CN113265384B - 一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用 - Google Patents

一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ‑卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。所述的结构域PpCBM自身不具备酶活力，但与κ‑卡拉胶酶PpCgkCD共同作用可以显著提高PpCgk的比酶活，使其具有更强的底物亲和性和更高的相对催化效率。本申请公开了所述结构域PpCBM的制备方法以及其在构建工程菌株和降解κ‑卡拉胶中的应用。采用所述的结构域PpCBM构建的κ‑卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。此外，所述的结构域PpCBM单独也能用于促进κ‑卡拉胶底物的降解。

Description

一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及 其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种碳水化合物结合结构域，具体涉及一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其制备和应用。
背景技术
卡拉胶(Carrageenan)是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等海洋红藻细胞壁中提取的硫酸化多糖，已经在食品及医药工程方面得到了广泛的应用。卡拉胶是由交替的D-半乳糖和3,6-内醚-D-半乳糖单元组成线性骨架，骨架由交替的β-1,4和α-1,3糖苷键连接，并含有一定比例的硫酸酯盐。根据3,6-内醚-D-半乳糖的含量以及酯类硫酸盐基团的数量和位置，常见的卡拉胶包括κ-卡拉胶、ι-卡拉胶及λ-卡拉胶。其中，κ-卡拉胶是由β-(1→3)-D-半乳糖-4硫酸基和α-(1→4)-3,6-内醚-D半乳糖交替连接而成的硫酸多糖。κ-卡拉胶寡糖在生理学和病理学研究中的生物活性引起了广泛关注，其具备包括抗凝、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗肿瘤在内的多种功效，已逐渐成为药物和功能性食品研究与开发的热点。近年来，κ-卡拉胶寡糖在生物体抗氧化和自由基的清除方面也发挥着重要的作用。降解κ-卡拉胶得到的κ-卡拉胶寡糖不仅在黏度上大幅度降低，而且更容易被机体吸收利用，有望在不久的将来成为海洋糖类药物资源库的重要来源。
目前最常见的降解κ-卡拉胶的方法包括酸水解法与酶水解法。然而，酸水解法存在以下问题：(1)反应条件剧烈、产物聚合度较难控制；(2)寡糖末端的3,6-内醚-半乳糖在酸性条件下不稳定，往往导致产物结构被破坏。而酶水解法则具有产物纯度高、重复性好以及水解过程绿色无污染等优势，因而逐渐受到青睐。κ-卡拉胶酶特异性作用于κ-卡拉胶的β-4-硫酸-D-半乳糖和α-3,6-内醚-D-半乳糖之间的β-1,4-糖苷键，最终产物为硫酸κ-新卡拉寡糖。目前，研究人员已经发现了若干微生物κ-卡拉胶酶基因，但关于κ-卡拉胶工程酶构建的相关研究却鲜有报道。
碳水化合物结合结构域(Carbohydrate Binding Module，简称CBM)，是一类天然存在于碳水化合物活性酶中的、对碳水化合物具有结合能力的独立结构域。研究发现，许多多糖水解酶，尤其是不溶性多糖水解酶具有CBM。CBM本身不具有明显水解活性，但通过其与底物的特异性结合，提高了底物周围相对酶的浓度，定向引导底物接近酶催化区，同时还破坏了多糖底物结构，从而有效促进了酶与底物的缔合，显著提高多糖水解酶的水解活性。目前，CAZY数据库中已报道的CBM蛋白家族共有81个。根据结构和功能的相似性，CBM可以分为三类，即Type-A(与不溶性多糖表面结合的CBM),Type-B(与糖链结合的CBM),Type-C(与糖分子结合的CBM)。但是，目前尚未有特异性结合κ-卡拉胶的CBM结构域的报道。
发明内容
针对现有技术中κ-卡拉胶工程酶构建研究较少的现状，本申请提供了一种分离的能够特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM。采用所述的结构域PpCBM构建的κ-卡拉胶工程酶，不但显著增强了水解活性、提高了温度稳定性，而且将水解模式限定进行性水解，在产业发展中具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案：
一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，所述结构域PpCBM的氨基酸序列选自如下(1)、(2)或(3)：
(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具备特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列；
(3)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同源性≥85％，且所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的氨基酸序列。
编码所述的结构域PpCBM的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3)或(4)：
(1)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(3)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同源性≥85％，且其所表达结构域具有特异性结合κ-卡拉胶的核苷酸序列；
(4)与(1)、(2)或(3)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
一种分离的表达载体，含有如前所述的编码PpCBM结构域的核苷酸序列的表达载体。
一种宿主细胞，包含如前所述的分离的表达载体。
所述的结构域PpCBM的制备方法，包括以下步骤：(a)将编码所述结构域PpCBM的核苷酸序列克隆入整合型载体中，构建表达载体；采用的穿梭载体是pNCMO2，所述pNCMO2的表达启动子是来自宿主菌细胞壁蛋白的P2启动子；(b)将表达载体导入短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中进行表达；(c)经纯化，得到所述分离的结构域PpCBM。
所述分离的结构域PpCBM为天然存在或人为进行改造的、与PpCBM结构具有相同或相似性的蛋白结构域。所述的结构域PpCBM自身不具备酶活力，但与κ-卡拉胶酶PpCgkCD共同作用可以显著提高PpCgk的比酶活，使其具有更强的底物亲和性和更高的相对催化效率。这是因为，结构域PpCBM能够特异性与κ-卡拉胶底物结合，从而有效促进酶与底物的缔合；具体包括以下三个方面：(1)其C末端能够与底物特异性结合，提高底物周围相对酶浓度，通过底物的临近效应提高酶活力；(2)定向引导底物接近κ-卡拉胶酶的催化区；(3)能够非催化性地破坏κ-卡拉胶的微晶结构。
此外，所述的结构域PpCBM能够提高κ-卡拉胶酶的温度稳定性；添加了结构域PpCBM的κ-卡拉胶酶PpCgk，温度稳定性显著提高。
同时，所述的结构域PpCBM对κ-卡拉胶酶的水解模式有影响；无论作为底物的是溶解状或胶体状κ-卡拉胶，结构域PpCBM都会让使其更倾向于呈现进行性水解，从而解决了水解产物不可控的问题。
所述的结构域PpCBM在构建工程κ-卡拉胶酶中的应用，将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的N端或C端，即可构建工程κ-卡拉胶酶。
所述的结构域PpCBM在制备κ-卡拉胶寡糖中的应用，具体为：(1)将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的N端或C端，构建工程κ-卡拉胶酶；(2)采用所述工程κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶，制备κ-卡拉胶寡糖。
所述的结构域PpCBM在降解κ-卡拉胶中的应用，将适量PpCBM结构域直接添加到κ-卡拉胶底物中。
一种特异性固定于κ-卡拉胶的融合蛋白，包括如前所述的PpCBM结构域和目标蛋白。通过PpCBM结构域将目标蛋白固定于卡拉胶上，从而实现相应的功能。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次提供了特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，所述的结构域PpCBM不但可以显著提高κ-卡拉胶酶的比酶活和温度稳定性，还实现了底物的进行性水解。
(2)本发明所述的结构域PpCBM，不但可以通过构建工程菌株实现κ-卡拉胶酶性能的提升，还可以单独用于促进κ-卡拉胶底物的降解。
(3)本发明所述的结构域PpCBM，可以用于构建融合蛋白，通过其与κ-卡拉胶底物的结合实现相应的功能，具有广泛的应用前景。
附图说明
附图1为κ-卡拉胶酶(PpCgk)的保守域分析；
附图2为PpCgkCD及PpCgk蛋白(A)、PpCBM蛋白(B)Ni-NTA分离纯化SDS-PAGE结果；
附图3为PpCgk、PpCgkCD和PpCBM的酶活力比较；
附图4为PpCgk与PpCgkCD的pH稳定性；
附图5为PpCgk与PpCgkCD的温度稳定性；
附图6为PpCgk与PpCgkCD的DSF曲线及相应的Tm值；
附图7为PpCgk、PpCgkCD和PpCBM与κ-卡拉胶结合的SDS-PAGE电泳结果(A)及结合率(B)；其中，图7A中，C泳道为结合前蛋白，S泳道为结合后上清蛋白，B泳道为结合后多糖沉淀蛋白。
附图8为PpCBM蛋白对不同底物的结合率；
附图9为PpCgkCD、PpCgk水解溶解状态κ-卡拉胶的HPLC分析结果；其中，图9A和图9B分别为PpCgkCD体系20min和60min的HPLC分析结果；图9C和图9D分别为PpCgk体系20min和60min的HPLC分析结果。
附图10为PpCgkCD、PpCgk水解胶体状态κ-卡拉胶的HPLC分析结果；其中，图10A和图10B分别为PpCgkCD体系20min和60min的HPLC分析结果；图10C和图10D分别为PpCgk体系20min和60min的HPLC分析结果。
附图11为添加不同浓度的PpCBM对PpCgk和PpCgkCD酶活力的影响。
附图12为融合蛋白GfpCBM与κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、ι-卡拉胶结合后上清液的相对荧光强度对比图。
具体实施方式
本发明公开了表达κ-卡拉胶酶的Pseudomonas porphyrae LL1菌株及其κ-卡拉胶酶的制备和生产κ-卡拉胶寡糖的方法，以及利用CBM蛋白结构域特异性与底物结合，定向引导底物接近酶催化区和破坏多糖底物结构这三方面作用，显著提高多糖水解酶的水解活性的方法。本发明所采用的载体、菌株、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：κ-卡拉胶酶(PpCgk)的保守域分析
发明人从一株高产κ-卡拉胶酶的菌株Pseudoalteromonas porphyrae LL1中克隆其κ-卡拉胶酶基因(CGK)(GU386342)。对该κ-卡拉胶酶氨基酸序列进行保守域分析发现，除信号肽(M1-P27)、N末端GH16家族催化结构域(W38-V296)、Linker序列(G297-N316)外，其C末端具有一个功能未知的结构域(S317-N407)(图1)。经过对该C末端结构域进行重组表达分析发现，其自身没有催化能力，但可以特异性结合κ-卡拉胶，证明其为特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-binding Modules，CBM)，发明人将其命名为PpCBM，并对其进行功能研究。所述结构域PpCBM，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO.1：
GGNTGGDTGGDTGGNTGGDNSNSCPDTWVAVTGVNVTPQTKTLSKGQSVTLNTNVLPACATNKNVVYSTSNKNVATVTNEGVVKAKNKGSATITVKTKNKGKTDTVMITVN
上述特异性结合κ-卡拉胶的PpCBM所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
GGCGGAAATACGGGAGGCGATACTGGGGGTGACACAGGAGGCAACACAGGTGGAGATAACTCTAATTCATGTCCTGACACTTGGGTAGCTGTTACAGGCGTTAATGTAACACCGCAAACAAAAACACTCAGTAAAGGTCAAAGCGTTACTTTAAATACCAATGTACTTCCTGCCTGTGCAACTAACAAGAATGTTGTTTACTCTACGAGCAACAAAAATGTTGCTACTGTGACGAATGAAGGGGTTGTTAAAGCTAAAAATAAGGGCAGTGCAACGATTACTGTTAAAACCAAAAATAAGGGAAAGACTGACACGGTTATGATCACGGTAAATTAA
实施例2：无CBM的κ-卡拉胶酶催化结构域编码基因(PpCgkCD)、κ-卡拉胶酶全长蛋白编码基因(PpCgk)、C末端结构域蛋白编码基因(PpCBM)的克隆
根据PpCgkCD、PpCgk、PpCBM基因以及表达载体pNCMO2及上面的多克隆位点设计引物，在引物上设计酶切位点与6×His标签，通过PCR技术获得目的基因PpCgkCD，经过酶切，连接到克隆载体PLB上，构建质粒PLB-PpCgkCD、PLB-PpCgk、PLB-PpCBM，引物设计如表1所示。
表1用于以上三种基因克隆所需引物
Figure BDA0003079532560000051
实施例3：重组表达载体的构建
使用限制性内切酶BamHI和KpnI对融合质粒PLB-PpCgkCD、PLB-PpCgk、PLB-PpCBM与表达载体pNCMO2进行双酶切。将酶切后的基因片段相连接，转入E.coli JM109中，选取阳性转化株提取质粒测序；然后将测序无误的pNCMO2-PpCgkCD、pNCMO2-PpCgk、pNCMO2-PpCBM质粒分别转入短芽孢杆菌B.choshinensis表达系统，得到阳性转化株。
实施例4：PpCgkCD、PpCgk、PpCBM蛋白的表达和纯化
将实施例3获得的转化株接种至TMNm种子液培养基37℃培养14h，离心弃上清；按照5％的比例接种至30mL优化发酵培养基TMNm当中，发酵培养基培养4天。将发酵液4℃离心10min，收集上清；将上清置于透析袋内于咪唑透析液中透析2h。将透析得到的发酵液经Ni-NTA纯化，将收集得到的目标蛋白进行SDS-PAGE检测。纯化得到的蛋白结果如图2所示。将目标蛋白收集混匀分装待用，液氮速冻后-80℃保存。
实施例5：κ-卡拉胶酶C末端PpCBM结构域对酶活力的影响
将分离纯化获得的三种蛋白稀释至等摩尔浓度，分别与κ-卡拉胶底物反应，测定酶活力及比酶活。酶活力测定方法：取20μL的稀释酶液上清加入到180μL 0.5％(w/v)的κ-卡拉胶中(pH为所测定酶的最适pH)，40℃反应15min；按照Nelson-Somogyi法，加入200μLSA沸水浴10min；后加入200μL SB，12000rpm离心5min；吸取200μL上清至96孔板，在620nm下测量吸光值，并以同等条件下处理的灭活粗酶液作为对照。
表2 PpCgk和PpCgkCD对于κ-卡拉胶酶底物的酶动力学参数比较
Figure BDA0003079532560000061
根据测定结果发现，PpCgk蛋白的比酶活比PpCgkCD蛋白的高40.9％，说明PpCgk的比酶活显著高于PpCgkCD，但PpCBM不具有酶活力(图3)。这表明，PpCBM具有特异性亲和κ-卡拉胶的能力，使得PpCgk的酶活力显著提升。如表2所示，对PpCgk和PpCgkCD进行酶动力学参数分析发现，PpCgk蛋白的Km值小于PpCgkCD蛋白，kcat以及kcat/Km均大于PpCgkCD蛋白；这说明，PpCgk具有更强的底物亲和性(Km(app)越小，与底物的结合能力越强)和更高的相对催化效率(kcat/Km(app)越高，催化效率高越高)。这说明，虽然PpCBM本身不具有催化能力，但却使PpCgk蛋白对κ-卡拉胶具有更高的亲和力及催化速率，从而显著提升了其对κ-卡拉胶酶的催化能力。
实施例6：结构域PpCBM对κ-卡拉胶酶最适pH、温度及稳定性的影响
温度对酶活力变化的影响：将蛋白样品稀释后与0.5％κ-卡拉胶底物反应；将反应体系置于25℃至55℃温度梯度，反应后测定酶活力，确定最适反应温度。按照如上的方法将反应体系置于各个温度条件下1h，再次测量其酶活力，以4℃条件下静置1h的蛋白样品同等条件处理作为对照，比较各个温度条件下酶活力变化情况。同时，利用差示荧光扫描实验(DSF)进一步验证蛋白热稳定性差异，将蛋白与SYPRO orange荧光染料混合，在LightCycler 480荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)中，以0.6℃/min的升温速度，监测溶液的荧光值变化，进行曲线拟合分析计算Tm值。
pH对酶活力变化的影响：将κ-卡拉胶底物配制成pH从4.0至10.0共计8个pH梯度，与纯酶稀释液反应。将反应体系置最适温度当中，测定酶活力，并由此确定最适反应pH。将蛋白分别置于pH从3.0至12.0的HCL/NaOH当中过夜，利用200mM Na2HPO4·12H2O(pH＝8.0)将同pH条件下的蛋白酶进行稀释，在最适反应温度和pH下测量酶活。
对PpCgk和PpCgkCD的酶稳定性进行比较分析发现，它们的pH稳定性类似(图4)，但PpCgk的温度稳定性较PpCgkCD显著提高(图5)；尤其在40和45℃保温条件下，PpCgk的残存活性显著高于PpCgkCD。而且，经差示荧光扫描实验(DSF)也发现，PpCgk蛋白的Tm值为46.25±0.19℃，而PpCgkCD蛋白的Tm值为41.26±0.23℃。即，PpCgk蛋白的Tm值比PpCgkCD蛋白的Tm值高4.99℃(图6)。由此可知，结构域PpCBM的存在显著提高了κ-卡拉胶酶的温度稳定性，说明PpCBM结构域对维持蛋白三维结构稳定具有重要作用。
综上可知，κ-卡拉胶酶C末端的结构域PpCBM对其催化能力和热稳定性都具有显著的促进作用。
实施例7：结构域PpCBM对卡拉胶特异性结合作用
将500μL 0.1mg/mL的PpCgk、PpCgkCD、PpCBM与15mgκ-卡拉胶于混匀器上4℃过夜，离心分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析原液、上清、沉淀，实验结果如图7(A)所示。根据图7(A)可知，大部分PpCgk蛋白与κ-卡拉胶结合离心后位于沉淀当中，而大部分PpCgkCD蛋白并未与κ-卡拉胶结合，离心后位于上清当中；同时PpCBM与卡拉胶结合也主要存在与沉淀中。由此说明，结构域PpCBM能够与底物结合，提高底物周围相对酶浓度，通过底物的临近效应提高酶活力。
此外，测定结合后上清的蛋白含量，计算其相对吸附率，如图7(B)所示；进一步说明，结构域PpCBM能够与底物结合，而且其与卡拉胶的结合在全长PpCgk酶的底物结合中占主要地位。同时发现，PpCgkCD也具有底物结合作用，其作用仅仅为活性催化中心的底物结合作用。
将15mg等量κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、ι-卡拉胶及琼胶加入到500μL 0.1mg/mL的PpCBM蛋白当中，置于混匀器上4℃条件下过夜混匀，使结合达到平衡；10000×g离心取上清液，分别在酶标仪280nm下测量上清液蛋白含量。PpCBM蛋白与各种底物的结合率如图8所示，其中，PpCBM蛋白对κ-卡拉胶的结合能力最强，且显著强于λ-卡拉胶和ι-卡拉胶，这表明结构域PpCBM具有高度特异性。
综上，κ-卡拉胶酶C末端的结构域PpCBM可以特异性结合κ-卡拉胶，并提高酶的底物结合能力，这很可能是PpCBM通过底物临近效应提高催化结构域酶活力的原因。
实施例8：κ-卡拉胶酶中C末端的结构域PpCBM对卡拉胶酶水解模式的影响
比较不带CBM结构域的PpCgkCD蛋白、带CBM结构域的PpCgk蛋白对于溶解的κ-卡拉胶和非溶解的κ-卡拉胶胶体(添加KCl)这两个底物的水解过程。利用ACE柱前衍生HPLC分析PpCgk水解底物的过程，揭示PpCBM对于κ-卡拉胶水解模式的影响。通过图9A和图9C对比可知，PpCgk水解过程(20min)中产生的高聚合度寡糖少于PpCgkCD；这说明，PpCgk水解过程中随机断裂多糖内部的糖苷键要少于PpCgkCD。通过60min终产物分析可以看出，PpCgkCD和PpCgk和的Dp4和Dp2的比值不同。其中，PpCgkCD终产物的Dp4/Dp2为0.56，而PpCgk终产物的Dp4/Dp2为0.84。Dp4/Dp2值是反映水解模式指标，Dp4/Dp2值越高，越倾向于进行性水解模式。由此可知，以溶解的κ-卡拉胶为底物时，当κ-卡拉胶酶具备PpCBM结构域时，酶更倾向于进行性水解。
然后以胶体κ-卡拉胶底物进行水解试验，结果如图10所示。首先，与图9相比，PpCgkCD和PpCgk的水解过程(20min)中没有产生系列的偶数寡糖，主要以二糖四糖为主。PpCgkCD终产物的Dp4/Dp2为0.65，而PpCgk终产物的Dp4/Dp2为0.71。这个两个值均大于前述以溶解的κ-卡拉胶作为底物获得的Dp4/Dp2值0.56；说明以胶体κ-卡拉胶作为底物时，PpCgkCD和PpCgk均呈现进行性水解。同时，PpCgk获得的Dp4/Dp2值显著高于PpCgkCD的相应结果，这说明以胶体κ-卡拉胶为底物时，PpCBM结构域也会让酶更呈现进行性水解的特性。
综上可知，无论底物是溶解的κ-卡拉胶抑或胶体κ-卡拉胶，带CBM结构域的PpCgk蛋白均呈现进行性水解模式，而提高四糖产物的比例，这对于四糖的生产有一定意义。
实施例9：结构域PpCBM的独立添加对κ-卡拉胶酶酶活的影响
为了测定结构域PpCBM独立添加是否会影响PpCgk和PpCgkCD蛋白的酶活力，发明人将结构域PpCBM的蛋白单独分离纯化，将纯CBM蛋白分别与PpCgk、PpCgkCD以摩尔比1:1、5:1、10:1、100:1进行混合，以单独的PpCgk和PpCgkCD作为对照，测定κ-卡拉胶酶活力。由图11可知，结构域PpCBM的独立添加对两种蛋白的酶活力均有促进作用，且浓度越高，促进效果越显著。在PpCgkCD与结构域PpCBM的摩尔比达到1:100时，混合液的相对酶活力为纯PpCgkCD蛋白的172.2％；而PpCgk与结构域PpCBM摩尔比达到1:100时，混合液的相对酶活力为纯PpCgk蛋白的189.2％，为纯PpCgkCD蛋白的281.9％。这说明，单独添加结构域PpCBM能够非催化性地破坏多糖的微晶结构，从而提高催化结构域的催化能力。
此外，值得注意的是，PpCgkCD与PpCBM结构域的摩尔比达到1:1时，混合液的相对酶活力与纯PpCgk蛋白的无显著区别，但却显著低于PpCgk的比酶活力(图11)。由此可知，尽管PpCBM的添加确实能提高κ-卡拉胶酶的酶活力，但效果显著低于PpCBM与相应的同源催化结构域处于融合状态下的水平。
实施例10：结构域PpCBM用于构建融合蛋白
将PpCBM的基因序列通过overlap PCR连接到绿色荧光蛋白基因的3‘端，将获得的融合基因利用pET28a载体在E.coli BL21菌株中进行表达，通过细胞破碎镍亲和层析获得在C末端融合PpCBM的工程绿色荧光蛋白(GfpCBM)。该蛋白可用于κ-卡拉胶的检测。将等量κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、ι-卡拉胶(10-50mg)与500μL GfpCBM蛋白(0.1-0.5μg/ml)混合，置于混匀器上4℃条件下混匀2h，使结合达到平衡；10000×g离心取上清液，利用荧光酶标仪测定上清液的荧光强度，未添加多糖的GfpCBM蛋白溶液作为对照。结果如图12所示，由于PpCBM的存在使得工程绿色荧光蛋白GfpCBM呈现出对κ-卡拉胶强的结合能力，所以上清的相对荧光水平很低。而PpCBM对λ-卡拉胶有较弱的结合能力，对ι-卡拉胶无结合能力。所以λ-卡拉胶、ι-卡拉胶组的上清分别呈现出70％和100％的相对荧光值。因此，所构建的GfpCBM蛋白凭借PpCBM的特异性κ-卡拉胶结合能力，可以用于κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、ι-卡拉胶的分别鉴定，特别是用于κ-卡拉胶的鉴定分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域及其应用
<130> KY1202105
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 紫菜假交替单孢菌(Pseudoalteromonas porphyrae LL1)
<400> 1
Gly Gly Asn Thr Gly Gly Asp Thr Gly Gly Asp Thr Gly Gly Asn Thr
1 5 10 15
Gly Gly Asp Asn Ser Asn Ser Cys Pro Asp Thr Trp Val Ala Val Thr
20 25 30
Gly Val Asn Val Thr Pro Gln Thr Lys Thr Leu Ser Lys Gly Gln Ser
35 40 45
Val Thr Leu Asn Thr Asn Val Leu Pro Ala Cys Ala Thr Asn Lys Asn
50 55 60
Val Val Tyr Ser Thr Ser Asn Lys Asn Val Ala Thr Val Thr Asn Glu
65 70 75 80
Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly Ser Ala Thr Ile Thr Val Lys
85 90 95
Thr Lys Asn Lys Gly Lys Thr Asp Thr Val Met Ile Thr Val Asn
100 105 110
<210> 2
<211> 336
<212> DNA
<213> 紫菜假交替单孢菌(Pseudoalteromonas porphyrae LL1)
<400> 2
ggcggaaata cgggaggcga tactgggggt gacacaggag gcaacacagg tggagataac 60
tctaattcat gtcctgacac ttgggtagct gttacaggcg ttaatgtaac accgcaaaca 120
aaaacactca gtaaaggtca aagcgttact ttaaatacca atgtacttcc tgcctgtgca 180
actaacaaga atgttgttta ctctacgagc aacaaaaatg ttgctactgt gacgaatgaa 240
ggggttgtta aagctaaaaa taagggcagt gcaacgatta ctgttaaaac caaaaataag 300
ggaaagactg acacggttat gatcacggta aattaa 336

Claims (10)

1.一种分离的特异性结合κ-卡拉胶的碳水化合物结合结构域PpCBM，其特征在于：所述结构域PpCBM的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2. 一种编码权利要求1所述的结构域PpCBM的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.一种分离的表达载体，其特征在于：含有权利要求2所述的编码结构域PpCBM的核苷酸序列的表达载体。
4.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求3所述的分离的表达载体；所述的宿主细胞不包括动物植物品种。
5. 如权利要求 1 或2所述的结构域PpCBM的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（a）将编码所述结构域PpCBM的核苷酸序列克隆入整合型载体中，构建表达载体；（b）将表达载体导入短芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis中进行表达；（c）经纯化，得到所述分离的结构域PpCBM。
6.根据权利要求5所述的结构域PpCBM的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）构建表达载体采用的穿梭载体是pNCMO2，所述pNCMO2的表达启动子是来自宿主菌细胞壁蛋白的P2启动子。
7. 如权利要求 1所述的结构域PpCBM在构建工程κ-卡拉胶酶中的应用，其特征在于：将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的C端，构建工程κ-卡拉胶酶。
8. 如权利要求 1所述的结构域PpCBM在制备κ-卡拉胶寡糖中的应用，其特征在于：（1）将PpCBM结构域融合到κ-卡拉胶酶的C端，构建工程κ-卡拉胶酶；（2）采用所述工程κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶，制备κ-卡拉胶寡糖。
9. 如权利要求 1所述的结构域PpCBM在降解κ-卡拉胶中的应用，其特征在于：将适量PpCBM结构域直接添加到κ-卡拉胶底物中。
10.一种特异性固定于κ-卡拉胶的融合蛋白，其特征在于：包括权利要求1所述的结构域PpCBM和目标蛋白。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013210506A1 (de) * 2013-06-06 2014-12-11 Henkel Ag & Co. Kgaa Alkoholoxidase mit Aktivität für Glycerol
CN109735520A (zh) * 2018-12-26 2019-05-10 青岛大学 一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用
CN111944787A (zh) * 2020-07-30 2020-11-17 华南理工大学 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013210506A1 (de) * 2013-06-06 2014-12-11 Henkel Ag & Co. Kgaa Alkoholoxidase mit Aktivität für Glycerol
CN109735520A (zh) * 2018-12-26 2019-05-10 青岛大学 一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用
CN111944787A (zh) * 2020-07-30 2020-11-17 华南理工大学 一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D5K195_9GAMM,Kappa-carrageenase;佚名;《UniProtKB》;20100615;第1-4页 *
Structural insights into marine carbohydrate degradation by;Maria Matard-Mann等;《J Biol Chem》;20171231;第19919-19934页 *
Truncation of κ‑carrageenase for higher κ‑carrageenan oligosaccharides yield with improved enzymatic characteristics;YajiaoZhang等;《International Journal of Biological Macromolecules》;20190601;第130卷;第958-968页 *

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