassa, 4-CBA: ácido 4-cianobenzóico, TA: ácido tereftálico. A atividade específica inicial do catalisador é determinada na primeira hora de reação e é dada em kU. 1 kU corresponde a 1 mmol de ácido 4-cianobenzóico formado por minuto.

EXEMPLO 8

[151] 3.515 g de água e 445 g de tereftalonitrila foram colocados em um reator. O biocatalisador foi utilizado na forma de suspensão de células concentradas contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (Seq. ID 2) e foi adicionado ao reator, de modo que a bioconversão foi iniciada. A temperatura foi mantida a 30ºC e o reator foi misturado por um agitador suspenso. A mistura foi agitada durante 23 h.

[152] Após a bioconversão, o pH foi ajustado com NaOH para pH 9,4 e a mistura de reação foi removida do reator. Uma ultrafiltração em uma máquina Sartoflow Advance (Sartorius) foi realizada usando uma membrana com um corte de peso molecular de 10 kDa para remover as células heterólogas de E. coli que expressam a nitrilase. O filtrado resultante foi dividido em duas porções. 1748 g do filtrado resultante foram diluídos com 1500 g de água e o pH foi ajustado para pH 2,2 por titulação com ácido clorídrico a 32% em peso para precipitar o ácido 4-cianobenzóico. Outros 500 g de água foram adicionados para facilitar a mistura durante a adição da solução de ácido clorídrico. A suspensão foi filtrada e lavada 1x com 1500 g de água. O produto úmido foi seco até atingir um peso constante. 193 g de produto cristalino foram recuperados e analisados por HPLC quanto ao teor de cloreto e água (porção 1). 2.029 g do filtrado resultante foram diluídos com 1500 g de água e o pH foi ajustado para pH 1,89 por titulação com ácido clorídrico a 32% em peso para precipitar o ácido 4-cianobenzóico. Outros 250 g de água foram adicionados para facilitar a mistura durante a adição da solução de ácido clorídrico. A suspensão foi filtrada e lavada 2x com 1500 g de água. O produto úmido foi seco até atingir um peso constante. 223 g de produto cristalino foram recuperados e analisados por HPLC quanto ao teor de cloreto, bem como de água (porção 2). A quantidade de água usada para a lavagem da torta de filtragem é decisiva para a pureza do produto resultante. O maior volume de lavagem reduz a quantidade de cloreto residual e outros componentes indesejados no produto final. A fração que falta para dar uma soma de 100% é composta de amônio e sódio e contaminantes da biotransformação anterior, tal como fosfato.

TABELA 7 Composto Teor na porção 1 Teor na porção 2 Ácido 4-cianobenzoico 97,3 [% em peso] 99,0 [% em peso] Ácido tereftálico 0,3 [% em peso] 0,3 [% em peso] Cloreto (IC) 1,0 [% em peso] 0,3 [% em peso] Água 0,1 [% em peso] 0,1 [% em peso]

[153] Tabela 7: Composição química do produto quando é utilizado ácido clorídrico para a precipitação de ácido 4-cianobenzóico. IC: cromatografia de íons EXEMPLO 9

[154] 881 g de água e 108,9 g de tereftalonitrila foram colocados em um reator. O biocatalisador foi utilizado sob a forma de uma suspensão celular concentrada contendo a nitrilase de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 2) e adicionado ao reactor, onde a bioconversão começou. A temperatura foi mantida a 30°C e o reactor foi misturado por um agitador agitador suspenso. A mistura foi mexida durante 24 h.

[155] 612 g do filtrado foram diluídos com 1.000 g de água e o pH foi ajustado para pH 2,1 por titulação com ácido sulfúrico a 98% em peso para precipitar o ácido 4-cianobenzóico. A suspensão foi filtrada e lavada com 250 g de água. O produto úmido foi seco até atingir um peso constante. 56 g de produto cristalino foram recuperados e analisados por HPLC quanto ao teor de ácido 4-cianobenzóico, amônio, sulfato e sódio.

TABELA 8 Composto Teor Ácido 4-cianobenzóico (HPLC) 96,00 [% em peso] Ácido tereftálico Não determinado Amônio (IC) 0,60 [% em peso] Sulfato (IC) 3,10 [% em peso] Na (análise elementar) 0,70 [% em peso] Água Não determinado

[156] Tabela 8: Composição química do produto quando é utilizado ácido sulfúrico para a precipitação de ácido 4-cianobenzóico. IC: cromatografia iônica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. NITRILASE ISOLADA capaz de catalisar a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio, caracterizada por estar em um meio aquoso compreendendo água, nitrilase e tereftalonitrila e/ou ácido 4- cianobenzóico de amônio, em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico de amônio e meio aquoso após a incubação é de pelo menos 5% (p/p) e a concentração de tereftalonitrila é inferior a 1,0% (p/p).

2. NITRILASE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender menos de 0,5% (p/p) de ácido tereftálico após a incubação no meio aquoso.

3. NITRILASE ISOLADA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste; a. na molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8, e b. em uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, ou um fragmento funcional da mesma, e c. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e d. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e e. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes (rigorosas) a um fragmento com pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional desta, em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., d. e e. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso.

4. SEQUÊNCIA DE NITRILASE ISOLADA, caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste; a. na molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, e b. em uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e c. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e d. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e e. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., c., e e. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso.

5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 4- CIANOBENZÓICO ou sal do mesmo, caracterizado por compreender as etapas de; i. fornecer um meio aquoso compreendendo água, uma ou mais nitrilases e tereftalonitrila, ii. incubar o meio aquoso; e iii. opcionalmente, isolar o ácido 4-cianobenzóico ou sal do mesmo a partir da mistura de reação, em que a uma ou mais nitrilases são capazes de catalisar a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso compreendendo água, nitrilase e tereftalonitrila e/ou ácido 4- cianobenzóico de amônio, em que a concentração de ácido 4-cianobenzóico de amônio e meio aquoso após a incubação é de pelo menos 5% (p/p) e a concentração de tereftalonitrila é inferior a 1,0% (p/p).

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender menos de 0,5% (p/p) de ácido tereftálico após a incubação no meio aquoso.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pela nitrilase compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste; a. na molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8, e b. em uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, ou um fragmento funcional da mesma, e c. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e d. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional da mesma, e e. em uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes (rigorosas) a um fragmento com pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou um fragmento funcional desta,

em que a molécula de aminoácido conforme definida em b., d. e e. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso.

8. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 4- CIANOBENZÓICO ou sal do mesmo, caracterizado por compreender as etapas de; i. fornecer um meio aquoso compreendendo água, uma ou mais nitrilases e tereftalonitrila, ii. incubar o meio aquoso; e iii. opcionalmente, isolar o ácido 4-cianobenzóico ou sal do mesmo a partir da mistura de reação, em que uma ou mais nitrilases são selecionadas a partir do grupo que consiste em; a. uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e b. uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e, c. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e d. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e e. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma,

em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iii., iv.

e v. têm a atividade de conversão de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo meio aquoso compreender ainda um cátion divalente.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo cátion divalente ser Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+ ou Co2+.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pela tereftalonitrila ser adicionada ao meio aquoso antes da incubação em uma concentração entre 1% e 30% (p/p).

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo valor de pH do meio aquoso ser ajustado para abaixo de pH 5 pela adição de ácido ao meio aquoso durante ou após a incubação.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado pelo produto ser isolado por filtração ou centrifugação após a incubação.

14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 13, caracterizado pelo meio aquoso ser incubado por pelo menos 2h.

15. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado pelo meio aquoso ser incubado entre 15ºC e 50ºC.

16. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15, caracterizado pela nitrilase ser produzida por fermentação.

17. CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE compreendendo uma nitrilase, caracterizada pela nitrilase ser selecionada a partir do grupo que consiste em; a. uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e b. uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e, c. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e d. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e e. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iii., iv.

e v. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico em um meio aquoso.

18. CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pela nitrilase estar funcionalmente ligada a um promotor heterólogo.

19. VETOR RECOMBINANTE, caracterizado por compreender a construção recombinante conforme definida na reivindicação 17 ou 18.

20. MICRORGANISMO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender a construção recombinante conforme definida na reivindicação 17 ou 18 ou o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 19.

21. MICRORGANISMO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo microrganismo ser Rhodococcus rhodochrous, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Myceliophthora thermophila, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris.

22. MICRORGANISMO do gênero Comamonas testosteroni, Agrobacterium rubi, Candidatus dadabacteria bacterium, Tepidicaulis marinus, Sphingomonas wittichii, Rhizobium spec., Synechococcus sp. CC9605, Flavihumibacter solisilvae ou Salinisphaera shabanensis E1L3A, caracterizado por expressar qualquer uma das nitrilases conforme definidas nas reivindicações 1 a 4.

23. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA NITRILASE, caracterizado por compreender as etapas de; a. fornecer um microrganismo recombinante, conforme definido na reivindicação 18 ou 19, ou um microrganismo, conforme definido na reivindicação 20, e b. cultivar o microrganismo sob condições que permitam a expressão do referido gene da nitrilase.

24. COMPOSIÇÃO que compreende água, nitrilase, tereftalonitrila e/ou ácido 4-cianobenzóico, caracterizada pela nitrilase ser selecionada a partir do grupo que consiste em; a. uma molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 22, ou um fragmento funcional desta, e b. uma molécula de aminoácido com pelo menos 55% de identidade de sequência com a molécula de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ou 22, ou um fragmento funcional da mesma, e, c. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21 ou um fragmento funcional da mesma, e d. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, e e. uma molécula de aminoácido codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um fragmento de pelo menos 250 bases complementares à SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 ou 21, ou um fragmento funcional da mesma, em que a molécula de aminoácido conforme definida em ii., iii., iv.

e v. é catalisadora da reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico de amônio em um meio aquoso.

25. COMPOSIÇÃO, caracterizada por consistir; a) de 95 % em peso a 99,5 % em peso de ácido 4- cianobenzóico, b) de 0,0 % em peso a 0,5 % em peso de ácido tereftálico c) de 0,2 % em peso a 1,5 % em peso de cloreto d) de 0,05 % em peso a 0,2 % em peso de água e) e opcionalmente até 4,75 % em peso de outros componentes.

26. COMPOSIÇÃO, caracterizada por consistir; a) de 95 % em peso a 97 % em peso de ácido 4- cianobenzóico, b) de 0,0 % em peso a 0,5 % em peso de ácido tereftálico c) de 0,3 % em peso a 1,5 % em peso de amônio d) de 2,0 % em peso a 0,4 % em peso de sulfato e) de 0,4 % em peso a 1,0 % em peso de sódio f) e opcionalmente até 2,3 % em peso de outros componentes.

27. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA contendo pelo menos 5% (p/p) de ácido 4-cianobenzóico de amônio, menos de 1,0% (p/p) de tereftalonitrila e menos de 0,5% (p/p) de ácido tereftálico, caracterizado por compreender as etapas de; I. fornecer um meio aquoso compreendendo água, uma ou mais nitrilases e tereftalonitrila, e II. incubar o meio aquoso, em que a nitrilase é capaz de catalisar a reação de tereftalonitrila em ácido 4-cianobenzóico em um meio aquoso.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo meio aquoso compreender ainda um cátion divalente.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo cátion divalente ser Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Zn2+ ou Co2+.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pela tereftalonitrila ser adicionada ao meio aquoso antes da incubação em uma concentração entre 1% e 30% (p/p).

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo valor de pH do meio aquoso ser ajustado para abaixo de pH 27 pela adição de ácido ao meio aquoso durante ou após a incubação.

32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo produto ser isolado por filtração ou centrifugação após a incubação.

33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo meio aquoso ser incubado por pelo menos 2h.

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 33, caracterizado pelo meio aquoso ser incubado entre 15ºC e 50ºC.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

27 a 34, caracterizado pela nitrilase ser produzida por fermentação.