CN114164244B - 一种制备橙皮素-7-o-葡萄糖苷和橙皮素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷和橙皮素的方法。该方法包括以下步骤：(1)培养黑曲霉细胞或米曲霉细胞进行生长发育，并制得黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂；(2)向新橙皮苷或橙皮苷中加入绿色溶剂与缓冲溶液，再加入黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂，混合均匀反应体系，进行新橙皮苷或橙皮苷的水解，水解后取上清液离心，进行分析鉴定，得到橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷和橙皮素。本方法能够克服传统化学方法制备橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷和橙皮素反应条件苛刻、污染严重、转化率低等缺点，以及直接采用酶法造成的生产操作复杂，成本高昂，不适用于大规模工业生产等不足之处。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,，具体涉及一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法。
背景技术
根据联合国粮食及农业组织(FAO)的数据，2017年全球柑橘产量约为8200万吨。目前，柑橘被认为是工业化生产橙汁最主要的原材料，而生产过程中，橘皮则被认为是一种具有良好发展前景的工业副产物。
传统药用资源橘皮,具有去湿，化痰，抗菌，抗病毒，降血压，抗氧化等药理作用。研究表明，橘皮中除含有挥发性精油1.5％-2％外，还含有大量的黄酮类化合物。而黄酮类化合物则是发挥橘皮抗菌，抗病毒，抗氧化等生理活性最主要的相关物质。针对上述情况，有研究表明，目前已有效从橘皮中分离60多种黄酮类化合物,其中较为常见的包括新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷等。
由于新橙皮苷与橙皮苷在橘皮中含量丰富，已受到科学界的重视与关注。科学研究表明，新橙皮苷与橙皮苷具有抑制骨质疏松、降低血糖血脂及改善糖耐量、抗氧化、保护心血管、促进胃肠道消化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等药理活性，具有广泛的成药基础。但近年来，有研究表明，橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素的生物利用度相比于新橙皮苷与橙皮苷有明显的提升，最大延迟吸收时间也呈现倍数的减少。究其原因可能在于新橙皮苷与橙皮苷无法直接被吸收利用，而是需经肠道菌群水解代谢后，方可被人体所吸收。因此，在已知其水解产物具有高生物利用度与生理活性的情况下，如何通过在自然界中含量较高的低价值新橙皮苷与橙皮苷水解制备含量较低的高价值橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素,成为食品与药学领域针对橘皮的研究热点。
目前，针对黄酮类糖苷水解主要采用的方法包括化学法和酶法。其中，化学法主要采用的是酸水解法。如Grohmann等人曾以稀硫酸为催化剂，催化橙皮苷发生水解反应(Karel Grohmann,John A.Manthey,Randall G.Cameron.Acid-catalyzed hydrolysis ofhesperidin at elevated temperatures[J].Carbohydrate Research,2000,328(2):141-146)。但目前，化学法仍然存在选择性差，反应不易被控制，副产物多，分离纯化操作复杂，环境污染等问题。
利用酶法对黄酮类糖苷进行水解也是目前常用的方法之一。Zhu等人曾使用从细菌中分离纯化得到的柚皮苷酶对新橙皮苷，橙皮苷进行水解从而得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素(Yunping Zhu,Huiyong Jia,Menglu Xi,et al.Purification andcharacterization of a naringinase from a newly isolated strain of Bacillusamyloliquefaciens 11568suitable for the transformation of flavonoids[J].FoodChemistry,2017,214:39-46)。专利CN109312375A介绍了使用通过构建重组质粒在大肠杆菌中异源表达的α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶将橙皮苷或新橙皮苷水解生成橙皮素或橙皮素中间体。尽管使用生物酶法可有效避免化学法出现的副产物多，易造成环境污染等问题，但由于酶的纯化分离操作复杂，商品化的酶价格昂贵，造成酶法的应用也受到了一定的限制。
全细胞催化黄酮类糖苷水解是一种新型且有效的生物转化方法，全细胞催化水解可根据细胞内的特异性水解酶，对黄酮类糖苷进行水解。其主要特点包括反应选择性高，反应条件温和及对环境友好，制备简单且价格低廉，可重复利用。因此，通过筛选菌株与诱导剂全细胞催化黄酮类糖苷水解成为目前科学领域研究的热点。
发明内容
本发明提供了一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法。
一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，按照以下步骤进行：
(1)培养黑曲霉细胞或米曲霉细胞进行生长发育，并制得黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂；
(2)向新橙皮苷或橙皮苷中加入绿色溶剂与缓冲溶液，再加入黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂，混合均匀反应体系，进行新橙皮苷或橙皮苷的水解，水解后取上清液离心，进行分析鉴定，得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素。
进一步地，步骤(1)所述黑曲霉细胞可以为黑曲霉GDMCC 3.149，来源Aspergillusniger van Tieghem CICC 2315，也可以选择通用黑曲霉细胞；步骤(1)所述米曲霉GDMCC3.236，来源Aspergillus oryzae(Ahlburg)Cohn CGMCC3.863，也可以选择通用米曲霉细胞。
进一步地，步骤(2)所述绿色溶剂为碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、2-甲基四氢呋喃、氯化胆碱-乙二醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-丙三醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-新戊二醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-三羟甲基乙烷深度共熔溶剂、氯化胆碱-三羟甲基丙烷深度共熔溶剂、氯化胆碱-葡萄糖深度共熔溶剂、氯化胆碱-蔗糖深度共熔溶剂、氯化胆碱-果糖深度共熔溶剂、氯化胆碱-木糖醇深度共熔溶剂或氯化胆碱-山梨醇深度共熔溶剂中的一种或多种混合。
进一步地，步骤(2)所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种以上。
进一步地，步骤(2)所述缓冲溶液的pH为4.0-8.0。
进一步地，步骤(2)所述水解的温度为30℃-60℃，所述水解的时间为1h-48h。
进一步地，步骤(2)所述新橙皮苷或橙皮苷的物质的量与绿色溶剂的体积比为3:10-82:5mmol/L。
进一步地，步骤(2)所述新橙皮苷或橙皮苷与黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂的质量比为1:1-1:8。
进一步地，步骤(2)所述绿色溶剂与缓冲溶液的体积比为9:1-1:9。
进一步地，步骤(2)所述离心的转速为8000rpm-16000rpm，离心的时间为0.5min-10min；步骤(2)所述分析鉴定具体方法为：色谱级甲醇稀释后过有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样,与橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的标准品进行色谱及光谱比对，即可鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素；
进一步地，步骤(2)所述分析鉴定具体方法为：色谱级甲醇稀释1-50倍后过0.22μm有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样20μL,与橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的标准品进行色谱及光谱比对，即可鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素。
进一步地，步骤(2)所述黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂对新橙皮苷或橙皮苷进行水解,使得双糖苷发生水解反应，生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素，转化率达到90％以上。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明提供了一种利用黑曲霉或米曲霉全细胞催化新橙皮苷或橙皮苷水解，制备高价值水解产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，底物转化率可达90％以上。与现有方法相比，该方法底物转化率高，反应选择性好，反应条件温和，制备简单且稳定性好，可重复利用且价格低廉。
附图说明
图1为新橙皮苷标准品的高效液相色谱图。
图2为橙皮素-7-O-葡萄糖苷标准品的高效液相色谱图。
图3为橙皮素标准品的高效液相色谱图。
图4为实施例1利用黑曲霉全细胞催化新橙皮苷水解生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素的高效液相色谱图和液质联用的质谱图。
图5为橙皮苷标准品的高效液相色谱图。
图6为实施例2利用米曲霉全细胞催化橙皮苷水解生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素的高效液相色谱图和液质联用的的质谱图。
具体实施方式
本发明通过下列实施例对本发明技术内容予以进一步阐明,其目的仅仅为了更好理解本发明,而不是限制本发明权利要求的保护范围。实施例需要体现权利要求中范围的上限、下限和中间值,至少还需要添加一个实施例。
图1为新橙皮苷标准品的高效液相色谱图，由图1可以观察到新橙皮苷标准品的保留时间为3.7min。
图2为橙皮素-7-O-葡萄糖苷标准品的高效液相色谱图，由图2可以观察到橙皮素-7-O-葡萄糖苷标准品的保留时间为4.0min。
图3为橙皮素标准品的高效液相色谱图，由图3可以观察到橙皮素标准品的保留时间为8.0min。
图5为橙皮苷标准品的高效液相色谱图，由图5可以观察到橙皮苷标准品的保留时间为3.7min。
实施例1
(1)从黑曲霉GDMCC 3.149试管斜面中接1环菌种至PDA培养基中画平板活化1次(28℃，60h)，用5mL无菌水溶解孢子，将孢子悬浮液(接种量为3％，v/v)接种到发酵培养基(500mL锥形瓶)中。
摇瓶培养48h后，经抽滤去除培养液后得到湿菌体。湿菌体用蒸馏水或PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次去除菌体残留的培养基后，-45℃真空冷冻干燥24h获得冻干菌体即为黑曲霉全细胞催化剂。
(2)向10mL锥形瓶中依次加入20mg新橙皮苷、2mL碳酸二甲酯，在旋涡振荡仪上振荡溶解，随后加入2mL乙酸盐缓冲液(pH为4.0)、20mg黑曲霉全细胞催化剂，混合均匀，封闭瓶口后，置于全温摇床柜中进行反应(30℃，180rpm)。分别在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，4 4h，48h取样50μL，8000rpm离心0.5min后，用色谱级甲醇稀释50倍，过0.22μm有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样20μL进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：甲醇(A)/纯水(B)，50％/50％，流速0.9mL/min)。新橙皮苷48h后转化率为93.86％，产物经鉴别分别为橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素。水解反应48h的高效液相色谱图和液质联用的质谱图如图4为所示，由图4中的(a)可知该黑曲霉全细胞催化剂对新橙皮苷具有良好的转化率，并由图4中的(b)确定新橙皮苷水解产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素。
实施例2
(1)从米曲霉GDMCC 3.236试管斜面中接1环菌种至PDA培养基中画平板活化1次(28℃，60h)，用5mL无菌水溶解孢子，将孢子悬浮液(接种量为3％，v/v)接种到发酵培养基(500mL锥形瓶)中。
摇瓶培养48h后，经抽滤去除培养液后得到湿菌体。湿菌体用蒸馏水或PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次去除菌体残留的培养基后，-45℃真空冷冻干燥24h获得冻干菌体即为米曲霉全细胞催化剂。
(2)向10mL锥形瓶中依次加入20mg橙皮苷、2mL2-甲基四氢呋喃，在旋涡振荡仪上振荡溶解，随后加入2mL乙酸盐缓冲液(pH为5.0)、40mg米曲霉全细胞催化剂，混合均匀，封闭瓶口后，置于全温摇床柜中进行反应(40℃，180rpm)。分别在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h取样50μL，12000rpm离心2min后，用色谱级甲醇稀释50倍，过0.22μm有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样20μL进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：甲醇(A)/纯水(B)，50％/50％，流速0.9mL/min)。橙皮苷48h后转化率为92.93％，产物经与标准品比对后鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素。水解反应48h的高效液相色谱图和液质联用的的质谱图如图6为所示，由图6中的(a)可知米曲霉全细胞催化剂对橙皮苷具有良好的转化率，并由图6中的(b)确定新橙皮苷水解产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素。
实施例3
(1)从黑曲霉GDMCC 3.149试管斜面中接1环菌种至PDA培养基中画平板活化1次(28℃，60h)，用5mL无菌水溶解孢子，将孢子悬浮液(接种量为3％，v/v)接种到发酵培养基(500mL锥形瓶)中。
摇瓶培养48h后，经抽滤去除培养液后得到湿菌体。湿菌体用蒸馏水或PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次去除菌体残留的培养基后，-45℃真空冷冻干燥24h获得冻干菌体即为黑曲霉全细胞催化剂。
(2)向150mL锥形瓶中依次加入2mg橙皮苷、10mL氯化胆碱-乙二醇深度共熔溶剂，在旋涡振荡仪上振荡溶解，随后加入90mL柠檬酸盐缓冲液(pH为6.0)、8mg黑曲霉全细胞催化剂，混合均匀，封闭瓶口后，置于全温摇床柜中进行反应(60℃，180rpm)。分别在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h取样50μL，12000rpm离心5min后，用色谱级甲醇稀释50倍，过0.22μm有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样20μL进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：甲醇(A)/纯水(B)，50％/50％，流速0.9mL/min)。橙皮苷48h后转化率为92.35％，产物经与标准品比对后鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素。
实施例4
(1)从米曲霉GDMCC 3.236试管斜面中接1环菌种至PDA培养基中画平板活化1次(28℃，60h)，用5mL无菌水溶解孢子，将孢子悬浮液(接种量为3％，v/v)接种到发酵培养基(500mL锥形瓶)中。
摇瓶培养48h后，经抽滤去除培养液后得到湿菌体。湿菌体用蒸馏水或PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次去除菌体残留的培养基后，-45℃真空冷冻干燥24h获得冻干菌体即为米曲霉全细胞催化剂。
(2)向10mL锥形瓶中依次加入10mg新橙皮苷、2mL氯化胆碱-葡萄糖深度共熔溶剂，在旋涡振荡仪上振荡溶解，随后加入0.22mL磷酸盐缓冲液(pH为8.0)、80mg米曲霉全细胞催化剂，混合均匀，封闭瓶口后，置于全温摇床柜中进行反应(45℃，180rpm)。分别在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h取样50μL，18000rpm离心10min后，用色谱级甲醇稀释50倍，过0.22μm有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样20μL进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：甲醇(A)/纯水(B)，50％/50％，流速0.9mL/min)。新橙皮苷48h后转化率为92.99％，产物经与标准品比对后鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷与橙皮素。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）培养黑曲霉细胞或米曲霉细胞，并制得黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂；所述黑曲霉细胞为黑曲霉GDMCC 3.149；所述米曲霉细胞为米曲霉GDMCC 3.236；
（2）向新橙皮苷或橙皮苷中加入绿色溶剂与缓冲溶液，再加入黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂，混合均匀反应体系，进行新橙皮苷或橙皮苷的水解，水解后取上清液离心，进行分析鉴定，得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素；所述水解的温度为30 ℃-60℃，所述水解的时间为1 h-48 h；所述新橙皮苷或橙皮苷的物质的量与绿色溶剂的体积比为3:10-82:5 mmol/L；所述缓冲溶液的pH为4.0-8.0；所述新橙皮苷或橙皮苷与黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂的质量比为1:1-1:8；所述绿色溶剂为碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、2-甲基四氢呋喃、氯化胆碱-乙二醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-丙三醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-新戊二醇深度共熔溶剂、氯化胆碱-葡萄糖深度共熔溶剂、氯化胆碱-蔗糖深度共熔溶剂、氯化胆碱-果糖深度共熔溶剂一种或多种混合。
2.根据权利要求1所述一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，其特征在于，步骤（2）所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种以上。
3.根据权利要求1所述一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，其特征在于，步骤（2）所述绿色溶剂与缓冲溶液的体积比为9:1-1:9。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的方法，其特征在于，步骤（2）所述离心的转速为8000 rpm-16000 rpm，离心的时间为0.5 min-10 min；步骤（2）所述分析鉴定具体方法为：色谱级甲醇稀释后过有机相滤膜，高效液相色谱自动进样器进样, 与橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的标准品进行色谱及光谱比对，即可鉴定为橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素；步骤（2）所述黑曲霉全细胞催化剂或米曲霉全细胞催化剂对新橙皮苷或橙皮苷进行水解,使得双糖苷发生水解反应，生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素，转化率达到90%以上。
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