CN110582563B - 细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶 - Google Patents

细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶 Download PDF

Info

Publication number
CN110582563B
CN110582563B CN201880029799.3A CN201880029799A CN110582563B CN 110582563 B CN110582563 B CN 110582563B CN 201880029799 A CN201880029799 A CN 201880029799A CN 110582563 B CN110582563 B CN 110582563B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
thr
ala
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880029799.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110582563A (zh
Inventor
阿龙·阿吉罗斯
米歇尔·厄泽尔
艾林·威斯沃尔
珍妮特·费希尔
约翰内斯·万·艾克
J·凯文·克劳斯
凯文·文格尔
布鲁克斯·亨宁森
瑞安·斯金纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danstar Ferment AG
Original Assignee
Lallemand Hungary Liquidity Management LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lallemand Hungary Liquidity Management LLC filed Critical Lallemand Hungary Liquidity Management LLC
Publication of CN110582563A publication Critical patent/CN110582563A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110582563B publication Critical patent/CN110582563B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/047—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01133—Glucan 1,4-alpha-maltohydrolase (3.2.1.133), i.e. maltogenic alpha-amylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C07K2319/912—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation containing a GPI (phosphatidyl-inositol glycane) anchor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本公开涉及表达细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的重组酵母宿主细胞，所述细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶在重组酵母宿主细胞的增殖过程中进行表达。重组酵母宿主细胞可用于随后的生产过程，以制备食品和/或饲料产品，例如烘焙产品。

Description

细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质复印件，并通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是PCT-提交的序列表。该文本文件224KB，创建于2018年3月12日，并以电子方式提交。
技术领域
本公开涉及表达细胞相连的酶并在食品和/或饲料(包括用于生产烘焙产品的那些)的生产中用作酶活性源的重组酵母宿主细胞。
背景技术
商业化酵母和商业化酶通常用于生产食品和饲料，例如，如面包和其它酵母发酵的烘焙产品等。商业化酶也可以在无酵母的情况下用于制造食品和饲料，例如在化学发酵和未发酵的烘焙产品(如蛋糕和扁面包)中。烘焙师的酵母是通过分批补料增殖从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生的，并以新鲜或干燥的形式提供。食品酶和饲料酶(例如烘焙酶、啤酒厂酶和饲料酶)由各种植物、细菌和真菌产生，通常通过遗传修饰进行强化。细菌和真菌酶通常在无菌分批发酵过程中从生产生物体中表达和分泌，经分离、纯化、浓缩、干燥并以颗粒状粉末提供。
可以将烘焙酶添加到用于制备烘焙产品的面粉、面团或面糊中。它们在混合、醒发和烘焙过程中作用于碳水化合物、蛋白质和脂质，以便于加工以及改善成品的外观、质地和保存性。例如，在面包、蛋糕和其它烘焙产品的生产过程中将产麦芽糖α-淀粉酶(MAA)加入到面团或面糊中。它作用于烘箱中小麦淀粉的支链淀粉部分，以抑制成品中的淀粉回生以及减缓固化速度。
通常，食品酶和饲料酶(特别是烘焙酶)是生产烘焙产品的花费的重要部分。因此，在制造过程中存在降低外源纯化食品酶和饲料酶(如烘焙酶)的利用率，或淘汰外源纯化食品和饲料酶(如烘焙酶)的动机。
发明内容
本公开提供了已经过基因工程改造以表达一种或多种细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的重组酵母宿主细胞以及使用它们或由其衍生的产品制备食品和/或饲料产品的方法。
根据第一方面，本公开提供了重组酵母宿主细胞，其具有编码细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的异源核酸分子。异源核酸分子与异源启动子可操作地相连，异源启动子允许异源核酸分子在增殖期间的表达。在一个实施方案中，异源核酸分子允许在细胞内表达异源食品酶和/或饲料酶。在另一个实施方案中，异源核酸分子允许表达膜相关的异源食品酶和/或饲料酶。例如，异源核酸分子可以允许表达栓系异源食品酶和/或饲料酶。在一个实施方案中，栓系异源食品酶和/或饲料酶是式(I)的嵌合蛋白：
(NH2)FFE-L-TT(COOH) (I)
其中，FFE是食品酶和/或饲料酶；L存在或不存在，并且是氨基酸接头；TT是氨基酸栓系部分，用于使食品酶和/或饲料酶与重组酵母宿主细胞的细胞壁相连；并且“-”是酰胺键。在式(I)的嵌合蛋白中，(NH2)表示嵌合蛋白的氨基末端的位置，以及(COOH)表示嵌合蛋白的羧基末端的位置。
在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是式(II)的嵌合蛋白：
(NH2)TT-L-FFE(COOH) (II)
其中，FFE是食品酶和/或饲料酶；L存在或不存在，并且是氨基酸接头；TT是氨基酸栓系部分，用于使食品酶和/或饲料酶与重组酵母宿主细胞的细胞壁相连；并且“-”是酰胺键。在式(II)的嵌合蛋白中，(NH2)表示嵌合蛋白的氨基末端的位置，以及(COOH)表示嵌合蛋白的羧基末端的位置。在一个实施方案中，异源核酸分子对异源食品酶进行编码，异源食品酶例如α-乙酰乳酸脱羧酶、氨肽酶、淀粉酶、麦芽糖α-淀粉酶、天冬酰胺酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、凝乳酶、天冬氨酸肽酶、无花果蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、菊粉酶、转化酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧化酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、乳凝固酶、胰酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、戊聚糖酶、胃蛋白酶、磷脂酶、过氧化物酶、蛋白酶、支链淀粉酶、凝乳酶(rennet)、转谷氨酰胺酶、胰蛋白酶、尿素酶和/或木聚糖酶。在另一个实施方案中，异源食品酶是异源烘焙酶，例如，如淀粉分解酶、纤维素酶、半纤维素酶、氧化酶、天冬酰胺酶或脂肪酶。在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是淀粉分解酶，例如，如麦芽糖α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶或真菌淀粉酶。在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是氧化酶，例如，如葡萄糖氧化酶。在另一个实施方案中，异源核酸分子对异源饲料酶进行编码，异源饲料酶例如，如植酸酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。在又一个实施方案中，异源饲料酶是植酸酶。在嵌合蛋白的另一个实施方案中，L存在并且可以包含，例如，一个或多个G4S(SEQ ID NO：41)基序和/或一个或多个EA2K(SEQ ID NO：100)或EA3K(SEQ ID NO：101)基序。在进一步的实施方案中，TT包含跨膜结构域、其变体或片段。例如，TT可以来自FLO1蛋白。例如，TT可以具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，是SEQ ID NO：14的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：14的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT可以通过后转录机制进行修饰以具有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。例如，TT可以来自SED1蛋白、TIR1蛋白、CWP2蛋白、CCW12蛋白、SPI1蛋白、PST1蛋白或者AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合。在具体实施方案中，TT来自SPI1蛋白并且可以具有例如SEQID NO：74的氨基酸序列，可以是SEQ ID NO：74的氨基酸序列的变体，或者可以是SEQ IDNO：74的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT可以是SPI蛋白的片段，并且可以具有SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列；可以是SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列的变体；或者可以是SEQID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列的片段。在另一个具体的实施方案中，TT来自CCW12蛋白，并且可以具有例如SEQ ID NO：84的氨基酸序列，可以是SEQ ID NO：84的氨基酸序列的变体，或者可以是SEQ ID NO：84的氨基酸序列的片段。在又一个实施方案中，TT可以是CCW12蛋白的片段，并且可以具有SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列；可以是SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的变体；或者可以是SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT来自AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合，并且可以具有例如SEQ ID NO：24的氨基酸序列，是SEQ ID NO：24的氨基酸序列的变体，是SEQ ID NO：24的氨基酸序列的片段；具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，是SEQ ID NO：26的氨基酸序列的变体，或者是SEQ ID NO：26的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，启动子是天然启动子或异源启动子。例如，异源启动子可包括启动子tdh1基因、hor7基因、hsp150基因、hxt7基因、gpm1基因、pgk1基因和/或stl1基因。异源启动子可包括，例如，来自tdh1基因和/或来自hor7基因的启动子。在一些实施方案中，异源核酸分子与终止子可操作地连接，所述终止子可以是例如天然终止子或异源终止子。在一些实施方案中，异源终止子包括来自dit1基因、adh3基因、idp1基因、gpm1基因、pma1基因、tdh3基因、hxt2基因和/或ira2基因的终止子。异源终止子可包括，例如，来自dit1基因、来自adh3基因和/或来自idp1基因的终止子。在一个实施方案中，膜相连的异源多肽具有异源信号肽，例如，如异源信号肽来自转化酶蛋白、AGA2蛋白或真菌淀粉酶。在一个实施方案中，异源信号肽来自转化酶蛋白，并且可以具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列，是SEQ ID NO：68的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：68的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，异源信号肽来自AGA2蛋白，并且可以具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列，是SEQ ID NO：69的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：69的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，异源信号肽来自真菌淀粉酶，并且可以具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列，是SEQ ID NO：107的氨基酸序列的变体，或者是SEQ ID NO：107的氨基酸序列的片段。在一些实施方案中，重组酵母宿主细胞可以来自酵母(Saccharomyces sp.)属。在一些进一步的实施方案中，重组酵母宿主细胞可以来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种属。
根据第二方面，本公开提供了包含本文所述的食品酶和/或饲料酶的添加剂。所述添加剂可包含具有如本文所述的重组酵母宿主细胞的酵母组合物或基本上由具有如本文所述的重组酵母宿主细胞的酵母组合物组成。在一个实施方案中，酵母组合物可以以活性形式或灭活形式提供。添加剂可包含由从本文所述的重组酵母宿主细胞获得的酵母产物或基本上由从本文所述的重组酵母宿主细胞获得的酵母产物组成。在一个实施方案中，酵母产物可以是基本上纯化的食品酶和/或饲料酶、酵母提取物或酵母部分。添加剂可用作食品添加剂和/或饲料添加剂。在一个实施方案中，食品添加剂可以是面团改良剂。
根据第四方面，本公开提供了用于制备食品或饲料产品的方法。该方法包括在食品或饲料产品中包含本文所述的重组酵母宿主细胞或本文所述的添加剂。在一个实施方案中，该方法还包括在重组酵母宿主细胞和/或添加剂存在下使食品或饲料产品发酵。在另一个实施方案中，该方法还包括对食品或饲料产品进行烘焙以提供烘焙产品。在这样的实施方案中，该方法可用于延长烘焙产品的保质期和/或用于改善烘焙产品的感官特性。在另一个实施方案中，烘焙产品是面包。在一个实施方案中，该方法可用于制备食品。在另一个实施方案中，该方法可用于制备饲料产品。
附图说明
由此概括地对本公开的本质进行了描述，现在将参考附图，通过图示的方式示出其优选实施方案，并且其中：
图1A和图1B提供了在酵母细胞沉淀中(图1A)或野生型(M10474)或重组酵母宿主细胞的膏状酵母样品中(图1B)测量的麦芽糖淀粉酶(MAA)酶活性。在图1A中，结果作为测试酵母菌种类(从左到右，M10474、T2986、T2987、T2988、T2989、T2990、T2991、T2944；菌株描述于表1中)的函数所测得的麦芽糖淀粉酶活性(以MANU/mL提供)示出。在图1B中，结果作为测试酵母菌的种类和批次(从左到右，M10474、M13819、M13822；菌株描述于表1中)的函数的麦芽糖淀粉酶活性(以MANU/mL提供)示出。
图2A至图2C提供了作为用以下制作的面包的函数的面包屑硬度(以g为单位测量，左轴，在条形图中显示)和面包体积(以cm3为单位测量，右轴，以-X-标记线表示)：(从左到右)用野生型菌株(M10474)无补给酶制作的面包，用补给了45ppm的野生型菌株制作的面包，用补给了90ppm/>的野生型菌株制作的面包，用补给了180ppm/>的野生型菌株制作的面包，用M13822菌株(批次A)制作的面包，用M13822菌株(批次B)制作的面包，用M13819(批次A)制作的面包和用M13819(批次B)制作的面包(菌株描述于表1中)。在烘焙后第5天(图2A)、第8天(图2B)和第11天(图2C)显示结果。
图3A至图3C提供了作为用以下制作的面包的函数的回弹性百分比：(从左到右)用野生型菌株(M10474)无补给酶制作的面包，用补给了45ppm的野生型菌株制作的面包，用补给了90ppm/>的野生型菌株制作的面包，用补给了180ppm/>的野生型菌株制作的面包，用M13822菌株(批次A)制作的面包，用M13822菌株(批次B)制作的面包，用M13819(批次A)制作的面包和用M13819(批次B)制作的面包。在烘焙后5天(图3A)、第8天(图3B)和第11天(图3C)显示结果。
图4提供了在不存在Sed1栓系(菌株M8498)和存在Sed1栓系(菌株M14244)下，在培养的表达异源葡萄糖淀粉酶的重组酵母宿主细胞的沉淀(“结合”，浅灰色)和上清液(“游离”，深灰色)中测量的葡萄糖淀粉酶活性。结果作为使用的菌株的函数的葡萄糖淀粉酶活性百分比显示。
图5提供了在Sed1栓系和接头(菌株M14253)存在下，在Sed1栓系存在但无接头(菌株M14254)条件下，以及不存在Sed1栓系(菌株M10074)条件下，在培养的表达异源α-淀粉酶的重组酵母宿主细胞的沉淀(“结合”，浅灰色)和上清液(“游离”，深灰色)中测量的α-淀粉酶活性。结果作为使用的菌株的函数的α-淀粉酶活性百分比显示。
图6提供了表达麦芽糖淀粉酶的各种菌株的小麦淀粉活性。结果显示为M10474、M13822、M13819、M13879和T3892菌株(菌株描述于表1中)的全培养物(左侧条)、上清液(中间条)和洗涤的沉淀(右侧条)的小麦淀粉MANU/mL(在OD 600nm处测量)。“M”菌株的数据是两份培养物的平均值。T3892的数据包括8种转化分离物跨培养物平均活性和表现最佳的分离物的活性(□＝最佳分离物，全培养物；△＝最佳分离物，上清液；○＝最佳分离物，洗涤的细胞沉淀)。下图显示每种工程策略的预测酶定位表型。
图7A和图7B提供了用于表达游离或栓系柠檬酸杆菌植酸酶(Citrobacterbraakii phytase.)的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连的(图7A中的对角线阴影条或图7B中的□)的植酸酶活性。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。(图7A)将700nm处的吸光度与已知磷酸盐浓度的标准曲线进行比较，以FTU表示活性。在不同菌株(M12548、T2633、T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)的上清液(灰色条)和细胞(对角线条)中对吸光度进行测量。(图7B)比较不同菌株之间的FTU。左垂直轴示出了上清液活性，并且每个菌株的FTU以灰色条提供。右轴示出了细胞相关的FTU活性，并且对于每种菌株(M12548、T2633、T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)提供为□。亲本菌株和Pst1栓系细胞相关活性的值在标准曲线的范围之外，因此低于检测限。
图8提供了表达与N-末端或C-末端栓系融合的大肠杆菌植酸酶的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连(对角线阴影条)的植酸酶活性。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。结果显示为每种菌株(M11312、T2705和T2706)在700nm处的光密度。
图9提供了表达大肠杆菌植酸酶的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连(对角线阴影条)的植酸酶活性，相较于与C端Sed1栓系融合的大肠杆菌植酸酶，该大肠杆菌植酸酶与具有或不具有AGA1过表达的N末端栓系融合。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。结果显示为每种菌株(M12550、M12795、M12983和T2816)在700nm处的光密度。
图10提供了表达麦芽糖淀粉酶的菌株的小麦淀粉活性。对于不同菌株(M10474、M13819、M13822、M14851、T4328、T4329、T4330、M12962、T4336、T4337和T4338)的全培养物(左侧条)、上清液(中间条)和洗涤的细胞(右侧条)，结果以在450nm处的吸光度/600nm处的光密度的比提供。“M”菌株的数据是两份培养物的平均值。“T”菌株的数据包括7种转化分离物的跨培养物平均活性。表达形态1是指存在转化酶信号肽和产生栓系酶的Spi1栓系。表达形态2是指存在转化酶信号肽，但不存在产生分泌酶的栓系。表达形态3是指不存在信号肽并且不存在产生细胞内酶的栓系。
图11A至图11C提供了烘焙后第3天(图11A)、第7天(图11B)和第11天(图11C)用不同的面团改良剂制成的面包的面包屑硬度(以g为单位测量，左轴，结果以条显示)。用额外添加的麦芽糖淀粉酶产物(标记为“Novamyl”)或不用额外添加的/>麦芽糖淀粉酶产物(标记为“对照”)制成对照，如直方图下方所示。将对照面包与用M13979喷雾干燥的匀浆(在图中显示为“匀浆+喷雾”)或如直方图下方所示的特定Phadebas酶活性的膏制成的面包进行比较。所有面包均使用野生型酵母用于产气力。
图12A至图12F提供了在烘焙后第4天(图12A和图12D)、第7天(图12B和图12E)和第10天(图12C和图12F)用不同的面团改良剂制成的面包的面包屑硬度(图12A-C，以g为单位进行测量)和回弹性(图12D-F，以百分比为单位进行测量)。用额外添加的麦芽糖淀粉酶产物(标记为“Novamyl”)或不用额外添加的/>麦芽糖淀粉酶产物(标记为“对照”)制成对照，如直方图下方所示。将对照面包与用M15532酵母膏制成的面包进行比较，后者经均质化以释放细胞内，并如直方图下方所示给予特定的Phadebas酶测定活性。所有面包均使用野生型酵母用于产气力。
图13示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α-淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自SPI1蛋白的不同栓系部分或相关平截(M15774、M15771、M15777、M15772和M15222)组合的衍生自强烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)的热耐受性α-淀粉酶(SEQ ID NO：71)。结果显示为使用的酵母菌株在540nm处的吸光度。
图14示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α-淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自CCW12蛋白的不同栓系部分或相关平截(M15773、M15776、M16251和M15215)组合的衍生自热水管热球菌(Thermococcushydrothermalis)的α-淀粉酶(SEQ ID NO：72)。结果显示为使用的酵母菌株在540nm处的吸光度。
图15示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α-淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自CCW12蛋白的栓系部分和不同接头(M15785、M15786、M15782、M16252、M16221和M16222)组合的衍生自热水管热球菌的α-淀粉酶(SEQ IDNO：72)。结果显示为酵母菌株在540nm处的吸光度。
图16示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α-淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含衍生自强烈热球菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO：71)、衍生自SPI1蛋白的栓系部分和不同接头(M15784、M15778、M15779、M15787、M15780、M15788和M15783)。结果显示为酵母菌株在540nm处的吸光度。
图17示出了相较于阴性对照菌株(M10474)和阳性对照量的市售纯化葡萄糖氧化酶(阳性对照，Gluzyme)，与表达葡萄糖氧化酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤的细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的葡萄糖氧化酶(GO)活性，酵母菌株衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)，以分泌形式(M16780)或细胞内(M16273)表达。结果显示为所用酵母菌株/对照在510nm处的吸光度。
图18显示了与表达葡萄糖氧化酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤的细胞(对角线条)相关的葡萄糖氧化酶(GO)活性，酵母菌株衍生自黑曲霉，以分泌形式(M16780)或细胞内(M16273)表达。结果显示为所用酵母菌株在510nm处的吸光度(校正以除去与对照菌株M10474相关的吸光度)。
图19示出了相较于阴性对照菌株(M10474)和阳性对照量的市售纯化的真菌α-淀粉酶(阳性对照，)，与表达真菌淀粉酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的真菌淀粉酶(FA)活性，酵母菌株衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)，以具有不同信号肽(用于M16772的酿酒酵母转化酶，用于M16540的米曲霉天然α-淀粉酶信号肽)的分泌形式表达。结果显示为所使用酵母菌株/对照在540nm处的吸光度。
图20示出了与表达真菌淀粉酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的真菌淀粉酶(FA)活性，酵母菌株衍生自米曲霉，以具有不同信号肽(对于M16772为酿酒酵母转化酶，对于M16540为米曲霉天然α-淀粉酶信号肽)的分泌形式表达。结果显示为所使用酵母菌株在540nm处的吸光度(校正以除去与对照菌株M10474相关的吸光度)。
图21示出了使用烘焙测试对来自菌株M16780的细胞沉淀的细胞相关葡萄糖氧化酶活性的评估。结果显示为对照面包(在不存在添加剂的情况下制备)，用10ppm或20ppm葡萄糖氧化酶制备的面包，或用给予菌株M16780的细胞沉淀制备的面包。
具体实施方式
本公开提供了在其增殖阶段过程中表达细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的重组酵母宿主细胞。如在本公开的上下文中所使用的，表述“增殖阶段”是指商业化过程的扩增阶段，其中，酵母在需氧条件下增殖以使底物向生物质的转化最大化。在一些情况下，增殖的生物质可以用于随后的发酵步骤(通常在厌氧条件下)，以使一种或多种所需代谢物的产生和/或制备发酵食品或付费产品最大化。本公开的重组酵母宿主细胞是有利的，因为它们提供比传统使用的纯化产品更低成本的酶活性来源。即使在醒发时间和条件不能提供使酵母原位产生酶的机会的情况下，这种重组酵母宿主细胞可有利地用于各种食品和/或饲料产品，例如烘焙产品。这种重组酵母宿主细胞还可用于其它烘焙产品、发酵食品、非发酵食品和动物饲料。有利地，重组酵母宿主细胞可以容易地进行测量、剂量和配制。
重组酵母宿主细胞
本公开的重组酵母宿主细胞旨在用于制备用于人(食品)和/或动物(饲料)消费的产品。如在本公开的上下文中使用的，表述“食品酶和/或饲料酶”是指具有酶活性并且能够用于制备食品或饲料产品的方法中的蛋白质。在一些实施方案中，“食品酶和/或饲料酶”是指具有转化淀粉应用的酶(例如，含淀粉的生物质)。食品酶和饲料酶包括但不限于烘焙酶、酿造酶、蒸馏酶、酿酒酶、果汁酶、淀粉加工酶和饲料酶。本公开的重组酵母宿主细胞可任选地用于发酵过程。在一个实施方案中，发酵过程可以是相对长的，并且重组酵母宿主细胞可以用于例如制备蒸馏产品、葡萄酒和啤酒。在另一个实施方案中，发酵过程可以是相对短的，并且重组酵母宿主细胞可以用于例如制备酵母发酵的烘焙产品。本公开的重组酵母宿主细胞也可以用于不包含发酵步骤的方法中。例如，重组酵母宿主细胞可用于制备食品和饮品(例如，非酵母发酵(化学发酵)烘焙产品、乳制品、酵母提取物、果汁、脂肪和油以及淀粉)或饲料。
在一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞在引入本公开的异源核酸分子之前确实表达至少一种食品酶和/或饲料酶，并且经遗传修饰以表达另外的(不同的或相同的)细胞相连酶。在另一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞不能用于制备例如生物燃料如生物乙醇的整合生物加工中。
本公开的重组酵母宿主细胞可以以活性形式(例如，液体(例如，如酵母膏等)、压缩的或流化床干燥的酵母)、半活性形式(例如，液体、压缩的或流化床干燥的)、无活性形式(例如，鼓式或喷雾干燥的)以及由此获得的混合物提供。例如，重组酵母宿主细胞可以是活性形式和半活性形式或非活性形式的组合，以提供制备食品或饲料产品所需的酶的比例和剂量。
本公开涉及经基因工程改造的重组酵母宿主细胞。遗传修饰旨在增加特定靶基因(其被认为是酵母宿主细胞的异源)的表达，并且可以在一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多)基因位置形成。在本公开的上下文中，当重组酵母细胞被鉴定为“基因工程改造”时，应理解为其已经被操作以添加至少一种或多种异源或外源核酸残基。在一些实施方案中，所添加的一种或多种核酸残基可以衍生自异源细胞或重组宿主细胞本身。在后一种情况下，核酸残基在一个或多个不同于天然基因组位置的基因组位置被添加。基因操作不是在自然界中发生的，而是酵母体外操作的结果。
当在重组酵母宿主细胞中表达时，在一种或多种异源核酸分子上编码本文所述的异源酶。当用于提及核酸分子(例如启动子、终止子或编码序列)或蛋白质(例如酶)时，术语“异源的”是指在重组宿主细胞中未天然发现的核酸分子或蛋白质。“异源”还包括天然编码区/启动子/终止子或其部分，其从源生物体中移出并随后以不同于相应天然基因的形式(例如，不在其生物体基因组中的天然位置处)重新引入源生物体。将异源核酸分子有目的地引入重组宿主细胞中。例如，异源因子可以来自宿主细胞的不同菌株，或来自不同分类群的生物(例如，不同的界、门、类、目、科属或种，或这些分类中一个的任何亚群)。
存在于重组宿主细胞中的异源核酸分子可以被整合到宿主细胞的基因组中。如本文所用的术语“整合”是指通过分子生物学技术置于宿主细胞基因组中的遗传因子。例如，遗传因子可以置于宿主细胞的染色体中，而非载体(如宿主细胞携带的质粒)。将遗传因子整合到宿主细胞基因组中的方法是本领域熟知的并且包括同源重组。异源核酸分子可以在酵母宿主细胞的基因组中以一个或多个副本(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或甚至更多副本)存在。或者，异源核酸分子可以独立地从酵母的基因组中复制。在这样的实施方案中，核酸分子可以是稳定的和自我复制的。
在本公开的上下文中，重组宿主细胞是酵母，并且在一些实施方案中，酵母可以用于食品和/或饲料的生产。合适的酵母宿主细胞可以是来自例如，酵母属(Saccharomyces)、克鲁维菌属(Kluyveromyces)、阿克苏拉菌属(Arxula)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、法菲亚菌属(Phaffia)、裂糖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、汉森拉菌属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、雪旺尼菌属(Schwanniomyces)、托鲁拉菌属(Torula)或亚罗维亚菌属(Yarrowia)。合适的酵母种可包括，例如酿酒酵母、博伊丁酵母(S.bulderi)、巴尼特酵母(S.barnetti)、少抱酵母(S.exiguus i)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、糖化酵母(S.diastaticus)、产朊假丝酵母(C.utilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。在一些实施方案中，酵母选自于由以下组成的组：酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、巴斯提亚毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、解脂耶式酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、红酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxulaadeninivorans、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方雪旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)。在一个具体实施方案中，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，宿主细胞可以是产油酵母细胞。例如，产油酵母宿主细胞可以来自布拉霉属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、产油油脂酵母(Lipomyces)、被孢霉(Mortierella)、毛霉菌属(Mucor)、须酶菌属(Phycomyces)、腐霉菌属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidum)、红酵母菌书(Rhodotorula)、毛孢子菌属(Trichosporon)或亚罗酵母属(Yarrowia)。在一些备选实施方案中，宿主细胞可以是产油微藻宿主细胞(例如，如来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium))。在一个实施方案中，重组酵母宿主细胞来自酵母属(Saccharomyces)，并且在一些实施方案中，来自酿酒酵母属(Saccharomyces cerevisiae)。
本公开的重组酵母宿主细胞包含异源核酸分子，其旨在允许表达(例如，编码)一种或多种异源食品酶和/或饲料酶。在一个实施方案中，异源酶是食品酶，其可以是但不限于α-乙酰乳酸脱羧酶、氨肽酶、淀粉酶、麦芽糖α-淀粉酶、天冬酰胺酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、凝乳酶(包括凝乳酶A和凝乳酶B)、天冬氨酸肽酶(cyprosin)、无花果蛋白酶、葡萄糖淀粉酶(又称淀粉葡萄糖苷酶或麦芽糖酶)、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、菊粉酶、转化酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧化酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、凝乳酶(milk coagulating enzyme)、胰酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、戊聚糖酶、胃蛋白酶、磷脂酶、过氧化物酶、蛋白酶、支链淀粉酶、凝乳酶(rennet)(包括牛凝乳酶)、转谷氨酰胺酶、胰蛋白酶、脲酶和/或木聚糖酶。在一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是烘焙酶。如在本公开的上下文中使用的，表述“烘焙酶”是指具有酶活性并且能够用于制备烘焙产品的方法中的蛋白质。在一个实施方案中，本公开的酵母宿主细胞的异源核酸分子编码至少一种异源烘焙酶。烘焙酶包括但不限于淀粉分解酶(包括例如麦芽糖α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶和真菌淀粉酶)、纤维素酶/半纤维素酶、氧化酶(包括例如葡萄糖氧化酶)、天冬酰胺酶和脂肪酶。在另一个实施方案中，异源酶是饲料酶，其可以是但不限于植酸酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。
如本文所用的表述“淀粉分解酶”是指一类能够将淀粉或水解淀粉水解的酶。在烘焙应用中，淀粉分解酶可参与可发酵糖的释放、增加面包体积、缩短发酵时间、减少老化和/或改善风味。淀粉分解酶包括但不限于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1，有时称为真菌α-淀粉酶以及细菌α-淀粉酶，见下文)、麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、异淀粉酶(EC3.2.1.68)和淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)。真菌α-淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)、果汁和发酵饮品(如啤酒)。细菌α-淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如，酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)、发酵饮品(包括啤酒、蒸馏饮品等)以及淀粉加工。麦芽糖α-淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)。在一个实施方案中，一种或多种淀粉分解酶可以是来自米曲霉的α-淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：105的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的麦芽糖α-淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：108的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)的葡萄糖淀粉酶(并且具有例如，SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)的葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(并且具有例如SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的支链淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：5的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)的支链淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)的异淀粉酶(并且具有例如SEQ IDNO：7的氨基酸序列，其变体或其片段)和/或来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的淀粉麦芽糖酶(并且具有例如SEQ ID NO：8的氨基酸序列，其变体或其片段)。
如本文所用，表述“纤维素酶/半纤维素酶”是指一类能够水解纤维素、半纤维素或戊聚糖的酶。在烘焙应用中，纤维素酶和半纤维素酶可参与建立面筋网络，提供可溶性膳食纤维，调节面团粘度和/或调节面团流变学。纤维素酶/半纤维素酶包括但不限于纤维素酶(E.C.3.2.1.4)和内切B(1,4)D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)。在一个实施方案中，一种或多种纤维素酶/半纤维素酶可以是来自绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)的纤维素酶(并且具有例如SEQ ID NO：42的氨基酸序列，其变体或其片段)和/或来自艾默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)的内切B(1,4)D-木聚糖酶(并且具有例如SEQ ID NO：43的氨基酸序列，其变体或其片段)。
如本文所用，表述“氧化酶”是指一类能够催化氧化还原反应的酶。氧化酶可以是氧化还原酶，例如己糖氧化酶(包括葡萄糖氧化酶)。氧化酶可用于生产烘焙产品(例如，如包括面包的酵母发酵产品等)。在一些实施方案中，氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)可以改善面团的可加工性。在烘焙应用中，氧化酶可参与控制美拉德反应和/或建立面包屑结构。在一个实施方案中，一种或多种氧化酶可以是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(并且具有例如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：103的氨基酸序列，其变体或其片段)。
如本文所用，表述“天冬酰胺酶”是指一类能够催化天冬酰胺转化为天冬氨酸和铵的酶。天冬酰胺酶可用于生产零食、谷物(包括早餐谷物)以及烘焙产品(例如酵母发酵(包括面包)、化学发酵或未发酵产品)。
如本文所用，表述“脂肪酶”是指一类能够水解脂质的酶。在烘焙应用中，脂肪酶可参与增加面包体积，增加面团稳定性，提供抗老化和/或促进乳化剂形成。脂肪酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵(包括面包)和化学发酵产品)。在一个实施方案中，一种或多种脂肪酶可以是来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosis)属的三酰基甘油脂肪酶(并且具有例如SEQ ID NO：45的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自野猪(Susscrofa)的磷脂酶A2(并且具有例如SEQ ID NO：46的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自Streptomyces vialaceoruber的磷脂酶A2(并且具有例如SEQ ID NO：47的氨基酸序列，其变体或其片段)，和/或来自米曲霉(Aspergillus oryzea)的磷脂酶A2(并且具有例如SEQID NO：48的氨基酸序列，其变体或其片段)。
在一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞包含(并且在一个实施方案中表达)编码麦芽糖淀粉酶的核酸分子。如在本公开中使用的，术语“麦芽糖淀粉酶”是指能够将淀粉或水解淀粉水解成麦芽糖的多肽。麦芽糖淀粉酶包括但不限于真菌α-淀粉酶(例如衍生自曲霉属(Aspergillus sp.)(例如，黑曲霉(A.Niger)、白曲霉(A.kawachi)和米曲霉(A.oryzae))；木霉属(Trichoderma sp.)(例如，里氏木霉(T.reesie))、根霉属(Rhisopussp.)、毛根霉属(Mucor sp.)和青霉属(Penicillium sp.)，酸稳定的真菌淀粉酶(例如衍生自黑曲霉(Aspergillus niger))，β-淀粉酶(例如衍生自植物(小麦、大麦、黑麦、高粱、大豆、甘薯、大米)和微生物(蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多形芽孢杆菌(Bacilluspolymixa)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、拟南芥(Arabidopsis thaliana))，麦芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133)(例如衍生自微生物，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、热芽孢杆菌(Bacillusthermoalkalophilus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、栖热菌属(Thermus sp.)。在具体实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞包含编码衍生自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的异源麦芽糖淀粉酶的异源核酸分子，并且具有例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：108的氨基酸序列，其变体或其片段。
如本文所使用，表述“磷酸酶”是指在水存在下能够催化磷酸单酯裂解成磷酸根离子和醇的食品酶/饲料酶。磷酸酶的实施方案是植酸酶，一种具有酶活性并且能够催化植酸(肌醇六磷酸肌苷)水解成无机磷的蛋白质。有四种不同类型的植酸酶：组氨酸酸性磷酸酶(HAPS)、β-螺旋桨植酸酶、紫色酸性磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶样植酸酶(PTP样植酸酶)。植酸具有六个磷酸基团，其可以通过植酸酶以不同的速率和不同的顺序释放。植酸酶以逐步的方式从植酸中水解磷酸盐，产生再次成为进一步水解的底物的产物。植酸酶基于水解的植酸的第一磷酸位置进行如下分组：3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、4-植酸酶(EC3.1.3.26)和5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。在一个实施方案中，植酸酶衍生自细菌物种，例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)或埃希氏菌属(Escherichia sp.)。在具体实施方案中，异源植酸酶衍生自柠檬酸杆菌属，例如布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，并且可以具有例如SEQ ID NO：66的氨基酸序列，其变体或其片段。在另一个实施方案中，异源植酸酶衍生自埃希氏菌属，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，并且可以具有例如SEQ ID NO：67的氨基酸序列，其变体或其片段。
异源食品酶和/或饲料酶可以是已知/天然食品酶和/或饲料酶的变体。例如，在异源食品酶和/或饲料酶是异源烘焙酶的实施方案中，异源烘焙酶可以是已知/天然烘焙酶的变体，例如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：108的氨基酸序列的异源烘焙酶的变体。当与天然食品酶和/或饲料酶的氨基酸序列比较时，变体包含至少一个氨基酸差异。如本文所使用，变体是指氨基酸序列中不会不利地影响食品酶和/或饲料酶的生物学功能的改变。当改变的序列阻止或破坏与食品酶和/或饲料酶相关的生物学功能时，认为取代、插入或缺失会对蛋白质产生不利影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水-亲水性质而不会不利地影响生物活性。因此，可以改变氨基酸序列，例如使肽更疏水或亲水，而不会不利地影响食品酶和/或饲料酶的生物活性。食品酶和/或饲料酶变体与本文所述的食品酶和/或饲料酶具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。如本领域已知的，术语“百分比同一性”是如通过对序列进行比较所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。可以使用已知的计算机程序常规地确定同一性水平。可通过已知方法容易地对同一性进行计算，所述方法包括但不限于以下所述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,NY(1993)；Computer Analysis of SequenceData,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NJ(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,NY(1991)。对确定同一性的优选方法进行设计，以给出测试序列之间的最佳匹配。确定统一性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中编纂。可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)以默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PEN ALT Y＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLB 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
本文所述的变体异源食品酶和/或饲料酶(包括本文所述的食品酶和/或饲料酶)可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的酶，并且这种取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的酶，或(iii)其中成熟多肽与另一种化合物(例如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇))融合的酶，或(iv)其中额外的氨基酸与用于纯化多肽的成熟多肽融合的酶。食品酶和/或饲料酶的“变体”可以是保守变体或等位变体。
异源食品酶和/或饲料酶可以是已知/天然食品酶和/或饲料酶的片段。在异源食品酶和/或饲料酶是异源烘焙酶的实施方案中，异源烘焙酶可以是已知/天然烘焙酶的片段或已知/天然烘焙酶的变体的片段(例如，如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQID NO：51、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：108的氨基酸序列或其变体的烘焙酶片段)。在一个实施方案中，片段对应于已除去信号肽序列的已知/天然食品酶和/或饲料酶。食品酶和/或饲料酶“片段”(包括烘焙酶“片段”)具有至少100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个或更多食品酶和/或饲料酶的连续氨基酸。当与已知/天然食品酶和/或饲料酶的氨基酸序列比较时，片段包含至少一个较少的氨基酸残基，并且仍然具有全长食品酶和/或饲料酶的酶活性。在一个实施方案中，片段对应于缺乏信号肽的酶的氨基酸序列。在一些实施方案中，食品酶和/或饲料酶的片段可用于通过肽合成产生相应的全长食品酶和/或饲料酶。因此，该片段可用作产生全长蛋白质的中间体。
在本公开的重组酵母宿主细胞中，异源食品酶和/或饲料酶(包括烘焙酶)与重组酵母宿主细胞“细胞相连”，因为它被设计成被表达并与重组酵母宿主细胞保持物理相连。在一个实施方案中，食品酶和/或饲料酶可以在重组酵母宿主细胞内(细胞内)表达。在这样的实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶不需要与重组酵母宿主细胞壁相连。当要在细胞内表达食品酶和/或饲料酶时，如果存在于天然序列中，可以删除其信号肽序列以允许细胞内表达。
在另一个实施方案中，可以分泌异源食品酶和/或饲料酶，但如果这样的话，则它必须与重组酵母宿主细胞保持物理相连。在一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶的至少一部分(通常至少一个末端)例如与细胞壁共价相连、非共价相连和/或静电相连(并且在一些实施方案中，与细胞质膜相连)。例如，可以对异源食品酶和/或饲料酶进行修饰，以携带一个或多个跨膜结构域，以具有一个或多个脂质修饰(豆蔻酰化、棕榈酰化、法尼基化和/或异戊烯化)，以与一个或多个膜相连的蛋白质相互作用和/或与细胞脂筏相互作用。虽然异源食品酶和/或饲料酶可能不直接与细胞膜或细胞壁相连(例如，当通过栓系部分发生相连时)，但蛋白质仍然被认为是根据本公开的“细胞相连的”异源食品酶和/或饲料酶。
在一些实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶可以表达为位于重组酵母宿主细胞的细胞壁上并与之相连。在一些实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶被表达为位于宿主细胞的细胞壁的外表面并与之相连。重组酵母宿主细胞均具有细胞壁(其包括细胞质膜)，其限定细胞内(例如，面向细胞核的内部)和细胞外(例如，面向外部)环境。异源食品和/或酶可以位于重组酵母宿主细胞壁的外表面(并且在一些实施方案中，物理上与之相连)，并且在其它实施方案中，与重组酵母宿主细胞质膜的外表面相连。在本公开的上下文中，表述“与重组酵母宿主细胞的细胞壁/细胞质膜的外表面相连”是指异源食品酶和/或饲料酶至少部分地在重组酵母宿主细胞的细胞壁中(和在一些实施方案中，在细胞质膜中)物理整合的能力(以共价方式或非共价方式)。物理整合可归因于例如异源食品酶和/或饲料酶上存在跨膜结构域，存在能够与异源食品酶和/或饲料酶上的细胞质膜蛋白质相互作用的结构域，存在对异源酶食品酶和/或饲料酶的翻译后修饰(例如，脂质化)等。
一些异源食品酶和/或饲料酶(包括烘焙酶)具有位于重组酵母宿主细胞的细胞壁并与其相连的固有能力(例如，与细胞相关)。具有细胞相连的固有能力的食品酶和/或饲料酶的一个实例示于图1A部分(例如，图1A中的菌株T2994栏)。在该图中，示出了在无栓系部分的情况下，在酿酒酵母中表达的嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α-淀粉酶的结果，并清楚地显示该酶本质上是“细胞相连的”并且表现出酶活性(例如，麦芽糖α-淀粉酶活性)。
然而，在某些情况下，可能需要增加或提供与某些食品酶和/或饲料酶的细胞相连，因为它们表现出内在细胞相连不足或只是缺乏固有的细胞相连。在这样的实施方案中，可以通过将异源食品酶和/或饲料酶与栓系氨基酸部分组合作为嵌合构建体来提供，这将提供或增加与重组酵母宿主细胞细胞壁的附着。在这样的实施方案中，嵌合食品酶和/或饲料酶将被认为是“栓系的”。优选嵌合蛋白的氨基酸栓系部分相对于异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性而言是中性的，例如，不干扰异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性。在一些实施方案中，氨基酸栓系部分与异源食品酶和/或饲料酶的结合可以增加异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性(当与非栓系、非嵌合形式相比较时)。
在一个实施方案中，栓系部分可用于与异源食品酶和/或饲料酶一起表达，以将酶位于重组酵母宿主细胞的壁。各种栓系氨基酸部分是已知技术，并且可以用于本公开的嵌合蛋白中。
栓系部分可以是在另一种蛋白质上发现的跨膜结构域，并允许嵌合蛋白质具有跨膜结构域。在这样的实施方案中，栓系部分可衍生自FLO1蛋白(具有例如SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：9的核酸序列编码)。
在又一实例中，氨基酸栓系部分可以被翻译后修饰以包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚并且允许嵌合蛋白具有GPI锚。GPI锚是附着于蛋白质末端(并且在一些实施方案中，附着于蛋白质的羧基末端)的糖脂，其允许蛋白质锚定至细胞膜的细胞质膜。能够提供GPI锚的栓系氨基酸部分包括但不限于与SED1蛋白结合/从SED1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ IDNO：12的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：11的核酸序列编码)，与TIR1蛋白结合/从TIR1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：14的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：13的核酸序列编码)，与CWP2蛋白结合/从CWP2蛋白衍生的那些(具有例如SEQID NO：16的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：15的核酸序列编码)，与CCW12蛋白结合/从CCW12蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：84的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：17的核酸序列编码)，与SPI1蛋白结合/从SPI1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：74的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQID NO：19的核酸序列编码)，与PST1蛋白结合/从PST1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ IDNO：22的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：21的核酸序列编码)，或与AGA1和AGA2蛋白的组合结合/衍生自其的那些(具有例如SEQ ID NO：24的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：23的核酸序列编码，例如，SEQ ID NO：26的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：25的核酸序列编码)。在一个实施方案中，栓系部分提供GPI锚，并且在又一个实施方案中，栓系部分衍生自SPI1蛋白(具有例如SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：74的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：19的核酸序列编码)，或衍生自CCW12蛋白(具有例如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：84的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：17的核酸序列编码)。
在一个实施方案中，栓系部分是SPI1蛋白的片段，其保留其定位于细胞膜的能力。SPI1蛋白的片段包含少于129个SEQ ID NO：74的氨基酸序列的氨基酸连续残基。例如，来自SPI1蛋白的栓系部分片段可包含至少10个、20个、21个、30个、40个、50个、51个、60个、70个、80个、81个、90个、100个、110个、111个或120个来自SEQ ID NO：74的氨基酸序列的连续氨基酸残基。在另一个实施方案中，来自SPI1蛋白的栓系部分片段可包含SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82中任一个所示的氨基酸序列，或基本上由SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82中任一个所示的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，栓系部分是CCW12蛋白的片段，其保留其定位于细胞膜的能力。CCW12蛋白的片段包含少于112个SEQ ID NO：84的氨基酸序列的氨基酸连续残基。例如，来自CCW12蛋白的栓系部分片段可包含至少10个、20个、24个、30个、40个、49个、50个、60个、70个、74个、80个、90个、99个、100个或110个来自SEQ ID NO：84的氨基酸序列的连续氨基酸残基。在另一个实施方案中，来自CCW12蛋白的栓系部分片段可以包含SEQ ID NO：86、SEQID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92中任一个所示的氨基酸序列，或基本上由SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92中任一个所示的氨基酸序列组成。
栓系氨基酸部分可以是已知/天然栓系氨基酸部分的变体，例如具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：80或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的栓系氨基酸部分的变体。当与天然栓系氨基酸部分的氨基酸序列比较时，变体包含至少一个氨基酸差异。如本文所使用，变体是指氨基酸序列中不会不利地影响栓系氨基酸部分的生物学功能(例如，外表面上的位置和异源食品酶和/或饲料酶在细胞质膜中的锚定)的改变。当改变的序列阻止或破坏与栓系氨基酸部分相关的生物学功能时(例如，外表面上的位置和异源食品酶和/或饲料酶在细胞质膜中的锚定)，认为取代、插入或缺失会对蛋白质产生不利影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水-亲水性质而不会不利地影响生物活性。因此，可以改变氨基酸序列，例如使肽更疏水或亲水，而不会不利地影响栓系氨基酸部分的生物活性。栓系氨基酸部分变体具有与本文所述的栓系氨基酸部分至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。如本领域已知的，术语“百分比同一性”是通过对序列进行比较所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。可以使用已知的计算机程序常规地确定同一性水平。可通过已知方法容易地对同一性进行计算，所述方法包括但不限于以下所述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,NY(1993)；Computer Analysis of SequenceData,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NJ(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,NY(1991)。对确定同一性的优选方法进行设计，以给出测试序列之间的最佳匹配。确定统一性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中编纂。可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)以默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PEN ALT Y＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLB 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
本文所述的变体栓系氨基酸部分可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的氨基酸部分，并且这种取代氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的氨基酸部分，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物(例如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇))融合的氨基酸部分，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合以纯化多肽的氨基酸部分。栓系氨基酸部分的“变体”可以是保守变体或等位基因变体。
栓系氨基酸部分可以是已知/天然栓系氨基酸部分的片段或已知/天然栓系氨基酸部分的变体的片段(例如，如具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的栓系氨基酸部分的片段，或其变体)。栓系氨基酸部分“片段”具有至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多栓系氨基酸部分的连续氨基酸。当与已知/天然栓系氨基酸部分的氨基酸序列比较时，片段包含至少少一个的氨基酸残基，并且仍具有全长栓系氨基酸部分的生物活性(例如，细胞壁的位置)。
在需要氨基酸栓系部分的实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶可以作为由重组酵母宿主细胞表达并具有下式之一的嵌合蛋白提供(由氨基(NH2)至羧基(COOH)方向提供)：
FFE-L-TT(I)或
TT-L-FFE(II)
在这两个式中，残基“FFE”是指异源食品酶和/或饲料酶部分，残基“L”是指存在任选的接头，而残基“TT”是指氨基酸栓系部分。在式(I)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系的氨基末端(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基(COOH或C)末端。在式(II)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系的羧基末端(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基(NH2或N)末端。
在另一个实施方案中，在式(I)和式(II)的嵌合蛋白中，食品酶和/或饲料酶可以是烘焙酶。在此类实施方案中，嵌合蛋白可具有下式之一(由氨基(NH2)至羧基(COOH)的方向提供)：
BE-L-TT(Ia)或
TT-L-BE(IIa)
在这两个式中，残基“BE”是指异源烘焙酶部分，残基“L”是指存在任选的接头，而残基“TT”是指氨基酸栓系部分。在式(Ia)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系(直接或间接)位于异源烘焙酶部分的羧基(COOH或C)末端。在式(IIa)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基(NH2或N)末端。
当氨基酸接头(L)不存在时，栓系氨基酸部分与异源食品酶和/或饲料酶(或与异源烘焙酶)直接相连。在式(I)和式(Ia)的嵌合体中，这意味着异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基末端(或异源烘焙酶部分的羧基末端)与栓系氨基酸部分的氨基末端直接相连(利用酰胺键)。在式(II)和(IIa)的嵌合体中，这意味着栓系氨基酸部分的羧基末端与异源食品酶和/或饲料酶(或异源烘焙酶)的氨基末端直接相连(利用酰胺键)。
在一些实施方案中，氨基酸接头(L)的存在对于提供例如异源食品酶和/或饲料酶部分与栓系氨基酸部分之间的一些灵活性，或促进异源核酸分子的构建是合乎需要的。如在本公开中使用的，“氨基酸接头”或“L”是指将异源酶部分FFE或BE与氨基酸栓系部分TT分开的一段或多段氨基酸(例如，间接将异源食品酶和/或饲料酶连接至氨基酸栓系部分TT)。优选氨基酸接头是中性的，例如，不干扰异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性，也不干扰氨基酸栓系部分的生物学(细胞相关)活性。在一些实施方案中，氨基酸接头L可以增加异源食品酶和/或饲料酶部分和/或氨基酸栓系部分的生物活性。
在其中接头(L)存在于式(I)和式(Ia)的嵌合体中的情况下，其氨基末端与异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基末端相连(利用酰胺键)，并且其羧基末端与氨基酸栓系部分的氨基末端相连(利用酰胺键)。在接头(L)存在于式(II)和式(IIa)的嵌合体中的情况下，其氨基末端与氨基酸栓系部分的羧基末端相连(利用酰胺键)，并且其羧基末端与异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基末端相连(具有酰胺键)。
存在各种氨基酸接头，包括但不限于(G)n、(GS)n；(GGS)n；(GGGS)n；(GGGGS)n；(GGSG)n；(GSAT)n，其中，n＝1至8(或更大)的整数。在一个实施方案中，氨基酸接头L是(GGGGS)n(也称为G4S)，并且在更进一步的实施方案中，氨基酸接头L包含多于一个G4S(SEQID NO：41)基序。例如，氨基酸接头L可以是(G4S)3并且具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列。在另一个实例中，氨基酸接头L可以是(G)8并且具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列。在另一个实例中，氨基酸接头L可以是(G4S)8，并且具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
在一些实施方案中，氨基酸接头也可以是GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：96)。
存在另外的氨基酸接头，包括但不限于(EAAK)n和(EAAAK)n，其中，n＝1至8(或更大)的整数。在一些实施方案中，一个或多个(EAAK)n/(EAAAK)n基序可以被一个或多个另外的氨基酸残基分开。在一个实施方案中，氨基酸接头包含一个或多个EA2K(SEQ ID NO：100)或EA3K(SEQ ID NO：101)基序。在一个实施方案中，氨基酸接头可以是(EAAK)3并且具有SEQID NO：97的氨基酸序列。在另一个实施方案中，氨基酸接头可以是(A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A)并且具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
其它氨基酸接头包括具有一个或多个(AP)n基序的那些接头，其中，n＝1至10(或更大)的整数。在一个实施方案中，接头是(AP)10并且具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列。
在一些实施方案中，接头还包含一个或多个HA标签(SEQ ID NO：53)。
用于制备重组酵母宿主细胞的工具
为了制备重组酵母宿主细胞，在体外制备异源核酸分子(也称为表达盒)并将其引入酵母宿主细胞中以允许异源食品酶和/或饲料酶的重组表达。
本公开的异源核酸分子包含异源多肽(例如异源食品酶和/或饲料酶或包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的编码区。DNA或RNA“编码区”是DNA或RNA分子(优选DNA分子)，其中，当置于合适的调控序列的控制下时，其在体外或体内在细胞中转录和/或翻译成异源食品酶和/或饲料酶。“合适的调控区”是指位于编码区的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核酸区域，并且其影响转录、RNA加工或稳定性、或结合编码区的翻译。调控区可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。编码区的边界取决于5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子。编码区可包括但不限于原核区、来自mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成的DNA分子或RNA分子。如果编码区用于在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码区的3'。在一个实施方案中，编码区域可以称为开放阅读框架。“开放阅读框”的缩写是ORF，并且是指核酸DNA、cDNA或RNA的长度，其包含翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)和终止密码子，并且可以潜在地翻译成多肽序列。
本文描述的异源核酸分子可包含转录和/或翻译控制区。“转录和翻译控制区”是DNA调控区，例如启动子、增强子、终止子等，其提供在宿主细胞中编码区的表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制区域。
在一些实施方案中，本公开的异源核酸分子包括启动子以及异源食品酶和/或饲料酶(包括包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的编码序列。异源核酸序列还可包括终止子。在本公开的异源核酸分子中，启动子和终止子(当存在时)与异源食品酶和/或饲料酶(包括包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸编码序列可操作地连接，例如，它们控制异源食品酶和/或饲料酶(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸序列的表达和异源食品酶和/或饲料酶(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸序列的表达的终止。本公开的异源核酸分子还可以包含编码信号肽的核酸，例如用于将异源食品酶和/或饲料酶输出宿主细胞外的短肽序列。当存在时，编码信号肽的核酸序列直接位于上游，并与编码异源食品酶和/或饲料酶的核酸序列(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)一致。
在本文所述的异源核酸分子中，启动子和编码异源食品酶和/或饲料酶的核酸分子(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)彼此可操作地连接。在本公开的上下文中，表述“可操作地连接”或“可操作地相连”是指启动子与编码异源多肽的核苷酸酸分子以以下方式物理结合的事实：在某些条件下允许表达来自核酸分子的异源蛋白质。在一个实施方案中，启动子可位于编码异源蛋白质的核酸序列的上游(5')。在另一个实施方案中，启动子可位于编码异源蛋白质的核酸序列的下游(3')。在本公开的上下文中，异源核酸分子中可包含一个或多于一个启动子。当异源核酸分子中包含多于一个启动子时，每个启动子与编码异源蛋白质的核酸序列可操作地连接。鉴于编码异源蛋白质的核酸分子，启动子可位于上游、下游以及位于上游和下游两者。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA片段。如本文所使用的术语“表达”是指来自本文所述的异源核酸分子的有义(mRNA)的转录和稳定积累。表达还可以指将mRNA翻译成多肽。启动子可以整体衍生自天然基因，或者由衍生自天然存在的不同启动子的不同元素组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段指导表达，或响应于不同的环境或生理条件。使基因在大多数细胞中以基本相似的水平表达的启动子通常称为“组成型启动子”。在酵母细胞增殖过程中引起基因表达的启动子在本文中称为“增殖启动子”。增殖启动子包括组成型启动子和诱导型启动子，例如葡萄糖调节的启动子、糖蜜调节的启动子、应激反应启动子(包括渗透胁迫应答启动子)和需氧调节的启动子。在本公开的上下文中，重要的是所选择的启动子允许在重组酵母宿主细胞的增殖阶段期间表达异源核酸分子，以允许足够量的细胞相连异源食品酶和/或饲料酶表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。启动子通常以转录起始位点的3'末端为界，并向上游(5'方向)延伸，以包含启动转录所必需的最少数量的碱基或元素，这些碱基或元素的数量要高于背景可检测的水平。在启动子内将发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图方便地定义)，以及负责聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
启动子可以源自编码异源多肽的核酸分子或与其是异源的。启动子可以是异源的或衍生自与重组宿主细胞相同的属或种的菌株。在一个实施方案中，启动子衍生自酵母宿主胞细的相同属或种，并且异源多肽衍生自与宿主细胞不同的属。启动子可以是单个启动子或不同启动子的组合。
在本公开中，在重组酵母宿主细胞的增殖期期间允许异源蛋白质表达或有利于异源蛋白质表达的启动子是优选的。作为兼性厌氧菌的酵母能够在有氧条件下进行呼吸增殖，并在厌氧条件下进行发酵增殖。在许多商业应用中，酵母在需氧条件下增殖以使底物向生物质的转化最大化。任选地，生物质可以在厌氧条件下用于随后的发酵以产生所需的代谢物。在本公开的上下文中，重要的是异源核酸中存在的启动子或启动子组合能够允许异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在重组酵母宿主细胞的增殖期过程中表达。这将允许在发酵前(如果有的话)积累与重组酵母宿主细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶。在一些实施方案中，启动子允许在增殖过程中表达异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体，但不允许在重组酵母宿主细胞的发酵(如果有的话)过程中表达。
启动子可以源自编码异源蛋白质的异源基因或与其异源。可以包含在异源核酸分子中的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子(例如Perez-Torrado等，2005中描述的那些)。诱导型启动子包括但不限于葡萄糖调节启动子(例如，hxt7基因的启动子(称为hxt7p)并具有SEQ ID NO：30的核酸序列，其功能变体或功能片段；ctt1基因的启动子(称为ctt1p)并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；glo1基因的启动子(称为glo1p)并具有核酸SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)，并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段；gsy2基因的启动子(称为gsy2p)并具有SEQ ID NO：53的核酸序列，其功能变体或功能片段)，糖蜜调节启动子(例如，在Praekelt等，1992中描述的mol1基因的启动子(称为mol1p)，或具有SEQ ID NO：64的核酸序列，其功能变体或功能片段)，热休克调节启动子(例如，glo1基因的启动子(称为glo1p)并且具有SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；sti1基因的启动子(称为sti1p)，并且具有SEQ ID NO：56的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)，并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段；gsy2基因的启动子(称为gsy2p)并具有SEQ ID NO：53的核酸序列，其功能变体或功能片段)，氧化应激反应启动子(例如，cup1基因的启动子(称为cup1p)并具有SEQ ID NO：58的核酸序列，其功能变体或功能片段；ctt1基因的启动子(称为ctt1p)并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；trx2基因的启动子(称为trx2p)，并具有SEQ ID NO：55的核酸序列，其功能变体或功能片段；gpd1基因的启动子(称为gpd1p)并具有SEQ ID NO：57的核酸序列，其功能变体或功能片段；hsp12基因的启动子(称为hsp12p)并具有SEQ ID NO：63的核酸序列，其功能变体或功能片段)，渗透应激反应启动子(例如，ctt1基因的启动子(称为ctt1p)，并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；glo1基因的启动子(称为glo1p)并具有SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；gpd1基因的启动子(称为gpd1p)，并具有SEQ ID NO：57的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段)以及氮调节启动子(例如，ygp1基因的启动子(称为ygp1p)并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段)。
可以包含在本公开的异源核酸分子中的启动子包括但不限于：tdh1基因的启动子(称为tdh1p，并且具有例如SEQ ID NO：27的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hor7基因的启动子(称为hor7p，并且具有例如SEQ ID NO：28的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hsp150基因的启动子(称为hsp150p，并且具有例如SEQ ID NO：29的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hxt7基因的启动子(称为hxt7p，并且具有例如SEQ ID NO：30的核酸序列，其功能变体或功能片段)，gpm1基因的启动子(称为gpm1p，并且具有例如SEQ ID NO：31的核酸序列，其功能变体或功能片段)，pgk1基因的启动子(称为pgk1p，并且具有例如SEQ ID NO：32的核酸序列，其功能变体或功能片段)和/或stl1基因的启动子(称为stl1p，并且具有例如SEQ ID NO：33的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在一个实施方案中，启动子是tdh1p和/或hor7p或包含tdh1p和/或hor7p。在另一个实施方案中，启动子包含tdh1p和hor7p，或基本上由tdh1p和hor7p组成。在进一步的实施方案中，启动子是thd1p。
可以使用一种或多种启动子以允许每种异源多肽在重组酵母宿主细胞中表达。在本公开的上下文中，当与启动子组合使用时，表达“启动子的功能片段”是指比天然启动子更短的核酸序列，其保留在重组酵母宿主细胞的增殖阶段期间，控制编码异源食品酶和/或饲料酶或其嵌合体的核酸序列的表达的能力。通常，功能片段是来自天然启动子核酸序列的一个或多个核酸残基的5'和/或3'平截。
在一些实施方案中，核酸分子包含一种终止子序列或终止子序列的组合，以终止异源食品酶和/或饲料酶(或包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的翻译。终止子对于编码异源食品酶和/或饲料酶或其相应嵌合体的核酸序列可以是天然的或异源的。在一些实施方案中，可以使用一种或多种终止子。在一些实施方案中，终止子包含来自dit1基因的终止子(称为dit1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：34的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自idp1基因的终止子(称为idp1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：35的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自gpm1基因的终止子(称为gpm1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：36的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自pma1基因的终止子(称为pma1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：37的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自tdh3基因的终止子(称为tdh3t，并且可以具有例如SEQ ID NO：38的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自hxt2基因的终止子(称为hxt2t，并且可以具有例如SEQ ID NO：39的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自adh3基因的终止子(称为adh3t，并且可以具有例如SEQ ID NO：70的核酸序列，其功能变体或功能片段)，和/或来自ira2基因的终止子(称为ira2t，并且可以具有例如SEQID NO：40的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在一个实施方案中，终止子衍生自dit1基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：34的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在另一个实施方案中，终止子包含adh3基因或衍生自adh3基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：70的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在本公开的上下文中，表述“终止子的功能变体”是指与天然终止子相比在至少一个核酸位置被取代的核酸序列，其保留结束表达编码异源蛋白质或其相应嵌合体的核酸序列的能力。在本公开的上下文中，表述“终止子的功能片段”是指比天然终止子更短的核酸序列，其保留结束编码异源蛋白质或其相应嵌合体的核酸序列表达的能力。
在一些实施方案中，异源核酸分子包含一种信号肽序列或信号肽序列的组合的编码序列，其允许异源蛋白质(或包含异源蛋白质的嵌合蛋白质)输出至酵母宿主细胞壁外。可以简单地将信号肽序列添加到核酸分子中(通常与编码异源食品酶和/或饲料酶的序列一致)或替换已经存在于异源食品酶和/或饲料酶中的信号肽序列。信号肽序列对于编码异源食品酶和/或饲料酶或其相应嵌合体的核酸序列可以是天然或异源的。在一些实施方案中，可以使用一种或多种信号序列。在一些实施方案中，信号序列来自编码转化酶蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：68的氨基酸序列，其变体或其片段)，编码AGA2蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：69的氨基酸序列，其变体或其片段)或编码真菌淀粉酶蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：107的氨基酸序列，其变体或其片段)。在本公开的上下文中，表述“信号序列的功能变体”是指当与天然信号序列相比较，在至少一个核酸位置上被取代的核酸序列，其保留指导异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在细胞外表达的能力。在本公开的上下文中，表述“信号序列的功能片段”是指比天然信号序列更短的核酸序列，其保留指导异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在细胞外表达的能力。
在其中需要在重组酵母宿主细胞内(细胞内)表达异源食品酶和/或饲料酶的一些实施方案中，异源核酸分子可以排除用于编码在编码食品酶和/或饲料酶的天然基因中发现的信号肽序列的部分。
可以将编码异源食品酶和/或饲料酶、嵌合体的异源核酸分子，其变体或片段整合到酵母宿主细胞的基因组中。如本文所使用的术语“整合”是指通过分子生物学技术置于宿主细胞基因组中的遗传因子。例如，可以将遗传因子置于宿主细胞的染色体中，而不是载体(如宿主细胞携带的质粒)。将遗传因子整合到宿主细胞基因组中的方法是本领域熟知的，并且包括同源重组。异源核酸分子可以在酵母宿主细胞基因组中以一个或多个副本存在。或者，异源核酸分子可以独立地从酵母的基因组中复制。在这样的实施方案中，核酸分子可以是稳定的和自我复制的。
本公开还提供了用于修饰酵母宿主细胞的核酸分子，以允许表达异源食品和/或酶、其嵌合体、变体或片段。核酸分子可以是DNA(例如互补DNA、合成DNA或基因组DNA)或RNA(其包括合成RNA)，并且可以以单链(有义链或反义链)或双链形式提供。预期的核酸分子可包括编码区的改变、非编码区的改变或两者的改变。实例是含有产生沉默取代、添加或缺失的改变的核酸分子变体，但不改变编码的食品酶和/或饲料酶、嵌合体、变体或片段的性质或活性。
在一些实施方案中，可以引入重组宿主细胞的异源核酸分子相对于预期的受体重组酵母宿主细胞进行密码子优化。如本文所使用，术语“密码子优化的编码区”是指通过用一个或多个更常在该生物体的基因中使用的密码子替换至少一个或多于一个密码子而适于在给定生物体的细胞中表达的核酸编码区。通常，生物体中高度表达的基因偏向于被该生物体中最丰富的tRNA种类识别的密码子。这种偏向的一个衡量标准是“密码子适应指数”或“CAI”，它测量用于编码特定基因中每个氨基酸的密码子在多大程度上出现在生物体高度表达基因的参考集中的程度。本文所述的密码子优化的异源核酸分子的CAI相当于约0.8至1.0，约0.8至0.9，或约1.0。
可以使用载体将异源核酸分子引入酵母宿主细胞中。“载体”，例如“质粒”、“粘粒”或“人工染色体”(例如，如酵母人工染色体等)是指额外的染色体元素，并且通常呈圆形双链DNA分子形式。此类载体可以是从任何来源衍生的线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中，许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的构建体，其能够将选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3'非翻译序列一起引入细胞中。
本公开还提供了与编码异源多肽以及变体或片段的互补核酸分子可杂交的核酸分子。当核酸分子的单链形式在适当的温度和溶液离子强度条件下与另一核酸分子退火时，核酸分子可与另一核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA)“杂交”。杂交和洗涤条件是众所周知的，其在以下示例：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Second Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor(1989)，特别是其中第11章和表11.1。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可以对严格条件进行调节，以筛选中等相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)以及高度相似的片段(例如复制来自密切相关生物的功能性酶的基因)。杂交后洗涤决定了严格条件。一组条件使用一系列洗涤，从6X SSC，0.5％SDS开始，室温下15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃下重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃下30分钟重复两次。对于更严格的条件，在较高温度下进行洗涤，其中洗涤与上述过程相同，除了在0.2X SSC，0.5％SDS中洗涤两个30min的温度升高至60℃。另一组高度严格的条件采用在0.1X SSC，0.1％SDS中在65℃下进行两次最终洗涤。另一组高度严格条件被定义为：在0.1X SSC，0.1％SDS，65℃下杂交，并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，0.1％SDS洗涤。
杂交需要两个核酸分子含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，但碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同一性程度越大，则具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经推导出用于计算Tm的等式。对于具有较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，并且寡核苷酸的长度决定了其特异性。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可以根据因素诸如探针长度的需要对温度和洗涤溶液盐浓度进行调节。
用于增殖和配制重组酵母宿主细胞的方法
本公开允许制备包含本公开的重组酵母宿主细胞的酵母组合物。在一些实施方案中，酵母组合物可用于减少或免除用外源(以及纯化/分离的)酶对食品或饲料制备过程进行补给的需求。
用于制备酵母组合物的方法一般包括两个步骤：第一步，使重组酵母宿主细胞增殖；以及第二步，配制酵母组合物。如在本公开的上下文中使用的，“酵母组合物”是包含已经增殖的本公开的重组酵母宿主细胞的组合物。酵母组合物可以用于例如后续发酵(在发酵过程中原位提供异源酶)或制备食品/饲料产品。在一个实施方案中，重组酵母宿主细胞以活性或半活性形式在酵母组合物中提供。例如，酵母组合物的一个实施方案是由本公开的重组酵母宿主细胞制备的膏状酵母。
增殖步骤可以是连续培养、分批培养或分批补料培养。在增殖步骤中，将重组酵母宿主细胞置于培养基中，在一些实施方案中，所述培养基可以允许快速生长。例如，培养基可包含碳源(例如，如糖蜜、蔗糖、葡萄糖、右旋糖糖浆、乙醇和/或玉米浆等)、氮源(例如，如氨等)和磷源(例如，如磷酸等)。增殖步骤可以细分为两个步骤，初始接种步骤和进一步的大规模增殖步骤。在增殖步骤中，可以对温度(当重组酵母宿主细胞来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属时，通常在约32℃)、pH和通气条件进行监测和调节，以有利于或优化重组酵母宿主细胞的分裂。例如，当采用分批补料增殖条件时，使用高通气和增量碳水化合物添加可以优化酵母组合物的生物量的产率。
在配制步骤中，可以对增殖后获得的混合物(包含增殖的重组酵母宿主细胞)进行改进。本公开的重组酵母宿主细胞的优点之一是异源食品酶/饲料酶活性与重组酵母宿主细胞相关，因此在增殖后浓缩生物质也将增加异源食品酶/饲料酶的量/活性。在提供酵母组合物的实施方案中，从培养基中除去增殖后获得的混合物的至少一种组分以提供酵母组合物。该组分可以是但不限于水、氨基酸、肽和蛋白质、核酸残基和核酸分子、细胞碎片、发酵产物等。在一个实施方案中，配制步骤包括从培养基的组分中基本上分离增殖的酵母重组宿主细胞(例如，生物质)。如在本公开的上下文中所使用的，表述“基本上分离”是指从增殖的重组酵母宿主细胞中除去培养基的大部分组分。为了提供酵母组合物，可以将增殖的重组酵母宿主细胞离心(并且可以任选地洗涤包含增殖的重组酵母宿主细胞的所得细胞沉淀)、过滤和/或干燥(任选地使用真空干燥技术)。然后可以将分离的重组酵母宿主细胞配制在酵母组合物中。在一些实施方案中，配制步骤可以(至少部分地)保留重组酵母宿主细胞的活力。因此，酵母组合物可以以活性或半活性形式提供。酵母组合物可以液体、半固体或干燥形式提供。在一个实施方案中，酵母组合物可以以酵母膏的形式提供。
酵母组合物可进一步修饰为酵母产品。如在本公开的上下文中所使用的，酵母产品是由增殖的重组酵母宿主细胞获得的产品，其包含异源食品酶和/或饲料酶。酵母产品可以是例如酵母溶解物(例如，自溶物)、酵母提取物、酵母部分(例如，酵母细胞壁)和/或基本上分离形式的异源食品酶和/或饲料酶。如在本公开的上下文中所使用的，表述“从溶解的重组酵母宿主细胞中基本上分离/纯化的异源食品酶和/或饲料酶”是指从异源食品酶和/或饲料酶中除去大部分溶解的重组酵母宿主细胞组分，并以分离/纯化形式提供它们。
酵母组合物以及酵母产品可以作为食品添加剂提供。如在本公开中使用的，表述“食品添加剂”是指用于人类营养的产品，用于改善食品质量或改善生产过程。在此类实施方案中，酵母组合物还可包括但不限于载体(例如盐或小麦砂)、稳定剂和/或油。在具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游食品制备的活酵母组合物(例如，如酵母膏等)提供，作为灭活酵母组合物提供，作为酵母部分和/或作为纯化食品酶提供。在另一个具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游食品制备的干燥制剂(例如喷雾干燥的制剂)提供。
酵母组合物可以作为饲料添加剂提供。如在本公开中所使用的，表述“饲料添加剂”是指用于动物营养的产品，用于改善饲料质量、动物源食品质量和/或改善动物的性能和健康(例如，提供增强的饲料原料消化率)。在此类实施方案中，酵母组合物还可包括但不限于载体(例如盐或小麦砂)、稳定剂和/或油。在具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游饲料制备的活酵母组合物(例如，如酵母膏等)提供，作为灭活酵母组合物提供，作为酵母部分和/或作为纯化饲料酶提供。在另一个具体的实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游饲料制备的干燥制剂(例如喷雾干燥的制剂)提供。在一个实施方案中，将饲料添加剂添加到动物的饮食中以补给它。
用于制作食品和饲料产品的过程
本公开的重组酵母宿主细胞已被设计用于制备用于人(食品)或动物(饲料)消费的产品。因此，本公开提供了一种方法，包括将本公开的重组酵母宿主细胞包含在食品或饲料产品中。在一些实施方案中，可能有利的是提供本公开的重组酵母宿主细胞作为食品添加剂或作为饲料添加剂。在一些实施方案中，该方法还可包括对产品进行发酵和/或对食品或饲料产品进行烘焙。在该方法包括发酵步骤的情况下，可以在本文所述的重组酵母宿主细胞存在下或通过本文所述的重组酵母宿主细胞进行发酵(全部或部分)。本公开的方法可用于延长食品或饲料产品的保质期。可以在使用前对重组酵母细胞的酶活性(与异源食品酶和/或饲料酶以及包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白有关)进行计量并根据所需的活性类型进行调整。
在一个实施方案中，食品和饲料产品是烘焙产品。在这样的实施方案中，优选使用表达细胞相连的烘焙酶的重组酵母宿主细胞。烘焙产品(如酵母发酵的烘焙产品)可以通过本文所述的重组酵母宿主细胞发酵。酵母发酵的烘焙产品包括但不限于面包、糕点(包括羊角面包)、卷、皮塔饼、玉米饼、百吉饼和馅饼或比萨饼皮等。当在制备酵母发酵产品的过程中使用时，重组酵母宿主细胞可以是添加到可发酵底物中的唯一发酵生物。在其它情况下，可以将重组酵母宿主细胞与非重组(例如野生型)酵母混合，以提供足够剂量的异源烘焙酶活性。例如，重组酵母宿主细胞(其可以是重组酿酒酵母酵母宿主细胞)可以任何比例与野生型酵母宿主细胞(其可以是野生型非重组酿酒酵母)组合。在一个实施方案中，重组体：野生型之间的比例为1:100至100:1。
淀粉分解酶在酵母发酵烘焙产品的生产中特别受关注，因为它们有利于淀粉(原始形式或水解形式)的水解，因此为发酵酵母提供能量源来加速发酵过程，增加CO2产量，增加乙醇产量和/或改善发酵产品的感官特性。特别地，麦芽糖淀粉酶在制作面包的过程中非常有用，因为已知它们通过保持烘焙面包的柔软性和回弹性来延长保质期。
在另一个实施方案中，烘焙产品不通过本文所述的重组酵母宿主细胞发酵，而是化学发酵或未发酵。化学发酵和未发酵的烘焙产品包括但不限于蛋糕和扁面包。
在本文所述的方法中，本公开的重组酵母宿主细胞可以以活性形式(例如，液体、压缩或流化床干酵母)、以半活性形式(例如，液体、压缩或流化床干燥的)、无活性形式(例如，鼓式或喷雾干燥的)以及它们的混合物提供。例如，重组酵母宿主细胞可以是活性和半活性或非活性形式的组合，以提供制备烘焙产品所需的烘焙酶的比例和剂量。
通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，这些实施例用于说明本发明而非限制其范围。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
细胞生长。细胞在5mL YPD(10g/L酵母提取物、20g/L细菌蛋白胨、40g/L葡萄糖)中生长过夜。收获(1)mL全培养物，通过离心使细胞沉淀。除去无细胞上清液并保存用于后续分析。将细胞沉淀洗涤一次并重悬于去离子水中。
种子分批补料发酵。制备糖蜜混合物(85％甜菜糖蜜、15％甘蔗糖蜜)，稀释并用硫酸将其pH调节至pH 5.2。将纯培养物接种物在无菌水中稀释，并与硫酸锌、硫酸镁、生物素、硫胺素、泛酸钙和磷酸一起加入糖蜜混合物中。将酵母在32℃，pH 4.5下增殖24小时。将得到的增殖酵母离心，并使用实验室Alfa分离器洗涤增殖液体培养基以达到约20％的酵母固体。用硫酸对酵母固体进行处理，然后用氢氧化钠调节pH，得到酵母膏。
商业化分批补料发酵。制备糖蜜混合物(85％甜菜糖蜜、15％甘蔗糖蜜)，稀释并用硫酸将其pH调节至pH 5.2。将来自种子分批补料的酵母膏在无菌水中稀释，并与硫酸锌、硫酸镁、生物素、硫胺素、泛酸钙一起加入糖蜜混合物中。将得到的增殖酵母离心，并使用实验室Alfa分离器洗涤增殖液体培养基以达到约20％的酵母固体。
膏状酵母和灭活膏状酵母。在发酵之后，将收获的发酵液体培养基离心并使用实验室规模的GEA分离器洗涤以制备最终干重接近20％的酵母膏。为了制备灭活膏状酵母，在温控搅拌/加热板上加热约600g酵母膏直至达到75℃。将膏在75℃下保持15分钟，然后从热源中取出。
喷雾干燥。喷雾干燥的样品通过用迷你喷雾干燥器(Buchi B-290)在150℃下干燥制备。保持进料速率以将出口温度维持在80℃-85℃左右。
珠磨/制备珠磨匀浆。通过在以下珠磨条件下进行珠磨，将酵母膏破坏(典型破碎率>95％的细胞)。将酵母膏(～20％固体)用0.6L室容积Dyno KDL在4℃下进行珠磨，使用0.5mm-0.75mm玻璃珠填充室至80％，填充容量1.6g/mL，采用直径64mm的搅拌器，圆周速度为10m/s。酵母膏流速为6kg/L/h。
速干酵母(IDY)的制备。经目的为生产IDY样品的商业化发酵之后，将收获的液体培养基离心并使用实验室规模的GEA分离器洗涤以制备最终干重接近20％的酵母膏。然后将膏在真空过滤系统中过滤以制备块状酵母。为了除去额外的水，在挤出之前进一步压制块状酵母以达到约35％的干重。然后在与司盘充分混合5分钟后，挤压压制的饼。基于酵母干物质，司盘添加率为1％。挤出后，将酵母在实验室规模的流化床干燥器(Aeromatic AG)中干燥。将干燥温度设定并控制在35℃-40℃。干燥持续约20-25分钟以达到大于94％的固体含量。就发酵配方而言，IDY发酵配方的显著差异在于其在发酵结束时具有2小时的成熟期，其中，氨(N)停止并且发酵温度升高至35℃。
发酵罐自溶。将至少3L(最小工作体积)的20％固体的膏转移到20L发酵罐(BiOENGiNEERNNG)中。自溶在55℃和pH 5.5(用2N硫酸自动控制pH)下进行，并在70rpm下温和搅拌。在温育24小时后收获自溶物(～20％干重)并如下所述进行分离。
实验室规模自溶。该自溶与上述发酵罐自溶相似，但是以较小的规模进行并且具有稍微不同的参数。将膏状酵母(20％固体)进行自溶，并将pH调节至pH 7。将混合物在55℃水浴中的50mL锥形管中温育48小时。
无需洗涤即可分离自溶物。在发酵罐自溶后，在Sorvall Lynx 6000离心机中在1L瓶中以11,000RCF将总自溶物分离10分钟，以获得可溶性级分(11％-13％干重，酵母提取物)和不溶性级分(酵母细胞壁)。测量总自溶物的干重和酶活性，酵母提取物和细胞壁部分的干重和MANU余量。
用洗涤分离自溶物。通过将发酵罐自溶物在50mL锥形管中以3,000RCF离心10分钟来进行分离。通过加入等于从离心步骤获得的上清液重量的水进行另外两次洗涤。YE(酵母提取物)分离产率计算为相对于自溶物中的起始固体，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(分别为WF＝1或2)的固体回收率。YE MANU回收率计算为相对于自溶物中的起始总Phadebas MANU，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(WF＝1或2)的活性(在Phadebas MANU中)。
超滤。通过在11,000RCF下在1L瓶中离心分离发酵罐自溶物，并通过用10kDa分子量截止PES膜(Millipore，Biomax-10)超滤，进一步浓缩酵母提取物级分。截留物部分被膜截留，以及渗透物部分通过膜。
麦芽糖淀粉酶测定。一种麦芽糖淀粉酶Novo单位，MANU，是在标准条件下每分钟裂解一微摩尔麦芽三糖的酶的量。在测定酶活性之前，通过在MANU测定缓冲液(0.1M柠檬酸，pH 5.0)中于60℃温育10分钟使酵母膏样品失活。然后将样品与20mg/ml麦芽三糖底物混合，并在37℃下温育30分钟。加入等体积的1N氢氧化钠终止试剂来终止反应。在用葡萄糖(HK)测定试剂(Sigma G3293)在室温下温育15分钟后，测量被麦芽糖淀粉酶活性水解的葡萄糖。在分光光度计中读取340nm处吸光度。将未知样品与具有已知酶活性的的剂量曲线进行比较。该方法仅用于生成图1的结果。
Phadebas MANU酶活性测定。Phadebas片含有水不溶性淀粉底物和蓝色染料，用交联键与染料结合。底物被麦芽糖淀粉酶水解，释放出可溶的蓝色染料。终止反应并离心后，用分光光度法测量溶液的吸光度，并认为是酶活性的代表。对于每个样品，将一片Phadebas片剂加入到4.9mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(70mM磷酸氢二钠、30mM柠檬酸，pH 5.5)中，在60℃水浴中温育5分钟。然后，将0.1mL在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中稀释的标准品或样品加入到片剂和缓冲溶液中，并在60℃水浴中温育15分钟。加入1mL 0.5M氢氧化钠溶液终止反应并混合。将管离心以除去固体，并用分光光度计在620nm处测量底物的吸光度。将样品(干燥或液体)与具有已知活性的的剂量曲线进行比较。该方法用于生成除了图1之外的所有MANU结果。
葡萄糖氧化酶测定。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加2％葡萄糖中在30℃下批量生长24小时。为了获得破碎的洗涤细胞上清液，将细胞在测定缓冲液中用玻璃珠打浆两次，每次1分钟，其间休息1分钟。通过离心将上清液与全裂解物分离。用K-GLOXTM试剂盒(Megazyme)对全培养物、上清液、破碎的洗涤细胞上清液(其反映细胞内细胞相关活性)、洗涤细胞或的阳性对照(2.40GOD U/mL，相当于10000BG)进行测量：将测定缓冲液(100mM磷酸钾，pH7，含有0.5mg/mL BSA和0.02％(w/v)叠氮化钠)中的样品与90mg/mL葡萄糖和POD混合物混合，并且在室温下温育20分钟。用分光光度计测量510nm处的吸光度。
α-淀粉酶测定(图5)。通过将25μL洗涤的细胞或无细胞上清液加入到50mM乙酸钠pH 5中的25μL 5mM对硝基苯基α-D-己糖苷中，来测量α-淀粉酶活性。将反应在35℃下温育2小时，并通过加入50μL 1M的碳酸氢钠终止。将细胞沉淀，将50μL测定混合物转移至微量滴定板并测量405nm处的吸光度。细胞级分的活性表示为总活性(“结合”+“游离”)的百分比。
α-淀粉酶测定(图13至图16)。将菌株最初在600μL的YPD40中在35℃下在振荡器上的96孔板中以900rpm生长48小时。通过将25μL洗涤的细胞或无细胞上清液加入100μL含有50mM乙酸钠缓冲液(pH5.2)的1％生淀粉中，来测定α-淀粉酶活性。使用Eppendorf梯度循环仪在85℃下测定30分钟。使用二硝基水杨酸试剂溶液(DNS)方法，使用2:1的DNS:淀粉测定比并在100℃下煮沸5分钟对还原糖进行测量。测量540nm处的吸光度。
真菌淀粉酶活性。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加2％葡萄糖中在30℃下批量生长24小时。将全培养物、上清液和破碎的细胞上清液或洗涤的细胞重悬于测定缓冲液(70mM磷酸氢二钠，30mM柠檬酸，pH 5.5)中，与1％糊化小麦淀粉在测定缓冲液中混合，并在30℃下温育1小时。加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)以与还原端反应并在99℃下煮沸5分钟。用分光光度计测量540nm处的吸光度。
小麦淀粉活性测定。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加4％葡萄糖中在35℃下批量生长48小时。将全培养物、上清液和洗涤的细胞重新悬浮于测定缓冲液(50mM乙酸钠，pH5)中，与1％小麦淀粉在测定缓冲液中混合，并在60℃温育5分钟。然后，加入3,5-二硝基水杨酸与还原端反应，并在99℃下煮沸5分钟。用分光光度计测量在540nm处的吸光度。
植酸酶活性测定。制备2倍连续稀释的1M磷酸二氢钾作为计算FTU的标准。将190μl5mM植酸钠溶液(pH 5.5)加入96孔PCR板的每个孔中。将具有4％葡萄糖的酵母提取物蛋白胨培养基中的酵母过夜培养物的标准品或上清液与pH 5.5的5mM植酸钠溶液合并，并在37℃下温育30分钟。温育2小时后再次测量细胞相连样品。在室温下以3500rpm沉淀3分钟之前，将等体积的反应物和变色溶液(4份试剂A至1份试剂B，其中，试剂A为12mM七钼酸铵-HCl水溶液，以及试剂B为2.7％硫酸亚铁水溶液)合并，并在室温下温育10分钟。在分光光度计中读取每种样品或标准品在700nm处的吸光度。
用作为对照的烘焙测试。在存在和不存在外部添加剂量的/>麦芽糖淀粉酶产物的情况下(如图中所示)，用M1074菌株制备面包，并与用表达细胞相连MAA的菌株制备的面包(在缺失/>的情况下)进行比较。对于用表达MAA的酵母膏制成的面包，基于图1B中所示的酶活性将酵母膏的剂量标准化为1000MANU，并补给野生型C菌株酵母膏以获得足够的产气力。简而言之，将1 000g白面粉、600g水、35g酵母膏(以30％固体计量)、70g右旋糖、30g菜籽油、20g盐、0.06g抗坏血酸、0.625g/>(当存在时)和3.75g硬脂酰乳酸钠在碗式混合器中合并成分，低速混合1分钟，并高速混合10分钟。形成三个400g面团块并醒发7分钟。然后将面团卷起以形成面包条，放入面包盘中并在44℃下醒发直至它们达到100mm的高度。面包在225℃下烘焙17分钟。烘焙后测量面包屑硬度(老化指标)、回弹性和面包体积。
质地分析。在面包烘焙后第5天、第8天和第13天进行面包屑质地分析。用电动刀切割面包，使用2.5cm规格。对面包中间的两片进行分析。使用TA-XT Plus TextureTM分析仪评估面包屑硬度和回弹性。使用TA-3探针将面包屑压缩至10mm的距离(40％压缩)。在两个切片上每个切片进行五次测量，总共进行10次测量。宏(macro)用于计算回弹性％。
用作为对照的烘焙测试。白盘面包是在未添加或添加商业(Gluzyme10000BG，剂量为100GOU/kg或200GOU/kg面粉)或酵母细胞相连葡萄糖氧化酶(剂量为127GOU/kg面粉)的情况下制备的。将1 000g白面粉、600g水、40g块状酵母(约30％固体)、70g右旋糖、30g植物油、20g盐和0.06g抗坏血酸在碗式搅拌机中进行组合，低速搅拌1分钟，以及高速混合9分钟。形成三个400g面团块并放入面包盘中，并在44℃下醒发直至它们达到100mm的高度。将面包条在225℃下烘焙17分钟。菌株M16780在酵母提取物蛋白胨培养基加4％葡萄糖中于32℃分批生长24小时。通过离心整个YPD培养物并除去上清液获得细胞沉淀。如葡萄糖氧化酶方法描述中所述对沉淀进行测量，并将相当于127GOU/kg面粉的体积加入面团中。将三个面团块各自校准至100mm高度并烘焙，然后测量烘烤高度。测量烘烤回弹性(烘烤高度减去校准高度)，并通过目视检查对面包屑结构进行评估(较高得分＝较细面包屑)。
实施例II-细胞相连的麦芽糖α-淀粉酶的表达
异源MAA的表达(特别是在栓系存在下)使重组酵母在细胞沉淀中具有麦芽糖淀粉酶活性(图1A)，并且在较大规模上，使重组酵母在酵母膏中具有麦芽糖淀粉酶活性(图1B)。相比之下，相应的野生型菌株未表现出任何麦芽糖淀粉酶活性(图1A和图1B)。通过表达来自tdh1和hor7基因的启动子的异源MAA获得图1A和图1B中所示的结果。仅用一种启动子(来自hor7基因；数据未示出)的组合获得了类似的结果。
为了确定在面包制作中使用表达异源MAA的酵母的效果，用野生型酵母(补给或不补给)或用表达异源MAA的重组酵母制备不同的面包。在面包制作中，质量与柔软性相关，因此寻求防止面包屑坚硬的能力。如图2A至图2C所示，与仅用未添加/>的野生型菌株制成的面包相比，使用表达异源MAA的重组酵母制作面包可降低面包屑硬度。表达异源MAA的重组酵母的使用提供了具有与用补给有/>的野生型酵母制备的面包块相似的面包屑硬度的面包块。
还如图2A至图2C所示，与补给或未补给的野生型酵母相比，表达异源MAA的酵母的使用维持或甚至增加了面包体积。
面包质量也可以通过测量回弹性百分比来评估，而回弹性百分比的增加是希望的。如图3A至图3C所示，与未补给的野生型酵母相比，表达异源MAA的酵母的使用甚至提高了回弹性百分比。
增殖细胞内表达嗜热脂肪土芽孢杆菌MAA的菌株(M14851)(用糖蜜有氧分批补料)并测定MANU活性。如表2所示，在未处理的总液体培养基中，检测到在25.6至39.3之间的MANU活性。在洗涤并浓缩膏后，检测到在132至288之间的MANU活性。
表2.浓缩酵母生物质浓缩物与细胞相连的麦芽糖淀粉酶。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的标准品的剂量曲线进行比较。
增殖表达拴系嗜热脂肪土芽孢杆菌MAA(M13879)的另一菌株(用糖蜜有氧分批补料)，并在各种酵母制剂中测定MANU活性。结果如表3所示。商业化增殖后第1天的酵母膏活性数据是其原始形式的膏的最具代表性的量度。所有其它数据均在商业化增殖后第8天获得。
表3.各种M13979制剂每克干重的Phadebas MANU活性。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线进行比较。
在酵母菌株的不同制剂中测定MANU和小麦淀粉活性，所述酵母菌株在细胞内表达来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α淀粉酶(M15532)并增殖(用糖蜜有氧分批补料)。结果在表4至8中提供，示出了观察到的不同制剂对酶活性水平的影响。
表4.测量各种M15532制剂上的麦芽糖淀粉酶活性的Phadebas和小麦淀粉酶测定法。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线进行比较。
表5.膏、实验室规模的自溶膏(在55℃，pH 7下温育48小时)和再水合速干酵母(IDY)样品的活性结果。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线比较。/>
表6.在酵母菌株M15532的不同制剂干燥之前和之后，自溶物、酵母提取物、超滤截留物和酵母细胞壁制剂中的干重和酶活性余量。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线进行比较。/>
表7.在洗涤和不洗涤酵母菌株M15532的情况下来自总自溶物的酵母提取物和酶回收的分离结果。YE(酵母提取物)分离产率是相对于自溶物中的起始固体，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(分别为WF＝1或2)的固体回收率。YE MANU回收率是相对于自溶物中的起始总Phadebas MANU，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(WF＝1或2)的活性(在Phadebas MANU中)。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线进行比较。
表8.具有10kDa截留分子量的M15532的酵母提取物的超滤结果。YE是酵母提取物，其通过将发酵罐自溶物在1升瓶中以11,000RCF离心10分钟而获得，以模拟商业化规模的分离。截留物是经超滤保留的样品，渗透物是未截留的样品。测定每种样品的Phadebas MANU/ml，并基于每个样品的干重计算MANU/g DW(干重)。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶标准品的剂量曲线进行比较。
已经使用不同的制剂(例如膏和喷雾干燥的)酵母菌株M13979(表达栓系MAA)和M15531(表达细胞内MAA)来制作面包。与无面团改良剂制成的对照面包相比，酵母菌株M13979和M15531的使用降低了面包的面包屑硬度(图11和图12A)，同时保持其体积(图11)并增加其回弹性(图12B)。
在表达来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α淀粉酶的各种酵母菌株的总培养物、培养物上清液和洗涤细胞中测定归一化至细胞密度的小麦淀粉活性，所述酶以分泌形式表达、以栓系形式表达或在细胞内表达，如在图10的图例中所解释的。结果示于图8中，并且表明当MAA在细胞内表达时观察到最高活性。
实施例III-异源α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶、葡萄糖氧化酶和真菌淀粉酶的表达
异源葡萄糖淀粉酶(GA)在酿酒酵母中由tef2基因的启动子表达。当GA表达为栓系酶时，与细胞沉淀有关的活性增加(图4)。
来自tef2基因启动子的异源α-淀粉酶(AA)。当AA表达为栓系酶时，与沉淀相关的活性增加，尤其是在接头存在下(图5)。
制备表达来自柠檬酸杆菌(C.braakii)的植酸酶的酵母菌株的各种制剂，并测定它们的FTU活性。一些菌株以分泌形式表达植酸酶(T2633)，其它菌株以使用不同栓系的栓系形式表达植酸酶(T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)。对于上清液和细胞本身，结果示于图7A和图7B中。
制备表达来自大肠杆菌的植酸酶的酵母菌株的各种制剂，并测定它们的FTU活性。一些菌株以分泌形式表达植酸酶(M11312)，其它菌株以使用不同构型栓系的栓系形式表达植酸酶(T2705、T2706、M12795、M12938、T2816)。对于上清液和细胞本身，结果示于图8和图9中。
使用栓系部分的各种平截制备异源嵌合耐热的强烈热球菌α-淀粉酶-SPl1构建体和热水管热球菌α-淀粉酶-CCW12构建体。将与表达具有平截的GPI锚定部分的嵌合多肽的菌株的洗涤细胞相关的α-淀粉酶活性与未平截的GPI锚定部分进行比较，如图13和图14所示。
如图13所示，具有全长栓系部分(由菌株M15222表达)的嵌合多肽显示出与具有平截的栓系部分的多肽(由菌株M15774(21aa-长平截)、M15771(51aa-长平截)、M1577(81aa-长平截)或M15772(130aa-长平截)表达)相同或更高的α-淀粉酶活性。
如图14所示，具有全长栓系部分的嵌合多肽(来自菌株M15215的表达)与具有平截的栓系部分的嵌合多肽(由菌株M15773(24aa-长平截)、M15776(49aa-长平截)、M16251(74aa-长平截)或M15775(99aa-长平截)表达)相比表现出相似或更高的α-淀粉酶活性。
使用各种接头和相同的栓系部分制备异源嵌合耐热的强烈热球菌α-淀粉酶-SPL1构建体和热水管热球菌α-淀粉酶-CCW12构建体。与表达具有不同接头的嵌合多肽的菌株的洗涤细胞相连的α-淀粉酶活性示于图15和图16中。
如图15所示，所有菌株的α-淀粉酶活性均高于对照菌株(M2390)，与所用接头的类型无关。当使用接头7(SEQ ID NO：99)(菌株M16222)时，α-淀粉酶活性最高。
如图16所示，所有菌株的α-淀粉酶活性均高于对照菌株(M2390)，与所用接头的类型无关。当使用接头5(SEQ ID NO：97)(菌株M15780)时，α-淀粉酶活性最高。
异源嵌合葡萄糖氧化酶(GO)构建体在细胞内或以分泌形式表达。将从各种细胞级分获得的GO活性与对照菌株(M10474)或阳性对照酶制剂Gluzyme(图17)进行比较。与菌株M16780和M16273相关的GO活性高于与亲本菌株M10474相关的对照GO活性(图18)。
菌株M16780也用于补给面包的面团，将其与阴性对照(未补给的面团)面包和阳性对照(葡萄糖氧化酶补给面团)面包相比较。如图21所示，较高的烘焙回弹性和较细的面包屑结构(在M16780细胞沉淀面团中观察到)是补给面团中葡萄糖氧化酶功能的指示。
异源嵌合真菌淀粉酶(FA)构建体以分泌形式表达。将从各种细胞级分获得的FA活性与对照菌株M10474或阳性对照酶制剂进行比较(图19)。与菌株M16772和M16540相关的FA活性高于与亲本菌株M10474相关的对照活性(图20)。
虽然已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但应理解，权利要求的范围不应受实施例中所述的优选实施方案的限制，而应给出与整个描述一致的最广泛的解释。
参考文献
Pérez-Torrado R,Bruno-Bárcena JM,Matallana E.Monitoring stress-related genes during the process of biomass propagation of Saccharomycescerevisiae strains used for wine making.Appl Environ Microbiol.2005Nov；71(11):6831-7.
Praekelt UM,Meacock PA.MOL1,a Saccharomyces cerevisiae gene that ishighly expressed in early stationary phase during growth onmolasses.Yeast.1992Sep；8(9):699-710.
序列表
<110> 拉勒曼德匈牙利流动性管理有限责任公司
<120> 细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶
<130> 55729550-16PCT
<150> 62/470,568
<151> 2017-03-13
<150> 62/625,751
<151> 2018-02-02
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 719
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪土芽孢杆菌
<400> 1
Met Lys Lys Lys Thr Leu Ser Leu Phe Val Gly Leu Met Leu Leu Ile
1 5 10 15
Gly Leu Leu Phe Ser Gly Ser Leu Pro Tyr Asn Pro Asn Ala Ala Glu
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile
35 40 45
Ile Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys
50 55 60
Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp
65 70 75 80
Gly Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln
85 90 95
Leu Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp
100 105 110
Thr Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg
115 120 125
Asp Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp
130 135 140
Thr Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp
145 150 155 160
Phe Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr
180 185 190
Phe Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser
195 200 205
Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro
210 215 220
Ala Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala
225 230 235 240
Gln Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp
245 250 255
Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys
260 265 270
Ser Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly
275 280 285
Glu Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val
290 295 300
Arg Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn
305 310 315 320
Thr Val Ile Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp
325 330 335
Leu Asn Asn Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu
340 345 350
Asn Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser
355 360 365
Val Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu
370 375 380
Thr Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met
385 390 395 400
Ala Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp
405 410 415
Thr Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg
420 425 430
Arg Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile
435 440 445
Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val
450 455 460
Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly
465 470 475 480
Leu Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly
485 490 495
Leu Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser
500 505 510
Phe Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser
515 520 525
Ala Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro
530 535 540
Gly Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly
545 550 555 560
Thr Val Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser
565 570 575
Asn Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp
580 585 590
Val Lys Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn
595 600 605
Ile Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala
610 615 620
Pro Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro
625 630 635 640
Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala
645 650 655
Gln Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe
660 665 670
Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg
675 680 685
Ala Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr
690 695 700
Thr Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn
705 710 715
<210> 2
<211> 499
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 2
Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Cys Asn Thr Ala Asp Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln
50 55 60
Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala
65 70 75 80
Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr
85 90 95
Gly Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn
100 105 110
Glu Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu
115 120 125
His Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met
130 135 140
Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Leu Ile Gln Asn Tyr
165 170 175
Glu Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val
180 185 190
Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp
195 200 205
Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu
210 215 220
Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Asn Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp
245 250 255
Pro Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn
260 265 270
Tyr Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly
275 280 285
Ser Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys
290 295 300
Pro Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro
305 310 315 320
Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala
325 330 335
Ala Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln
340 345 350
Glu Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr
355 360 365
Trp Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala
370 375 380
Ser Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe
385 390 395 400
Val Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala
405 410 415
Met Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly
435 440 445
Tyr Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val
450 455 460
Thr Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu
465 470 475 480
Pro Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys
485 490 495
Ser Ser Ser
<210> 3
<211> 515
<212> PRT
<213> 扣囊复膜酵母菌
<400> 3
Met Ile Arg Leu Thr Val Phe Leu Thr Ala Val Phe Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser Cys Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe Gln
20 25 30
Ala Tyr Ser Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp Ile
35 40 45
His Glu Gln Pro Ala Val Ser Trp Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile Asp
50 55 60
Tyr Pro Glu Gly Gln Phe Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Val Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ala Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His Ser
100 105 110
Phe Ser Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn
115 120 125
Thr Tyr Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp Ser
130 135 140
Pro Asn His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp Thr
145 150 155 160
Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu
165 170 175
Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His Asn
180 185 190
Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser Ser
195 200 205
Ala Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His Val
210 215 220
Ser Thr His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln
225 230 235 240
Gly Thr His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser Tyr
245 250 255
Gly Ile Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser Trp
260 265 270
Leu Glu Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser Gly
275 280 285
Phe Val Asn Ser Gly Lys Lys His Ile Val Glu Ser Pro Gln Leu Ser
290 295 300
Ser Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile Thr
305 310 315 320
His Asp Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp Asn
325 330 335
Ser Tyr Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys Asn
340 345 350
Arg Tyr Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly Arg
355 360 365
Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn Pro
370 375 380
Trp Gln Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Gly Gln Thr Phe Tyr Thr Leu Ala
385 390 395 400
Tyr Asn Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu Asn
405 410 415
Tyr Asp Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp Ser
420 425 430
Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp Asn
435 440 445
Tyr Lys Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe Leu
450 455 460
Lys Val Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu Glu
465 470 475 480
Ile Asn Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr Trp
485 490 495
Ser Ser Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu Ile
500 505 510
Glu Leu Leu
515
<210> 4
<211> 551
<212> PRT
<213> 嗜糖假单胞菌
<400> 4
Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
Phe Pro Ala Leu Ala Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg
20 25 30
Tyr His Gly Gly Asp Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val
35 40 45
Val Arg Glu Ala Pro Asn Asp Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala
50 55 60
Ser Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro
65 70 75 80
Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Thr Asp Gly Gly Lys Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser
100 105 110
Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val
115 120 125
Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Gly Tyr Pro
130 135 140
Asp Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe Trp Arg Asn Asp
145 150 155 160
Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg
165 170 175
Phe Ile Gly Gly Glu Ser Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr
180 185 190
Gly Met Phe Arg Asp Glu Leu Ala Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala
195 200 205
Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val
210 215 220
Asp Ser Trp Met Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu
225 230 235 240
Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp Trp Arg Asn Thr
245 250 255
Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys
260 265 270
Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val
275 280 285
Ala Asp Trp Lys His Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg
290 295 300
Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro
305 310 315 320
Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln Asp Gly Leu Ile
325 330 335
Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val
340 345 350
Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln
355 360 365
Leu Ile Gln Val Arg Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile
370 375 380
Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser
385 390 395 400
Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly
405 410 415
Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp
435 440 445
Gly Gly Glu Gly Gly Leu Val Asn Val Asn Phe Arg Cys Asp Asn Gly
450 455 460
Val Thr Gln Met Gly Asp Ser Val Tyr Ala Val Gly Asn Val Ser Gln
465 470 475 480
Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Ser Ala Val Arg Leu Thr Asp Thr Ser
485 490 495
Ser Tyr Pro Thr Trp Lys Gly Ser Ile Ala Leu Pro Asp Gly Gln Asn
500 505 510
Val Glu Trp Lys Cys Leu Ile Arg Asn Glu Ala Asp Ala Thr Leu Val
515 520 525
Arg Gln Trp Gln Ser Gly Gly Asn Asn Gln Val Gln Ala Ala Ala Gly
530 535 540
Ala Ser Thr Ser Gly Ser Phe
545 550
<210> 5
<211> 926
<212> PRT
<213> 长野芽胞杆菌
<400> 5
Asp Gly Asn Thr Thr Asn Ile Val Val His Tyr Phe Arg Pro Ser Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Thr Asp Trp Asn Leu Trp Met Trp Pro Glu Asn Gly Asp Gly
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Thr Asp Ser Tyr Gly Glu Val Ala
35 40 45
Ser Val Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg
50 55 60
Lys Gly Asn Trp Asp Ala Lys Asp Ile Asp Ser Asp Arg Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Leu Ser Lys Gly His Glu Ile Trp Leu Val Gln Gly Asn Ser Gln Ile
85 90 95
Phe Tyr Ser Glu Lys Asp Ala Glu Ala Ala Ala Gln Pro Ala Val Ser
100 105 110
Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln
115 120 125
Pro Phe Thr Leu Gly Glu Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp
130 135 140
Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Ser Asp Ala Asn Gln
145 150 155 160
Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser
165 170 175
Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Asn Thr Leu Leu Lys Lys Val Asn Ser
180 185 190
Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asn Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr
195 200 205
Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp
210 215 220
Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser
225 230 235 240
Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn
245 250 255
Ala Asp Leu Gln Val Asp Ser Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Ala
260 265 270
Val Thr Leu Gly Glu Asn Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln
275 280 285
Thr Glu Asp Tyr Gln Ala Gly Gln Val Ile Pro Arg Lys Val Leu Asp
290 295 300
Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr
305 310 315 320
Lys Asn Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val
325 330 335
Asn Val Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ala Val Thr Lys Thr Val
340 345 350
Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln
355 360 365
Asp Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser
370 375 380
Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly
385 390 395 400
Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp
405 410 415
Glu Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile
420 425 430
Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ser Asn Ser Gly Met
435 440 445
Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly
450 455 460
Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile
465 470 475 480
Thr His Val Gln Leu Gln Pro Val Phe Ala Phe Asn Ser Val Asn Glu
485 490 495
Asn Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn
500 505 510
Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Thr Arg Ile
515 520 525
Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Gln Asp His Ile Gly
530 535 540
Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser
545 550 555 560
Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala
565 570 575
Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu
580 585 590
Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Phe Trp Val
595 600 605
Asn Glu Tyr His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu
610 615 620
Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Thr Gln Leu His Ala Ile Asp
625 630 635 640
Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala
645 650 655
Leu Pro Ala Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly
660 665 670
Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Gly Leu Asp Gly Ser Val
675 680 685
Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr
690 695 700
Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ala
705 710 715 720
Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr
725 730 735
Leu Trp Asp Lys Ile Ala Gln Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp
740 745 750
Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Ile Val Met Thr Ser Gln
755 760 765
Gly Ile Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly
770 775 780
Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Val Val Asn Glu Phe Asp
785 790 795 800
Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly
805 810 815
Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala
820 825 830
Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr
835 840 845
Val Ala Tyr Glu Leu Ser Asp His Ala Asn Lys Asp Thr Trp Gly Asn
850 855 860
Ile Val Val Ile Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ile Asn Leu
865 870 875 880
Pro Ser Gly Lys Trp Glu Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu
885 890 895
Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser
900 905 910
Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Ser Asp Gly Lys
915 920 925
<210> 6
<211> 829
<212> PRT
<213> 嗜酸普鲁兰芽孢杆菌
<400> 6
Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ser
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn
20 25 30
Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly Val
35 40 45
Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu Ile
50 55 60
Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu His
65 70 75 80
Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp Pro
85 90 95
Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro Lys
100 105 110
Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu
115 120 125
Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val Thr
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn Ala
145 150 155 160
Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr Leu
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala Gly
180 185 190
Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Leu Pro Arg
195 200 205
Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln Leu Glu Met Gln
245 250 255
Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro Gly Asn Leu Lys
260 265 270
Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Gln Thr
275 280 285
Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn Ala Thr Arg Gly
290 295 300
Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly Trp Lys Glu Asp
305 310 315 320
His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val Ile Tyr Glu Val
325 330 335
His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys
340 345 350
Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn
355 360 365
Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ile Asn Ala Val
370 375 380
Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Asn Ser Ile Asp Glu Thr Gln Pro
385 390 395 400
Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn Val Pro Glu
405 410 415
Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg Ile Thr Gln Leu
420 425 430
Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile Ala Ile Asn Met
435 440 445
Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Asn Val Gly Val Ser Asp Phe Asp
450 455 460
Lys Ile Val Pro Gln Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Ser Ala Gly Asn Tyr
465 470 475 480
Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu Ile Ala Thr Glu Arg Pro Met
485 490 495
Val Gln Lys Phe Val Leu Asp Ser Val Lys Tyr Trp Val Lys Glu Tyr
500 505 510
His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp
515 520 525
Thr Met Ala Lys Ile Ser Lys Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile
530 535 540
Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ser Ser
545 550 555 560
Asp Gln Leu Val Thr Lys Gly Gln Gln Lys Gly Leu Gly Ile Gly Val
565 570 575
Phe Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Lys
580 585 590
Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Asp Pro Asn Gln Val Asn Val Ile
595 600 605
Lys Asn Arg Val Met Gly Ser Ile Ser Asp Phe Thr Ser Ala Pro Ser
610 615 620
Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Met Thr Leu Trp Asp
625 630 635 640
Lys Ile Ser Ala Ser Asn Pro Asn Asp Thr Gln Ala Asp Arg Ile Lys
645 650 655
Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Phe Thr Ser Gln Gly Val Pro
660 665 670
Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp
675 680 685
Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ser Val Asn Gln Phe Asp Trp Ser Arg
690 695 700
Lys Ala Gln Phe Glu Asn Val Phe Asp Tyr Tyr Ser Trp Leu Ile His
705 710 715 720
Leu Arg Asp Asn His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asp Gln Ile
725 730 735
Lys Gln Asn Leu Thr Phe Leu Asp Ser Pro Thr Asn Thr Val Ala Phe
740 745 750
Glu Leu Lys Asn His Ala Asn His Asp Lys Trp Lys Asn Ile Ile Val
755 760 765
Met Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Gln Thr Leu Thr Leu Pro Ser Gly
770 775 780
Asn Trp Thr Ile Val Gly Leu Gly Asn Gln Val Gly Glu Lys Ser Leu
785 790 795 800
Gly His Val Asn Gly Thr Val Glu Val Pro Ala Leu Ser Thr Ile Ile
805 810 815
Leu His Gln Gly Thr Ser Glu Asp Val Ile Asp Gln Asn
820 825
<210> 7
<211> 776
<212> PRT
<213> 假单胞菌
<400> 7
Met Lys Cys Pro Lys Ile Leu Ala Ala Leu Leu Gly Cys Ala Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Val Pro Ala Met Pro Ala His Ala Ala Ile Asn Ser Met Ser
20 25 30
Leu Gly Ala Ser Tyr Asp Ala Gln Gln Ala Asn Ile Thr Phe Arg Val
35 40 45
Tyr Ser Ser Gln Ala Thr Arg Ile Val Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Gly
50 55 60
Tyr Gly Val Gln Glu Ser Ala Thr Tyr Thr Leu Ser Pro Ala Gly Ser
65 70 75 80
Gly Val Trp Ala Val Thr Val Pro Val Ser Ser Ile Lys Ala Ala Gly
85 90 95
Ile Thr Gly Ala Val Tyr Tyr Gly Tyr Arg Ala Trp Gly Pro Asn Trp
100 105 110
Pro Tyr Ala Ser Asn Trp Gly Lys Gly Ser Gln Ala Gly Phe Val Ser
115 120 125
Asp Val Asp Ala Asn Gly Asp Arg Phe Asn Pro Asn Lys Leu Leu Leu
130 135 140
Asp Pro Tyr Ala Gln Glu Val Ser Gln Asp Pro Leu Asn Pro Ser Asn
145 150 155 160
Gln Asn Gly Asn Val Phe Ala Ser Gly Ala Ser Tyr Arg Thr Thr Asp
165 170 175
Ser Gly Ile Tyr Ala Pro Lys Gly Val Val Leu Val Pro Ser Thr Gln
180 185 190
Ser Thr Gly Thr Lys Pro Thr Arg Ala Gln Lys Asp Asp Val Ile Tyr
195 200 205
Glu Val His Val Arg Gly Phe Thr Glu Gln Asp Thr Ser Ile Pro Ala
210 215 220
Gln Tyr Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Ala Gly Leu Lys Ala Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Ala Ser Leu Gly Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Pro Val Gln Glu Thr
245 250 255
Gln Asn Asp Ala Asn Asp Val Val Pro Asn Ser Asp Ala Asn Gln Asn
260 265 270
Tyr Trp Gly Tyr Met Thr Glu Asn Tyr Phe Ser Pro Asp Arg Arg Tyr
275 280 285
Ala Tyr Asn Lys Ala Ala Gly Gly Pro Thr Ala Glu Phe Gln Ala Met
290 295 300
Val Gln Ala Phe His Asn Ala Gly Ile Lys Val Tyr Met Asp Val Val
305 310 315 320
Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Gly Thr Trp Thr Ser Ser Asp Pro Thr
325 330 335
Thr Ala Thr Ile Tyr Ser Trp Arg Gly Leu Asp Asn Ala Thr Tyr Tyr
340 345 350
Glu Leu Thr Ser Gly Asn Gln Tyr Phe Tyr Asp Asn Thr Gly Ile Gly
355 360 365
Ala Asn Phe Asn Thr Tyr Asn Thr Val Ala Gln Asn Leu Ile Val Asp
370 375 380
Ser Leu Ala Tyr Trp Ala Asn Thr Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe
385 390 395 400
Asp Leu Ala Ser Val Leu Gly Asn Ser Cys Leu Asn Gly Ala Tyr Thr
405 410 415
Ala Ser Ala Pro Asn Cys Pro Asn Gly Gly Tyr Asn Phe Asp Ala Ala
420 425 430
Asp Ser Asn Val Ala Ile Asn Arg Ile Leu Arg Glu Phe Thr Val Arg
435 440 445
Pro Ala Ala Gly Gly Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ala Glu Pro Trp Ala
450 455 460
Ile Gly Gly Asn Ser Tyr Gln Leu Gly Gly Phe Pro Gln Gly Trp Ser
465 470 475 480
Glu Trp Asn Gly Leu Phe Arg Asp Ser Leu Arg Gln Ala Gln Asn Glu
485 490 495
Leu Gly Ser Met Thr Ile Tyr Val Thr Gln Asp Ala Asn Asp Phe Ser
500 505 510
Gly Ser Ser Asn Leu Phe Gln Ser Ser Gly Arg Ser Pro Trp Asn Ser
515 520 525
Ile Asn Phe Ile Asp Val His Asp Gly Met Thr Leu Lys Asp Val Tyr
530 535 540
Ser Cys Asn Gly Ala Asn Asn Ser Gln Ala Trp Pro Tyr Gly Pro Ser
545 550 555 560
Asp Gly Gly Thr Ser Thr Asn Tyr Ser Trp Asp Gln Gly Met Ser Ala
565 570 575
Gly Thr Gly Ala Ala Val Asp Gln Arg Arg Ala Ala Arg Thr Gly Met
580 585 590
Ala Phe Glu Met Leu Ser Ala Gly Thr Pro Leu Met Gln Gly Gly Asp
595 600 605
Glu Tyr Leu Arg Thr Leu Gln Cys Asn Asn Asn Ala Tyr Asn Leu Asp
610 615 620
Ser Ser Ala Asn Trp Leu Thr Tyr Ser Trp Thr Thr Asp Gln Ser Asn
625 630 635 640
Phe Tyr Thr Phe Ala Gln Arg Leu Ile Ala Phe Arg Lys Ala His Pro
645 650 655
Ala Leu Arg Pro Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Ser Gln Leu Thr Trp Tyr
660 665 670
Gln Pro Ser Gly Ala Val Ala Asp Ser Asn Tyr Trp Asn Asn Thr Ser
675 680 685
Asn Tyr Ala Ile Ala Tyr Ala Ile Asn Gly Pro Ser Leu Gly Asp Ser
690 695 700
Asn Ser Ile Tyr Val Ala Tyr Asn Gly Trp Ser Ser Ser Val Thr Phe
705 710 715 720
Thr Leu Pro Ala Pro Pro Ser Gly Thr Gln Trp Tyr Arg Val Thr Asp
725 730 735
Thr Cys Asp Trp Asn Asp Gly Ala Ser Thr Phe Val Ala Pro Gly Ser
740 745 750
Glu Thr Leu Ile Gly Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Gly Gln Cys Gly Gln
755 760 765
Ser Leu Leu Leu Leu Ile Ser Lys
770 775
<210> 8
<211> 500
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<400> 8
Met Glu Leu Pro Arg Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Pro Thr Ser Leu
1 5 10 15
Pro Gly Pro Tyr Gly Val Gly Val Leu Gly Gln Glu Ala Arg Asp Phe
20 25 30
Leu Arg Phe Leu Lys Glu Ala Gly Gly Arg Tyr Trp Gln Val Leu Pro
35 40 45
Leu Gly Pro Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Leu Arg Pro Leu Ala Glu Arg
65 70 75 80
Gly Tyr Val Arg Leu Glu Asp Pro Gly Phe Pro Gln Gly Arg Val Asp
85 90 95
Tyr Gly Leu Leu Tyr Ala Trp Lys Trp Pro Ala Leu Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Arg Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Arg Glu Ala Phe Ala
115 120 125
Ala Phe Arg Glu Arg Glu Ala Trp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu Phe
130 135 140
Met Ala Leu Lys Gly Ala His Gly Gly Leu Pro Trp Asn Arg Trp Pro
145 150 155 160
Leu Pro Leu Arg Lys Arg Glu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Ala Lys Ser
165 170 175
Ala Leu Ala Glu Glu Val Ala Phe His Ala Phe Thr Gln Trp Leu Phe
180 185 190
Phe Arg Gln Trp Gly Ala Leu Lys Ala Glu Ala Glu Ala Leu Gly Ile
195 200 205
Arg Ile Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Glu Asp Ser Ala Glu
210 215 220
Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln
245 250 255
Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Val Leu Glu Arg Glu Gly
260 265 270
Phe Ser Phe Trp Ile Arg Arg Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe His
275 280 285
Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile
290 295 300
Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro
305 310 315 320
Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Val Phe Gly Glu Val Pro
325 330 335
Val Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu
340 345 350
Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe
355 360 365
Asp Asp Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala His
370 375 380
Gly Arg Val Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Leu
385 390 395 400
Gly Trp Tyr Arg Thr Ala Thr Pro His Glu Lys Ala Phe Met Ala Arg
405 410 415
Tyr Leu Ala Asp Trp Gly Ile Thr Phe Arg Glu Glu Glu Glu Val Pro
420 425 430
Trp Ala Leu Met His Leu Gly Met Lys Ser Val Ala Arg Leu Ala Val
435 440 445
Tyr Pro Val Gln Asp Val Leu Ala Leu Gly Ser Glu Ala Arg Met Asn
450 455 460
Tyr Pro Gly Arg Pro Ser Gly Asn Trp Ala Trp Arg Leu Leu Pro Gly
465 470 475 480
Glu Leu Ser Pro Glu His Gly Ala Arg Leu Arg Ala Met Ala Glu Ala
485 490 495
Thr Glu Arg Leu
500
<210> 9
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Flo1栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1641)
<400> 9
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc atc aga act cca acc agt gaa ggt 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly
35 40 45
ttg gtt aca acc acc act gaa cca tgg act ggt act ttt act tcg act 192
Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr
50 55 60
tcc act gaa atg tct act gtc act gga acc aat ggc ttg cca act gat 240
Ser Thr Glu Met Ser Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp
65 70 75 80
gaa act gtc att gtt gtc aaa act cca act act gcc atc tca tcc agt 288
Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser
85 90 95
ttg tca tca tca tct tca gga caa atc acc agc tct atc acg tct tcg 336
Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser
100 105 110
cgt cca att att acc cca ttc tat cct agc aat gga act tct gtg att 384
Arg Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile
115 120 125
tct tcc tca gta att tct tcc tca gtc act tct tct cta ttc act tct 432
Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu Phe Thr Ser
130 135 140
tct cca gtc att tct tcc tca gtc att tct tct tct aca aca acc tcc 480
Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser
145 150 155 160
act tct ata ttt tct gaa tca tct aaa tca tcc gtc att cca acc agt 528
Thr Ser Ile Phe Ser Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser
165 170 175
agt tcc acc tct ggt tct tct gag agc gaa acg agt tca gct ggt tct 576
Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Gly Ser
180 185 190
gtc tct tct tcc tct ttt atc tct tct gaa tca tca aaa tct cct aca 624
Val Ser Ser Ser Ser Phe Ile Ser Ser Glu Ser Ser Lys Ser Pro Thr
195 200 205
tat tct tct tca tca tta cca ctt gtt acc agt gcg aca aca agc cag 672
Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln
210 215 220
gaa act gct tct tca tta cca cct gct acc act aca aaa acg agc gaa 720
Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu
225 230 235 240
caa acc act ttg gtt acc gtg aca tcc tgc gag tct cat gtg tgc act 768
Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr
245 250 255
gaa tcc atc tcc cct gcg att gtt tcc aca gct act gtt act gtt agc 816
Glu Ser Ile Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser
260 265 270
ggc gtc aca aca gag tat acc aca tgg tgc cct att tct act aca gag 864
Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu
275 280 285
aca aca aag caa acc aaa ggg aca aca gag caa acc aca gaa aca aca 912
Thr Thr Lys Gln Thr Lys Gly Thr Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr
290 295 300
aaa caa acc acg gta gtt aca att tct tct tgt gaa tct gac gta tgc 960
Lys Gln Thr Thr Val Val Thr Ile Ser Ser Cys Glu Ser Asp Val Cys
305 310 315 320
tct aag act gct tct cca gcc att gta tct aca agc act gct act att 1008
Ser Lys Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile
325 330 335
aac ggc gtt act aca gaa tac aca aca tgg tgt cct att tcc acc aca 1056
Asn Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr
340 345 350
gaa tcg agg caa caa aca acg cta gtt act gtt act tcc tgc gaa tct 1104
Glu Ser Arg Gln Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser
355 360 365
ggt gtg tgt tcc gaa act gct tca cct gcc att gtt tcg acg gcc acg 1152
Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr
370 375 380
gct act gtg aat gat gtt gtt acg gtc tat cct aca tgg agg cca cag 1200
Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln
385 390 395 400
act gcg aat gaa gag tct gtc agc tct aaa atg aac agt gct acc ggt 1248
Thr Ala Asn Glu Glu Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Gly
405 410 415
gag aca aca acc aat act tta gct gct gaa acg act acc aat act gta 1296
Glu Thr Thr Thr Asn Thr Leu Ala Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val
420 425 430
gct gct gag acg att acc aat act gga gct gct gag acg aaa aca gta 1344
Ala Ala Glu Thr Ile Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val
435 440 445
gtc acc tct tcg ctt tca aga tct aat cac gct gaa aca cag acg gct 1392
Val Thr Ser Ser Leu Ser Arg Ser Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala
450 455 460
tcc gcg acc gat gtg att ggt cac agc agt agt gtt gtt tct gta tcc 1440
Ser Ala Thr Asp Val Ile Gly His Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser
465 470 475 480
gaa act ggc aac acc aag agt cta aca agt tcc ggg ttg agt act atg 1488
Glu Thr Gly Asn Thr Lys Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met
485 490 495
tcg caa cag cct cgt agc aca cca gca agc agc atg gta gga tat agt 1536
Ser Gln Gln Pro Arg Ser Thr Pro Ala Ser Ser Met Val Gly Tyr Ser
500 505 510
aca gct tct tta gaa att tca acg tat gct ggc agt gcc aac agc tta 1584
Thr Ala Ser Leu Glu Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu
515 520 525
ctg gcc ggt agt ggt tta agt gtc ttc att gcg tcc tta ttg ctg gca 1632
Leu Ala Gly Ser Gly Leu Ser Val Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala
530 535 540
att att taa 1641
Ile Ile
545
<210> 10
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 10
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly
35 40 45
Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Glu Met Ser Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp
65 70 75 80
Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser
100 105 110
Arg Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile
115 120 125
Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu Phe Thr Ser
130 135 140
Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser
145 150 155 160
Thr Ser Ile Phe Ser Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser
165 170 175
Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Gly Ser
180 185 190
Val Ser Ser Ser Ser Phe Ile Ser Ser Glu Ser Ser Lys Ser Pro Thr
195 200 205
Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln
210 215 220
Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu
225 230 235 240
Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr
245 250 255
Glu Ser Ile Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser
260 265 270
Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu
275 280 285
Thr Thr Lys Gln Thr Lys Gly Thr Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr
290 295 300
Lys Gln Thr Thr Val Val Thr Ile Ser Ser Cys Glu Ser Asp Val Cys
305 310 315 320
Ser Lys Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile
325 330 335
Asn Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr
340 345 350
Glu Ser Arg Gln Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser
355 360 365
Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr
370 375 380
Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln
385 390 395 400
Thr Ala Asn Glu Glu Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Gly
405 410 415
Glu Thr Thr Thr Asn Thr Leu Ala Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val
420 425 430
Ala Ala Glu Thr Ile Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val
435 440 445
Val Thr Ser Ser Leu Ser Arg Ser Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala
450 455 460
Ser Ala Thr Asp Val Ile Gly His Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser
465 470 475 480
Glu Thr Gly Asn Thr Lys Ser Leu Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met
485 490 495
Ser Gln Gln Pro Arg Ser Thr Pro Ala Ser Ser Met Val Gly Tyr Ser
500 505 510
Thr Ala Ser Leu Glu Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu
515 520 525
Leu Ala Gly Ser Gly Leu Ser Val Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala
530 535 540
Ile Ile
545
<210> 11
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sed1栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(807)
<400> 11
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc gct ctt cca act aac ggt act tct 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Leu Pro Thr Asn Gly Thr Ser
35 40 45
act gaa gct cca act gat act act act gaa gct cca acc acc ggt ctt 192
Thr Glu Ala Pro Thr Asp Thr Thr Thr Glu Ala Pro Thr Thr Gly Leu
50 55 60
cca acc aac ggt acc act tca gct ttc cca cca act aca tct ttg cca 240
Pro Thr Asn Gly Thr Thr Ser Ala Phe Pro Pro Thr Thr Ser Leu Pro
65 70 75 80
cca agc aac act acc acc act cct cct tac aac cca tct act gac tac 288
Pro Ser Asn Thr Thr Thr Thr Pro Pro Tyr Asn Pro Ser Thr Asp Tyr
85 90 95
acc act gac tac act gta gtc act gaa tat act act tac tgt cca gaa 336
Thr Thr Asp Tyr Thr Val Val Thr Glu Tyr Thr Thr Tyr Cys Pro Glu
100 105 110
cca acc act ttc acc aca aac ggt aag act tac acc gtc act gaa cca 384
Pro Thr Thr Phe Thr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Thr Val Thr Glu Pro
115 120 125
acc aca ttg act atc act gac tgt cca tgc acc att gaa aag cca aca 432
Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr
130 135 140
acc aca tca acc acc gaa tac act gta gtc act gag tac act act tac 480
Thr Thr Ser Thr Thr Glu Tyr Thr Val Val Thr Glu Tyr Thr Thr Tyr
145 150 155 160
tgt cca gaa cca acc act ttc acc aca aac ggt aag act tac acc gtc 528
Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Thr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Thr Val
165 170 175
act gaa cca acc act ttg act atc act gac tgt cca tgt act att gaa 576
Thr Glu Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Glu
180 185 190
aag agc gaa gcc cct gag tct tct gtc cca gtt acc gaa tct aag ggc 624
Lys Ser Glu Ala Pro Glu Ser Ser Val Pro Val Thr Glu Ser Lys Gly
195 200 205
act acc acc aaa gaa aca ggt gtt act acc aaa caa acc aca gcc aac 672
Thr Thr Thr Lys Glu Thr Gly Val Thr Thr Lys Gln Thr Thr Ala Asn
210 215 220
cca agt cta acc gtc tcc aca gtc gtc cca gtt tca tcc tct gct tct 720
Pro Ser Leu Thr Val Ser Thr Val Val Pro Val Ser Ser Ser Ala Ser
225 230 235 240
tct cat tcc gtt gtc atc aac agt aac ggt gct aac gtc gtc gtt cca 768
Ser His Ser Val Val Ile Asn Ser Asn Gly Ala Asn Val Val Val Pro
245 250 255
ggt gct tta ggt ttg gct ggt gtt gct atg tta ttc taa 807
Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Val Ala Met Leu Phe
260 265
<210> 12
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 12
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Leu Pro Thr Asn Gly Thr Ser
35 40 45
Thr Glu Ala Pro Thr Asp Thr Thr Thr Glu Ala Pro Thr Thr Gly Leu
50 55 60
Pro Thr Asn Gly Thr Thr Ser Ala Phe Pro Pro Thr Thr Ser Leu Pro
65 70 75 80
Pro Ser Asn Thr Thr Thr Thr Pro Pro Tyr Asn Pro Ser Thr Asp Tyr
85 90 95
Thr Thr Asp Tyr Thr Val Val Thr Glu Tyr Thr Thr Tyr Cys Pro Glu
100 105 110
Pro Thr Thr Phe Thr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Thr Val Thr Glu Pro
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr
130 135 140
Thr Thr Ser Thr Thr Glu Tyr Thr Val Val Thr Glu Tyr Thr Thr Tyr
145 150 155 160
Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Thr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Thr Val
165 170 175
Thr Glu Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Glu
180 185 190
Lys Ser Glu Ala Pro Glu Ser Ser Val Pro Val Thr Glu Ser Lys Gly
195 200 205
Thr Thr Thr Lys Glu Thr Gly Val Thr Thr Lys Gln Thr Thr Ala Asn
210 215 220
Pro Ser Leu Thr Val Ser Thr Val Val Pro Val Ser Ser Ser Ala Ser
225 230 235 240
Ser His Ser Val Val Ile Asn Ser Asn Gly Ala Asn Val Val Val Pro
245 250 255
Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Val Ala Met Leu Phe
260 265
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tir1栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(759)
<400> 13
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc agc tta gct tct gat tct tcc tct 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Asp Ser Ser Ser
35 40 45
gga ttt tcc tta agc agt atg cca gct ggt gtt ttg gat atc ggt atg 192
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Met Pro Ala Gly Val Leu Asp Ile Gly Met
50 55 60
gct tta gct tcc gcc act gac gac tcc tac act act ttg tac tct gag 240
Ala Leu Ala Ser Ala Thr Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Leu Tyr Ser Glu
65 70 75 80
gtt gac ttt gct ggt gtt agc aag atg ttg acc atg gtt cca tgg tac 288
Val Asp Phe Ala Gly Val Ser Lys Met Leu Thr Met Val Pro Trp Tyr
85 90 95
tcc tct aga ttg gaa cca gct ttg aag tct ttg aat ggt gat gct tct 336
Ser Ser Arg Leu Glu Pro Ala Leu Lys Ser Leu Asn Gly Asp Ala Ser
100 105 110
tct tct gct gcc cca agc tct tct gct gct cca act tct tct gct gcc 384
Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Ala
115 120 125
cca agc tca tct gct gcc cca act tct tct gct gcc tca agc tct tct 432
Pro Ser Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser
130 135 140
gaa gct aag tct tct tct gct gcc cca agc tct tct gaa gct aag tct 480
Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser
145 150 155 160
tct tct gct gcc cca agc tct tct gaa gct aag tct tct tct gct gcc 528
Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala
165 170 175
cca agc tct tct gaa gct aag tct tct tct gct gct cca agc tcc act 576
Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Thr
180 185 190
gaa gct aag ata act tct gct gct cca agc tcc act ggt gcc aag acc 624
Glu Ala Lys Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ala Lys Thr
195 200 205
tct gcc atc tct caa att acc gat ggt caa atc caa gct acc aag gct 672
Ser Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Lys Ala
210 215 220
gtt tct gag caa act gaa aac ggt gct gct aag gcc ttt gtt ggt atg 720
Val Ser Glu Gln Thr Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ala Phe Val Gly Met
225 230 235 240
ggt gct ggt gtt gtc gca gct gcc gct atg ttg tta taa 759
Gly Ala Gly Val Val Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu
245 250
<210> 14
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 14
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Asp Ser Ser Ser
35 40 45
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Met Pro Ala Gly Val Leu Asp Ile Gly Met
50 55 60
Ala Leu Ala Ser Ala Thr Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Leu Tyr Ser Glu
65 70 75 80
Val Asp Phe Ala Gly Val Ser Lys Met Leu Thr Met Val Pro Trp Tyr
85 90 95
Ser Ser Arg Leu Glu Pro Ala Leu Lys Ser Leu Asn Gly Asp Ala Ser
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala
165 170 175
Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Glu Ala Lys Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ala Lys Thr
195 200 205
Ser Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Lys Ala
210 215 220
Val Ser Glu Gln Thr Glu Asn Gly Ala Ala Lys Ala Phe Val Gly Met
225 230 235 240
Gly Ala Gly Val Val Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu
245 250
<210> 15
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cwp2栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(450)
<400> 15
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc gga tcc ggt ggc ggt gga tct gga 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
gga ggc ggt tct tgg tct cac cca caa ttt gaa aag ggt gga gaa aac 192
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Glu Asn
50 55 60
ttg tac ttt caa ggc ggt ggt gga ggt tct ggc gga ggt ggc tcc ggc 240
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
tca gct atc tct caa atc acc gac ggt caa atc caa gcc act acc aca 288
Ser Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr
85 90 95
gct acc act gaa gct aca act acc gct gct cct tca tct act gtt gaa 336
Ala Thr Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Thr Val Glu
100 105 110
act gtt tct cca tct tcc acc gaa acc atc tct caa caa acc gaa aac 384
Thr Val Ser Pro Ser Ser Thr Glu Thr Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn
115 120 125
ggt gct gct aag gct gct gtt ggt atg ggt gct ggt gct ttg gct gct 432
Gly Ala Ala Lys Ala Ala Val Gly Met Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala
130 135 140
gct gct atg ttg ttg taa 450
Ala Ala Met Leu Leu
145
<210> 16
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 16
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Glu Asn
50 55 60
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Ala Ile Ser Gln Ile Thr Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr
85 90 95
Ala Thr Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro Ser Ser Thr Val Glu
100 105 110
Thr Val Ser Pro Ser Ser Thr Glu Thr Ile Ser Gln Gln Thr Glu Asn
115 120 125
Gly Ala Ala Lys Ala Ala Val Gly Met Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Met Leu Leu
145
<210> 17
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ccw12栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(468)
<400> 17
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc gct gct aac gtt acc act gct act 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Ala Asn Val Thr Thr Ala Thr
35 40 45
gtc agc caa gaa tct acc act ttg gtc acc atc act tct tgt gaa gac 192
Val Ser Gln Glu Ser Thr Thr Leu Val Thr Ile Thr Ser Cys Glu Asp
50 55 60
cac gtc tgt tct gaa act gtc tcc cca gct ttg gtt tcc acc gct acc 240
His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser Pro Ala Leu Val Ser Thr Ala Thr
65 70 75 80
gtc acc gtc gat gac gtt atc act caa tac acc acc tgg tgc cca ttg 288
Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu
85 90 95
acc act gaa gcc cca aag aac ggt act tct act gct gct cca gtt acc 336
Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr
100 105 110
tct act gaa gct cca aag aac acc acc tct gct gct cca act cac tct 384
Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser
115 120 125
gtc acc tct tac act ggt gct gct gct aag gct ttg cca gct gct ggt 432
Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly
130 135 140
gct ttg ttg gct ggt gcc gct gct ttg ttg ttg taa 468
Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
145 150 155
<210> 18
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 18
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Ala Asn Val Thr Thr Ala Thr
35 40 45
Val Ser Gln Glu Ser Thr Thr Leu Val Thr Ile Thr Ser Cys Glu Asp
50 55 60
His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser Pro Ala Leu Val Ser Thr Ala Thr
65 70 75 80
Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu
85 90 95
Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr
100 105 110
Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser
115 120 125
Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly
130 135 140
Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
145 150 155
<210> 19
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spi1栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(510)
<400> 19
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc ttg gta tct aat tct agt tcc tct 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Val Ser Asn Ser Ser Ser Ser
35 40 45
gta atc gtg gta cca tca agc gat gct act att gcc ggt aac gat aca 192
Val Ile Val Val Pro Ser Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Asn Asp Thr
50 55 60
gcc acg cca gca cca gag cca tca tcc gcc gct cca ata ttc tac aac 240
Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala Ala Pro Ile Phe Tyr Asn
65 70 75 80
tcg act gct act gca aca cag tac gaa gtt gtc agt gaa ttc act act 288
Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr
85 90 95
tac tgc cca gaa cca acg act ttc gta acg aat ggc gct aca ttc act 336
Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr
100 105 110
gtt act gcc cca act acg tta aca att acc aac tgt cct tgc act atc 384
Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile
115 120 125
gag aag cct act tca gaa aca tcg gtt tct tct aca cat gat gtg gag 432
Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu
130 135 140
aca aat tct aat gct gct aac gca aga gca atc cca gga gcc cta ggt 480
Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly
145 150 155 160
ttg gct ggt gca gtt atg atg ctt tta tga 510
Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu Leu
165
<210> 20
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 20
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Val Ser Asn Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Val Ile Val Val Pro Ser Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Asn Asp Thr
50 55 60
Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala Ala Pro Ile Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr
85 90 95
Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr
100 105 110
Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile
115 120 125
Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu
130 135 140
Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly
145 150 155 160
Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu Leu
165
<210> 21
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pst1栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1398)
<400> 21
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc gct act tcc tct tct tcc agc ata 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile
35 40 45
ccc tct tcc tgt acc ata agc tca cat gcc acg gcc aca gct cag agt 192
Pro Ser Ser Cys Thr Ile Ser Ser His Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ser
50 55 60
gac tta gat aaa tat agc cgc tgt gat acg tta gtc ggg aac tta act 240
Asp Leu Asp Lys Tyr Ser Arg Cys Asp Thr Leu Val Gly Asn Leu Thr
65 70 75 80
att ggt ggt ggt ttg aag act ggt gct ttg gct aat gtt aaa gaa atc 288
Ile Gly Gly Gly Leu Lys Thr Gly Ala Leu Ala Asn Val Lys Glu Ile
85 90 95
aac ggg tct cta act ata ttt aac gct aca aat cta acc tca ttc gct 336
Asn Gly Ser Leu Thr Ile Phe Asn Ala Thr Asn Leu Thr Ser Phe Ala
100 105 110
gct gat tcc ttg gag tcc atc aca gat tct ttg aac cta cag agt ttg 384
Ala Asp Ser Leu Glu Ser Ile Thr Asp Ser Leu Asn Leu Gln Ser Leu
115 120 125
aca atc ttg act tct gct tca ttt ggg tct tta cag agc gtt gat agt 432
Thr Ile Leu Thr Ser Ala Ser Phe Gly Ser Leu Gln Ser Val Asp Ser
130 135 140
ata aaa ctg att act cta ccc gcc atc tcc agt ttt act tca aat atc 480
Ile Lys Leu Ile Thr Leu Pro Ala Ile Ser Ser Phe Thr Ser Asn Ile
145 150 155 160
aaa tct gct aac aac att tat att tcc gac act tcg tta caa tct gtc 528
Lys Ser Ala Asn Asn Ile Tyr Ile Ser Asp Thr Ser Leu Gln Ser Val
165 170 175
gat gga ttc tca gcc ttg aaa aaa gtt aac gtg ttc aac gtc aat aac 576
Asp Gly Phe Ser Ala Leu Lys Lys Val Asn Val Phe Asn Val Asn Asn
180 185 190
aat aag aaa tta acc tcg atc aaa tct cca gtt gaa aca gtc agc gat 624
Asn Lys Lys Leu Thr Ser Ile Lys Ser Pro Val Glu Thr Val Ser Asp
195 200 205
tct tta caa ttt tcg ttc aac ggt aac cag act aaa atc acc ttc gat 672
Ser Leu Gln Phe Ser Phe Asn Gly Asn Gln Thr Lys Ile Thr Phe Asp
210 215 220
gac ttg gtt tgg gca aac aat atc agt ttg acc gat gtc cac tct gtt 720
Asp Leu Val Trp Ala Asn Asn Ile Ser Leu Thr Asp Val His Ser Val
225 230 235 240
tcc ttc gct aac ttg caa aag att aac tct tca ttg ggt ttc atc aac 768
Ser Phe Ala Asn Leu Gln Lys Ile Asn Ser Ser Leu Gly Phe Ile Asn
245 250 255
aac tcc atc tca agt ttg aat ttc act aag cta aac acc att ggc caa 816
Asn Ser Ile Ser Ser Leu Asn Phe Thr Lys Leu Asn Thr Ile Gly Gln
260 265 270
acc ttc agt atc gtt tcc aat gac tac ttg aag aac ttg tcg ttc tct 864
Thr Phe Ser Ile Val Ser Asn Asp Tyr Leu Lys Asn Leu Ser Phe Ser
275 280 285
aat ttg tca acc ata ggt ggt gct ctt gtc gtt gct aac aac act ggt 912
Asn Leu Ser Thr Ile Gly Gly Ala Leu Val Val Ala Asn Asn Thr Gly
290 295 300
tta caa aaa att ggt ggt ctc gac aac cta aca acc att ggc ggt act 960
Leu Gln Lys Ile Gly Gly Leu Asp Asn Leu Thr Thr Ile Gly Gly Thr
305 310 315 320
ttg gaa gtt gtt ggt aac ttc acc tcc ttg aac cta gac tct ttg aag 1008
Leu Glu Val Val Gly Asn Phe Thr Ser Leu Asn Leu Asp Ser Leu Lys
325 330 335
tct gtc aag ggt ggc gca gat gtc gaa tca aag tca agc aat ttc tcc 1056
Ser Val Lys Gly Gly Ala Asp Val Glu Ser Lys Ser Ser Asn Phe Ser
340 345 350
tgt aat gct ttg aaa gct ttg caa aag aaa ggg ggt atc aag ggt gaa 1104
Cys Asn Ala Leu Lys Ala Leu Gln Lys Lys Gly Gly Ile Lys Gly Glu
355 360 365
tct ttt gtc tgc aaa aat ggt gca tca tcc aca tct gtt aaa cta tcg 1152
Ser Phe Val Cys Lys Asn Gly Ala Ser Ser Thr Ser Val Lys Leu Ser
370 375 380
tcc act tcc aaa tct caa tca agc caa act act gcc aag gtt tcc aag 1200
Ser Thr Ser Lys Ser Gln Ser Ser Gln Thr Thr Ala Lys Val Ser Lys
385 390 395 400
tca tct tct aag gcc gag gaa aag aag ttc act tct ggc gat atc aag 1248
Ser Ser Ser Lys Ala Glu Glu Lys Lys Phe Thr Ser Gly Asp Ile Lys
405 410 415
gct gct gct tct gcc tct agt gtt tct agt tct ggc gct tcc agc tct 1296
Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser
420 425 430
agc tct aag agt tcc aaa ggc aat gcc gct atc atg gca cca att ggc 1344
Ser Ser Lys Ser Ser Lys Gly Asn Ala Ala Ile Met Ala Pro Ile Gly
435 440 445
caa aca acc cct ttg gtc ggt ctt ttg acg gca atc atc atg tct ata 1392
Gln Thr Thr Pro Leu Val Gly Leu Leu Thr Ala Ile Ile Met Ser Ile
450 455 460
atg taa 1398
Met
465
<210> 22
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 22
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile
35 40 45
Pro Ser Ser Cys Thr Ile Ser Ser His Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ser
50 55 60
Asp Leu Asp Lys Tyr Ser Arg Cys Asp Thr Leu Val Gly Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gly Gly Gly Leu Lys Thr Gly Ala Leu Ala Asn Val Lys Glu Ile
85 90 95
Asn Gly Ser Leu Thr Ile Phe Asn Ala Thr Asn Leu Thr Ser Phe Ala
100 105 110
Ala Asp Ser Leu Glu Ser Ile Thr Asp Ser Leu Asn Leu Gln Ser Leu
115 120 125
Thr Ile Leu Thr Ser Ala Ser Phe Gly Ser Leu Gln Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ile Lys Leu Ile Thr Leu Pro Ala Ile Ser Ser Phe Thr Ser Asn Ile
145 150 155 160
Lys Ser Ala Asn Asn Ile Tyr Ile Ser Asp Thr Ser Leu Gln Ser Val
165 170 175
Asp Gly Phe Ser Ala Leu Lys Lys Val Asn Val Phe Asn Val Asn Asn
180 185 190
Asn Lys Lys Leu Thr Ser Ile Lys Ser Pro Val Glu Thr Val Ser Asp
195 200 205
Ser Leu Gln Phe Ser Phe Asn Gly Asn Gln Thr Lys Ile Thr Phe Asp
210 215 220
Asp Leu Val Trp Ala Asn Asn Ile Ser Leu Thr Asp Val His Ser Val
225 230 235 240
Ser Phe Ala Asn Leu Gln Lys Ile Asn Ser Ser Leu Gly Phe Ile Asn
245 250 255
Asn Ser Ile Ser Ser Leu Asn Phe Thr Lys Leu Asn Thr Ile Gly Gln
260 265 270
Thr Phe Ser Ile Val Ser Asn Asp Tyr Leu Lys Asn Leu Ser Phe Ser
275 280 285
Asn Leu Ser Thr Ile Gly Gly Ala Leu Val Val Ala Asn Asn Thr Gly
290 295 300
Leu Gln Lys Ile Gly Gly Leu Asp Asn Leu Thr Thr Ile Gly Gly Thr
305 310 315 320
Leu Glu Val Val Gly Asn Phe Thr Ser Leu Asn Leu Asp Ser Leu Lys
325 330 335
Ser Val Lys Gly Gly Ala Asp Val Glu Ser Lys Ser Ser Asn Phe Ser
340 345 350
Cys Asn Ala Leu Lys Ala Leu Gln Lys Lys Gly Gly Ile Lys Gly Glu
355 360 365
Ser Phe Val Cys Lys Asn Gly Ala Ser Ser Thr Ser Val Lys Leu Ser
370 375 380
Ser Thr Ser Lys Ser Gln Ser Ser Gln Thr Thr Ala Lys Val Ser Lys
385 390 395 400
Ser Ser Ser Lys Ala Glu Glu Lys Lys Phe Thr Ser Gly Asp Ile Lys
405 410 415
Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Lys Ser Ser Lys Gly Asn Ala Ala Ile Met Ala Pro Ile Gly
435 440 445
Gln Thr Thr Pro Leu Val Gly Leu Leu Thr Ala Ile Ile Met Ser Ile
450 455 460
Met
465
<210> 23
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Aga1/2栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<400> 23
aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt aga tac cca tac gac gtt cca 48
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt 96
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc cag gaa ctg aca act ata tgc gag 144
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu
35 40 45
caa atc ccc tca cca act tta gaa tcg acg ccg tac tct ttg tca acg 192
Gln Ile Pro Ser Pro Thr Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr
50 55 60
act act att ttg gcc aac ggg aag gca atg caa gga gtt ttt gaa tat 240
Thr Thr Ile Leu Ala Asn Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr
65 70 75 80
tac aaa tca gta acg ttt gtc agt aat tgc ggt tct cac ccc tca aca 288
Tyr Lys Ser Val Thr Phe Val Ser Asn Cys Gly Ser His Pro Ser Thr
85 90 95
act agc aaa ggc agc ccc ata aac aca cag tat gtt ttt taa 330
Thr Ser Lys Gly Ser Pro Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe
100 105
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 24
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu
35 40 45
Gln Ile Pro Ser Pro Thr Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr
50 55 60
Thr Thr Ile Leu Ala Asn Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr
65 70 75 80
Tyr Lys Ser Val Thr Phe Val Ser Asn Cys Gly Ser His Pro Ser Thr
85 90 95
Thr Ser Lys Gly Ser Pro Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe
100 105
<210> 25
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Aga1/2栓系
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 25
atg cag tta ctt cgc tgt ttt tca ata ttt tct gtt att gct tca gtt 48
Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
tta gca cag gag ctg aca act ata tgc gag caa atc ccc tca cca act 96
Leu Ala Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu Gln Ile Pro Ser Pro Thr
20 25 30
tta gaa tcg acg ccg tac tct ttg tca acg act act att ttg gcc aac 144
Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Thr Thr Ile Leu Ala Asn
35 40 45
ggg aag gca atg caa gga gtt ttt gaa tat tac aaa tca gta acg ttt 192
Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Lys Ser Val Thr Phe
50 55 60
gtc agt aat tgc gat tct cac ccc tca aca act agc aaa gac agc ccc 240
Val Ser Asn Cys Asp Ser His Pro Ser Thr Thr Ser Lys Asp Ser Pro
65 70 75 80
ata aac aca cag tat gtt ttt aag gac aat agc tcg acg att gaa ggt 288
Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly
85 90 95
aga tac cca tac gac gtt cca gac tac gct ctg cag gct agt ggt ggt 336
Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly
100 105 110
ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt tct gct agc 381
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 26
Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
Leu Ala Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu Gln Ile Pro Ser Pro Thr
20 25 30
Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Thr Thr Ile Leu Ala Asn
35 40 45
Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Lys Ser Val Thr Phe
50 55 60
Val Ser Asn Cys Asp Ser His Pro Ser Thr Thr Ser Lys Asp Ser Pro
65 70 75 80
Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly
85 90 95
Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tdh1基因的启动子
<400> 27
agaaacgaat gtatatgctc atttacactc tatatcacca tatggaggat aagttgggct 60
gagcttctga tccaatttat tctatccatt agttgctgat atgtcccacc agccaacact 120
tgatagtatc tactcgccat tcacttccag cagcgccagt agggttgttg agcttagtaa 180
aaatgtgcgc accacaagcc tacatgactc cacgtcacat gaaaccacac cgtggggcct 240
tgttacgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg cttagtaacc acaccacatt 300
ttcaaggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag cggcccataa tcgcgctttt 360
tttttaaaat gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt tcaaccttcg gagtggtcgc 420
agatctggag actggatcct tacaatacag taaggcaagc caccatctgc ttcttaggtg 480
catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag aaggggggga ggagcatgtt 540
cattctctgt agcactaaga gcttggtgat aatgaccaaa actggagtct cgaaatcata 600
taaatagaca atatattttc acacaatgtg atttgtagta cagttctact ctctctcttg 660
cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc accaacacac acaaaaaaca 720
gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 750
<210> 28
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hor7基因的启动子
<400> 28
acctccatga aatttttttt tttctttcga ttagcacgca cacacatcac atagactgcg 60
tcataaaaat acactacgga aaaaccataa agagcaaagc gatacctact tggaaggaaa 120
aggagcacgc ttgtaagggg gatgggggct aagaagtcat tcactttctt ttcccttcgc 180
ggtccggacc cgggacccct cctctccccg cacaatttct tcctttcata tcttcctttt 240
attcctatcc cgttgaagca accgcactat gactaaatgg tgctggacat ctccatggct 300
gtgacttgtg tgtatctcac agtggtaacg gcaccgtggc tcggaaacgg ttccttcgtg 360
acaattctag aacaggggct acagtctcga taatagaata ataagcgcat ttttgttagc 420
gccgccgcgg cgcccgtttc ccaataggga ggcgcagttt atcggcggag ctttacttct 480
tcctatttgg gtaagcccct ttctgttttc ggccagtggt tgctgcaggc tgcgccggag 540
aacatagtga taagggatgt aactttcgat gagagaatta gcaagcggaa aaaaaactat 600
ggctagctgg gagttgtttt tcaatcatat aaaagggaga aattgttgct cactatgtga 660
cagtttctgg gacgtcttaa cttttattgc agaggactat caaatcatac agatattgtc 720
aaaaaaaaaa aaaaagacta ataataaaaa 750
<210> 29
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsp150基因的启动子
<400> 29
tgtaaaaaca agcaaaaaaa aaccaagaag gaacaaatgc accaaactgt tgatctattc 60
tgcaaaaaaa gtatggtaaa ttttttccat tatcctggcc gctaatccat atggaggtga 120
acttagaact tgcacaagga tgcgatgaat gataggcttt gtgctataat taatgcaggc 180
aggtccgcca tgtccaacac gttgctggcc gcaaaacgag tcaatctcac tgctttgcca 240
cgctcatttc tccccccttc tgcccaatta ggcgaccctc acaatgcaca tacacatttc 300
ccacctctat tggaaggggc cgtaaatggt aattcttggg agttattcat attaagtgat 360
cttactattt cctatttcgg aaattattaa agacaaaaaa gctcatttat ggctttccgt 420
ctgtagtgat aagtcgccaa ctcagcctaa tttttcattt ctttaccaga tcaggaaaac 480
taatagtaca aatgagtttt ttctcaagcg gaacaccaca ttttgagcta aatttagatt 540
ttggtcaaaa taagaaagat cctaaaaaag gaatggttgg tgaaaaattt attagcttga 600
atggtaggaa tcctcgagat ataaaaggaa cacttgaagt ctaacgacaa tcaatttcga 660
ttatgtcctt ccttttacct caaagctcaa aaaaacatca ataagaaact catattcctt 720
ttctaaccct agtacaataa taataatata 750
<210> 30
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hxt7基因的启动子
<400> 30
ccagaaaggc aacgcaaaat tttttttcca gggaataaac tttttatgac ccactacttc 60
tcgtaggaac aatttcgggc ccctgcgtgt tcttctgagg ttcatctttt acatttgctt 120
ctgctggata attttcagag gcaacaagga aaaattagat ggcaaaaagt cgtctttcaa 180
ggaaaaatcc ccaccatctt tcgagatccc ctgtaactta ttggcaactg aaagaatgaa 240
aaggaggaaa atacaaaata tactagaact gaaaaaaaaa aagtataaat agagacgata 300
tatgccaata cttcacaatg ttcgaatcta ttcttcattt gcagctattg taaaataata 360
aaacatcaag aacaaacaag ctcaacttgt cttttctaag aacaaagaat aaacacaaaa 420
acaaaaagtt tttttaattt taatcaaaaa 450
<210> 31
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gpm1基因的启动子
<400> 31
tgtggtagaa ttcaaaagac tatgtgatgc cataggcaag aagggagact ctcactccga 60
gatgggcagc ttgatcgccc aggaattgaa ttgtattgtg gtggagaaag gtcagtcaga 120
taagatattc tcacccgata gtgaaaaaga catgttgacg aacagcgaag agggcagcaa 180
caagagggta ggaggccaag gtgatacttt gacaggagct atatcatgca tgcttgcatt 240
tagtcgtgca atgtatgact ttaagatttg tgagcaggaa gaaaagggag aatcttctaa 300
cgataaaccc ttgaaaaact gggtagacta cgctatgttg agttgctacg caggctgcac 360
aattacacga gaatgctccc gcctaggatt taaggctaag ggacgtgcaa tgcagacgac 420
agatctaaat gaccgtgtcg gtgaagtgtt cgccaaactt ttcggttaac acatgcagtg 480
atgcacgcgc gatggtgcta agttacatat atatatatat atatatatat atatatatat 540
agccatagtg atgtctaagt aacctttatg gtatatttct taatgtggaa agatactagc 600
gcgcgcaccc acacacaagc ttcgtctttt cttgaagaaa agaggaagct cgctaaatgg 660
gattccactt tccgttccct gccagctgat ggaaaaaggt tagtggaacg atgaagaata 720
aaaagagaga tccactgagg tgaaatttca gctgacagcg agtttcatga tcgtgatgaa 780
caatggtaac gagttgtggc tgttgccagg gagggtggtt ctcaactttt aatgtatggc 840
caaatcgcta cttgggtttg ttatataaca aagaagaaat aatgaactga ttctcttcct 900
ccttcttgtc ctttcttaat tctgttgtaa ttaccttcct ttgtaatttt ttttgtaatt 960
attcttctta ataatccaaa caaacacaca tattacaata 1000
<210> 32
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pgk1基因的启动子
<400> 32
acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60
aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120
tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180
cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240
gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300
gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360
caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420
gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480
tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540
tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600
atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660
agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720
ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 750
<210> 33
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> stl1基因的启动子
<400> 33
tggtctcgcg tgtgaatcag caatgattct gaaatactcc ttttacaacc tttgcaaaga 60
taatgtcatt cagtctgata ttacgagcga cctggaagca ctaatccata ttcttcattc 120
aacttactcc attttccttg gcaaacaatg ccccacaatc atatacgtca taactataag 180
ggatatgtct ggaatgcggc caagatagaa ttaaagggct gcagaacacc actactgata 240
ctcattgcca aggctaggag gcaccatccg tttcattttc tttgaggtaa gccaatcatg 300
aaatagtata cacatccata acggacgtac ggacgaaata agtgccgttg tcccactatt 360
ccaccgcatt tggcccattt ggctcacttt gactcaactt gcgtcatttt aactgatatg 420
aagggtccga ctttgtcctt tttcggccac cgcatacccc acggcgacgc ctccgctacc 480
tgcatttgag tagcatctcc gtttcgcggg gtattcggcg ctacgtcgcc tgttcgagcg 540
gctctgttcg ttgcatgaaa ctaaaataag cggaaagtgt ccagccatcc actacgtcag 600
aaagaaataa tggttgtaca ctgtttctcg gctatatacc gtttttggtt ggttaatcct 660
cgccaggtgc agctattgcg cttggctgct tcgcgatagt agtaatctga gaaagtgcag 720
atcccggtaa gggaaacact tttggttcac ctttgatagg gctttcattg gggcattcgt 780
aacaaaaagg aagtagatag agaaattgag aaagcttaag tgagatgttt tagcttcaat 840
tttgtcccct tcaacgctgc ttggccttag agggtcagaa ttgcagttca ggagtagtca 900
cactcatagt atataaacaa gccctttatt gattttgaat aattattttg tatacgtgtt 960
ctagcataca agttagaata aataaaaaat agaaaaatag aacatagaaa gttttagacc 1020
<210> 34
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dit1基因的终止子
<400> 34
taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60
cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccctcaaaag ttctgatttt ataatatttt 120
atttcacaca attccaatta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180
tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240
caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300
aattgacgta attaatgata ctattaataa tacagagcgt atatgaagta ttgcaaataa 360
catgcacagt tcttttggga tgagaatgag aatgagaggc gaaggcgggc gttcagaaaa 420
gcgttgcgga gtaacaagtg attaaatagc acccaaataa tcttctttga tactaccgat 480
tgcgtgaata gaactcactt 500
<210> 35
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> idp1基因的终止子
<400> 35
tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt ttttttcatt ttttaaagtg ttatacttag 60
ttatgctcta ggataatgaa ctactttttt ttttttttac tgttatcata aatatatata 120
ccttattgat gtttgcaacc gtcggttaat tccttatcaa ggttccccaa gttcggatca 180
ttaccatcaa tttccaacat cttcatgagt tcttcttctt cattaccgtg ttttaggggg 240
ctgttcgcac ttctaatagg gctatcacca agctgttcta attcgtccaa aagttcagta 300
acacgatctt tatgcttcag ttcgtcataa tctttcaatt cataaatatt tacaatttcg 360
tctacgatat taaattgcct cttgtaggtg cctatctttt ccttatgctc ttcattttca 420
ccgttttctt gaaaccaaac accgaactca ctacgcattt ctttcatagg ctcatataat 480
acttcttttg acgtcatttg 500
<210> 36
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gpm1基因的终止子
<400> 36
gtctgaagaa tgaatgattt gatgatttct ttttccctcc atttttctta ctgaatatat 60
caatgatata gacttgtata gtttattatt tcaaattaag tagctatata tagtcaagat 120
aacgtttgtt tgacacgatt acattattcg tcgacatctt ttttcagcct gtcgtggtag 180
caatttgagg agtattatta attgaatagg ttcattttgc gctcgcataa acagttttcg 240
tcagggacag tatgttggaa tgagtggtaa ttaatggtga catgacatgt tatagcaata 300
accttgatgt ttacatcgta gtttaatgta caccccgcga attcgttcaa gtaggagtgc 360
accaattgca aagggaaaag ctgaatgggc agttcgaata g 401
<210> 37
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pma1基因的终止子
<400> 37
tcctgttgaa gtagcattta atcataattt ttgtcacatt ttaatcaact tgatttttct 60
ggtttaattt ttctaatttt aattttaatt tttttatcaa tgggaactga tacactaaaa 120
agaattagga gccaacaaga ataagccgct tatttcctac tagagtttgc ttaaaatttc 180
atctcgaatt gtcattctaa tattttatcc acacacacac cttaaaattt ttagattaaa 240
tggcatcaac tcttagcttc acacacacac acacaccgaa gctggttgtt ttatttgatt 300
tgatataatt ggtttctctg gatggtactt tttctttctt ggttatttcc tattttaaaa 360
tatgaaacgc acacaagtca taattattct aatagagcac aattcacaac acgcacattt 420
caactttaat atttttttag aaacacttta tttagtctaa ttcttaattt ttaatatata 480
taatgcacac acactaattt 500
<210> 38
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tdh3基因的终止子
<400> 38
gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60
tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120
tttcttgatg cggtattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtaatag 180
atatctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240
aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300
aacgattctg aagttactct tagcgttcct atcggtacag ccatcaaatc atgcctataa 360
atcatgccta tatttgcgtg cagtcagtat catctacatg aaaaaaactc ccgcaatttc 420
ttatagaata cgttgaaaat taaatgtacg cgccaagata agataacata aatctagatg 480
cagtaatata cacagattcc 500
<210> 39
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hxt2基因的终止子
<400> 39
gagattatac ttaaactagc actgattttt ttaaggctaa tggctactaa tactttaata 60
gatgatcttc atactttttt atttaacgat ttttaatgat gtttttattt gtaccactca 120
tttatctaga tttttttaat actgatcaaa tcttacggac tcgacgttaa aaagttccta 180
catacgtctg gtacttgaaa cgctgcttcg aggtattgac actataagaa tacgatccaa 240
atacttacac cgcatgtaaa aatatgccga caatatgaat acttgttgat gaatgatatt 300
tgattttaat ccggcaattt acctccttta tataatccaa taattgttga taattagtgg 360
ttaggttgca gtactaataa gaattaagac aaatattctt ctactatata aaaggtgcaa 420
acaaaacaca cgccgatcgg ccatactaaa caagaccaac ataataatgg tggaaccatt 480
tactgtattt tcaatgtaac 500
<210> 40
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ira2基因的终止子
<400> 40
aggtgttaca taaactaatg aaagaaatat caatatctat ctgtaagcat gaatgtacat 60
atctcatgtt agggttttct tatcgctaat ttttcgcaat ttgttacgtg ggttgctttt 120
atacagctac aatttttata tattctatca tgtaatgaat ggctcagtaa attcaagcgc 180
cacatagact aatgtacata ccaatgcatt taattgtaag aatgaaaggg gccattcatc 240
taccgtctta gttgaaagtg tttctgtgaa ttttttcaaa ttccgttttt tcctttttat 300
ataatagcat ggtggcgcga gcatcttcga ctgaagaatg ctcaccttct tgaatggaaa 360
tttttaaaac ctccttggtt aatttcttta agctgggtgt tttaccctta gcatacaact 420
tcctgaatgg gaggtgtctt gaagtgtccc tgagtagtga ctttgggtgg gataacatca 480
atgcttcgag atcatgcttt 500
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S基序
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 42
<211> 457
<212> PRT
<213> 绳状青霉菌
<400> 42
Met Leu Arg Tyr Leu Ser Ile Val Ala Ala Thr Ala Ile Leu Thr Gly
1 5 10 15
Val Glu Ala Gln Gln Ser Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp
20 25 30
Ser Gly Ala Thr Ser Cys Ala Ala Gly Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asn
35 40 45
Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Thr Leu
50 55 60
Val Lys Thr Thr Ser Ser Thr Ser Val Gly Thr Thr Ser Pro Pro Thr
65 70 75 80
Thr Thr Thr Thr Lys Ala Ser Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala
85 90 95
Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Ala Asn Pro Tyr Tyr
100 105 110
Ser Ser Glu Val His Thr Leu Ala Ile Pro Ser Leu Thr Gly Ser Leu
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Glu Ile Pro Ser Phe Val Trp Leu
130 135 140
Asp Thr Ala Ala Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asn Ile
145 150 155 160
Glu Ala Ala Asn Lys Ala Gly Ala Ser Pro Pro Ile Ala Gly Ile Phe
165 170 175
Val Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn
180 185 190
Gly Glu Tyr Thr Val Ala Asn Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr
195 200 205
Ile Asp Ser Ile Val Ala Gln Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Val His Thr
210 215 220
Ile Leu Ile Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Leu
225 230 235 240
Ser Thr Ala Lys Cys Ala Glu Ala Gln Ser Ala Tyr Tyr Glu Cys Val
245 250 255
Asn Tyr Ala Leu Ile Lys Pro His Leu Ala His Val Ala Met Tyr Ile
260 265 270
Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Ser Ala Asn Leu Ser Pro
275 280 285
Ala Ala Gln Leu Phe Ala Thr Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ala Pro Ala
290 295 300
Ser Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser
305 310 315 320
Ile Ser Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Ser Gly Asp Ser Asn Tyr Asp Glu
325 330 335
Lys Leu Tyr Ile Asn Ala Leu Ser Pro Leu Leu Thr Ser Asn Gly Trp
340 345 350
Pro Asp Ala His Phe Ile Met Asp Thr Ser Arg Asn Gly Val Gln Pro
355 360 365
Thr Lys Gln Gln Ala Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly
370 375 380
Phe Gly Val Gln Pro Thr Thr Asn Thr Gly Asp Pro Leu Glu Asp Ala
385 390 395 400
Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser
405 410 415
Ser Ala Thr Arg Tyr Asp Phe His Cys Gly Tyr Ser Gly Ala Leu Gln
420 425 430
Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Val Gln Leu
435 440 445
Leu Thr Asn Ala Asn Pro Ala Leu Val
450 455
<210> 43
<211> 408
<212> PRT
<213> 艾默森罗萨氏菌
<400> 43
Met Val Arg Leu Ser Pro Val Leu Leu Ala Ser Ile Ala Gly Ser Gly
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Ile
20 25 30
Gly Leu Lys Tyr Phe Gly Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp
35 40 45
Thr Ala Tyr Glu Thr Gln Leu Asn Asn Thr Gln Asp Phe Gly Gln Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Glu Gln Asn
65 70 75 80
Val Phe Thr Phe Ser Ala Gly Asp Gln Ile Ala Asn Leu Ala Lys Ala
85 90 95
Asn Gly Gln Met Leu Arg Cys His Asn Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Trp Val Thr Ser Gly Ser Trp Thr Asn Glu Thr Leu Leu Ala
115 120 125
Ala Met Lys Asn His Ile Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Gln
130 135 140
Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Ser Asn Val Phe Tyr Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro
165 170 175
Ile Ala Phe Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr
180 185 190
Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Tyr Pro Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala
195 200 205
Gln Asn Leu Val Lys Leu Val Gln Ser Tyr Gly Ala Arg Ile Asp Gly
210 215 220
Val Gly Leu Gln Ser His Phe Ile Val Gly Glu Thr Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Ser Gln Gln Gln Asn Met Ala Ala Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val
245 250 255
Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Gln Leu Pro Glu Thr Glu Ala
260 265 270
Leu Leu Thr Gln Gln Ala Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Val Gln Ala Cys
275 280 285
Ala Asn Thr Lys Gly Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Asp Trp Thr Asp
290 295 300
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Asp Ala Cys
305 310 315 320
Pro Trp Asp Ala Asn Tyr Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Glu Gly Ile Leu
325 330 335
Thr Gly Leu Gly Gln Thr Val Thr Ser Thr Thr Tyr Ile Ile Ser Pro
340 345 350
Thr Thr Ser Val Gly Thr Gly Thr Thr Thr Ser Ser Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Thr Gly Val Ala Gln His Trp Glu Gln Cys Gly Gly Leu Gly
370 375 380
Trp Thr Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Val Ile
385 390 395 400
Asn Glu Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
405
<210> 44
<211> 605
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 44
Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
20 25 30
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
35 40 45
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
50 55 60
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
65 70 75 80
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
85 90 95
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
100 105 110
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
115 120 125
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp
130 135 140
Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile
165 170 175
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr
180 185 190
Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val
195 200 205
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys
210 215 220
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr
225 230 235 240
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
245 250 255
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val
260 265 270
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly
275 280 285
Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys
290 295 300
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu
305 310 315 320
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
325 330 335
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
340 345 350
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
355 360 365
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser
370 375 380
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu
385 390 395 400
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
405 410 415
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp
435 440 445
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp
450 455 460
Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu
465 470 475 480
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
485 490 495
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro
500 505 510
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr
515 520 525
Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser
530 535 540
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
545 550 555 560
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr
565 570 575
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
580 585 590
Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
595 600 605
<210> 45
<211> 291
<212> PRT
<213> 疏棉状嗜热丝孢菌
<400> 45
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu
1 5 10 15
Ala Arg Pro Val Arg Arg Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp Gln Phe
20 25 30
Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Asn Asn
35 40 45
His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro
50 55 60
Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
85 90 95
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val Glu Asn Trp Ile
100 105 110
Ala Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Ser Asp Ile Cys Ser Gly
115 120 125
Cys Glu Gly His Val Gly Phe Val Thr Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
130 135 140
Thr Ile Arg Glu Gln Val Gln Asn Ala Val Asn Glu His Pro Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Ile
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Ile Asp Val Phe Ser
180 185 190
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
195 200 205
Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
210 215 220
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Asp Trp Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Trp Val Thr Ser Gly Asn Asp Val Pro Val Thr Ala Asn Asp
245 250 255
Ile Thr Val Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Gly
260 265 270
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ser His Leu Trp Tyr Phe Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Glu Cys Asp
290
<210> 46
<211> 146
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 46
Met Lys Phe Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Thr Val Gly Ala Ala Gln
1 5 10 15
Glu Gly Ile Ser Ser Arg Ala Leu Trp Gln Phe Arg Ser Met Ile Lys
20 25 30
Cys Ala Ile Pro Gly Ser His Pro Leu Met Asp Phe Asn Asn Tyr Gly
35 40 45
Cys Tyr Cys Gly Leu Gly Gly Ser Gly Thr Pro Val Asp Glu Leu Asp
50 55 60
Arg Cys Cys Glu Thr His Asp Asn Cys Tyr Arg Asp Ala Lys Asn Leu
65 70 75 80
Asp Ser Cys Lys Phe Leu Val Asp Asn Pro Tyr Thr Glu Ser Tyr Ser
85 90 95
Tyr Ser Cys Ser Asn Thr Glu Ile Thr Cys Asn Ser Lys Asn Asn Ala
100 105 110
Cys Glu Ala Phe Ile Cys Asn Cys Asp Arg Asn Ala Ala Ile Cys Phe
115 120 125
Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Glu His Lys Asn Leu Asp Thr Lys Lys
130 135 140
Tyr Cys
145
<210> 47
<211> 150
<212> PRT
<213> Streptomyces vialaceoruber
<400> 47
Met Arg Thr Thr Thr Arg Thr Arg Thr Thr Leu Ala Ala Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Pro Pro Gln Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln Thr Ser Ala Ser Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln Ser Ala Trp Ala Ala
50 55 60
Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Ser Gln Ala Pro Asp Asn
65 70 75 80
Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala Arg His Asp Phe Gly
85 90 95
Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Ser Phe Asp Ala Asn Lys Ser Arg
100 105 110
Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr Gly Tyr
115 120 125
Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp Thr Tyr Tyr
130 135 140
Gln Ala Val Lys Ile Leu
145 150
<210> 48
<211> 295
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 48
Met Phe Ser Leu Ala Arg Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ala Ala Pro Ala Ser Leu Arg Arg Asp Val Ser Ser Ser Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys
35 40 45
Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly
50 55 60
Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr Gln Ser Leu Asp Glu Phe
65 70 75 80
Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala Gly Tyr Leu Ala Ala Asp
85 90 95
Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ala Asp Leu
100 105 110
Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly Leu Glu Asp Ala Ser Asp
115 120 125
Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly Phe Trp Lys Ala Trp Ser
130 135 140
Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ser Ala Leu Ser Asp
145 150 155 160
His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala
165 170 175
Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly His Ser Val
180 185 190
Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu Gly Asn Glu Ala Leu Ala
195 200 205
Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His
210 215 220
Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Thr Leu Leu Gly Tyr His
225 230 235 240
His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Ala Asp Glu Ala Thr Val
245 250 255
Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly
260 265 270
Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp Ala His Arg Trp Tyr Phe
275 280 285
Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser
290 295
<210> 49
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的葡萄糖淀粉酶
<400> 49
Met Ile Arg Leu Thr Val Phe Leu Thr Ala Val Phe Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser Cys Val Pro Val Glu Leu Asp Lys Arg Asn Thr Gly His Phe Gln
20 25 30
Ala Tyr Ser Gly Tyr Thr Val Asn Arg Ser Asn Phe Thr Gln Trp Ile
35 40 45
His Glu Gln Pro Ala Val Ser Trp Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile Asp
50 55 60
Tyr Pro Glu Gly Gln Phe Lys Ser Ala Lys Pro Gly Val Val Val Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Phe Tyr Gln Trp Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ala Ile Thr Phe Leu Ser Leu Ile Ala Glu Val Glu Asp His Ser
100 105 110
Phe Ser Asn Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Glu Tyr Tyr Ile Ser Asn
115 120 125
Thr Tyr Thr Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Ser Gly Asn Phe Asp Ser
130 135 140
Pro Asn His Asp Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Asp Thr
145 150 155 160
Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu
165 170 175
Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Ala Val Ala Lys His Asn
180 185 190
Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Gly Gln Asn Gly Ile Pro Tyr Ser Ser
195 200 205
Ala Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Ile Ile Lys Pro Asp Leu Gln His Val
210 215 220
Ser Thr His Trp Ser Thr Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln
225 230 235 240
Gly Thr His Phe Phe Thr Ala Leu Val Gln Leu Lys Ala Leu Ser Tyr
245 250 255
Gly Ile Pro Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Asp Pro Gly Phe Thr Ser Trp
260 265 270
Leu Glu Lys Gln Lys Asp Ala Leu Asn Ser Tyr Ile Asn Ser Ser Gly
275 280 285
Phe Val Asn Ser Gly Lys Lys His Ile Val Glu Ser Pro Gln Leu Ser
290 295 300
Ser Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Ile Thr
305 310 315 320
His Asp Ile Gly Asp Asp Asp Thr Tyr Thr Pro Phe Asn Val Asp Asn
325 330 335
Ser Tyr Val Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Val Asp Asn Lys Asn
340 345 350
Arg Tyr Lys Ile Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Gly Ala Ala Val Gly Arg
355 360 365
Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Val Gly Thr Ser Glu Gly Asn Pro
370 375 380
Trp Gln Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Gly Gln Thr Phe Tyr Thr Leu Ala
385 390 395 400
Tyr Asn Ser Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Val Ile Glu Lys Leu Asn
405 410 415
Tyr Asp Leu Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ile Asp Ser
420 425 430
Ser Tyr Ala Ser Lys Asp Ser Leu Thr Leu Thr Tyr Gly Ser Asp Asn
435 440 445
Tyr Lys Asn Val Ile Lys Ser Leu Leu Gln Phe Gly Asp Ser Phe Leu
450 455 460
Lys Val Leu Leu Asp His Ile Asp Asp Asn Gly Gln Leu Thr Glu Glu
465 470 475 480
Ile Asn Arg Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Gly Ala Val Ser Leu Thr Trp
485 490 495
Ser Ser Gly Ser Leu Leu Ser Ala Asn Arg Ala Arg Asn Lys Leu Ile
500 505 510
Glu Leu Leu
515
<210> 50
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的α-淀粉酶
<400> 50
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala Gly Pro Ala Ala Ala Asn Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser
20 25 30
Asn Asn Val Thr Ala Ser Ser Val Lys Asn Gly Thr Ile Leu His Ala
35 40 45
Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Thr Gln Asn Met Lys Asp Ile Arg
50 55 60
Asp Ala Gly Tyr Ala Ala Ile Gln Thr Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met Arg Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr
85 90 95
Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln
100 105 110
Glu Phe Lys Asp Met Cys Ala Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Val Lys Val
115 120 125
Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr Ser Asp Tyr Gly Ala Ile
130 135 140
Ser Asp Glu Ile Lys Arg Ile Pro Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gln
145 150 155 160
Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu
165 170 175
Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn Thr Glu Val Gln Val Tyr Leu
180 185 190
Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ala Leu Asn Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg
195 200 205
Tyr Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu Pro Asp Asp Gly Asn Tyr Gly
210 215 220
Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser Arg Asp Thr Ala Tyr Ala Asn
245 250 255
Tyr Met Asn Val Thr Ala Ser Asn Tyr Gly His Ser Ile Arg Ser Ala
260 265 270
Leu Lys Asn Arg Asn Leu Ser Val Ser Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser
275 280 285
Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr Trp Val Glu Ser His Asp Thr
290 295 300
Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile
305 310 315 320
Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Gly Ser Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu
325 330 335
Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly
340 345 350
Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser Ala Leu Phe Lys Asp Gln Ala
355 360 365
Ile Thr Ala Val Asn Thr Phe His Asn Val Met Ala Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln Val Phe Met Asn Gln Arg
385 390 395 400
Gly Ser Lys Gly Val Val Leu Ala Asn Ala Gly Ser Ser Ser Val Thr
405 410 415
Ile Asn Thr Ser Ala Lys Leu Pro Asp Gly Arg Tyr Asp Asn Arg Ala
420 425 430
Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Ala Asn Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile
435 440 445
Asn Ala Arg Ser Ala Ala Val Leu Tyr Pro Asp Asp Ile Gly Asn Ala
450 455 460
Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Gly Ala Val His Ser Phe
465 470 475 480
Asn Asp Gln Leu Thr Val Thr Leu Arg Ala Asn Ala Lys Thr Thr Lys
485 490 495
Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Gln Gln Thr Ala Phe Lys Asp Gly
500 505 510
Asp Arg Leu Thr Ile Gly Lys Gly Asp Pro Ile Gly Thr Thr Tyr Asn
515 520 525
Ile Lys Leu Thr Gly Thr Asn Gly Glu Gly Ala Ala Arg Thr Gln Glu
530 535 540
Tyr Thr Phe Val Lys Lys Asp Pro Ser Gln Thr Asn Ile Ile Gly Tyr
545 550 555 560
Gln Asn Pro Asp His Trp Gly Gln Val Asn Ala Tyr Ile Tyr Lys His
565 570 575
Asp Gly Gly Arg Ala Ile Glu Leu Thr Gly Ser Trp Pro Gly Lys Ala
580 585 590
Met Thr Lys Asn Ala Asn Gly Met Tyr Thr Leu Thr Leu Pro Glu Asn
595 600 605
Thr Asp Thr Ala Asn Ala Lys Val Ile Phe Asn Asn Gly Ser Ala Gln
610 615 620
Val Pro Gly Gln Asn Gln Pro Gly Phe Asp Tyr Val Gln Asn Gly Leu
625 630 635 640
Tyr Asn Asn Ser Gly Leu Asn Gly Tyr Leu Pro His
645 650
<210> 51
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的麦芽糖α-淀粉酶
<400> 51
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala Tyr Asn Pro Asn Ala Ala Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ser
20 25 30
Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile Ile Asp Arg Phe Tyr Asp
35 40 45
Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp
50 55 60
Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Glu Gly
65 70 75 80
Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr Ile
85 90 95
Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp Thr Leu Ala Gly Thr Asp
100 105 110
Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg Asp Phe Lys Gln Ile Glu
115 120 125
Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp Thr Leu Val Asn Asp Ala
130 135 140
His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Phe Val Pro Asn His Ser
145 150 155 160
Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe Ala Glu Gly Gly Ala Leu
165 170 175
Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr Phe Asp Asp Ala Thr Lys
180 185 190
Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser Asn Trp Asp Asp Arg Tyr
195 200 205
Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ala
210 215 220
Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala Gln Tyr Leu Thr Asp Ala
225 230 235 240
Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ala
245 250 255
Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser Leu Ala Asp Lys Leu
260 265 270
Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu Trp Tyr Gly Asp Asp
275 280 285
Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg Tyr Ala Asn Asn Ser
290 295 300
Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr Val Ile Arg Asn Val
305 310 315 320
Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu Asn Asn Met Val Asn
325 330 335
Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn Leu Ile Thr Phe Ile
340 345 350
Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val Asn Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu Thr Ser Arg Gly Thr Pro
370 375 380
Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ala Gly Gly Asn Asp Pro
385 390 395 400
Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp Thr Thr Thr Thr Ala Phe
405 410 415
Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg Arg Asn Asn Ala Ala Ile
420 425 430
Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val Tyr Ile
435 440 445
Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val Leu Val Ala Ile Asn Arg
450 455 460
Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Leu Gln Thr Ala Leu Pro
465 470 475 480
Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly Leu Leu Gly Gly Asn Gly
485 490 495
Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe Thr Leu Ala Pro Gly
500 505 510
Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser Ala Ser Ala Pro Gln Ile
515 520 525
Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro Gly Asn Val Val Thr Ile
530 535 540
Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly Thr Val Thr Phe Gly Gly
545 550 555 560
Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser Asn Arg Ile Glu Val Tyr
565 570 575
Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Gly
580 585 590
Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gly Thr Gln
595 600 605
Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro Pro Thr Asn Leu Gly
610 615 620
Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser
625 630 635 640
Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln Gly Pro Leu Leu Ala
645 650 655
Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser Val Pro Ala Gly Lys
660 665 670
Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg Ala Asp Gly Thr Ile Gln
675 680 685
Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr Thr Pro Thr Gly Ala Thr
690 695 700
Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn
705 710
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 52
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala
<210> 53
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA tag
<400> 53
Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Ala Leu Gln Ala
20
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的G4S接头
<400> 54
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser
<210> 55
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> trx2基因的启动子
<400> 55
ataaccacaa tgatcgcaga ccgtcgacat gataatgact tctttaaagt gtgggatatt 60
tactggcttc atatgagttt cacactcttg ggtacacgat ggacaagaag ctctgaatgt 120
ttgcacctcg ttgttaaagt tttcgatgtc ggtggcgtct gacaaaaact gtgggtttgc 180
tgagccaact ttgacagatt cagaaggatt tctttcacgg ttggccaatt gttttaattg 240
ttcttggcga cgttgctcca actggtctct agtaataatg ccaacttgaa cgttttgttc 300
gtcggttctc acgtactggg tatgagacca tttgtgttga ggttcaccgg gtttgtattc 360
gatccaggaa tttcccgcag gatcatccaa aataaatgta atcggaatag tgttgggttc 420
acaattgatg taggatttaa ctttctgtac gaagtcatcg atcttcttgt aaagagcttc 480
gtctatagat tttctcattt cctggtcttg cgacagatcg tcgatcatct cggataacaa 540
accttcaact gtcgtcaatt gacctctctt agcaggaatc tcaatgtcta gctcgacaaa 600
cttacaagtg gcagtttctg acttaataac ttgcctgtta aaatcttcac ggcactccac 660
tttcaaaacg taacgagagc ccttctcttg aatttgagaa gcgggttgga tctcacagtt 720
cttaaaccca cagtgaggac agtcgaatga 750
<210> 56
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sti1基因的启动子
<400> 56
taccacaaag ggtaaaacgt caataaaagc aagcaatgtt attcgtgcca gagaactata 60
tctggcgtac gtcttatata taacacaagc aagggcaaat acgtggttag tggtgtaaaa 120
actgaaggga ttaatttaca tacaactaga tccatctttc tcaaaaatga cttcagtatc 180
gccctcgcca cctgccagtc gatcgggctc aatgtgctcc gacttaccgt cctctttgca 240
gactgagaaa ctggcacata ttataggtct tgatgccgac gatgaagttc tccggcgcgt 300
aaccaagcag ttgagcagat ctaggagaat tgcttgtctg actggggcag gcatttcgtg 360
caacgcgggc attcctgact ttcgctcttc tgatgggctc tacgacctag tgaaaaagga 420
ttgttcacag tattggtcta tcaagtccgg cagggaaatg tttgatattt cgctatttag 480
agatgacttc aaaatatcca tttttgctaa atttatggag aggctctatt caaatgttca 540
attggcaaag ccgactaaga cgcacaagtt cattgcgcat ctaaaagata ggaacaaact 600
gctgcgctgt tacacgcaaa acatcgatgg gctcgaagaa agcataggac ttactttatc 660
aaataggaaa ttaccgctta cctcatttag ttcacattgg aaaaatctgg atgtcgttca 720
gttgcacggc gacctgaaaa ctctttcgtg 750
<210> 57
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gdp1基因的启动子
<400> 57
aaggaaaata tatactcttt cccaggcaag gtgacagcgg tccccgtctc ctccacaaag 60
gcctctcctg gggtttgagc aagtctaagt ttacgtagca taaaaattct cggattgcgt 120
caaataataa aaaaagtaac tccacttcta cttctacatc ggaaaaacat tccattcaca 180
tatcgtcttt ggcctatctt gttttgtcct tggtagatca ggtcagtaca aacgcaacac 240
gaaagaacaa aaaaagaaga aaaacagaag gccaagacag ggtcaatgag actgttgtcc 300
tcctactgtc cctatgtctc tggccgatca cgcgccattg tccctcagaa acaaatcaaa 360
cacccacacc ccgggcaccc aaagtcccca cccacaccac caatacgtaa acggggcgcc 420
ccctgcaggc cctcctgcgc gcggcctccc gccttgcttc tctcccctcc cttttctttt 480
tccagttttc cctattttgt ccctttttcc gcacaacaag tatcagaatg ggttcatcaa 540
atctatccaa cctaattcgc acgtagactg gcttggtatt ggcagtttcg cagttatata 600
tatactacca tgagtgaaac tgttacgtta ccttaaattc tttctccctt taattttctt 660
ttatcttact ctcctacata agacatcaag aaacaattgt atattgtaca cccccccccc 720
tccacaaaca caaatattga taatataaag 750
<210> 58
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cup1基因的启动子
<400> 58
taaatatatg ctgagattta gcaagaaaaa acaaaatttt gcgagaaact ctgataacaa 60
taatgttaca gattatagtc agtcggcgaa gaacaaaaat gttctcttga aattccccgt 120
tagtgaactg aacagaatct atttaaaatt taaggagatt tcagattttt taatggaaag 180
agaagttgtc caaaggagta taattattga caaggatttg gaatctgata atctgggtat 240
tactacggca aacttcaacg atttctatga tgcattttat aattagtaag ccgatcccat 300
taccgacatt tgggcgctat acgtgcatat gttcatgtat gtatctgtat ttaaaacact 360
tttgtattat ttttcctcat atatgtgtat aggtttatac ggatgattta attattactt 420
caccaccctt tatttcaggc tgatatctta gccttgttac tagttagaaa aagacatttt 480
tgctgtcagt cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttctagaag caaaaagagc 540
gatgcgtctt ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgcaa tatggattgt 600
cagaatcata taaaagagaa gcaaataact ccttgtcttg tatcaattgc attataatat 660
cttcttgtta gtgcaatatc atatagaagt catcgaaata gatattaaga aaaacaaact 720
gtacaatcaa tcaatcaatc atcacataaa 750
<210> 59
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> glo1基因的启动子
<400> 59
tattaatcca aaaagtgaat ctttgacacc cctttctcct atcttgctta gtaccgagtg 60
atcttttgca taatcaaaac aagtgaagaa ggtcgagttt tgaaccttct ctaatataag 120
tcgacggtct ttcgtgatgg cgtcaatatt acttagtctt ttgtacttca catataccat 180
taatggcgtc aatcccttat aattttcctc attaatatct agcttagtca gttgtaaaag 240
gattggaatg tttgttttca aaacatgcaa caagctattg cccttattat cggtgtggtc 300
tagatagtca aacaaactgt tgtgctttct ataccaagta tttgcgatat caaatgcggt 360
cttcaccatt tcttcataat ttggttgatc ataacttcta aagatggaaa ataaaggcgt 420
ttgtccactg gagttttttc gtttccaatc aatataattt ccgatgcttt taagtatatc 480
catttcatgg gttagataat gagccacggt acgtgcatat ttatctgttt tattgatata 540
agaaaccagc tcctcttcag tacaattgaa cagcatgatc tttatgagaa ctttcgcggc 600
ttctaaattt cctgctttta tcgattctat aagcagcgta gaaccatcaa tcgtttcgtc 660
ctctaaaagg tcttctactg gaaagtcgtt ttcatattca gaaagaatat ctaataagat 720
gtagttttta tgatttgtta tacatatgga 750
<210> 60
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ctt1基因的启动子
<400> 60
ttaactgcaa agacccgtca cctatgaata agatgactct cttgttgggg tcaatctcct 60
cagcggcaaa ggcagcacct aaagttgctc ctgttgtaaa accgatagac ccccacaaca 120
cttgcgagat accgtaggcg tccttaggaa agatagtttg attgataccg aaggcagacg 180
tgccggtctc ggaaatgata acatcacctt cttgcaagaa cttggacaat tcgttccaca 240
accactcttg tttcaagggc gtgctagcag atacaccttt gtttgcggga gttttggttg 300
gtacgggaac gctcttgtag cccttaataa catcgggaat aaccttcagt aagttttgta 360
gtgcaaattt catttgtacg ccggggaacg tagcgttctt cacctttacg taatcggaat 420
gaaactccac tacattttta gtcttgtagg agtaggaaaa cgaacctgtg ttaaaatcag 480
agagcaaagc accgaccgaa aggatcaaat cagccgactc aacggcctgt ttcacgtctg 540
gtttggacag cgttcccaca taaacaccgc catatctggg atgctgttca tctattgacc 600
ctttacctaa aggtgtcaca aaagctggga attgcgtcaa atcaattaac ttctgggttt 660
cctttttaac gttgtgccta gaagcacagg catccgatag tatgacaggg tttttcgaat 720
tctggatcaa ttctagtacg gtatcaataa 750
<210> 61
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ygp1基因的启动子
<400> 61
tctcataatt ggtcagaaga aaggaaatct aggcaattga gttctttggg taaaaaagag 60
tcacaatttt taaggctgcg tagaacgaga ttatcgttag aagatttcca cactgtgaaa 120
gtcattggaa aaggggcatt tggtgaagtc agactggttc agaagaaaga caccggaaaa 180
atatatgcaa tgaaaacttt attaaaatcc gaaatgtaca aaaaggacca attagcacac 240
gtcaaggctg aaagggatgt tctggctgga agtgattctc catgggtggt ttcgctatat 300
tactcattcc aagatgctca atacttatat ttaatcatgg aatttttgcc cggtggtgat 360
ttgatgacca tgctaatcag gtggcaacta tttacagagg atgttactag attttacatg 420
gctgagtgta ttttggccat cgaaaccatt cataaattag gattcattca cagagatatt 480
aaaccagata atattttgat cgatattaga ggtcatataa aattatctga tttcgggttg 540
tctacggggt tccataaaac tcacgactca aactactata aaaagctttt gcaacaagat 600
gaggcaacta atggtatttc caagccaggt acttacaatg caaatacaac cgatactgca 660
aataaaaggc aaacaatggt tgtggattct attagtctaa caatgtcaaa caggcaacaa 720
attcagacat ggagaaaatc acgtcgttta 750
<210> 62
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gsy2基因的启动子
<400> 62
tattatagct cttgataaca atgaaatttc aacaattatt cactcaaccc tcaagtgtat 60
atcgccaaga tcctaatcac ccctctctgg tggccttccc tcattgtttt tacacagaac 120
aagaatccat aaaatcaaga tattgggaac aattcattgt cttaggaaca agtttttata 180
atttagtttc attagcctat tgtaacttct tgtttttttt tttattttgg ctggcaaaac 240
aagaagtata aagaagttac cactgctata acgtatatct taaatcaagt gggcaattct 300
tcgaataaac ttagaggcgc tgaagaaaga accgctcaat tagttcgatc atacaaaata 360
cagatattgc gctgtgtatt atcattacag aaagtgtgat ataaacaatg ctgtgttgta 420
ttcggtcttt tttttccgcc tgcagattgt cgtttttgtt tttttttctc gtgtagctgc 480
agttatcatc gttttgcatg tctgttctgt cggtgaagcc gatctcatgg cacttcgctt 540
tgataccgta aagaatcttc ttcattaata cggcactgca aggcgatatc tatctctggg 600
gttaggactg ataaataggt acttatcagt tatcactaga gacgaactgt ttacgttttg 660
aagctcgaca gcaggggttc ttaacgggcg tcggcctaga cctcaccttg cgagaaattt 720
ttagttcata tccaggggat ggtgaatggt 750
<210> 63
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hsp12基因的启动子
<400> 63
gcttgtccac aatcaccatg gggttatatt gcattatttt tttatcttcg ttatcattcc 60
atactgtggc ttcattccag tattttatga gtttgctgaa ggattcgggg gtaatagtgc 120
ccacggtggt caaaaccttt agcgtctcag tgacctgttc caaatccccc tcttccattc 180
gccttatata aaatccatcg ggtaagctca ttattttatg ttgatatcca gcttccgttc 240
gtcaactatt ctctcgagct cagttttggg ttttggcatg taaacaatgc cttcgcttgt 300
attacgcaaa aaaaaaaaaa ataaataaaa aaaaaaaaaa aaaaataagg tataaatcgt 360
tggttctttt atgcacaatt atttaactat agttatctat ttacgtaaag gcttctattt 420
ttccttatct acaagaaatt gcatgaagtt taattttttt tgtcaccttt gatcttcctg 480
aatgtgttgg taatgaaatt ttctagtctc ttcaaagtgt tgtcgtcatc cttttttgcg 540
tgtttttcct cttcttgttt ttgtttcttc agtatctctt cattaatggc tgtacccgcg 600
gctgtgcccg gttgcatggt tttcttggcc atgtcatcgt tggtgacatc tgccagtgcc 660
tcccacaagc atttttctgc cagcgattgc ggtttcttaa caacgatctt gtactggact 720
ttcatatcac cgcgaatggt tgatgtttta 750
<210> 64
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mol1/thi4基因的启动子
<400> 64
tcgttgaaag ttctagattt gggtacggaa gcagccatgt aaatggtctt cctttgtaat 60
aatatcgtca ctggagtttt taaattagag tacggattca agttaacgaa aaatttctgt 120
tggtatctga tagcaatttg tcgacaaggt ggagagtttt tgaagttttt ttttgtaaca 180
gttatgttac actatttacc agagaaacac caagacagga gccctcagaa gctttcgtgt 240
tgtcagaaca taaatatctt ctatatgttt tattctttta tattaatcaa tattttatgt 300
taaatcatat tattattcgt taatgcttaa cttgccctat ttcaaaatcg gaagggtagt 360
atggtgacaa gcggtgtttt tggtgtatgt ttactgctaa gagtataccg tcctgtttac 420
ttttttacct tttgttccgt tattgatttt tcgcagcaag gttgaagctt ccatatttga 480
aaatgaaatt aagaagtaga gatgaaaaac agcgacgaaa ttacttttta tagcttcttt 540
cccttctgac tccgttttat aaacagggga tctttaaggg cttacaaaat aaatataaac 600
actaacacat atatattatt cgacctacag tttttgcgac caatgaagtt tacctatttt 660
gagatggtgc ttacgtagtt tgcttaaggt caaggcggga ttaagcttgc gctttctcta 720
aataatatca tatgttacag acagggataa 750
<210> 65
<211> 695
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪土芽孢杆菌
<400> 65
Met Tyr Asn Pro Asn Ala Ala Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile Ile Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp
20 25 30
Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr
35 40 45
Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp Gly Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg
50 55 60
Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu
65 70 75 80
Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp Thr Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr
85 90 95
Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg Asp Phe Lys Gln Ile Glu Glu His
100 105 110
Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp Thr Leu Val Asn Asp Ala His Gln
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Phe Val Pro Asn His Ser Thr Pro
130 135 140
Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe Ala Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn
145 150 155 160
Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr Phe Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr
165 170 175
Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala
180 185 190
Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu
195 200 205
Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala Gln Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val
210 215 220
Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys
225 230 235 240
His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln
245 250 255
Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly
260 265 270
Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val
275 280 285
Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr Val Ile Arg Asn Val Phe Gly
290 295 300
Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu Asn Asn Met Val Asn Gln Thr
305 310 315 320
Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn
325 330 335
His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu
340 345 350
His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu Thr Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile
355 360 365
Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ala Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn
370 375 380
Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp Thr Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu
385 390 395 400
Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg Arg Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr
405 410 415
Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu
420 425 430
Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr
435 440 445
Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Leu Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly
450 455 460
Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly Leu Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser
465 470 475 480
Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val
485 490 495
Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser Ala Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser
500 505 510
Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro Gly Asn Val Val Thr Ile Asp Gly
515 520 525
Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly Thr Val Thr Phe Gly Gly Val Thr
530 535 540
Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser Asn Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro
545 550 555 560
Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Gly Gly Val
565 570 575
Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser
580 585 590
Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys
595 600 605
Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp
610 615 620
Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn
625 630 635 640
Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile
645 650 655
Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg Ala Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu
660 665 670
Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr Thr Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn
675 680 685
Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn
690 695
<210> 66
<211> 411
<212> PRT
<213> 布氏柠檬酸杆菌
<400> 66
Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu
50 55 60
Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val
100 105 110
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val
115 120 125
Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln
145 150 155 160
Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu
165 170 175
Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala
180 185 190
Leu Pro Ser Glu Phe Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly
195 200 205
Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu
210 215 220
Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys
225 230 235 240
Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu
245 250 255
Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp
260 265 270
Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr
275 280 285
Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr
290 295 300
Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Lys Trp Ser Leu Pro
305 310 315 320
Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys
325 330 335
Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val
340 345 350
Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu
355 360 365
Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys
370 375 380
Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys
385 390 395 400
Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
405 410
<210> 67
<211> 410
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 67
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 68
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 69
Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 70
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 70
tagcgtgtta cgcacccaaa ctttttatga aagtctttgt ttataatgat gaggtttata 60
aatatatagt ggagcaaaga ttaatcacta aatcaagaag cagtaccagt atttttttta 120
tatcaagtag tgataatgga aatagcccaa atttggcttc cgtcggcaca tagcacgttt 180
gagagacatt atcaccatca agcatcgagc cgcccaaacc taactgtata agttttttca 240
cgtttttgat ttttccttgc acacttcgat attactctca cgataaaagg gccgaagaga 300
atatttttct tgaacatcca gaattttaat tcggagaaat ttcacaagcc gccgatttaa 360
gggtcctgtg ttcttaataa tcagcctctc tcaaagcagg taagaggcag tctttctttt 420
aacaatagga gacattcgaa ctaaaacatc agccccaaaa atgcgcttga aggtcattag 480
gatttggatt tcttcctcat 500
<210> 71
<211> 460
<212> PRT
<213> 强烈热球菌
<400> 71
Met Asn Ile Lys Lys Leu Thr Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Phe Phe
1 5 10 15
Ile Val Leu Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu
20 25 30
Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe Tyr Trp Asp Val Pro Gly Gly
35 40 45
Gly Ile Trp Trp Asp His Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu
50 55 60
Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Leu Pro Pro Pro Ser Lys Gly Met Ser
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly
85 90 95
Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu
100 105 110
Glu Leu Val Arg Leu Ile Gln Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Val
115 120 125
Ile Ala Asp Val Val Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp
130 135 140
Asn Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala
145 150 155 160
Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu
165 170 175
His Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Cys His
180 185 190
His Lys Glu Trp Asp Gln Tyr Trp Leu Trp Lys Ser Asn Glu Ser Tyr
195 200 205
Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Phe Asp Gly Trp Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val Arg Asp Trp Leu Asn Trp Trp
225 230 235 240
Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu
245 250 255
Leu Ser Trp Ala Tyr Glu Ser Gly Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu
260 265 270
Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu
275 280 285
Val Tyr Ala Leu Gln Asn Gly Gln Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Val
325 330 335
Ile Phe Tyr Arg Asp Phe Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Ile
340 345 350
Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Thr Ile
355 360 365
Val Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Val Arg Asn Gly Asp Ser
370 375 380
Arg Arg Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Pro Asn Trp Val
385 390 395 400
Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu
405 410 415
Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Val Asp Lys Arg Val Asp Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro Pro His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr
435 440 445
Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr Cys Gly Val Gly
450 455 460
<210> 72
<211> 457
<212> PRT
<213> 热水管热球菌
<400> 72
Met Ala Arg Lys Val Leu Val Ala Leu Leu Val Phe Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Ser Val Ser Ala Val Pro Ala Lys Ala Glu Thr Leu Glu Asn Gly Gly
20 25 30
Val Ile Met Gln Ala Phe Tyr Trp Asp Val Pro Gly Gly Gly Ile Trp
35 40 45
Trp Asp Thr Ile Ala Gln Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr
85 90 95
Gln Lys Gly Ser Val Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Val
100 105 110
Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala His Asn Met Lys Val Ile Ala Asp
115 120 125
Ile Val Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe
130 135 140
Thr Asn Ser Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly
165 170 175
Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser
180 185 190
Trp Asp Gln His Trp Leu Trp Ala Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr
195 200 205
Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly
210 215 220
Tyr Ala Pro Trp Val Val Lys Asn Trp Leu Asn Arg Trp Gly Gly Trp
225 230 235 240
Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Ser Trp
245 250 255
Ala Tyr Asp Ser Gly Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys
260 265 270
Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Val Asp Ala
275 280 285
Leu Lys Asn Gly Gly Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val
290 295 300
Thr Phe Val Ala Asn His Asp Thr Asn Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Ala Ile Phe Tyr
325 330 335
Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Arg Asn Leu Ile
340 345 350
Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Ile Tyr Tyr
355 360 365
Asp Ser Asp Glu Leu Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro
370 375 380
Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp
385 390 395 400
Val Tyr Val Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly
405 410 415
Asn Leu Gly Gly Trp Ile Asp Lys Trp Val Asp Ser Ser Gly Arg Val
420 425 430
Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gln Tyr Gly Tyr
435 440 445
Ser Val Trp Ser Tyr Cys Gly Val Gly
450 455
<210> 73
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPI1栓系部分
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(390)
<400> 73
ttg gta tct aat tct agt tcc tct gta atc gtg gta cca tca agc gat 48
Leu Val Ser Asn Ser Ser Ser Ser Val Ile Val Val Pro Ser Ser Asp
1 5 10 15
gct act att gcc ggt aac gat aca gcc acg cca gca cca gag cca tca 96
Ala Thr Ile Ala Gly Asn Asp Thr Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser
20 25 30
tcc gcc gct cca ata ttc tac aac tcg act gct act gca aca cag tac 144
Ser Ala Ala Pro Ile Phe Tyr Asn Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr
35 40 45
gaa gtt gtc agt gaa ttc act act tac tgc cca gaa cca acg act ttc 192
Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe
50 55 60
gta acg aat ggc gct aca ttc act gtt act gcc cca act acg tta aca 240
Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr
65 70 75 80
att acc aac tgt cct tgc act atc gag aag cct act tca gaa aca tcg 288
Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser
85 90 95
gtt tct tct aca cat gat gtg gag aca aat tct aat gct gct aac gca 336
Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala
100 105 110
aga gca atc cca gga gcc cta ggt ttg gct ggt gca gtt atg atg ctt 384
Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu
115 120 125
tta tga 390
Leu
<210> 74
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 74
Leu Val Ser Asn Ser Ser Ser Ser Val Ile Val Val Pro Ser Ser Asp
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ala Gly Asn Asp Thr Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Pro Ile Phe Tyr Asn Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr
35 40 45
Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe
50 55 60
Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser
85 90 95
Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala
100 105 110
Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu
115 120 125
Leu
<210> 75
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPI1栓系部分的21aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(66)
<400> 75
gct gct aac gca aga gca atc cca gga gcc cta ggt ttg gct ggt gca 48
Ala Ala Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
gtt atg atg ctt tta tga 66
Val Met Met Leu Leu
20
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 76
Ala Ala Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Val Met Met Leu Leu
20
<210> 77
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPI1栓系部分的51aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(156)
<400> 77
tta aca att acc aac tgt cct tgc act atc gag aag cct act tca gaa 48
Leu Thr Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu
1 5 10 15
aca tcg gtt tct tct aca cat gat gtg gag aca aat tct aat gct gct 96
Thr Ser Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala
20 25 30
aac gca aga gca atc cca gga gcc cta ggt ttg gct ggt gca gtt atg 144
Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met
35 40 45
atg ctt tta tga 156
Met Leu Leu
50
<210> 78
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 78
Leu Thr Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu
1 5 10 15
Thr Ser Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala
20 25 30
Asn Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met
35 40 45
Met Leu Leu
50
<210> 79
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPI1栓系部分的81aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(246)
<400> 79
gaa gtt gtc agt gaa ttc act act tac tgc cca gaa cca acg act ttc 48
Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe
1 5 10 15
gta acg aat ggc gct aca ttc act gtt act gcc cca act acg tta aca 96
Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr
20 25 30
att acc aac tgt cct tgc act atc gag aag cct act tca gaa aca tcg 144
Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser
35 40 45
gtt tct tct aca cat gat gtg gag aca aat tct aat gct gct aac gca 192
Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala
50 55 60
aga gca atc cca gga gcc cta ggt ttg gct ggt gca gtt atg atg ctt 240
Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu
65 70 75 80
tta tga 246
Leu
<210> 80
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 80
Glu Val Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser
35 40 45
Val Ser Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala
50 55 60
Arg Ala Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu
65 70 75 80
Leu
<210> 81
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPI1栓系部分的111aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 81
att gcc ggt aac gat aca gcc acg cca gca cca gag cca tca tcc gcc 48
Ile Ala Gly Asn Asp Thr Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala
1 5 10 15
gct cca ata ttc tac aac tcg act gct act gca aca cag tac gaa gtt 96
Ala Pro Ile Phe Tyr Asn Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr Glu Val
20 25 30
gtc agt gaa ttc act act tac tgc cca gaa cca acg act ttc gta acg 144
Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val Thr
35 40 45
aat ggc gct aca ttc act gtt act gcc cca act acg tta aca att acc 192
Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr
50 55 60
aac tgt cct tgc act atc gag aag cct act tca gaa aca tcg gtt tct 240
Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser
65 70 75 80
tct aca cat gat gtg gag aca aat tct aat gct gct aac gca aga gca 288
Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala Arg Ala
85 90 95
atc cca gga gcc cta ggt ttg gct ggt gca gtt atg atg ctt tta tga 336
Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu Leu
100 105 110
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 82
Ile Ala Gly Asn Asp Thr Ala Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ile Phe Tyr Asn Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gln Tyr Glu Val
20 25 30
Val Ser Glu Phe Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val Thr
35 40 45
Asn Gly Ala Thr Phe Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ile Thr
50 55 60
Asn Cys Pro Cys Thr Ile Glu Lys Pro Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser
65 70 75 80
Ser Thr His Asp Val Glu Thr Asn Ser Asn Ala Ala Asn Ala Arg Ala
85 90 95
Ile Pro Gly Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Val Met Met Leu Leu
100 105 110
<210> 83
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCW12栓系部分
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 83
gtt acc act gct act gtc agc caa gaa tct acc act ttg gtc acc atc 48
Val Thr Thr Ala Thr Val Ser Gln Glu Ser Thr Thr Leu Val Thr Ile
1 5 10 15
act tct tgt gaa gac cac gtc tgt tct gaa act gtc tcc cca gct ttg 96
Thr Ser Cys Glu Asp His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser Pro Ala Leu
20 25 30
gtt tcc acc gct acc gtc acc gtc gat gac gtt atc act caa tac acc 144
Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr
35 40 45
acc tgg tgc cca ttg acc act gaa gcc cca aag aac ggt act tct act 192
Thr Trp Cys Pro Leu Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr
50 55 60
gct gct cca gtt acc tct act gaa gct cca aag aac acc acc tct gct 240
Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala
65 70 75 80
gct cca act cac tct gtc acc tct tac act ggt gct gct gct aag gct 288
Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala
85 90 95
ttg cca gct gct ggt gct ttg ttg gct ggt gcc gct gct ttg ttg ttg 336
Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
100 105 110
taa 339
<210> 84
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 84
Val Thr Thr Ala Thr Val Ser Gln Glu Ser Thr Thr Leu Val Thr Ile
1 5 10 15
Thr Ser Cys Glu Asp His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser Pro Ala Leu
20 25 30
Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr
35 40 45
Thr Trp Cys Pro Leu Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala
65 70 75 80
Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
100 105 110
<210> 85
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCW12栓系部分的24aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(75)
<400> 85
tac act ggt gct gct gct aag gct ttg cca gct gct ggt gct ttg ttg 48
Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu
1 5 10 15
gct ggt gcc gct gct ttg ttg ttg taa 75
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
20
<210> 86
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 86
Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
20
<210> 87
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCW12栓系部分的49aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(150)
<400> 87
act gct gct cca gtt acc tct act gaa gct cca aag aac acc acc tct 48
Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser
1 5 10 15
gct gct cca act cac tct gtc acc tct tac act ggt gct gct gct aag 96
Ala Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys
20 25 30
gct ttg cca gct gct ggt gct ttg ttg gct ggt gcc gct gct ttg ttg 144
Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu
35 40 45
ttg taa 150
Leu
<210> 88
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 88
Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser
1 5 10 15
Ala Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys
20 25 30
Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu
35 40 45
Leu
<210> 89
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCW12栓系部分的74aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(225)
<400> 89
acc gtc gat gac gtt atc act caa tac acc acc tgg tgc cca ttg acc 48
Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu Thr
1 5 10 15
act gaa gcc cca aag aac ggt act tct act gct gct cca gtt acc tct 96
Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser
20 25 30
act gaa gct cca aag aac acc acc tct gct gct cca act cac tct gtc 144
Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser Val
35 40 45
acc tct tac act ggt gct gct gct aag gct ttg cca gct gct ggt gct 192
Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala
50 55 60
ttg ttg gct ggt gcc gct gct ttg ttg ttg taa 225
Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
65 70
<210> 90
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 90
Thr Val Asp Asp Val Ile Thr Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser Val
35 40 45
Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Leu
65 70
<210> 91
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCW12栓系部分的99aa-平截
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(300)
<400> 91
gtc acc atc act tct tgt gaa gac cac gtc tgt tct gaa act gtc tcc 48
Val Thr Ile Thr Ser Cys Glu Asp His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser
1 5 10 15
cca gct ttg gtt tcc acc gct acc gtc acc gtc gat gac gtt atc act 96
Pro Ala Leu Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr
20 25 30
caa tac acc acc tgg tgc cca ttg acc act gaa gcc cca aag aac ggt 144
Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly
35 40 45
act tct act gct gct cca gtt acc tct act gaa gct cca aag aac acc 192
Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr
50 55 60
acc tct gct gct cca act cac tct gtc acc tct tac act ggt gct gct 240
Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala
65 70 75 80
gct aag gct ttg cca gct gct ggt gct ttg ttg gct ggt gcc gct gct 288
Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala
85 90 95
ttg ttg ttg taa 300
Leu Leu Leu
<210> 92
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构造
<400> 92
Val Thr Ile Thr Ser Cys Glu Asp His Val Cys Ser Glu Thr Val Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Val Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Asp Val Ile Thr
20 25 30
Gln Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Leu Thr Thr Glu Ala Pro Lys Asn Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Ala Ala Pro Val Thr Ser Thr Glu Ala Pro Lys Asn Thr
50 55 60
Thr Ser Ala Ala Pro Thr His Ser Val Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Ala
65 70 75 80
Ala Lys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ala
85 90 95
Leu Leu Leu
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 93
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 94
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 95
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头3
<400> 95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头4
<400> 96
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头5
<400> 97
Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头6
<400> 98
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
<210> 99
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头7
<400> 99
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 100
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EA2K基序
<400> 100
Glu Ala Ala Lys
1
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EA3K基序
<400> 101
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 102
<211> 1752
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<400> 102
tccaatggta ttgaggcttc cttgttgact gatccaaaag atgtttctgg tagaaccgtc 60
gattacatta ttgctggtgg tggtttgact ggtttaacta ctgctgctag attgactgaa 120
aacccaaaca tctccgtttt ggttatcgaa tctggttcct acgaatctga tagaggtcca 180
attatcgaag atttgaacgc ctacggtgat atctttggtt cttctgttga tcatgcttac 240
gaaaccgttg aattggctac caacaatcaa actgccttga ttagatctgg taacggttta 300
ggtggttcta ctttggttaa tggtggtact tggactagac cacataaggc tcaagttgat 360
tcttgggaaa ctgtttttgg taacgaaggt tggaattggg ataatgttgc tgcttattca 420
ttgcaagctg aaagggctag agcaccaaat gctaaacaaa ttgctgctgg tcattacttc 480
aatgcctctt gtcatggtgt taacggtact gttcatgctg gtccaagaga tactggtgat 540
gattattctc caatcgttaa ggctttgatg tccgctgttg aagatagagg tgttccaact 600
aagaaagatt tcggttgtgg tgatccacat ggtgtttcta tgtttccaaa taccttgcac 660
gaagatcaag ttagatctga tgctgcaaga gaatggttgt tgccaaatta tcaaagacca 720
aacttgcagg tcttgactgg tcaatatgtt ggtaaggttt tgttgtccca aaacggtact 780
actccaagag ctgttggtgt tgaatttggt actcataagg gtaacaccca taacgtttac 840
gccaaacatg aagttttgtt agctgctggt tctgctgttt ctccaactat tttggaatac 900
tccggtatcg gtatgaagtc cattttggaa ccattgggta ttgataccgt tgttgatttg 960
ccagttggtt tgaacttaca agatcaaact accgctaccg tcagatctag aattacttct 1020
gctggtgctg gtcaaggtca agctgcttgg tttgctactt ttaacgaaac tttcggtgac 1080
tactctgaaa aggcccatga attattgaac accaaattgg aacaatgggc tgaagaggct 1140
gttgctagag gtggttttca taacactact gccttgttga tccagtacga aaattacaga 1200
gattggatcg ttaaccacaa cgttgcttac tctgagttgt ttttggatac tgctggtgtt 1260
gcttcttttg atgtatggga tttgttgcca ttcaccagag gttacgttca cattttggat 1320
aaggatccat acttgcatca tttcgcttac gacccacaat actttttgaa cgaattggac 1380
ttgttgggtc aagccgctgc tactcaattg gctagaaaca tttctaattc cggtgctatg 1440
caaacctatt tcgctggtga aactattcca ggtgataact tggcttatga tgctgatttg 1500
tctgcttgga ctgagtacat tccataccat ttcagaccaa attaccacgg tgttggtact 1560
tgttctatga tgccaaaaga aatgggtggt gttgttgata atgcagctag agtttacggt 1620
gttcaaggtt tgagagttat cgatggttct attccaccaa ctcaaatgtc ctctcatgtt 1680
atgactgttt tctacgctat ggccttgaag atttccgatg caattttgga agattacgcc 1740
tccatgcaat aa 1752
<210> 103
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 103
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 104
<211> 1437
<212> DNA
<213> 米曲霉
<400> 104
gctactccag ctgattggag atcacaatct atctactttt tgttgaccga cagattcgct 60
agaactgatg gttctactac tgctacttgt aataccgctg atagaaagta ttgtggtggt 120
acttggcaag gtatcatcga taagttggat tacattcaag gtatgggttt caccgctatt 180
tggattactc cagttactgc tcaattgcca caaactactg cttatggtga tgcttatcat 240
ggttattggc aacaggatat ctactccttg aacgaaaatt acggtactgc cgatgatttg 300
aaggctttgt catctgcttt acatgaacgt ggtatgtact tgatggttga tgttgttgct 360
aaccacatgg gttatgatgg tgctggttct tctgttgatt actctgtttt taagcccttc 420
agctcccaag attactttca tccattctgc ttgatccaaa actacgaaga tcaaactcaa 480
gtcgaagatt gctggttggg tgataatact gtttctttgc cagatttgga taccaccaag 540
gatgttgtta agaacgaatg gtatgattgg gtcggttctt tggtttccaa ctactctatt 600
gatggtttga gaatcgatac cgtcaagcac gttcaaaaag atttttggcc aggttacaac 660
aaagctgctg gtgtttactg tattggtgaa gttttagatg gtgatccagc ttacacttgt 720
ccataccaaa atgttatgga tggcgttttg aactacccaa tctactaccc attattgaac 780
gctttcaagt ctacctctgg ttctatggat gacttgtaca acatgatcaa caccgttaag 840
tctgattgtc cagattctac tttgttgggt actttcgttg aaaaccacga taatccaaga 900
ttcgcttctt acaccaacga tattgctttg gctaaaaacg ttgccgcctt cattattttg 960
aacgatggta ttccaattat ctacgccggt caagaacaac attatgctgg tggtaatgat 1020
ccagcaaata gagaagctac ttggttgtct ggttatccaa ctgattccga gttgtacaaa 1080
ttgattgctt ccgctaacgc cattagaaac tacgctattt ctaaggatac tggcttcgtt 1140
acttacaaga attggcctat ctacaaggat gataccacta ttgctatgag aaagggtaca 1200
gatggttctc aaatcgttac catcttgtct aacaaaggtg cttctggtga ttcctacact 1260
ttgtctttgt ctggtgcagg ttatactgct ggtcaacaat tgactgaagt tattggttgt 1320
actaccgtta ccgttggttc tgatggtaat gttcctgttc caatggctgg tggtttgcca 1380
agagtcttgt atccaacaga aaaattggcc ggttccaaga tctgttcttc ttcttga 1437
<210> 105
<211> 478
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 105
Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr
20 25 30
Ala Asp Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys
35 40 45
Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Thr Pro
50 55 60
Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly Asp Ala Tyr His
65 70 75 80
Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu Asn Tyr Gly Thr
85 90 95
Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His Glu Arg Gly Met
100 105 110
Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr Asp Gly Ala
115 120 125
Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe Ser Ser Gln Asp
130 135 140
Tyr Phe His Pro Phe Cys Leu Ile Gln Asn Tyr Glu Asp Gln Thr Gln
145 150 155 160
Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser Leu Pro Asp Leu
165 170 175
Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr Asp Trp Val Gly
180 185 190
Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val
195 200 205
Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ala Gly
210 215 220
Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ala Tyr Thr Cys
225 230 235 240
Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Tyr
245 250 255
Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser Met Asp Asp Leu
260 265 270
Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro Asp Ser Thr Leu
275 280 285
Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr
290 295 300
Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala Phe Ile Ile Leu
305 310 315 320
Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu Gln His Tyr Ala
325 330 335
Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr
340 345 350
Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser Ala Asn Ala Ile
355 360 365
Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val Thr Tyr Lys Asn
370 375 380
Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr
385 390 395 400
Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gly
405 410 415
Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Thr Ala Gly Gln
420 425 430
Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr Val Gly Ser Asp
435 440 445
Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro Arg Val Leu Tyr
450 455 460
Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser Ser Ser
465 470 475
<210> 106
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自米曲霉的真菌淀粉酶的信号肽
<400> 106
atgatggttg cttggtggtc tttgttcttg tacggtttac aagttgctgc tccagctttg 60
gct 63
<210> 107
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自米曲霉的真菌淀粉酶的信号肽
<400> 107
Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Leu Ala
20
<210> 108
<211> 687
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪土芽孢杆菌
<400> 108
Met Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile
1 5 10 15
Ile Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys
20 25 30
Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp
35 40 45
Gly Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln
50 55 60
Leu Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp
65 70 75 80
Thr Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg
85 90 95
Asp Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp
100 105 110
Thr Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp
115 120 125
Phe Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe
130 135 140
Ala Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr
145 150 155 160
Phe Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser
165 170 175
Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro
180 185 190
Ala Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala
195 200 205
Gln Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp
210 215 220
Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly
245 250 255
Glu Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val
260 265 270
Arg Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn
275 280 285
Thr Val Ile Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp
290 295 300
Leu Asn Asn Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Asn Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser
325 330 335
Val Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met
355 360 365
Ala Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp
370 375 380
Thr Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg
385 390 395 400
Arg Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile
405 410 415
Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val
420 425 430
Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly
435 440 445
Leu Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly
450 455 460
Leu Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser
465 470 475 480
Phe Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser
485 490 495
Ala Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro
500 505 510
Gly Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly
515 520 525
Thr Val Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser
530 535 540
Asn Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp
545 550 555 560
Val Lys Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn
565 570 575
Ile Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala
580 585 590
Pro Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro
595 600 605
Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala
610 615 620
Gln Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe
625 630 635 640
Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg
645 650 655
Ala Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr
660 665 670
Thr Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn
675 680 685

Claims (37)

1.一种用于制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括在食品或饲料产品中包含重组酵母宿主细胞或包含含所述重组酵母宿主细胞的添加剂，其中，所述重组酵母宿主细胞具有编码细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的异源核酸分子，其中，所述细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶是麦芽糖α-淀粉酶，其中所述异源核酸分子与异源启动子可操作地相连，所述异源启动子允许所述异源核酸分子在增殖期间的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源核酸分子允许所述异源食品酶和/或饲料酶的细胞内表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源核酸分子允许膜相连的异源食品酶和/或饲料酶的表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源核酸分子允许栓系异源食品酶和/或饲料酶的表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述栓系异源食品酶和/或饲料酶是式(I)或式(II)的嵌合蛋白：
(NH2)FFE-L-TT(COOH)(I)
(NH2)TT-L-FFE(COOH)(II)
其中，FFE是所述异源食品酶和/或饲料酶；
L存在或不存在，并且是氨基酸接头；
TT是氨基酸栓系部分，用于使所述食品酶和/或饲料酶与所述重组酵母宿主细胞的细胞壁相连；
(NH2)表示嵌合蛋白的氨基末端；
(COOH)表示嵌合蛋白的羧基末端；并且
“-”是酰胺键。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，L存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，L包含一个或多个由SEQ ID NO：41所示的G4S基序。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，L包含一个或多个由SEQ ID NO：100所示的EA2K基序或由SEQ ID NO：101所示的EA3K基序。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中，TT包含跨膜结构域、其变体或片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，TT来自FLO1蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，TT由SEQ ID NO：14的氨基酸序列构成。
12.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中，TT可以通过翻译后机制进行修饰，以具有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，TT来自SED1蛋白、TIR1蛋白、CWP2蛋白、CCW12蛋白、SPI1蛋白、PST1蛋白或者AGA1和AGA2蛋白的组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，TT来自SPI1蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，TT由SEQ ID NO：74的氨基酸序列构成。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，TT由SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列构成。
17.根据权利要求13所述的方法，其中，TT来自CCW12蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，TT由SEQ ID NO：84的氨基酸序列构成。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，TT由SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列构成。
20.根据权利要求13所述的方法，其中，TT来自AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合由SEQ ID NO：24的氨基酸序列或者SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源启动子包括来自tdh1基因、hor7基因、hsp150基因、hxt7基因、gpm1基因、pgk1基因和/或stl1基因的启动子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述异源启动子包括来自tdh1基因的启动子。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述异源启动子包括hor7基因的启动子。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源核酸分子与终止子可操作地连接。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述终止子是天然终止子或异源终止子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述终止子是异源终止子，并包括来自dit1基因、adh3基因、idp1基因、gpm1基因、pma1基因、tdh3基因、hxt2基因和/或ira2基因的终止子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述异源终止子包括来自dit1基因的终止子。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述异源终止子包括来自adh3基因的终止子。
30.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述异源终止子包括来自idp1基因的终止子。
31.根据权利要求3所述的方法，其中，所述膜相连的异源食品酶和/或饲料酶具有异源信号肽。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述异源信号肽来自转化酶蛋白、AGA2蛋白或真菌淀粉酶。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述异源信号肽来自转化酶蛋白，并由SEQ IDNO：68的氨基酸序列构成。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述异源信号肽来自AGA2蛋白，并由SEQ IDNO：69的氨基酸序列构成。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述异源信号肽来自真菌淀粉酶蛋白，并由SEQID NO：107的氨基酸序列构成。
36.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述重组酵母宿主细胞来自酵母(Saccharomyces sp.)属。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述重组酵母宿主细胞来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种属。
CN201880029799.3A 2017-03-13 2018-03-13 细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶 Active CN110582563B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762470568P 2017-03-13 2017-03-13
US62/470,568 2017-03-13
US201862625751P 2018-02-02 2018-02-02
US62/625,751 2018-02-02
PCT/IB2018/051670 WO2018167669A1 (en) 2017-03-13 2018-03-13 Cell-associated heterologous food and/or feed enzymes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110582563A CN110582563A (zh) 2019-12-17
CN110582563B true CN110582563B (zh) 2024-01-02

Family

ID=61832547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880029799.3A Active CN110582563B (zh) 2017-03-13 2018-03-13 细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20200087672A1 (zh)
EP (2) EP4285729A3 (zh)
CN (1) CN110582563B (zh)
AU (1) AU2018234446B2 (zh)
BR (1) BR112019019106A2 (zh)
CA (1) CA3056554A1 (zh)
WO (1) WO2018167669A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111132553A (zh) * 2017-08-29 2020-05-08 诺维信公司 表达抗老化/保鲜淀粉酶的面包酵母
US20230091532A1 (en) 2018-03-13 2023-03-23 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Inactivated yeast and yeast product for improving fermentation yield
CA3093776A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast expressing thermostable alpha-amylases for hydrolysis of starch
CN110551644A (zh) * 2019-07-19 2019-12-10 天津科技大学 通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
CN111500561B (zh) * 2020-05-08 2022-12-02 江南大学 一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法
MX2023008732A (es) 2021-01-26 2023-08-01 Danstar Ferment Ag Celula de levadura hospedera recombinante con tasa de crecimiento mejorada.
EP4370683A2 (en) * 2021-07-13 2024-05-22 Amyris, Inc. High efficiency production of cannabidiolic acid
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN116114786B (zh) * 2023-04-19 2023-07-04 荣成鸿德海洋生物科技有限公司 一种以浓缩玉米浆为原料生产低粘性玉米浆蛋白粉的方法
CN117887688B (zh) * 2024-03-07 2024-06-25 合肥工业大学 一种高活力、高稳定性的脂肪酶突变体及其编码基因和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999043794A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Maltogenic alpha-amylase variants

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI92333C (fi) * 1987-03-17 1994-10-25 Panimolaboratorio Bryggerilabo -asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiä koodaava DNA-sekvenssi ja sen käyttö nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi
US20100075363A1 (en) * 2006-11-22 2010-03-25 The Trustees Of Dartmouth College Recombinant Yeast Strains Expressing Tethered Cellulase Enzymes
CA2724036C (en) * 2008-05-11 2018-09-25 Mascoma Corporation Construction of protrophic/celluloytic yeast strains expressing tethered and secreted cellulases
BR112012031362A2 (pt) * 2010-06-03 2015-10-13 Mascoma Corp levedura expressando enzimas sacarolíticas para bioprocessamento consolidado usando amido e celulose
WO2014035458A1 (en) * 2012-08-29 2014-03-06 Mascoma Corporation Expression of enzymes in yeast for lignocellulose derived oligomer cbp

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999043794A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Maltogenic alpha-amylase variants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bread making with Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D expressing lipase A from Bacillus subtilis: leavening characterisation and aroma enhancement;Lucia Paciello等;《International Journal of Food Science and Technology》;第50卷(第9期);第2120-2128页 *
Cell Surface Engineering of Yeast: Construction of Arming Yeast with Biocatalyst;MITSUYOSHI UEDA等;《JOURNAL OP BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING》;20000101;第90卷(第2期);第125-136页 *
Efficient co-displaying and artificial ratio control of α-amylase and glucoamylase on the yeast cell surface by using combinations of different anchoring domains;Kentaro Inokuma等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20141130;第99卷(第4期);第1655-1663页 *
酵母表面展示酶技术;陶站华等;《现代生物医学进展》;第10卷(第3期);第593-596页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20200087672A1 (en) 2020-03-19
CN110582563A (zh) 2019-12-17
AU2018234446B2 (en) 2024-02-08
CA3056554A1 (en) 2018-09-20
EP4285729A2 (en) 2023-12-06
AU2018234446A1 (en) 2019-10-03
EP3596200A1 (en) 2020-01-22
WO2018167669A1 (en) 2018-09-20
EP3596200B1 (en) 2024-05-29
BR112019019106A2 (pt) 2020-08-11
EP4285729A3 (en) 2024-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110582563B (zh) 细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶
CN110637085A (zh) 表达细胞相连的异源蛋白的重组酵母宿主细胞
EP3346004B1 (en) Amylase polypeptides
US20150240223A1 (en) Method of using alpha-amylase from talaromyces emersonii for saccharification
WO2014099415A1 (en) Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
CN115867651A (zh) 葡糖淀粉酶及其使用方法
US20160040202A1 (en) Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and pullulanase for saccharification
US9765374B2 (en) Method of using α-amylase from Aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification
CN111757931B (zh) 变体g6p g7p葡糖淀粉酶组合物及方法
WO2014099416A1 (en) Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and isoamylase for saccharification
US20220186200A1 (en) Amylases and methods for making and using them
EP3938498A1 (en) Improved lipase for defoaming
JP7194112B2 (ja) 細胞結合型異種タンパク質を発現する組換え酵母宿主細胞
WO2023091631A2 (en) High performance alphα-amylases for starch liquefaction
KR20240103026A (ko) 전분 액화를 위한 고 성능 알파-아밀라제

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240411

Address after: Swiss Express

Patentee after: DANSTAR FERMENT AG

Country or region after: Switzerland

Address before: Budapest

Patentee before: LALLEMAND HUNGARY LIQUIDITY MANAGEMENT LLC

Country or region before: Hungary