JPH0355115B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物を用いてＬ−トリプトフアン
ないしはその誘導体アミノ酸を製造する方法に関
するものである。 Ｌ−トリプトフアンは動物の必須アミノ酸の一
つであり、医薬、栄養剤あるいは動物飼料の添加
物として利用されている重要なアミノ酸である。
またＬ−トリプトフアンの誘導体は、Ｌ−トリプ
トフアン代謝の拮抗体としての作用をもつものが
あり、中枢神経系用薬品などの利用が考えられる
生理活性物質を含むものである。これらのアミノ
酸類の製法には、合成法、生化学的方法など数多
くの方法が知られている。 微生物を用いるＬ−トリプトフアンの製造方法
としては、糖質を用いて直接発酵法により、培養
液中にＬ−トリプトフアンを生成蓄積させる方法
の他に、インドールあるいはアントラニール酸を
糖質と同時に添加して培養し、Ｌ−トリプトフア
ンを培養液中に生成蓄積せしめる方法がある。一
方、インドールとセリン、あるいはインドールと
ピルビン酸およびアンモニウムイオンから微生物
の生成する酵素トリプトフアナーゼを用いてＬ−
トリプトフアンを製造する方法がある。酵素トリ
ブトフアナーゼを用いる時にはインドールの代り
に、他のインドール化合物を用いることにより、
相当する種々なアミノ酸を生成せしめることが可
能であり、目的に応じて反応を選択することがで
きる。 酵素トリプトフアナーゼを用いてＬ−トリプト
フアンを製造する方法には、エシエリチア属
（genus Escherichia）、プロテウス属（Genus
Proteus）、シユードモナス属（Genus
Pseudomonas）、アエロバクター属（Genus
Aerobacter）、あるいはエルビニア属（Genus
Erwinia）に属する微生物を用いて、インドール
とセリン、あるいはインドールとピルビン酸およ
びアンモニウムイオンとからＬ−トリプトフアン
を製造する方法（特公昭49−46917号）、エシエリ
チア属、クラビセプツ属（genus Claviceps）、
ノイロスポラ属（genus Neurospora）、サツカ
ロマイセス属（genus Saccharomyces）、バチル
ス属（genus Bacillus）、アクロモバクター属
（genus Achromobacter）あるいはアルカリゲネ
ス属（genus Alcaligenes）に属する微生物を用
いて、インドールとセリンよりＬ−トリプトフア
ンを製造する方法（フランス特許第1207437号、
特開昭47−39693号、特公昭53−1836）等がある。
一方、種々なインドール化合物を生成させる方法
には、プロテウス属、エシエリチア属、シエード
モナス属、アエロバクター属、あるいはエルビニ
ア属の微生物による５−ヒドロキシトリプトフア
ンの製法（特公昭49−46917）、アクロモバクター
属、エシエリチア属、シエードモナス属、アルカ
リゲネス属あるいはプロテウス属の微生物を用い
る５−ヒドロキシトリプトフアンの製法（特公昭
53−1835）、コリネバクテリウム属（genus
Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属
（genus Brevibacterium）などの属に属する微生
物を用いる５−ヒドロキシトリプトフアン、メト
キシトリプトフアンなどの製造方法（特公昭51−
5479、特公昭52−8400）が知られている。 これらの微生物を用いる製造方法は、合成法に
比較し、光学活性なＬ一体のみが生産できる利点
があり、インドール化合物、セリンあるいはピル
ビン酸などの工業用原料より、Ｌ−トリプトフア
ンないしはＬ−トリプトフアン誘導体を大量に生
産することが可能なものである。 本発明者らは、インドール化合物とセリン、あ
るいはインドール化合物とピルビン酸およびアン
モニウムイオンとからＬ−トリプトフアンないし
はその誘導体を生成する能力を有する微生物を広
く探索したところ、高い収率でこれらのアミノ酸
類を生成する新規な微生物を見い出し、これらの
微生物を用いて本発明を完成したのである。 すなわち、本発明は、エアロモナス・SP.AST
108−１（微工研菌寄第5539号）またはエアロモナ
ス・SP.AST 111−４（微工研菌寄第5540号）の
培養物あるいはその処理物の存在下に、インドー
ル化合物とセリン、あるいはインドール化合物と
ピルビン酸およびアンモニウムイオンとを反応せ
しめることを特徴とするＬ−トリプトフアンない
しはその誘導体アミノ酸の製法である。 種々な微生物がＬ−トリプトフアンを分解して
インドールを生成する酵素トリプトフアナーゼを
生成することは知られているが、酵素トリプトフ
アナーゼを生成する微生物のすべてが著量にＬ−
トリプトフアンを生成するものではない。酵素ト
リプトフアナーゼを生成する微生物のうちで、イ
ンドール化合物とセリン、あるいはインドール化
合物とピルビン酸およびアンモニウムイオンとか
ら効率よくＬ−トリプトフアンないしはその誘導
体アミノ酸を生成する微生物の条件としては、微
生物菌体中の酵素トリプトフアナーゼ活性が高い
こと、インドール化合物、セリン、ピルビン酸な
どの原料、および生成したＬ−トリプトフアンな
いしはその誘導体アミノ酸を分解しないことが必
須である。 本発明者らは、多数の酵素トリプトフアナーゼ
生成微生物を土壌中より分離し、そのなかから、
Ｌ−トリプトフアンないしはその誘導体アミノ酸
を効率よく生成する微生物としてエアロモナス属
に属する新菌種を発見した。すなわちエアロモナ
ス・SP.AST108−１（微生物受託番号、微工研菌
寄第5539号）、エアロモナス・SP.AST111−４
（微生物受託番号、微工研菌寄第5540号）であり、
いずれも本発明に用いる微生物として好ましいも
のである。 以下、これらの微生物の菌学的性質について記
載する。 (1) エアロモナス・SP.AST108−１ (A) 形態学的性質（肉汁32℃、24時間培養） 菌形：短桿菌、単一または２個連鎖、一端に
べん毛あり。 大きさ：0.9〜1.2μ×1.2〜2.0μ 運動性：あり グラム染色：陰性 抗酸性染色：陰性 胞子：形成しない。 細胞の多形性：なし (B) 培養的性質（32℃） 肉汁：生育良好、皮膜なし、菌環なし、沈渣
あり、液は濁る、色素生成なし 肉汁寒天平板：生育良好、円形、表面平滑、
隆起、全縁、光沢あり、淡い肌色、やや粘
性、色素生成なし。 肉汁寒天斜面：生育良好、糸状生育、光沢あ
り、淡い肌色、色素生成なし。 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃）：生育は上面
に良好で、淡い肌色、穿刺部分にやや生
育、穿刺部分にガス生成なし、液化なし。 (C) 生理的性質 生育温度：13〜37℃で生育する、45℃では生
育しない。 生育PH：５〜９。 酸素要求性：通性嫌気性。 OF試験（ヒユーレイフソン培地）：発酵 ガスの産生（グルコース培地）：ガス発生あ
り。 リトマスミルク：生育良好、淡い肌色の菌環
を形成する、リトマスはピンク色になる、
沈渣あり、ミルクは変化なし。 ゼラチン液化：液化しない。 硫化水素の生成：生成しない。 澱粉の分解：分解しない。 硝酸塩の還元：亜硫酸を生成する。 カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 ウレアーゼ活性：陰性 フエニルアラニンデアミナーゼ活性：陰性 リジンデカルボキシラーゼ活性：陰性 アルギニンヒドロラーゼ活性：陽性 オルニチンデカルボキシラーゼ活性：陽性 インドール生成：陽性 アンモニア生成：陽性 VP反応：陰性 MR試験：陽性 脱窒反応：陽性 クエン酸の利用： Koser培地：利用する Christensen培地：利用する。 食塩耐性：５％まで生育する。 色素の生成（キングＡ培地）：生成しない。 窒素源の利用性：アンモニウム塩、硝酸塩を
利用する。 糖類の利用性、酸、ガスの生成：

【表】 分離源：土壌
() エアロモナス・SP AST111−４ (A) 形態学的性質（肉汁32℃、24時間培養） 菌形：短桿菌、単一又は２〜３個連鎖、一端
にべん毛あり。 大きさ：0.8〜1.0μ×1.2〜1.8μ 運動性：あり グラム染色：陰性 抗酸性染色：陰性 胞子：形成しない。 細胞の多形性：なし (B) 培養的性質（32℃） 肉汁：生育良好、皮膜なし、菌環を形成する、
沈渣あり、液はやや濁る、色素生成なし。 肉汁寒天平板：生育良好、円形、表面平滑、
隆起、全縁、光沢あり、灰白色、やや粘
性、色素生成なし。 肉汁寒天斜面：生育良好、やや液状になつた
糸状の生育、光沢あり、灰白色、色素生成
なし。 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃）：生育は上面
に良好で灰白色、穿刺部分に生育あり、穿
刺部分にガス生成なし、液化なし。 (C) 生理的性質 生育温度：９〜45℃で生育する、50℃では生
育しない。 生育PH：５〜10 酸素要求性：通性嫌気性 OF試験（ヒユーレイフソン培地）：発酵 ガスの産生（グルコース培地）：ガス発生あ
り。 リトマスミルク：生育良好、リトマスは脱色
される、ミルク凝固する、沈渣あり。 ゼラチン液化：液化しない。 硫化水素の生成：生成しない。 澱粉の分解：分解しない。 硝酸塩の還元：亜硝酸を生成する。 カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 ウレアーゼ活性：陽性 フエニルアラニンデアミナーゼ活性：陰性 リジンデカルボキシラーゼ活性：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ活性：陰性 オルニチンデカルボキシラーゼ活性：陽性 インドール生成：陽性 アンモニア生成：陽性 VP反応：陽性 MR試験：陰性 脱窒反応：陽性 クエン酸の利用： Koser培地：利用する。 Christensen培地：利用する。 食塩耐性：５％まで生育する。 色素の生成（キングＡ培地）：生成しない。 窒素源の利用性：アンモニウム塩、硝酸塩、
尿素を利用する。 糖類の利用性、酸、ガスの生成

【表】 分離源：土壌
本発明者らが発見した微生物は、上記のごとき
菌学的性質をもつものである。これをバージーの
マニユアル・オブ・デターミナテイブ・バクテリ
オロジー（Bergeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版（1974）の記載にしたが
つて同定帰属を行なうと、グラム陰性の短桿菌、
通性嫌気性、べん毛は一端に１本ないし数本あつ
て運動する、カタラーゼ陽性、オキシターゼ陽
性、グルコースをよく発酵して酸およびガスを生
成するなどの分類学上の性質より、本微生物をビ
ブリオナシー科（family Vibrionaceae）のエア
ロモナス属（genus Aeromonas）に属せしめる
ことが妥当である。 また、バージーのマニユアル・オブ・デターミ
ナテイブ・バクテリオロジー第８版に記載されて
いるエアロモナス属の菌種は３種あり、エアロモ
ナス・ハイドロフイラ（Aeromonas
hydrophila）、エアロモナス・パンクテイタ
（Aeromonas punctata）およびアエロモナス・
サーモニサイダ（Aeromonas salmonicida）で
ある。これらの微生物と本発明の微生物を比較す
ると、エアロモナス・サーモニサイダは37℃で生
育できないが、本発明の微生物は良く生育するこ
とより、本発明の微生物とは異なる。一方、エア
ロモナス・ハイドロフイラおよびエアロモナス・
パンクテイタと比較すると、第１表に示したよう
に、多くの分類上の性質において、これらの微生
物は本発明の微生物とは異なるものである。かく
して、本発明の微生物を新しい菌種と認め、それ
ぞれエアロモナス・SP.AST−108−１およびエ
アロモナス・SP.AST−111−４と命名した。

【表】 本発明は、上記の菌種を使用して、トリプトフ
アンないしはその誘導体アミノ酸を製造する新規
な製造方法に関するものである。これらの微生物
を培養する培地としては、通常用いられる合成あ
るいは天然培地が好ましい。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、マンノース、シユーク
ロース、ガラクトース、キシロース、糖蜜などの
糖質、グリセリン、ソルビトールなどの糖アルコ
ール、酢酸、クエン酸、フマール酸、リンゴ酸、
コハク酸などの有機酸が適宜用いられる。培地中
に添加される量は、通常0.1〜10％程度である。
窒素源としては、塩安、リン安、硝安、酢酸アン
モン、アンモニア水などのアンモニア類、尿素、
肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーン・スチ
ープ・リカー、脱脂大豆粉、蛋白質加水分解物な
どの有機性窒素源が用いられる。また使用する微
生物の増殖を促進させる物質の添加が好ましい。
このような物質のうち無機物としては、リン酸第
１カリ、リン酸第２カリ、リン酸、塩化カリ、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウムのほか、鉄、亜
鉛、マンガン、銅、カルシウムなどの金属イオン
も適宜使用される。一方、有機物としては、アミ
ノ酸類、ビタミン類、有機酸類、脂肪酸類のほか
に、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・
スチープ・リカー、カゼイン、脱脂大豆加水分解
物などの天然物質が用いられる。 本発明に用いる微生物の生成する酵素トリプト
フアナーゼは適応酵素と考えられており、本発明
の反応に使用する微生物培養物を調製するにあた
つては、培地中にＬ−トリプトフアンを添加する
必要がある。Ｌ−トリプトフアンの添加量は、
0.1〜0.7％程度が好ましい。 このような培地に、本発明で使用する微生物を
25〜37℃において16〜96時間培養する。 かくして調製された微生物の培養物は、インド
ール化合物とセリン、あるいはインドール化合物
とピルビン酸およびアンモニウムイオンとから、
Ｌ−トリプトフアンないしはその誘導体アミノ酸
を生成する酵素系をもつものである。かかる培養
物はそのまま反応に使用してもよく、また培養物
を遠心分離法などで分離して得られる菌体、その
乾燥菌体、あるいは分離した菌体を超音波処理、
自己消化、磨砕などの方法により処理して得られ
る菌体処理物として使用してもよい。また、通常
の方法によつて酵素トリプトフアナーゼを抽出精
製したものを用いることもできる。さらには、分
離して得た菌体あるいは酵素をアクリル酸アミド
系単量体などと重合反応させ、かくして得られた
固定化菌体、あるいは固定化酵素として使用して
もよい。 このようにして調製した酵素トリプトフアナー
ゼを含有する菌体、菌体処理物、精製酵素、固定
化菌体、固定化酵素などを触媒として用い、イン
ドール化合物とセリン、あるいはインドール化合
物とピルビン酸およびアンモニウムイオンとから
なる反応液中で反応せしめて、Ｌ−トリプトフア
ンあるいはその誘導体アミノ酸を生成せしめる。 反応液には、基質であるインドール化合物、セ
リン、ピルビン酸、アンモニウムイオンの他に、
Ｌ−トリプトフアンあるいはその誘導体アミノ酸
の生成率を高めるために、反応液中にエチレンジ
アミン４酢酸液およびピリドキサールリン酸を共
存させることが好ましい。基質の使用量には制限
がないが、0.1〜10％の間で適宜使用する。酸素
反応は、通常PH５〜11の範囲、温度10〜60℃の範
囲において行なうことができる。 反応系に添加するインドール化合物としては、
たとえば、インドール、５−ヒドロキシインドー
ル、５−クロルインドール、５−ブロムインドー
ル、５−アミノインドール、５−メトキシインド
ールなどが利用できる。 反応液中に生成したＬ−トリプトフアンあるい
はその誘導体アミノ酸の単離は、通常のイオン交
換樹脂法、活性炭吸着法などの方法により行なう
ことができる。なお、生成したＬ−トリプトフア
ンあるいはその誘導体アミノ酸の確認と定量は、
高速液体クロマトグラフイー、シリカゲル薄層ク
ロマトグラフイーにより行なつた。 以下、実施例を挙げて説明するが、これらは例
示であつて本発明を限定するものではない。 実施例 １ 第１表に示した培地５mlを直径18mmの試験管に
分注し、120℃、10分間殺菌した培地に、エアロ
モナス・SP−AST108−１を１白金耳接種し、
32℃で20時間振盪培養した。この種培養液５mlを
第２表に示した培地100mlを500ml容量の振盪フラ
スコに入れて、120℃、10分間殺菌した本培養液
に接種して、32℃で20時間振盪培養した。 培養終了液２を遠心分離して菌体を集め、こ
れをピルビン酸ソーダー２ｇ、酢酸アンモニウム
２ｇ、ピリドキサール・リン酸10mg、エチレンジ
アミン４酢酸200mg、水100ml、PH9.0の組成をも
つ反応液180mlに懸濁した。これを６等分して、
それぞれの30mlに第２表に示したインドール化合
物をそれぞれ600mg加えて、振盪しながら32℃で
72時間反応を行なつた。 反応終了液に30mlのメタノールを加えて激しく
撹拌したのち、遠心分離して得た上澄液をサンプ
ルとして、高速液体クロマトグラフイーで生成し
たアミノ酸の分析を行なつたところ、第３表に示
すように、添加したインドール化合物に相当する
アミノ酸類が生成していた。 第２表 ペプトン ２％ カザミノ酸 １ 酵母エキス 0.5 コーン・スチープ・リカー ５ Ｌ−トリプトフアン 0.2 KH₂PO₄ 0.05 MgSO₄・7H₂O 0.05 FeSO₄・7H₂O 0.003 MnSO₄・4H₂O 0.003 PH 7.2

【表】 インドールを添加して得た反応液に苛性ソーダ
を加えてPH10にしたのち、アンモニア型強酸性イ
オン交換樹脂のカラムを通してＬ−トリプトフア
ンを吸着せしめ、2Nアンモニア水で溶出せしめ
た。溶出液を濃縮してＬ−トリプトフアンの粗結
晶を析出させたのち、これをアセトンで洗浄し、
乾燥してＬ−トリプトフアンの結晶を185mg得た。 実施例 ２ 実施例１と同様にしてエアロモナス・SP−
AST108−１を培養して培養終了液２を得た。
これを遠心分離して菌体を集め、Ｌ−セリン1.5
ｇ、ピリドキサールリン酸10mg、エチレンジアミ
ン４酢酸200mg、水100ml、PH9.0の組成をもつ反
応液180mlに懸濁した。これを６等分して、それ
ぞれ30mlに第４表に示したインドール化合物をそ
れぞれ600mg加えて、振盪しながら32℃で72時間
反応を行なつた。 反応終了液を実施例１と同様にして処理したの
ち、高速液体クロマトグラフイーにより生成した
アミノ酸を分析したところ、第４表に示すとお
り、添加したインドール化合物に相当するアミノ
酸が生成していた。

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様な培地にエアロモナス・SP−
AST111−４を培養して、培養終了液４を得
た。これを遠心分離して菌体を集め、半量の菌体
をピルビン酸ソーダー２ｇ、酢酸アンモニウム２
ｇ、ピリドキサール、リン酸10mg、エチレンジア
ミン４酢酸200mg、水100ml、PH9.0の組成をもつ
反応液180mlに懸濁した。一方、残りの半量は、
Ｌ−セリン1.5ｇ、ピリドキサールリン酸10mg、
エチレンジアミン４酢酸200mg、水100ml、PH9.0
の組成をもつ反応液180mlに懸濁した。 それぞれの反応液を実施例１および実施例２と
同様に６等分して、第５表に示したインドール化
合物をそれぞれ600mg加えて、振盪しながら32℃
で72時間反応を行なつた。 反応終了液を実施例１と同様にして処理したの
ち、高速液体クロマトグラフイーにより、生成し
たアミノ酸を分析したところ、第５表に示したと
おり添加したインドール化合物に相当するアミノ
酸が生成していた。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エアロモナス・SP.AST 108−１（微工研菌
   寄第5539号）またはエアロモナス・SP.AST 111
   −４（微工研菌寄第5540号）の培養物あるいはそ
   の処理物の存在下に、インドール化合物とセリ
   ン、あるいはインドール化合物とピルビン酸およ
   びアンモニウムイオンとを反応せしめることを特
   徴とするＬ−トリプトフアンないしはその誘導体
   アミノ酸の製法。 ２ インドール化合物が、インドール、５−ヒド
   ロキシインドール、５−クロルインドール、５−
   ブロムインドール、５−アミノインドールおよび
   ５−メトキシインドールから選ばれた１種である
   特許請求の範囲第１項記載の製法。